Procédures modérées

405 poussins vont être utilisés, tous tués entre le 6e et le 34e jour pour prélever leurs caeca, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent par voie orale une souche de Salmonella puis un probiotique administré jusqu'à quinze fois sur 34 jours, pour tester une stratégie de réduction de la contamination dans la filière du poulet de chair. Le porteur indique que l'infection reste souvent asymptomatique mais que les inoculations répétées peuvent stresser les animaux. Il présente le projet comme une réponse aux attentes des industriels de l'alimentation animale et qualifie la validation in vivo de "nécessaire" après les essais in vitro.

Objectifs

La salmonellose, représente la deuxième cause d’infection humaine d’origine alimentaire en Europe. Cette infection, est une maladie qui peut être transmise à l’Homme tout au long de la chaine alimentaire, mais plus généralement par le biais d'aliments d'origine animale contaminés. Les salmonelloses humaines sont principalement attribuées à la filière avicole. L’objectif principal de ce projet est de réduire la présence de Salmonella, prédominante dans cette filière par l’ajout d’un probiotique comme source de molécules bioactives. Par ailleurs, au cours d’un précédent travail, l’inhibition du passage de la barrière intestinale de différents sérotypes de Salmonella (S. Typhimurium, S. Senftenberg), a été mis en évidence in vitro. Cet essai permettra de valider les effets bénéfiques obtenus in vitro, en vérifiant en animalerie expérimentale l’effet inhibiteur sur Salmonella de B. fragilis. La réduction du portage de Salmonella sera mesurée au niveau intestinal, au sein des caeca, de sa diffusion dans le sang et par la réponse immunitaire. L’impact de B. fragilis sur le microbiote digestif en présence de Salmonella sera également considéré. Développer une stratégie de lutte efficace pour limiter la colonisation des animaux par Salmonella dès l’élevage permettra de réduire la charge qui arriverait sur la chaine alimentaire, et ainsi répondre aux attentes des industriels de l’alimentation animale et des différents acteurs de la filière avicole dont la priorité est d’assurer l’innocuité de leurs produits auprès des consommateurs.

Bénéfices attendus

Ce travail permettra de valider les effets bénéfiques du probiotique B. fragilis observés in vitro sur la colonisation de Salmonella. Ces données sont nécessaires pour l’acquisition de connaissance, et pour le développement d’une stratégie de lutte efficace pour limiter la colonisation des animaux par Salmonella dès l’élevage. Cela permettrait de limiter à terme, l’usage d’antibiotiques en cas de salmonelloses animales, de réduire la charge bactérienne qui arriverait sur la chaine alimentaire, et ainsi répondre aux attentes des industriels de l’alimentation animale et des différents acteurs de la filière avicole dont la priorité est d’assurer l’innocuité de leurs produits auprès des consommateurs. Par ailleurs, cette étude nous permettra de vérifier que les résultats obtenus in vitro sont transposables in vivo dans l'objectif de réduire le recours à l’expérimentation animale lors de futures études.

Procédures

Les animaux seront soumis à une inoculation par voie orale de Salmonella spp. et du probiotique B. fragilis. Les prélèvements de caeca et de sang auront lieu après mises à mort des animaux (J6, J13, J20, J27 et J34). Dès la mise en place (J0), 400 poussins tout venant de 1 jour de l’espèce Gallus gallus de souche commerciale de chair (type ROSS PM3), seront inoculés par voie orale avec 100 µL de B. fragilis pour le Lot 1, Lot 4 et Lot 7, et 100 µL de Tryptone Sel pour le Lot 2, Lot 3, Lot 5, Lot 6 et Lot 8. L’inoculation par voie orale, à la pipette, (d’une durée maximale d’une minute par animal) sera réalisée au maximum tous les 2 jours (hors week-end) sur une période de 34 jours, pour un maximum de 15 inoculations. A J0, il y aura aussi une mise à mort de 5 poussins pour prélèvements de vésicules vitellines afin de vérifier le statut indemne des animaux en Salmonella. Le lendemain de la mise en place (à J1), tous les animaux seront pesés et les poussins inoculés recevront 100 µL de la suspension de Salmonella adequate (S. Typhimurium ou S. Senftenberg) par voie orale à la pipette, à une dose de 10^5 UFC/ml (Lot 3, Lot 4, Lot 5, Lot 6, Lot 7 et Lot 8) et 100 µL de Tryptone Sel pour le Lot 1 et Lot 2. A partir de J2 jusqu’au J20 le Lot 1, Lot 4 et Lot 7 recevrons 100 µL de B. fragilis tous les deux jours, tandis que le Lot 2, Lot 3, Lot 5, Lot 6 et Lot 8 recevront 100 µL de Tryptone Sel. A J20 le Lot 1, Lot 2, Lot 4, Lot 5, Lot 7 et Lot 8 recevrons 100 µL de B. fragilis tous les deux jours, tandis que les Lot 3 et Lot 6 recevront 100 µL de Tryptone Sel.

Impact sur les animaux

Les infections à Salmonella chez les volailles passent généralement inaperçues. Principalement asymptomatiques, elles peuvent provoquer parfois une réduction des performances de ponte chez les poules, une perte d’appétit, de la prostration et des diarrhées liquides. Les salmonelles se multiplient dans le tube digestif des oiseaux et peuvent être excrétées en grande quantité dans les déjections. Toutefois, les souches de S. Typhimurium et S. Senftenberg utilisées dans cette étude ont déjà fait l’objet d’essais in vivo et aucun effet indésirable n’a été observé. Il n’est pas attendu d’effet indésirable tout au long de cet essai. La souche de B. fragilis utilisée est considéré comme un probiotique. Toutefois, l’apport d’une solution de probiotiques ou de tryptone sel, par voie orale, tous les 2 jours peut conduire à une situation de stress pour les poulets de chair.

Devenir

Les prélèvements de caeca nécessitent la mise à mort des animaux.

Remplacement

La volaille et notamment le poulet de chair représente une source importante de salmonellose pour l’Homme. Ainsi, il est nécessaire de contribuer au développement d’un moyen de lutte contre Salmonella dans la filière avicole afin de réduire in fine le risque d’infection humaine par Salmonella. Des essais préliminaires, réalisés in vitro sur des cellules humaines, montrent un effet bénéfique de B. fragilis en inhibant le passage de Salmonella au travers de la muqueuse intestinale. Toutefois, ces essais ont été réalisés en présence de cellules humaines en absence de lignée cellulaire intestinale de poulet disponible. Il est par conséquent necessaire de valider ses résultats lors d’un essai sur le poulet de chair. Cette validation nous permettra de vérifier que les résultats obtenus in vitro sont transposables in vivo afin de réduire par la suite le recours à l’expérimentation animale.

Réduction

Les animaux seront utilisés au seuil de la pertinence scientifique et statistique. En raison de la variabilité interindividuelle importante des niveaux de colonisation par les bactéries étudiées et de la variabilité du microbiote au cours du temps, il a été déterminé qu’un minimum de 10 animaux par groupe (8) était nécessaire pour chaque temps donné (5) afin d’assurer la robustesse des tests statistiques. Ainsi, 405 animaux seront nécessaires à cette étude (5 animaux seront utilisés au début de l’étude pour vérifier l’absence de contamination par Salmonella et 400 pour observer l'effet de B. Fragilis sur la contamination par Salmonella).

Raffinement

L’inoculation des bactéries à la pipette par voie orale et les pesées seront réalisées par le personnel expérimenté qui apportera la même attention à chaque inoculation de sorte à éviter/limiter les inconforts au moment de l’administration. Bien qu'aucun effet indésirable ne soit attendu au cours de cet essai, les animaux seront observés quotidiennement. Le raffinement des conditions d’hébergement vise à assurer l’inconfort des animaux. Les paramètres d’ambiance utilisés en animaleries sont ceux préconisés pour les élevages de poulets de chair. Chaque lot de poulets sera installé dans des parcs au sol sur une litière composée de copeaux de bois (qui servira d’enrichissement du milieu puisque les animaux grattent et picorent cette litière). De plus, des alvéoles en carton seront disposés sur les copeaux de bois avec de l’aliment et des cartons seront apposés sous les mangeoires afin de stimuler les poussins à s’alimenter dans leurs premières heures de vie. Tout au long de l'essai, les animaux recevront à volonté, de l’eau et de l’aliment spécifique à leur âge et leur espèce.

Choix des espèces

Les salmonelloses humaines sont principalement attribuées à la filière avicole. Ce projet à pour pbjectif de développer une stratégie de lutte efficace pour limiter la colonisation des animaux par Salmonella dès l’élevage afin de réduire la charge qui arrive sur la chaine alimentaire. Par conséquent, le poulet de chair est l’espèce adaptée aux objectifs et aux conditions de notre procédure. Des poussins de 1 jour seront utilisés et élevés jusqu’à 34 jours (âge d’abattage des poulets de chair pour la consommation). Le but est de suivre l’effet de l’ajout du probiotique B. fragilis sur la colonisation de Salmonella, la modulation du microbiote et l’influence sur des marqueurs de l’immunité.

848 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par exsanguination et perfusion intracardiaque, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès la naissance elles reçoivent des injections intragastriques, puis subissent une restriction alimentaire ramenant leur poids à 85 % pendant deux mois et des tests d'équilibre, d'attention et de flexibilité comportementale, pour clarifier le rôle des cellules murales dans les maladies des petits vaisseaux cérébraux. Le porteur reconnaît que la manipulation des nouveau-nés peut provoquer leur cannibalisme par la mère et que la perte de cellules murales peut entraîner lésions cérébrales, troubles moteurs et mort prématurée, tout en qualifiant ces lésions de très bien tolérées. Il affirme ne pas pouvoir substituer au modèle animal une approche in vitro ou informatique.

Objectifs

Les vaisseaux sanguins sont des conduits qui transportent le sang dans l'organisme. Ils sont schématiquement constitués de l'intérieur vers l'extérieur d'une monocouche interne de cellules endothéliales en contact avec le sang et d'une ou plusieurs couches de cellules murales permettant la contraction ou la dilatation du vaisseau. Dans le cerveau, il existe au moins 3 grands types de vaisseaux: les artères/artérioles, les capillaires et les veines. Les cellules endothéliales et les cellules murales présentent des caractéristiques moléculaires, histologiques et fonctionnelles qui différent en fonction du type de vaisseau. Les maladies des petits vaisseaux cérébraux sont définies par la présence de lésions structurales ou fonctionnelles des cellules endothéliales ou des cellules murales. Elles sont responsables chez l'homme d'environ un tiers des accidents vasculaires cérébraux, de lésions de la substance blanche diffuse, de microsaignements, d'une atrophie cérébrale et sont une cause majeure de déclin cognif. IL n'existe à ce jour aucun traitement spécifique pour ces maladies, une des raisons étant que les mécanismes physiopathogéniques de ces maladies sont encore très mal connus. Des données de la littérature suggèrent que la perte des cellules murales joue un rôle important dans le déterminisme de ces maladies mais il existe des données contradictoires quant à l'implication des cellules murales des artères versus celles des capillaires. L'objectif de ce projet est de clarifier l'implication des cellules murales de ces différents types de vaisseaux cérébraux dans les différentes manifestations cliniques des maladies des petits vaisseaux cérébraux chez la souris.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet de recherche fondamentale permettront de clarifier de façon définitive le rôle respectif de la perte des cellules murales des artères, des capillaires et des veines dans la symptomatologie des maladies des petits vaisseaux cérébraux. S'il s'avère comme nous le pensons que la perte des cellules murales des artères joue un rôle déterminant dans ces maladies, nos résultats conduiront à une ré-orientation des travaux de recherche dans ce domaine et à l'exploration de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

3 injections intragastriques quotidiennes après la naissance (durée 10 min/injection). Restriction alimentaire visant à réduire le poids à 85% du poids initial d’une durée maximale de 2 mois, de l’âge de 4 à 6 mois et de l’âge de 10 à 12 mois. Tests de comportement d'une durée de 5 min à 1 heure / jour pendant 2 mois, de l’âge de 4 à 6 mois et de l’âge de 10 à 12 mois. 1 injection intraveineuse 6 heures avant la mise à mort (durée de l'injection 10 min). Mise à mort par exsanguination et perfusion intracardiaque (durée 30 min).

Impact sur les animaux

La manipulation des nouveaux nés en vue de la réalisation des injections intragastriques de tamoxifène pourrait conduire au cannibalisme par la mère mais ceci peut être très largement évité en soupoudrant les souriceaux de sciure de la cage après leur manipulation. La perte des cellules murales des vaisseaux peut conduire à des lésions histologiques du cerveau, des troubles moteurs et la mort prématurée de la souris mais dans notre expérience ces lésions sont extraordinairement bien tolérées chez la souris car d'apparition très progressive. La restriction alimentaire pourrait conduire à une perte de poids supérieure à celle souhaitée (environ 85% du poids original) mais pour prévenir celà les souris seront pesées tous les jours.

Devenir

mise à mort par exsanguination et perfusion transcardiaque de fixateurs. La perfusion intracardiaque de fixateurs permet de fixer le cerveau in situ avant son prélèvement et donc de préserver la morphologie des tissus et des vaisseaux du cerveau , ce qui est indispensable dans notre projet.

Remplacement

La complexité des interactions vaisseaux –cerveau- débit sanguin fait qu’il est fondamental d’étudier ces anomalies sur l’animal vivant, soumis à l’ensemble des systèmes régulateurs, de façon parfaitement intégrée. De plus, la complexité de ces interactions fait qu’on ne sait pas modéliser correctement ce système in vitro. Pour ces raisons, nous ne pouvons pas substituer au modèle animal un modèle in vitro ou computationnel.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux, seules les expériences considérées comme absolument indispensables seront réalisées. Les mêmes animaux seront utilisés pour étudier différents aspects de la symptomatologie des maladies des petits vaisseaux cérébraux. Plus spécifiquement, les mêmes animaux seront utilisés pour examiner l’équilibre et la cognition de l’âge de 2 à 12 mois et la présence de lésions des vaisseaux et du cerveau à 12 mois. Comme il n’est pas recommandé de réaliser chez la même souris 2 tests cognitifs distincts qui requièrent plusieurs semaines d’apprentissage et que les modalités de conservation du cerveau prélevé après la mise à mort pour l’analyse des lésions en histologie et en immunohistochimie sont très différentes de celles requises pour l’étude en IRM qui requière le prélèvement de la tête entière, nous utiliserons une première série d’animaux chez lesquels seront analysés les processus attentionnels et les lésions du cerveau en IRM et une deuxième série d’animaux chez lesquels seront analysés la flexibilité comportementale et les lésions du cerveau en immunohistochimie. De plus, les analyses en histologie et en IRM seront réalisées de façon séquentielle. Nous commencerons pour chaque modèle par l’analyse des souris de 12 mois. L’analyse des souris âgées de 6 mois ne sera effectuée que si nous détectons des lésions à 12 mois ; idem pour les souris âgées de 2 mois qui ne seront analysées que si nous détectons des lésions à 6 mois. Nous ne pouvons pas fournir de calcul de puissance puisque les souris avec les génotypes décrits dans cette saisine n’ont encore jamais été explorées avec les tests proposés dans cette saisine. En revanche, nous avons calculé la taille des échantillons en nous basant sur des jeux de données collectées au cours d’expériences précédentes similaires mais avec des souris de génotype différent. 10 Males et 10 femelles par groupe sont suffisants pour détecter la présence de lésions en histologie ou en IRM. 20 males et 20 femelles par groupe sont suffisants pour détecter la présence de troubles de l’équilibre ou de la cognition.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe sociaux dans des cages enrichies afin d’éviter le stress lié à l’isolement. Les injections intragastriques sont réalisées, entre jour 1 à 3 après la naissance quand l’estomac des souriceaux est facilement identifiable du fait de sa couleur blanchâtre et avant l’apparition de la pigmentation de la peau. La restriction alimentaire, nécessaire pour la réalisation de certains tests du comportement, aura pour objectif d’obtenir une réduction du poids de la souris de 15% par rapport à son poids initial. Elle sera étroitement surveillée par la pesée quotidienne de la souris et l’apport de nourriture sera adapté individuellement afin de maintenir le poids à 85% du poids initial. La durée de la restriction alimentaire n’excédera pas 2 mois et ne sera renouvelée au maximum qu’une fois. Les injections intraveineuses seront réalisées sous analgésie. La mise à mort sera effectuée sous analgésie et anesthésie générale profonde. Nous veillerons au bienêtre des animaux en mettant en place une grille de score et en utilisant des points limites adaptés, un arbre décisionnel et des critères d’arrêt de souffrance. Tout signe de douleur, souffrance, angoisse ou stress chez les animaux sera soulagé au préalable avec des analgésiques.

Choix des espèces

La souris est un animal vertébré chez lequel, d'une part, l'organisation du système vasculaire cérébral est assez proche de l'homme et d'autre part les manipulations génétiques sont aujourd’hui réalisables. Ces manipulations génétiques sont indispensables pour la réalisation de ce projet. Elles permettront de déléter des populations spécifiques de cellules murales vasculaires. La majorité des animaux utilisés seront des souris jeunes âgées de 2 mois à souris âgées de 12 mois car il est nécessaire de pouvoir analyser la progression des lésions au cours de la maladie. Un nombre limité d'animaux seront analysées à l’âge de 18 jours afin de valider le modèle expérimental.

1 552 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur provoque un AVC par application de chlorure de fer sur une artère cérébrale, suivi d'une IRM sous anesthésie, de tests comportementaux non détaillés et d'une ponction cardiaque terminale. Le porteur indique que le modèle entraîne un déficit sensorimoteur et des lésions cérébrales, avec pertes d'équilibre et faiblesse musculaire possibles. Il juge "indispensable" de développer de nouvelles stratégies face à un traitement actuel inefficace sur les caillots riches en plaquettes.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de tester quatre stratégies thérapeutiques dont leurs mécanismes d’action est susceptible d’agir sur différentes phases de l’AVC : la phase aigüe (24h) pour limiter la lésion et la phase inflammatoire qui s’installe les jours suivants. L’effet de nos quatre stratégies thérapeutiques seront évalués en utilisant un modèle d’AVC thrombotique chez la souris par administration intrapéritonéale (i.p), par administration intra veineuse ou bien par voie orale (per-os), pour chaque traitement. Nous chercherons également à comparer l’effet de ces stratégies thérapeutiques à 3 doses différentes afin de déterminer laquelle permet d’obtenir une réduction du déficit moteur ainsi que du volume lésionnel.

Bénéfices attendus

L’accident vasculaire cérébral (AVC) est une pathologie neurologique survenant après l’occlusion d’une artère irriguant le cerveau. Actuellement, la prise en charge des patients à la phase aigüe de l’infarctus cérébral est réalisée par l’injection intraveineuse de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) associée ou non à la thrombectomie. Cependant, le tPA n’a aucune efficacité sur un caillot riche en plaquettes. Ainsi, il parait indispensable de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes visant à traiter efficacement cette pathologie. L’objectif de ce projet est de tester quatre stratégies thérapeutiques par 3 voies d’administrations différentes afin d’étudier la diminution des volumes lésionnels ainsi que l’augmentation de la récupération fonctionnelle après un AVC. Ces stratégies thérapeutiques sons susceptibles d’agir sur la lyse d’un caillot riche en plaquettes. Nous utiliserons donc un modèle d’infarctus cérébral thrombotique qui reproduit au mieux la physiopathologie de l’AVC permettant une meilleure transposabilité des résultats obtenus vers la clinique.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie au niveau de la tête afin de pouvoir appliquer une solution de chlorure de fer (FeCl3 ; 20 %), provoquant ainsi l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (ACM). Cet acte chirugical durera 20 minutes. La pose d’un cathéter en veine caudale sera nécessaire pour l’infusion des traitements. Une moyenne de 5 minutes est à prévoir pour cette pose. A J+1, ces mêmes animaux seront passés à l'IRM sous anesthésie générale pour une durée totale de 11 minutes et suiveront une série de test comportementaux s'étalant de J+1 à J+14 post AVC. Un total de 56 minutes est prévu pour l'ensemble des tests comportementaux. Enfin, à la fin du projet, un prélèvement de sang par ponction cardiaque sera réalisé avant perfusion permettant la fixation du cerveau avant prélèvement. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes pour la perfusion puis 10 minutes minutes pour les différents prélèvements. Les procédures douloureuse (chirurgie, perfusion) seront réalisées sous anesthésie générale associée à une analgésie.

Impact sur les animaux

Le modèle, par définition, reproduit les effets d’un AVC à savoir : déficit sensorimoteur et lésions cérébrales. Cela peut occasionnellement entraîner des pertes d’équilibres et une faiblesse musculaire des membres opposés à la lésion. Néanmoins, le modèle utilisé ici affecte une région du cerveau ne causant pas d’effets délétères sur le long terme : l’animal peut continuer à s’alimenter, s’abreuver ou encore se fabriquer un nid.Nous pouvons nous attendre à déceler sur certains animaux des signes de complications et de détresse postchirurgicales tels qu'une absence de réaction aux stimuli, une inactivité de l'animal dans sa cage ou encore une perte de poids suite à un arrêt de la prise alimentaire. Les situations précédemment citées définissent nos points limite à appliquer pour ce projet. Nous surveillerons à ce qu'ils ne soient pas dépassés. Aucune nuisances n'est attendues concernant l'administration des traitements, les test comportementaux ainsi que pour l'examen IRM.

Devenir

A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement du cerveau post fixation pour analyse.

Remplacement

Ce projet correspond à l’étape de validation in vivo qui fait suite aux nombreuses validations réalisées in vitro, et ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que de tester ces stratégies thérapeutiques chez l'animal. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature font que la souris est un modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, la souris est une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC ce qui permettra une analyse comparative et critique des résultats obtenus. De plus, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes alternatives pertinentes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.

Réduction

Les données de la littérature ainsi qu’une étude de puissance statistique en amont permettent de nous assurer que nous utiliserons le nombre minimal d'animaux pour pouvoir conclure d’un effet ou non de nos stratégies thérapeutiques. D’un point de vue statistique, nous avons déterminé que le nombre idéal d’animaux par groupe est de 12. En effet, ce nombre est reconnu pour réduire au maximum le nombre d’individus, tout en conservant la pertinence scientifique et la significativité statistique.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE) et isolés de tous bruits extérieurs. Les souris seront en groupes sociaux avec plusieurs enrichissements, auront de la nourriture et de l’eau ad libitum pendant toute la durée du projet. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Pendant les phases chirurgicales, chaque animal sera anesthésié et aura une couverture analgésique administrée 15 minutes avant incision. L’anesthésie générale sera maintenue jusqu’au réveil. Pour limiter les douleurs liées aux barres d’oreilles au niveau du conduit auditif, une anesthésie locale est appliquée. La température corporelle de l’animal est maintenue à 37.5 ± 0.5°C grâce à un système de couverture chauffante rétrocontrôlée, et une couverture isothermique sur son dos limite les pertes de chaleur. Chaque site d’incision de peau fait appel à une tonte préalable du pelage, à une désinfection et enfin l’application d’une analgésie locale. Lors de la phase de réveil,de l'oxygène sera administré pour permettre une meilleure récupération post-opératoire. Les animaux seront placés dans une cage individuelle chauffée à 28°C pendant 2 heures avant d’être remis en cage par 5. Même si la surveillance des animaux s’effectuera en continue, elle sera accrue pendant les premières heures de réveil. Les critères d’arrêt de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse seront pris en compte. Si en période postopératoire, nous constaterons un dépassement des points limites précédemment fixés, l’animal sera mis à mort. Enfin, une surveillance stricte des souris sera réalisée pendant les jours suivants l’opération. Il pèsera chaque animal et veillera à ce que les points limites ne soient pas dépassés.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences et notamment dans le cadre de développement de stratégies de thérapies pharmacologiques. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la protection, la perfusion cérébrale ainsi que le devenir des lésions induites par un AVC thrombotique. Les animaux utilisés seront âgés de 10 semaines soit un poids de 35g pour les SWISS et de 25g pour les C57BL6J. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’AVC.

486 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont irradiées à deux reprises puis reçoivent une transplantation de moelle osseuse et des prélèvements sanguins répétés, pour étudier le vieillissement des cellules souches du sang. Le porteur indique que l'irradiation et la greffe peuvent provoquer des infections et un rejet se traduisant par prostration et grande fatigue. Il affirme qu'aucun système in vitro comparable au corps du mammifère n'existe pour étudier l'hématopoïèse.

Objectifs

Le vieillissement de la population, en particulier au sein de la population occidentale, est aujourd’hui l’un des principaux problèmes socio-économiques. Le vieillissement du système sanguin et en partie de la population de cellules capables de former toutes les cellules du sang, appelée cellules souches hématopoïétiques ou CSH, entraîne un dysfonctionnement de la formation de sang. Ceci accroit le risque de développer diverses maladies malignes du sang telles que la myélodysplasie, un ensemble de maladies caractérisées par une production insuffisante de cellules sanguines matures saines par la moelle osseuse, la leucémie ou encore le lymphome. Au sein de notre laboratoire, nous supposons que le vieillissement "sain" ou "physiologique" est une succession de moments de stress, c’est-à-dire une pression ou contrainte de l’environnement. Nous avons déjà montré que les CSH dépourvues d'une protéine spécifique de la réponse des CSH sont moins activées ; c’est-à-dire qu’elles présentent des défauts dans leur division, et nous pensons donc que ces cellules mutées peuvent conserver leurs caractéristiques de jeunesse. Notre hypothèse est donc de vérifier si des signaux de stress provoquent des changements dans l’ADN ou les ARNm constituant ainsi une signature du vieillissement des CSH.

Bénéfices attendus

L'objectif de cette étude est d’identifier de futures cibles thérapeutiques qui permettront de développer de nouvelles thérapies dans le but d’améliorer la qualité de vie de la population vieillissante.

Procédures

Les souris seront injectées en intra-veineux une, deux ou trois fois (15s environ par injection). Les souris seront irradiées 2 fois à 4 à 6 heures d'intervalle pour une durée de 5 minutes et une irradiation de 5 et 4,5Gy respectivement. Les souris seront également soumises à des transplantation (une par souris receveuse, injection des cellules de 15s environ), et à des prélèvements sanguins (prélèvement de 15s environ, 3 prélèvements sanguins par souris à 4, 8 et 12 semaines post-transplantation).

Impact sur les animaux

Les injections en intra-veineux peuvent induire des rougeurs et des gonflements. La diminution du système immunitaire des souris receveuses de transplantation peut entrainer des infections par une diminution de l’efficacité du système immunitaire. La transplantation peut induire un rejet de greffe qui se traduit par une absence de système immunitaire (donc des infections), une prostration des animaux et une grande fatigue.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure afin d’isoler et d’étudier les cellules souches hématopoïetiques.

Remplacement

Nous avons envisagé la possibilité de modéliser les mêmes processus in vitro. Cependant, il n'existe pas de système in vitro approprié pour étudier l'hématopoïèse, qui soit comparable au corps du mammifère. Seules certaines expériences peuvent être réalisées in vitro, comme les tests d'unités de formation de colonies, que nous allons mettre en place. Par conséquent, les expériences in vivo utilisant des souris sont essentielles.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, chaque groupe contiendra le nombre minimum nécessaire pour la quantité de matériel nécessaire à l'expérience et pour obtenir des résultats statistiquement pertinents. Nous effectuerons 3 répétitions pour vérifier si la variation est importante. Si les deux premières expériences donnent le même résultat, la troisième expérience sera annulée pour réduire le nombre d'animaux utilisés. Concretement dans notre étude, et afin d'obtenir des résultats solides, même en cas d'échec de la prise de greffe (environ 5% de rejet de greffe attendus), nous aurons besoin de 3 répliquats biologiques (donneurs)*3 expériences indépendantes = 9 animaux par condition et par âge. La moelle osseuse isolée de chaque animal donneur sera ensuite injectée dans 3 souris de type sauvage irradiées (receveurs).

Raffinement

Afin de prévenir les infections bactériennes, les souris transplantées recevront un traitement antibiotique dans l'eau de boisson. Lors des prélèvements sanguins une pression sera appliquée sur le site de prélevement pour arrêter l'hémorragie. Les souris seront surveillées pour détecter tout signe d'inconfort 10 à 15 minutes après la procédure. Un manque de soin ou un isolement de l’animal entrainera une surveillance quotidienne. Un deplacement anormal nécessitera l’administration d’eau gélifée et de nourriture directement dans la cage. Une respiration haletante entrainera une surveillance quotidienne. L’animal sera mis à mort dans tous les cas si les symptomes persistent plus de 3 jours. Une perte de poids de plus de 10% sans récupération sur 2 semaines entrainera une vigilance accrue des autres paramètres. Une perte de poids supérieure à 20% entrainera la mise à mort de l’animal. Des rougeurs ou gonflements au niveau des sites de prélèvement ou d’injection entraineront l’utilisation quotidienne de solution antiseptique non colorée. Les animaux seront mis à mort s’il n’y a pas d’amélioration après 3 jours.

Choix des espèces

La souris est le système idéal pour étudier l'hématopoïèse car le système hématopoïétique est hautement conservé entre la souris et l'humain. En outre, le vieillissement du système hématopoïétique est bien défini et l'approximation des âges pertinents entre les humains et les souris est connue. Enfin, la capacité d'isoler les cellules souches hématopoïétiques (CSH) de la souris est bien définie et les CSH peuvent être préservées dans un système normal où elles sont situées dans leur niche et peuvent donc conserver leur quiescence (état de repos). Les procédures telles que la transplantation sont également réalisables chez la souris puisque des protocoles sont en place et utilisés en routine. Les animaux utilisés pour les expériences de vieillissement seront jeunes (6-12 semaines), d'âge moyen (10-14 mois), ou âgés (18-24 mois) ces âges simulant respectivement les systèmes humains jeunes, d'âge moyen et âgés. Les souris receveuses de la transplantation seront quant à elles toutes agées de 3 mois (âge idéal pour une transplantation optimisée). Une attention particulière sera portée aux groupes, afin d'équilibrer autant que possible les âges dans chaque expérience.

600 anguilles vont être utilisées puis relâchées près de leur lieu de capture, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Capturées par pêche électrique, elles reçoivent sous anesthésie une puce RFID implantée chirurgicalement, pour suivre leur comportement migratoire. Le porteur indique que la pêche électrique peut provoquer des blessures spinales et une gêne cardiorespiratoire, et le marquage un saignement et une douleur post-opératoires brefs. Il justifie l'étude par la protection d'une espèce en "danger critique d'extinction", dont la migration reste mal connue.

Objectifs

L'approche RFID vise à étudier le comportement migratoire des anguilles (Anguilla anguilla) de Méditerranée. L'objectif est d'identifer les facteurs environnementaux qui stimulent cette migration, ainsi que le périodes clefs où elle est susceptible de survenir. Ces connaissances permettront de prendre des mesures de gestions plus efficaces pour protéger cette espèce en "Danger critique d'extinction".

Bénéfices attendus

Une meilleure connaissance du comportement de migration permettra de mieux identifer les périodes clefs où elle survient, et quels sont les paramètres qui la déclenchent. Une mortalité importante des futurs géniteurs de cette espèce est observée lors de cette migration, en particulier lors du passage par les turbines d'ouvrages hydroélectiques. L'identification de périodes clefs de migration permettra donc aux exploitants d'adapter efficacement leur gestion en période critique de migration.

Procédures

Capture par pêche électrique de tous les individus (environ 20-30 minutes), puis sédation/anesthésie profonde (5-10 minutes), puis Intervention chirurgicale avec implantation d'une puce RFID 23 mm (environ 1 minute), suivi d’un réveil et de la remise en contact avec les congénères dans un bac de stabulation (environ 1h30 en observation).

Impact sur les animaux

Nuisances induites classiquement par la pêche électrique sur les espèces piscicoles : blessures spinales / infleunce sur le rythme cardique et respiratoire / stress et changement de comportement. Nuisance induite par l'anesthésie et la biométrie : stress des individus Nuisance induite par le marquage : saignement léger lors de l'incision, stress et douleur/gêne post-opératoire de courte durée (le poisson retrouve très rapidement un comportement de nage normal).

Devenir

Toutes les anguilles capturées sont relachées dans le milieu naturel, à proximité immédiate de leur lieu de capture.

Remplacement

L'étude vise à étudier le comportement d'individus sauvage dans leur milieu naturel. De plus, l'Anguille est le seul migrateur amphihalin à se reproduire en mer. Il n'est donc pas possible de remplacer cette espèce par une autre ou de trouver un substitut.

Réduction

Le marquage a été à un total de 600 individus sur la durée du projet. Cette approche permet de limiter l'impact sur le milieu, tout en assurant un nombre d'individus suffisant pour que les résultats soient exploitables sur le plan scientifique.

Raffinement

Avant et après le marquage, de l'enrichissement est proposé aux animaux pour limiter leur stress durant leur stabulation (blocs pour se cacher, recouvrement des bacs pour un maintien dans l'obscurité).

Choix des espèces

L'anguille européenne est un migrateur amphihalin dont les modalités de reproduction sont mal connues. En Méditerranée, le déclenchement du comportement migratoire de cette espèce vers son aire de reproduction est mal connu. Les anguilles marquées sont des "anguilles jaunes" (stades FI, FII), des anguilles jaunes en cours de métamorphose (stades FIII, FIV), et des anguilles argentées (Stades FV (femelles) / MD (mâles)) Tous ces stades sont des morphotypes plus ou moins agés, qui appartiennet à la même espèce : Anguilla anguilla.

90 mulets sauvages, de deux espèces, vont être utilisés puis relâchés sur leur lieu de capture, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pêchés en milieu naturel, ils sont marqués d'une puce sous anesthésie puis soumis à des tests de nage en courant, de prise de risque face à un prédateur et d'exploration en labyrinthe. Le porteur indique que les manipulations peuvent entraîner une perte d'écailles et un risque d'infection, limités par l'anesthésie. Il justifie le recours à l'animal par l'étude du comportement d'individus sauvages, qu'aucun modèle ne pourrait selon lui prédire.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de comprendre comment la variabilité comportementale individuelle impacte la structure de groupe, qu’elle corresponde à une agrégation c’est à-dire un regroupement d’individus sans organisation de nage précise ou à un banc qui correspond à un groupe hautement polarisé, chez les mulets. Les différentes espèces de mulets métropolitaines se répartissent largement sur les espaces côtiers, habitats les plus propices à leur régime alimentaire de type limnivore (se nourrissant à partir de matières organiques présentes dans la vase). Ce sont les dernières espèces migratrices de l’eau salée à l’eau douce à l’instar du saumon atlantique, de l’anguille européenne, des aloses et des lamproies, dont le statut de conservation n’est pas encore dégradé. Une meilleure compréhension de leurs stratégies de déplacement apparaît particulièrement pertinente pour expliquer leur résilience. L’objectif de cette étude est donc basé sur l’existence d’une variabilité dans la structure de groupe chez deux espèces proches Chelon ramada (mulet porc) et Chelon labrosus (mulet lippu) pouvant se déplacer en groupe mono- et plurispécifiques. Après avoir étudié les capacités métaboliques de ces deux espèces lors de notre expérimentation précédente, cette nouvelle étude aura pour but de poursuivre l’exploration des mécanismes proximaux pouvant expliquer ces structures de groupe différentes : la variabilité comportementale interindividuelle. L’expérimentation se fera sur des poissons issus du milieu naturel et durera trois mois. A l’issu de l’expérimentation les poissons seront relâchés sur le lieu de capture. A l’heure actuelle, le Chelon ramada est intégré dans les plans d’actions de gestion des poissons migrateurs en raison du manque de connaissances biologiques et écologique de cette espèce. Ce projet apportera des informations essentielles sur la biologie de ces deux espèces afin de prévenir une baisse future des stocks déjà observable à l’heure actuelle chez toutes les autres espèces migratrices.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettrait d’obtenir pour la première fois des données sur l’impact de la variabilité comportementale interindividuelle sur la structure de groupe chez les juvéniles de mulets. Fort de notre précédente expérimentation, nous savons que la structure de groupe entre Chelon ramada et Chelon labrosus est différente et par conséquent nous pourrons caractériser le niveau d’implication de la personnalité dans les différentes réponses comportementales observées à l’échelle du groupe. Très longtemps négligée, car difficile à étudier, la variabilité interindividuelle est au cœur de la structure d’un groupe. En effet, nous pourrions prédire qu’une agrégation laisserait davantage les personnalités individuelles s’exprimer tandis que le banc amènerait à une décision collective. De plus, une perturbation extérieure telle que la présence d’un prédateur pourrait modifier la structure de groupe. Par conséquent, ces résultats ouvriraient de nouvelles perspectives d’étude afin d’aller plus loin dans la compréhension de la biologie de ces deux espèces de mulets et de l’étendre à d’autres espèces migratrices particulièrement menacées.

Procédures

Les poissons seront pêchés au verveux (filet pliant en forme de longue nasse en entonnoir posé sur le fond) ou à la seine (filet encerclant et trainant à la surface) en milieu naturel puis transportés dans des viviers de 500 L contenant l’eau du milieu naturel et oxygénée à l’aide d’un bulleur jusqu’à l’animalerie. A leur arrivée, une acclimatation par remplacement progressif de l’eau (500 L en 2h) du milieu naturel par l’eau des bassins sera effectué. Une fois acclimaté, les poissons seront installés dans les bassins. Les poissons seront marqués une fois avec une puce permettant l’identification individuelle à l’aide d’un lecteur. Chaque mois pendant trois mois, les poissons seront pêchés à l’aide d’une épuisette à fine maille afin de réaliser des contrôles de croissance. Le marquage et le contrôle de croissance nécessitant une sortie de l’eau, les poissons seront anesthésiés dans un bain de sédatif. Les poissons seront soumis à une procédure consistant à quatre tests. Ils passeront tout d’abord dans un canal avec du courant par groupe de dix poissons afin de mesurer la structure de chaque groupe pendant 10 minutes, puis ils seront confrontés à un test de prise de risque où les poissons par groupe de dix seront placés dans une boîte noire puis il leur sera laissé la possibilité de sortir dans une zone lumineuse pendant 15 minutes en présence ou non d’un prédateur (bar, Dicentrarchus labrax) et enfin chaque poisson, individuellement sera passé dans un labyrinthe pendant 15 minutes afin de mesurer ses capacités exploratoires et son audace. Enfin, en fin d’expérimentation, les poissons seront relâchés en milieu naturel. Ils seront donc pêchés des bassins, placés dans des viviers de 500 L, amenés sur sites, acclimatés à l’eau du milieu naturel (remplacement de 500 L en 2h) puis libérés dans le milieu.

Impact sur les animaux

Lors de la pêche et du transport des animaux, la phase critique correspond au changement de milieu (du milieu naturel vers les bassins) dû aux modifications des paramètres physico-chimiques de l’eau. Pour éviter ces problèmes, d’après les expérimentations précédentes sur ces espèces dans notre laboratoire, une acclimatation avec un remplacement progressif de l’eau permet une habituation douce et ainsi d’avoir 100 % de survie. Le transport ne pose aucun problème, aucune mortalité n’a été observée chez ces deux espèces. Fort de nos expérimentations précédentes sur ces deux espèces, nous ne prévoyons aucun problème une fois les animaux mis en élevage dans l’animalerie. Toutefois, il est envisageable qu’un individu refuse de s’alimenter entrainant une perte de poids. Les mulets étant des individus vivant dans des zones turbides, la mise à disposition de refuges dans les bacs limitera le stress et les comportements anormaux (fuites rapides à l’approche d’une personne). Concernant le marquage individuel, nous avons 100 % de réussite, n’entrainant aucune infection ni aucune mort. Enfin, nous pouvons envisager que certains individus puissent développer une maladie due à la perte d’écailles liée aux manipulations. Afin de limiter la perte d’écailles les poissons sont toujours manipulés à l’aide d’une épuisette à fine maille et pour des manipulations plus invasives, comme les contrôles de croissance nécessitant une sortie de l’eau, les poissons sont anesthésiés. D’après notre expérience, l’anesthésie permet de limiter la perte d’écailles et donc d’éviter les infections.

Devenir

Tous les animaux seront remis en liberté avec une acclimatation progressive à l’eau du milieu naturelle. Le suivi après la relâche ne sera pas possible car très rapidement les poissons plongent en profondeur et donc ne sont plus visibles en surface.

Remplacement

L’objectif de l’étude étant d’étudier le comportement d’une espèce de Téléostéens il n’est pas possible de remplacer les animaux prévus pour cette expérimentation. Il est donc nécessaire de recourir à des animaux. De plus, il est impossible de modéliser ce comportement car c’est un comportement individuel sur une question qui n’a jamais été posée et par conséquent aucun modèle ne pourra permettre de prédire ce qu’il va se passer.

Réduction

90 mulets porc et lippu (45 Chelon ramada et 45 Chelon labrosus) pour pouvoir tester 9 groupes composés d’espèces (mono- ou plurispécifique) différentes : 3 x (5 Chelon ramada + 5 Chelon labrosus) ; 3 x (10 Chelon labrosus) ; 3 x (10 Chelon ramada). Un groupe est composé de 10 poissons. Le nombre de poissons testés est le minimum pour obtenir des statistiques viables (modèle linéaire réalisé sur le logiciel R permettant d’étudier les interactions statistiques sur le comportement des individus testés) concernant la structure du groupe ainsi que de la composition mono- ou pluri- spécifique. Des tests de puissance préliminaires ont été réalisés permettant de démontrer que l’effectif (n = 90) permettra d’obtenir une réponse précise sur les questions posées dans ce projet. Les triplicats permettent de rendre compte de la variabilité interindividuelle existante au sein des groupes tout en obtenant une moyenne au plus proche de la réalité.

Raffinement

Les mulets étant des individus vivant dans des zones turbides, la mise à disposition de refuges dans les bacs limitera le stress et les comportements anormaux (fuites rapides à l’approche d’une personne). La distribution de la nourriture par un distributeur d’aliment automatique permet d’éviter le stress des poissons lié à la présence d’une personne au-dessus du bassin pendant la prise alimentaire. Chaque jour, une personne sera en charge de vérifier le comportement des poissons (en dehors des périodes de nourrissage). La qualité de l’eau, c’est-à-dire les paramètres physico-chimique (température, salinité, oxygène, nitrite, ammonium, nitrate) seront mesurés une fois par semaine. En cas de mauvaise qualité d’eau (par exemple une concentration de nitrites supérieure à 0,02 mg /L), un changement d’eau sera effectué puis une mesure deux jours après sera reprise pour s’assurer que les poissons sont dans un environnement stable. Le transport de la zone d’élevage à la zone expérimentale (canal hydrodynamique et labyrinthe) sera effectué dans des bacs couverts permettant de placer les individus dans le noir limitant le stress de ces poissons lors du transport. Par ailleurs, entre chaque procédure, une phase de repos (une semaine) sera mise en place. Enfin, l’anesthésie dans un bain de sédatif lors du marquage et des mesures de croissance permettra de limiter tout stress et a montré précédemment, après le réveil, qu’il n’y a aucun comportement de nage anormal et que les individus ont un comportement normal 15 minutes après et un retour à l’alimentation 24h après.

Choix des espèces

Les deux espèces choisies sont : le mulet porc, Chelon ramada et le mulet lippu Chelon labrosus à des stades de juvéniles. Les différentes espèces de mulets métropolitaines se répartissent largement sur les espaces côtiers, habitats les plus propices à leur régime alimentaire de type limnivore. Ce sont les dernières espèces migratrices de l’eau salée vers l’eau douce à l’instar du saumon atlantique, de l’anguille européenne, des aloses et des lamproies, dont le statut de conservation n’est pas encore dégradé. Une meilleure compréhension de leurs stratégies de déplacement apparaît particulièrement pertinente pour expliquer leur résilience. Plusieurs espèces de mulets sont intégrées dans les plans d’actions de gestion des poissons migrateurs en raison du manque de connaissances biologiques et écologique de ces espèces. Ce projet vise à enrichir les connaissances de ces deux espèces et particulièrement l’impact du comportement individuel sur la formation de groupe, présent lors de la migration mer-estuaire. Les mulets utilisés dans cette expérimentation seront des juvéniles. Les mulets sont des espèces à l’âge adulte qui sont très stressées par les manipulations et qui ont besoin d’un espace suffisant pour pouvoir exprimer un répertoire comportemental dit normal. Nous sommes limités en termes d’espace avec les bassins à la station. Le comportement de groupe se met en place très tôt chez ces deux espèces. Il est donc possible de faire cette expérimentation sur des juvéniles. D’un point de vue scientifique et pratique (en termes de manipulation), les juvéniles de mulets apparaissent donc comme le modèle biologique idéal pour répondre aux questions posées.

Les 225 souris utilisées sont des souris NSG, immunodéficientes, qui tolèrent la greffe de cellules humaines. Elles reçoivent par la veine de la queue, éveillées, des cellules cancéreuses stimulées ou non par des vésicules issues de cellules métastatiques, puis passent jusqu'à 20 séances d'imagerie par bioluminescence d'environ 20 minutes. Ces procédures impliquent un niveau de souffrance modéré, les souris pouvant développer tumeurs et micrométastases, et toutes sont tuées à la fin de chaque procédure pour l'analyse post-mortem de leurs organes. Les tests in vitro menés en amont montrent déjà, selon le porteur, le rôle de ces vésicules dans le potentiel métastatique des cellules de cancer du sein, et il conclut : "Nous devons donc avoir recours à un modèle physiologique complet et fonctionnel pour cette dernière étape : le modèle animal."

Objectifs

Les métastases sont responsables de 90% des causes de décès lié au cancer selon l’OMS, et représente un problème majeur de santé publique. En effet, le mécanisme de formation des métastases est très complexe et il n’existe actuellement aucun traitement. La compréhension du mécanisme de formation des métastases constitue donc un enjeu majeur pour identifier de nouvelles cibles et axes thérapeutiques. L’objectif de ce projet vise à comprendre l’impact de vésicules extracellulaires produites par des cellules agressives métastatiques sur la capacité à former des métastases de cellules moins invasives (qui potentialiseraient le pouvoir métastatique des cellules moins invasives). Ce projet implique l’injection de cellules cancéreuses chez la souris afin de pouvoir suivre la formation de micrométastases en réponse à la stimulation aux vésicules extracellulaires ou non. Nous avons montré un effet significatif de ces vésicules extracellulaires sur l’augmentation des capacités invasives in vitro. La présence de ces vésicules dans un modèle in vitro 3D a également été confirmée. Les expériences in vivo nous permettrons de tenir compte de l’environnement complexe de la tumeur intégrée dans un organisme entier. Seules les expériences in vivo nous permettront de valider notre hypothèse.

Bénéfices attendus

A la fin du projet, ces résultats nous permettront de valider que ces vésicules sont impliquées dans la formation de métastases. A des fins thérapeutiques, ces vésicules pourront par la suite être ciblées par des traitements visant à réduire la formation de métastases aujourd’hui largement responsable de la gravité des cancers et des rechutes. Grâce à cette étude, nous pourrons apporter des bénéfices sur la meilleure compréhension des cellules à former des métastases mais aussi une nouvelle cible thérapeutique pour espérer mieux soigner les patients à terme.

Procédures

Greffe par voie caudale sur animaux vigiles (une fois par procédure, moins de 5 minutes) Imagerie par bioluminescence ( 1 à 2 fois par semaine ou tous les 15 jours en fonction de la procédure et en fonction du développement tumoral obtenu soit au plus 20 fois -durée de la séance d'imagerie : environ 20 minutes)

Impact sur les animaux

Les souris pourront développer des tumeurs et des micrométastases. Des points limites suffisament précoces ont été établis pour limiter ces nuisances au maximum.

Devenir

Tous les animaux seront sacrifiés à la fin de chaque procédure afin de réaliser l'analyse post-mortem des différents organes qui présenteront des micrométastases.

Remplacement

Tous les tests cellulaires in vitro réalisés en amont de cette étude montrent le rôle important de ces vésicules dans la tumorigénicité des cellules de cancer du sein et notamment dans le potentiel métastatique. Cependant, les tumeurs sont des modèles intégrés qui font intervenir un grand nombre de mécanismes physiologiques et de tissus avoisinants qui ne peuvent être modélisés in vitro. Nous devons donc avoir recours à un modèle physiologique complet et fonctionnel pour cette dernière étape : le modèle animal.

Réduction

Une expérience pilote nous permettra de déterminer le nombre nécessaire et suffisant à la greffe tumorale. Nous combinerons nos lots témoins dans le but de restreindre le nombre d'animaux. La croissance tumorale sera suivie de manière longitudinale tout au long de l'expérience notamment grâce l’expression de la luciférase dans nos cellules, système très sensible qui nous permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux nécessaires par lot pour détecter 50% de différence inter lots avec 50% d’écart type intra lot est de 10, les expériences seront réalisées en duplicat et des tests statistiques seront effectués.

Raffinement

Le bien-être de nos animaux sera pris en compte de leur naissance à leur mort, les animaux seront hébergés en groupe et l'enrichissement de leur milieu de vie sera systématique. Les animaux recevront une surveillance quotidienne et des soins adaptés (administration d’analgésiques et anesthésiques en pré et/ou postopératoire, mesure hebdomadaire du poids des souris et du volume tumoral, définition de points limites suffisamment précoces et mise en place de critères d’arrêt). Les cellules greffées exprimeront la luciférase ce qui permettra de détecter l’apparition de cellules tumorales très précocement permettant ainsi d’améliorer le bien-être animal par une prise en charge plus rapide.

Choix des espèces

Nous avons choisi de réaliser nos expériences sur des souris immunodéficientes, en particulier sur des souris NSG, qui permettent la greffe de cellules humaines Les souris seront utilisées à l'âge adulte de 8 semaines à 12 semaines de vie. À cet âge la taille de la souris facilite la manipulation expérimentale et l´inoculation de cellules.

131 chiens vont être utilisés, dont 81 chiots qui subissent chacun, sur environ 33 semaines, trois ouvertures de l'abdomen par une large incision sous anesthésie générale pour des biopsies intestinales, douze biopsies de peau et huit prises de sang. Dès six semaines d'âge, ces chiots reçoivent de la cacahuète deux fois par semaine pendant sept semaines, par la bouche ou sur une peau dont la couche la plus superficielle est rompue par des calques cutanés, puis une prise orale censée déclencher l'allergie, avec la possibilité, écrit le porteur, d'une éruption, d'un gonflement sous la peau, "voire d'une réaction allergique importante". Environ six mois plus tard vient une sensibilisation par la peau "jusqu'à obtention d'un eczéma", et les 50 chiens adultes subissent la même application d'allergène sur peau fragilisée, dans des procédures que le porteur classe à un niveau de souffrance modéré. Tous restent en vie et sont déclarés réutilisés, certains pouvant aussi "entrer dans un programme d'adoption" selon le porteur, qui cite parmi les bénéfices la possibilité "de diminuer les frais pour les propriétaires car ces croquettes sont très onéreuses".

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont multiples : 1) Déterminer le rôle et les mécanismes de sensibilisation à travers la peau d’allergènes alimentaires chez le chien. 2) Evaluer la possibilité de rétablissement de la tolérance aux allergènes alimentaires chez les chiens allergiques. 3) Explorer les risques de rupture de la tolérance, induite par contact précoce digestif, par pénétration des allergènes par voie cutanée chez les chiens tolérants. 4) Déterminer si des modifications des micro-organismes présents au niveau digestif ou cutané, sont associées à la sensibilisation à des allergènes alimentaires et à l’allergie alimentaire. 5) Evaluer si la composition des micro-organismes présents au niveau digestif ou cutané est modifiée par la sensibilisation à des allergènes alimentaires ou l’allergie alimentaire, et déterminer si ces modifications sont réversibles. 6) Identifier des biomarqueurs de la sensibilisation à des allergènes, présents dans la couche cornée. 7) Comparer ces résultats avec les mêmes paramètres évalués à partir des modèles expérimentaux de dermatite atopique canine.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet seront, en plus de la connaissance scientifique sur les mécanimes pathogéniques de ces allergies (dermatite atopique et allergie alimentaire), d’en améliorer la prise en charge. En effet, aujourd’hui, l’éviction alimentaire (croquettes hypo / anallergéniques strictes) semble la seule méthode de diagnostic fiable d’allergie alimentaire, qu’elle soit associée à une dermatite atopique ou pas. Nous souhaitons mettre en évidence des biomarqueurs diagnostiques dans le sang et dans la peau (désensibilisation par immunothérapie) qui évitera la lourdeur d’un régime d’éviction alimentaire et de nombreux dosages d’IgE sériques inutiles car non validés et permettront : 1) d’accélerer la démarche diagnostique et donc la prise en charge de cette dermatose, 2) de diminuer les frais pour les propriétaires car ces croquettes sont très onéreuses. Ces biomarqueurs pourront églement servir lors du suivi thérapeutique. De plus, le modèle actuel d’allergie alimentaire étudié est un modèle murin, très éloigné de l’Homme. Il serait intéressant de montrer une similarité avec notre modèle d’allergie alimentaire canin car le chien est un modèle plus pertinent, de part la proximité qu’il partage avec l’Homme : environnement, alimentation, pression allergénique.

Procédures

Chez chiots (actes étalés sur une période d’environ 33 semaines) : écouvillons cutanés et prélèvements de selles (à 5 reprises, sur animal vigile, sur tous les chiots, la durée de l’acte est de 1 minute à chaque fois), prises de sang (à 8 reprises, sur animal vigile, sur tous les chiots, la durée de l’acte est de 1 minute à chaque fois), biopsies cutanées (à 4 reprises, avec 3 biopsies à chaque fois, sous anesthésie locale, sur tous les chiots, la durée de l’acte est de 20 minutes à chaque fois), biopsies intestinales (à 3 reprises, avec 2 biopsies à chaque fois, sous anesthésie générale par ouverture de l’abdomen par une incision large, sur tous les chiots, la durée de l’acte est de 1 heure à chaque fois entre l’induction de l’anesthésie, l’acte chirurgical et le réveil des animaux). Un test cutané explorant la sensibilisation à divers allergènes sera également réalisé (sur animal vigile, sur tous les chiots, la durée de l’acte est de 15 minutes). Application cutanée de cacahuète ou administration par voie orale en fonction des groupes, à la fréquence de 2 fois par semaine pendant 7 semaines, avec rupture de la peau la plus superficielle via des calques cutanés pour certains groupes (sur animal vigile, la durée de l’acte est d’environ 15 minutes par animal à chaque fois). Chez chiens (actes étalés sur une période d’environ 7 semaines) : prises de sang (à 2 reprises, sur animal vigile, sur tous les chiens, la durée de l’acte est de 1 minute à chaque fois), prélèvements partie superficielle de la peau (à 2 reprises, sur animal vigile, sur tous les chiens, la durée de l’acte est de 1 minute à chaque fois), biopsies cutanées (à 2 reprises, avec 3 biopsies à chaque fois, sous anesthésie locale, sur tous les chiens, la durée de l’acte est de 20 minutes à chaque fois). Application cutanée de l’allergène après rupture de la peau la plus superficielle via des calques cutanés, à la fréquence de 2 fois par semaine pendant 7 semaines (sur animal vigile, la durée de l’acte est d’environ 15 minutes par animal à chaque fois).

Impact sur les animaux

Prises de sang au début de la sensibilisation, puis en fin de sensibilisation 42 jours plus tard, puis environ 15 jours plus tard lors du déclenchement de l’allergie, puis le lendemain, puis environ 3 mois plus tard, puis le lendemain, puis environ 3 mois plus tard, puis le lendemain. Application cutanée de cacahuète ou administration par voie orale en fonction des groupes, à la fréquence de 2 fois par semaine pendant 7 semaines (avec rupture de la peau la plus superficielle via des calques cutanés pour certains groupes). Puis, environ 6 mois plus tard, sensibilisation à travers la peau 2 fois par semaine jusqu’à obtention d’un eczéma lors de la phase de rupture de la tolérance. Biopsies cutanées réalisées par voie sous-cutanée en début de sensibilisation, puis 42 jours plus tard en fin de sensibilisation, puis environ 15 jours plus tard lors du déclenchement de l’allergie, puis environ 3 mois plus tard lors du rétablissement de la tolérance, puis environ 3 mois plus tard lors de la rupture de la tolérance. Biopsies intestinales réalisées lors du déclenchement de l’allergie, puis environ 3 mois plus tard lors du rétablissement de la tolérance, puis environ 3 mois plus tard lors de la rupture de la tolérance. Ces biopsies impliqueront donc une ouverture de l’abdomen par une incision large sous anesthésie générale. La possibilité d’une éruption se manifestant par des plaques rouges au niveau des lèvres, d’un gonflement de zones de tissu sous la peau, voire d’une réaction allergique importante est attendue lors de la phase de déclenchement (administration par voie orale de la cacahuète) et cette réaction sera la preuve de l’allergie alimentaire induite par sensibilisation transcutanée.

Devenir

Après chaque procédure, les animaux seront gardés en vie, car les procédures ne devraient pas impacter l'état de santé des animaux sur le long terme. Le vétérinaire et le directeur d'étude valideront systématiquement le devenir des animaux, en tenant compte de leur utilisation, des leur état de santé, et des possibilités éventuelles de réutilisation. Certains animaux pourront entrer dans un programme d'adoption, en tenant compte de leur utilisation, des leur état de santé, des possibilités éventuelles de réutilisation, et de leur comportement. Il n'est pour le moment pas possible d'anticiper le nombre d'animaux qui seront adoptés.

Remplacement

Une première étude in vitro sur peau reconstruite permet de caractériser l’inflammation induite par le contact avec la cacahuète, mais il n’est pas possible de réaliser la phase de déclenchement (qui consiste à administer l’allergène par voie digestive), d’où la nécessité d’utiliser des animaux vivants. Ce projet repose sur l’étude de la voie d’administration de l’allergène et de la comparaison entre l’induction de tolérance digestive versus la sensibilisation par voie transcutanée, qui n’est possible que sur animaux vivants. Enfin, le projet utilise des animaux vivants car il fait intervenir des réactions locales, régionales et générales, pour lesquelles aucune méthode alternative n’est disponible. Pour atteindre les objectifs du projet, les résultats seront analysés statistiquement.

Réduction

L’étude repose sur la formation de 9 groupes de chiots. Le nombre de chiots nécessaires pour une puissance statistique satisfaisante est de 81. La comparaison avec des modèles expérimentaux de dermatite atopique se fera sur 50 chiens pour avoir un nombre assez proche de chiots et des résultats interprétables.

Raffinement

Période d’acclimatation systématique de 2 à 3 semaines avant le premier acte technique. Animaux hébergés en groupe et avec des jouets. Des points limites adaptés permettront de sortir un animal de l’étude afin de limiter la douleur à son minimum. Actes techniques réalisés par du personnel formé et habitué à travailler avec les chiens, toujours accompagnés de renforcement positif (calins, croquettes). Présence de vétérinaires et surveillance accrue des animaux lors du déclenchement de l’allergie alimentaire. Pour les chiots, des lampes chauffantes seront installées. Paramètres d’ambiance des salles surveillés avec possibilité de modifier la température, afin d’optimiser le bien-être des chiots. Les chiots seront en présence de leur mère jusqu’au sevrage complet. Biopsies cutanées réalisées sous anesthésie locale et biopsies intestinales réalisées sous anesthésie générale, avec observation quotidienne des sites après interventions et prise en charge de la douleur.

Choix des espèces

Chez le chien, l’allergie alimentaire est souvent évoquée, exceptionnellement confirmée, car surtout mal comprise, en particulier chez les chiens souffrant de dermatite atopique. C’est la seule espèce qui présente une dermatite atopique comparable (sur plans cliniques et pathogéniques) à celle de l’Homme. Ce modèle permettra de vérifier les données obtenues uniquement dans le modèle murin expérimental et permettra d’approfondir les connaissances de la dermatite atopique du chien et d’explorer le rôle des allergènes alimentaires, en particulier la voie de pénétration de l’allergène. Utilisation d’animaux vivants car intervention de réactions locales, régionales et générales, pour lesquelles aucune méthode alternative n’est disponible. Le chien est l’espèce cible mais le projet peut, par la suite, servir à l’étude de l’allergie alimentaire chez l’Homme. Le chien est l’espèce idéale pour réaliser un modèle d’allergie alimentaire et de dermatite atopique (de plus, c’est la seule espèce pouvant développer une dermatite atopique de manière spontanée). L’étude s’interesse à une sensibilisation de chiots dès l’âge de 6 semaines pour la comparaison avec l’Homme (les bébés se sensibilisant par voie transcutanée dès la naissance et ayant une diversification alimentaire le plus tôt possible pour induire une tolérance, c’est-à-dire dès 2 mois). Il est donc choisi de commencer à sensibiliser les chiots dès qu’ils commencent une diversification alimentaire et ne se nourrissent plus exclusivement de lait maternel. Ce phénomène se produit à l’âge de 6 semaines chez le chien. Ils seront suivis pendant 2 ans pour la sensibilisation, l’induction de tolérance, la rupture de la tolérance acquise et l’immunothérapie (ce qui renforce le besoin d’animal jeune). Les chiens permettant l’établissement d’un modèle de dermatite atopique seront des jeunes adultes qui seront ainsi comparés aux chiots ayant grandi et pour lesquels l’étape de déclenchement aura eu lieu. Ils présentent, à cet âge, un juste équilibre entre réponse physiologique et acclimatation en étude.