Procédures modérées

990 souris vont être utilisées pour tester des candidats médicaments contre le syndrome métabolique, et une partie d'entre elles n'entre dans le projet qu'à seize semaines, après au moins douze semaines d'humanisation de leur système immunitaire ou de leur foie. Un régime riche en graisse et en sucre doit leur faire développer obésité, diabète et stéatose hépatique, et elles subissent des prises de sang ainsi que des tests de tolérance au glucose et à l'insuline, avec mise à jeun et injection intrapéritonéale, qui durent jusqu'à 13 h 30. Le porteur classe ces procédures à un niveau de souffrance modéré et cite pourtant, parmi les effets possibles, des accidents vasculaires cérébraux, une encéphalopathie hépatique, une ascite et des vomissements de sang. Une souris qui atteint un score clinique de 7 ou perd plus de 25 % de son poids maximal est mise à mort, et toutes les autres le sont en fin d'étude, le porteur écrivant que le protocole induit des "modifications délétères pour la santé de la souris".

Objectifs

L’objectif du projet est de développer un modèle murin de syndrome métabolique, c'est-à-dire une association d'anomalies mêlant dans ce cas obésité, stéatose hépatique non alcoolique (NASH) qui est une pathologie caractérisée par un excès de graisses dans le foie qui n'est pas due à une consommation élevée d'alcool et le développement de diabète qui est donc une résistance à l’insuline. Ce syndrôme sera reproduit grâce à des régimes riche en graisse et en sucre mimant les régimes occidentaux et permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires de cette pathologie et de tester de nouveaux candidats médicaments puisqu'aucune thérapie curative n'est approuvée.

Bénéfices attendus

En basant notre modèle sur des souris ayant un système immunitaire et/ou un foie humanisé, nous mettons à disposition des chercheurs un modèle permettant d'étudier un syndrome métabolique (diabète, NASH, obésité) et des potentiels traitements avec davantage de spécificité pour l’espèce cible de ces recherches : l’Homme.

Procédures

Prélèvements sanguins : la fréquence et les volumes seront déterminés sur base du poids de la souris. La durée des prélèvements est de 10 à 15 secondes. Test de résistance à l’insuline et test de résistance au glucose comprenant une mise à jeun suivie de prise de sang pour analyse de la glycémie et injection intrapéritonéale d’une solution de glucose. Durée totale du test entre 5h30 et 13h30.

Impact sur les animaux

Pour le développement de ce modèle pathologique divers signes cliniques pouvant entraîner un inconfort pourront être observés: en lien avec le développement d’un diabète de type II : polyphagie, polyurie – polydipsie, troubles de la vision, asthénie, pathologie cardio-vasculaires (accident vasculaire cérébral, crise cardiaques), néphropathie, neuropathie, rétinopathie; en lien avec l’obésité: accumulation de graisse viscérale et augmentation du poids pouvant entraîner une difficulté à se mouvoir, pathologie cardio-vasculaire; en lien avec une insuffisance hépatique : état général dégradé, encéphalopathie hépatique, ictère, asthénie, anorexie, ascite, troubles de la coagulation, vomissement (hématémèse), diarrhée (méléna ou hématochésie). Des nuisances peuvent également être induites par les prélèvements sanguins et les injections et les effets potentiellement toxiques de composés à visées thérapeutiques dans un contexte préclinique. Cette douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.

Devenir

Le modèle induisant des modifications délétères pour la santé de la souris, les souris seront mises à mort en fin d'étude.

Remplacement

Il n'est actuellement pas possible de recréer in vitro un environnement qui mimerait le développement d'un syndrôme métabolique (diabète, obésité, NASH) tout en objectivant l’efficacité de molécules agissant, entre autres, sur l’activité du système immunitaire, la mort cellulaire, le stress oxidatif ou les taux d’insuline et de lipides dans le sang. Les modèles murins en général, et plus particulièrement la souris avec un foie et/ou un système immunitaire humanisé(s), constituent donc un modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable au développement et la mise au point de traitements innovants visant à lutter contre cette maladie.

Réduction

Un total de 990 animaux est demandé pour la réalisation de ce projet sur une durée de 5 ans, permettant de réaliser 33 études de 4 groupes (contrôle négatif, contrôle positif, plusieurs doses ou traitements à comparer) avec 5 à 10 animaux par groupe. Le nombre d'animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum en se basant sur les effets attendus de la série, ainsi que des tests statistiques paramétriques et non paramétriques. Les tests in vitro seront envisagés si ceux-ci sont appropriés.

Raffinement

Les souris seront hébergées en cages ventilées, par groupe social stable. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. La cage contiendra une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. Six morceaux de bois permettant aux souris d’exprimer leur comportement de rongeur, ainsi qu’un nid en carton seront également disposés. À leur entrée dans le projet, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation et seront habituées à la présence de l’expérimentateur qui les manipulera régulièrement. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle cumulative de scores (donnés entre parenthèse) prenant en compte : l’aspect du pelage, les mouvements, l’activité, l’activité, la couleur des muqueuses et le score corporel. Les souris seront évaluées quotidiennement et l’échelle sera appliquée dès que nécessaire. Une souris avec un score clinique ≥ à 7 sera euthanasiée pour raison éthique. Le poids sera monitoré 1 à 3 fois par semaine. Le suivi de l’évolution pondérale pourra être adapté au stade de l’étude. Une perte de plus de 25%, calculée à partir du poids mesuré le plus élevé, sera considérée comme une raison de mise à mort. Une augmentation importante du poids et une obésité entraînant une invalidité sera aussi considérée comme une raison de mise à mort. Le vétérinaire d’établissement aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire.

Choix des espèces

L'utilisation de modèles murins dans les syndromes métaboliques a déjà été démontré dans la littérature scientifique. Par ailleurs, nous maitrisons l'humanisation du système immunitaire ainsi que l'humanisation du foie chez les souris. En se basant sur cette expertise, il est essentiel de poursuivre avec cette espèce. Les animaux seront utilisés à partir de l'age de 16 semaines pour les animaux humanisés, ceci prenant en compte une période d'humanisation de 12 semaines (minimum) qui peut être réalisée à partir de l'age de 3 à 4 semaines. Les animaux non humanisés seront utilisés à partir de l'age de 6 à 8 semaines afin d'utiliser des animaux adultes. Les études seront réalisées sur des groupes d'âges homogènes.

104 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur leur est greffée par injection de cellules cancéreuses, 80 d’entre elles recevant en plus un médicament, la tumeur pouvant atteindre deux centimètres cubes et gêner leurs déplacements avant leur mise à mort pour prélèvement, afin de valider le rôle d’un ARN non codant dans le carcinome rénal. Le porteur indique que des métastases pulmonaires peuvent se former et provoquer une perte de poids et d’appétit. Il affirme que les cultures in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes de la formation tumorale et compte ouvrir une collaboration avec l’industrie pharmaceutique.

Objectifs

Le carcinome rénal à cellules claires (CRCC) est un cancer agressif et malgré le développement de thérapies ciblées et d'immunothérapies, les patients diagnostiqués au stade métastatique ont toujours un mauvais pronostic. Il est donc urgent de trouver de nouvelles cibles pour les tests de diagnostic précoce et pour les traitements de la maladie métastatique. Ce projet vise à démontrer que l'expression d'un ARN long non codant in vivo altère la formation de carcinome des cellules rénales et la progression de métastases, en association avec les traitements déjà existants. Ces preuves ouvriront la possibilité de collaborer avec l'industrie pharmaceutique pour développer des inhibiteurs spécifiques pouvant être testés dans des essais précliniques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra la validation d'une cible pour le traitement du carcinome rénal à cellules claires. Ces preuves ouvriront la possibilité de collaborer avec l'industrie pharmaceutique pour développer des inhibiteurs spécifiques pouvant faire l'objet d'essais précliniques, dans l'objectif final d'identifier de nouveaux traitements pour le carcinome rénal à cellules claires chez l'homme.

Procédures

Toutes les souris seront injectées avec des cellules tumorales (104). L'injection se fait sous anesthésie gazeuse et dure une dizaine de secondes. Les souris de l'étude expérimentale (80) subiront en plus l'administration de médicament 3 fois à 3 jours d'intervalle. Ce traitement supplémentaire est réalisé sur animaux vigiles et dure une dizaine de secondes.

Impact sur les animaux

L'injection de cellules tumorales va provoquer la croissance d'une tumeur primaire à l'endroit de l'injection et potentiellement la formation de métastases distantes, notamment dans les poumons. La tumeur primaire pourra générer un inconfort physique lors des déplacements des souris. Cette tumeur primaire devrait apparataitre à partir de 5 jours suivant injection et croitre assez rapidement. La temps d'atteinte du point limite du volume de 2cm3 est estimé à moins de 3 semaines. Les métastases ne seront pas visibiles mais pourront entraîner une perte de poids, d'appétit et d'autres effets biologiques liés à la perturbation des organes vitaux touchés. Lors des expériences précédentes d'injection de cellules tumorales dans le laboratoire, les souris ont du être sacrifiées du fait de la taille de la tumeur primaire et non d'effets dus aux métastases.

Devenir

Il est prévu de mettre à mort tous les animaux pendant ou à la fin du projet : l'injection de cellules tumorales devant conduire à la formation de tumeurs voire de métastases chez les souris, les animaux seront mis à mort pendant le projet si la taille de(s) tumeur(s) atteint les points limites, en cas de signes de souffrance ou à la fin du projet. Les tumeurs et métastases seront prélevées à des fins d'histologie pour étudier les marqueurs de cancer et la composition des tumeurs ainsi que pour d'autres analyses : séquençage d'ARNs, quantification protéique afin d'évaluer le résultat des différents traitements.

Remplacement

Les procédures expérimentales proposées visent à étudier l’importance d'un ARN non codant dans des conditions de croissance tumorale in vivo. Nous estimons que ces approches sont très importantes et ne peuvent être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation des souris. Les expériences in vitro nous ont permis de valider nos techniques d’expérimentation et d’apporter de premiers résultats encourageants. Cependant, ces méthodes de substitution in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes caractéristiques de la tumorigenèse in vivo et donc ne pourront pas apporter le niveau d'information requis.

Réduction

L'étude se fera en deux étapes : * la première procédure constitut l'étude-pilote de la tumorigénicité des modèles cellulaires utilisés (12 souris par lignée cellulaire, donc 24 souris). * Si l'étude pilote est concluante (les lignées injectées vont entraîner une croissance tumorale), elle sera suivie de la seconde procédure : l'étude expériementale visant à étudier l'effet du médicament sur la croissance tumorale : 80 souris injectées avec les lignées modifiées pour la surexpression de l'ARN non codant et traitées ensuite soit avec le véhicule, soit avec le médicament. Ce nombre représente le nombre minimal de souris pour obtenir un résultat significatif d’un point de vue statistique en tenant compte de l’éventualité de mort précoce. Le nombre total de souris expérimentales sera de 104. Cet effectif correspond au nombre d’animaux nécessaires afin que les résultats obtenus soient exploitables et reproductibles (statistiquement valides).

Raffinement

Des souris femelles seront utilisées : moins agressives entre congénères que les mâles, elles pourront être hébergées en cohorte afin de conserver l’interaction sociale, ce qui confortera le résultat des expériences. Les expérimentateurs établiront le contact avec les cohortes au moins 8 jours avant le début de l’expérimentation pour habituation à la manipulation et réduction de l’angoisse des animaux. Les cages seront agrémentées de coton type « nestlet ». Nous mesurerons la taille de la tumeur au moins deux fois par semaine (lundi et vendredi plus éventuellement le mercredi) à l'aide d'un pied à coulisse tout au long de la croissance tumorale jusqu’à l'atteinte de la taille limite de la tumeur de 2 cm3 par souris. La vitesse de croissance des tumeurs n’est pas connue, nous adapterons donc la période de mesure pour chacune des lignées cellulaires utilisées. Nous surveillerons également quotidiennement l'état des souris après injection des lignées tumorales afin de détecter tout effet dommageable. En cas de souffrance évidente, les souris seront sacrifiées.

Choix des espèces

In vitro, nous avons validé nos techniques expérimentales et obtenu des premiers résultats encourageants. Cependant, ces méthodes in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes caractéristiques de la tumorigenèse in vivo et ne peuvent donc fournir le niveau d'information requis. L'utilisation du modèle de xénogreffe chez la souris ne peut être remplacée par d'autres méthodes expérimentales, il est fiable et facile à manipuler et déjà largement utilisé. De plus, les données que nous produirons à partir de nos tumeurs (cinétique tumorale, séquençage d'ARN, quantifications de protéines) seront comparées à celles collectées par notre laboratoire et nos collaborateurs dans des modèles similaires pour d'autres études. Pour cette expérience d’injection de lignées cellulaires murines sur des souris immunocompétentes, nous ferons correspondre la souche d'origine des lignées cellulaires avec celle des souris réceptrices. Nous utiliserons des souris jeunes adultes de 6 semaines. Le médicament à tester étant un inhibiteur des points de contrôle immunitaires, il convient que sa cible, la population de lymphocytes T, soit à son meilleur stade de développement. A 6 semaines, les souris présentent un système immunitaire développé et fonctionnel, que ne présentent pas des souris plus jeunes. Après cet âge, certaines sous-populations de cellules immunitaires ainsi que la fonction immunitaire globale commence à décliner : la diminution des lymphocytes T naïfs, l'augmentation des lymphocytes T à mémoire dont la fonctionnalité est réduite et la diminution de la diversité de la reconnaissance des antigènes par les lymphocytes T entraînent l'immunosénescence.

80 lézards mâles adultes de deux espèces, capturés dans la nature ou en enclos semi-naturel, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis relâchés sur leur site de capture. Chaque animal subit une restriction d’eau poussée pendant huit jours jusqu’à une forte déshydratation, deux prises de sang et des mesures répétées de course et d’endurance, pour décrire l’effet de la déshydratation sur les performances locomotrices. Le porteur situe les retombées du côté de la prévision des effets du réchauffement climatique et de la sécheresse. Il fixe un point limite à 30 % de perte de masse et affirme que ces mesures sur animal vigile ne peuvent être remplacées par des modèles cellulaires ou informatiques.

Objectifs

Chez les ectothermes terrestres, le maintien de performances optimales suppose une régulation fine de la température corporelle et de l’état d’hydratation individuel. D’une part, les performances augmentent généralement avec la température avant de décliner brutalement auprès de la limite thermique critique maximale. La thermorégulation comportementale assure le maintien des températures corporelles autour de la gamme de ces températures optimales. D’autre part, les performances déclinent avec l’état de déshydratation. L’hydrorégulation comportementale assure le maintien d’un état d’hydratation optimal de l’organisme en fonction des besoins saisonniers ou du cycle de vie. Des travaux sur les amphibiens ont démontré que leurs capacités locomotrices chutaient après un seuil de déshydratation de l’ordre de 10-30% de perte de la masse corporelle. De plus, chez certaines espèces, la déshydratation influence la sensibilité thermique des performances en diminuant l’optimum thermique, la largeur de la niche thermique ou la limite thermique critique maximale. Cependant, il reste encore à mieux comprendre tous les facteurs qui expliquent les variations entre espèces et entre traits. Les ectothermes terrestres à peau sèche comme les reptiles sont aussi sensibles à la déshydratation même s’ils sont beaucoup plus résistants que les amphibiens. La déshydratation corporelle peut provoquer chez ces organismes la mort mais peut aussi engendrer des effets sub-létaux comme des réallocations d’énergie. L’analyse des relations entre déshydratation et performance chez ces espèces est encore très parcellaire. Aucune étude n’a quantifié les effets d’interaction de l’eau et de la température sur les performances locomotrices des reptiles. Cependant, une publication récente démontre une baisse de la tolérance thermique chez les lézards déshydratés. Ce projet vise donc spécifiquement à décrire la relation entre déshydratation et courbes de performance thermique de la locomotion chez deux espèces de lézards sensiblement différentes dans leurs adaptations thermiques à savoir le lézard vivipare (Zootoca vivipara) et le lézard des murailles (Podarcis muralis).

Bénéfices attendus

Les espèces sauvages de reptiles sont soumises à un double stress du changement climatique à savoir le réchauffement climatique et des évènements plus fréquents et plus prolongés de sécheresse. La capacité à prédire l’impact de ces changements climatiques dépend d’une bonne compréhension des effets interactifs de l’état d’hydratation et de la température corporelle sur les performances de ces espèces ectothermes. Les capacités locomotrices sont un indicateur des performances des animaux pour s’alimenter, se reproduire ou éviter les prédateurs, et ce projet va donc permettre pour la première fois de (1) quantifier le seuil de tolérance hydrique des capacités locomotrices chez deux espèces de lézards, et (2) de vérifier si une déshydratation impacte la tolérance thermique de ces espèces, en supposant que les animaux tolèreront moins des températures élevées s’ils sont déshydratés. Ces travaux permettront par ailleurs de mieux qualifier les seuils critiques de déshydratation chez ces deux espèces et donc d’améliorer notre suivi du bien-être animal dans les conditions d’élevage dans le futur.

Procédures

L'étude sera effectuée successivement sur 40 mâles adultes de deux espèces de lézards dont une espèce (lézard vivipare) prélevée dans des enclos semi-naturels en captivité et une autre espèce (lézard des murailles) prélevée en milieu naturel, soit 80 animaux au total. Après la capture, les animaux seront maintenus en acclimatation dans des cages individuelles pendant une semaine. Ils seront ensuite mesurés pendant une journée, transférés en habituation dans des grandes cages par paire et maintenus pendant deux jours d'acclimatation puis exposés soit à des conditions d'alimentation et d'eau ad libitum soit à des conditions expérimentales avec restriction de l'eau pendant 8 journées (10 individus dans le lot témoin, 30 dans le lot expérimental par espèce). Au début et à la fin de la période de manipulation, une prise de sang de 20 ul sur animal vigile sera effectuée pour quantifier l'osmolalité plasmatique (geste impliquant une contention de 2-3 minutes). Au début, au bout de 3-4 jours, puis au bout de 7-8 jours de manipulation, les performances locomotrices de sprint et d'endurance seront mesurés sur chaque animal à chaque fois pendant une journée. Après la manipulation, les animaux seront maintenus en cage individuelle dans des conditions d'alimentation et d'eau ad libitum pendant une semaine puis relâchés sur leur site de capture d'origine.

Impact sur les animaux

Nos protocoles sont choisis pour permettre de comparer des animaux dans des lots témoins (nourriture et eau ad libitum) à des animaux soumis à une restriction hydrique forte pendant 8 jours. Il s’agit d’une période courte de déshydratation qui reste écologiquement réaliste à la lumière de nos travaux précédents et des observations en conditions naturelles. Nous anticipons que les animaux soient faiblement déshydratés après 3-4 journées d’expérimentation puis fortement déshydratés après 8 journées, mais cet état est réversible et les animaux seront ensuite tous maintenus avec eau et alimentation ad libitum à la fin de l’étude. L’autre source de nuisance sera les mesures répétées de vitesse de sprint et d’endurance. Ces procédures induisent seulement un stress ponctuel au moment de la manipulation et éventuellement une fatigue des animaux. Les mesures de sprint seront effectuées plusieurs fois la même journée mais espacées d’une heure ce qui est suffisant pour permettre la récupération. Les mesures d'endurance seront effectuées sur plusieurs journées mais très espacées et après les mesures de sprint. Toutes ces procédures expérimentales sont pour l’essentiel non invasives en dehors de deux prises de sang qui sont très bien tolérées par les animaux adultes. Les lézards sont aussi très tolérants à la mise en élevage dans les conditions de captivité de ce projet et à la manipulation par un expérimentateur.

Devenir

Les animaux sont tous relâchés dans les enclos semi-naturels donc replacés en captivité dans des conditions extérieures proches du milieu naturel.

Remplacement

Cette étude consiste à mesurer sur des animaux vigiles les performances locomotrices en fonction de la température et l'hydratation, et elle ne peut donc se pratiquer avec des équivalents cellulaires, des modèles in silico ou des robots.

Réduction

Un échantillon très réduit d’animaux sera utilisé pour quantifier les conséquences de la déshydratation sur les performances locomotrices (40 individus maximum par espèce, 80 individus au total). Afin de réduire le nombre d'animaux, nous effectuerons trois mesures répétées sur chaque animal avant la manipulation, après une déshydratation faible et après une déshydratation plus forte. On exploitera cette gamme temporelle, exprimée à l'échelle individuelle par la perte de masse, pour quantifier la relation exacte existant entre déshydratation individuelle et performances locomotrices. Ainsi, le nombre de lots expérimentaux sera réduit. De plus, un échantillon minimum pourra être utilisé en étudiant uniquement une seule classe d'âge (adulte) et de sexe (mâle) ce qui permettra de réduire la variabilité initiale entre lézards et la prise en compte de covariables associées au plan expérimental.

Raffinement

On raffinera les conditions d'élevage grâce à un enrichissement des cages (utilisation d'abris, de zones de thermorégulation et d'un susbtrat pour les comportements fouisseurs) et à l'utilisation de conditions climatiques optimales du milieu naturel pour l'été (cycle thermique jour et nuit, éclairage optimale pendant la journée avec des conditions de lumières enrichies en UV) en dehors du stress de déshydratation. Des points limites associés à la perte de masse (perte de masse supérieure à 30% de la masse initiale ad libitum) seront appliqués avec arrêt des procédures expérimentales en cas de dépassement du point limite et basculement des conditions d'élevage des animaux vers des conditions d'alimentation et d'eau optimales ad libitum si les points limites sont dépassés.

Choix des espèces

Ce projet vise spécifiquement à décrire la relation entre déshydratation et courbes de performance thermique chez deux espèces de lézards sensiblement différentes dans leurs adaptations thermiques à savoir le lézard vivipare (Zootoca vivipara) et le lézard des murailles (Podarcis muralis). Le lézard vivipare est une espèce typique des milieux froids et humides et présente des taux de pertes hydriques cutanées élevés par rapport aux autres espèces de lézards du même groupe. Le lézard des murailles est une espèce saxicole qui affectionne les milieux plus chauds et plus secs et est plus résistant à la déshydratation. Le comportement des deux espèces est sensible à la déshydration ; notamment, il a été démontré pour le lézard des murailles des effets de la disponibilité en eau de boisson sur les préférences thermiques et les limites critiques maximales. Les animaux utilisés seront des animaux mâles adultes en bonne santé sur lesquels il est possible de faire des prises de sang répétées. En utilisant des adultes plutôt que des subadultes, on aura moins de variation de taille corporelle et on disposera d'animaux de plus grande taille plus faciles à manipuler pour les tests de performance de locomotion.

60 souris génétiquement modifiées, rendues obèses et diabétiques, vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Hébergées seules pendant 78 jours, elles reçoivent un régime gras, un gavage quotidien pendant huit semaines, des mises à jeun répétées et des tests de tolérance au glucose et à l’insuline, avant une ponction cardiaque terminale, pour évaluer un composé anti-obésité pour le compte d’un laboratoire client. Le porteur situe la finalité du côté d’un dossier d’autorisation de mise sur le marché. Il affirme qu’aucune méthode de substitution ne permet d’étudier l’effet d’un composé sur le poids et le métabolisme et conclut au recours à la souris.

Objectifs

L’étude décrite dans le présent dossier sera réalisée dans le cadre du développement d'un composé d'intérêt thérapeutique, destinés à l’amélioration des troubles métaboliques, notamment l'obésité. Une première étude pilote, réalisée par le laboratoire pharmaceutique client de l'étude, a montré que ce composé induit une perte de poids corporel associée à une diminution de prise alimentaire chez des souris obèses. L’objectif de la présente étude sera de confirmer et de compléter ces résultats préliminaires en évaluant l’impact à plus long terme de ce composé sur la prise alimentaire, le poids corporel et la régulation glycémique chez des souris génétiquement modifiées obèses et diabétiques.

Bénéfices attendus

Cette étude a pour objectif de constituer un dossier d'autorisation de mise sur le marché pour commercialiser un composé thérapeutique luttant contre l'obésité.

Procédures

Les animaux seront soumis à : - une pesée trois fois par semaine sur une durée de 11 semaines - une administration orale quotidienne pendant 8 semaines - une mise à jeun de 4h pour un prélèvement sanguin à partir de la veine caudale (2 fois ; durée du prélèvement : 1-2 min) - une analyse de la composition corporelle de l'animal vigile (3 fois ; durée de la mesure : 1-2 min). - un test oral de tolérance au glucose (OGTT) (1 fois ; durée totale de l’OGTT : 16h) [Mise à jeun pendant 12-14h, Prélèvements sanguins (6 fois sur 2h ; 5min/prélèvement), Administration orale (durée : 1 min)] - un test de tolérance à l'insuline (ITT) (1 fois ; durée totale de l’ITT : 8h) [Mise à jeun pendant 6h, Prélèvements sanguins (6 fois sur 2h ; 5min/prélèvement), Injection intrapéritonéale (durée : 1 min)]

Impact sur les animaux

Les animaux seront hébergés individuellement sur l’ensemble de l’étude (78 jours). De par leur caractère social, ce type d’hébergement les prive de leur liberté d’expression d’un comportement normal de leur espèce. Le régime alimentaire riche en gras (71 jours) et l’obésité induite peuvent conduire à un inconfort sur les animaux. Les interventions ci-après peuvent constituer une source de stress sur l’animal. Le poids corporel [1 min] sera mesuré sur l’ensemble de l’étude, deux fois par semaine. De J22 à J28, l’ensemble des animaux recevront quotidiennement une administration orale [1 min] de véhicule afin de les habituer à cette voie d’administration. A J26, J50 et J70, une mesure de la composition corporelle sera mesurée sur animal vigile (durée de la mesure : 1-2min). A J26 et J50, à l’issue de l’analyse, les souris seront mises à jeun (atteinte à l’absence de faim) pendant 4h, et auront un prélèvement sanguin [5 min] pour mesurer leur glycémie et récupérer du plasma. A partir de J29, les animaux recevront une administration quotidienne [1-2 min] per os de leur composé d'intérêt ; ceci impliquerait potentiellement une perte de poids. A J58, les animaux seront mis à jeun toute la nuit (atteinte à l’absence de faim) et un test de tolérance au glucose [2h30] sera réalisée. Ceci consiste à mesurer la glycémie 30 min avant, et immédiatement avant (0 min) administration per os du glucose [1 min] puis 5 min, 20 min, 60 min, 90 min et 120 min après administration du glucose. Du plasma sera également récupéré pour mesurer l’insulinémie sera mesurée immédiatement avant (0 min) puis 20 et 60 minutes après administration du glucose. A J65, les animaux seront mis à jeun 6h (atteinte à l’absence de faim) et un test de tolérance à l’insuline sera réalisé [2h]. Ceci consiste à mesurer la glycémie immédiatement avant (0min) l'injection intrapéritonéale d'insuline [1 min] puis 15, 30, 45, 60 et 120min après administration de l'insuline. A J71, les souris seront mises à jeun pendant 4h (atteinte à l’absence de faim), pour mesurer leur glycémie [1min]. Après une anesthésie à l'aide d'un mélange kétamine/xylazine pouvant créer un inconfort, un prélèvement par ponction cardiaque sera réalisé. Une deuxième méthode de mise à mort par dislocation cervicale aura lieu pour s'assurer de la mort de l'animal. Ainsi, la durée de l’anesthésie avant sacrifice durera environ 15min.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort. Des prélèvements post-mortem sont nécessaires à l'étude afin de réaliser des analyses histologiques et biochimiques sur les tissus.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la prise alimentaire et les troubles métaboliques.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté pour chaque série expérimentale en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Les paramètres étudiés sont les suivants : poids corporel, gain de poids corporel, prise alimentaire, prise alimentaire cumulée, efficacité alimentaire, composition corporelle, glycémie à jeun, test de tolérance au glucose par voie orale, test de tolérance à l’insuline, poids des différents organes, analyses sur plasma.

Raffinement

Le modèle animal qui sera utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études précliniques cherchant à mettre en évidence les effets bénéfiques de composés sur la prise alimentaire, le poids corporel et les troubles métaboliques. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les animaux seront hébergés en cages individuelles du fait de la nécessité de mesurer précisément l'impact du composé sur leur prise alimentaire individuelle. Néanmoins, les animaux conserveront des contacts visuels avec leurs congénères et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout de dôme en carton et de briquettes en bois. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. A la fin du protocole, après une anesthésie à l'aide d'un mélange d'anesthésique/analgésique, un prélèvement sanguin par ponction cardiaque sera réalisé. Une deuxième méthode de mise à mort par dislocation cervicale aura lieu pour s'assurer de la mort de l'animal.

Choix des espèces

Le modèle de souris C57BL/6J nourris avec une alimentation enrichie en graisse (60%) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Le choix du modèle a été validé avec le client par le chef de projet. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte.

120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une polyarthrite leur est provoquée par une injection de collagène, puis ils reçoivent un anticorps trois fois par semaine pendant deux semaines, avant d'être tués pour prélever sang, rate, ganglions et une patte, afin de tester une immunothérapie contre la polyarthrite rhumatoïde. Le porteur indique que ce modèle entraîne une inflammation des articulations puis une atteinte du cartilage et des os. Il affirme que le produit n'a jamais provoqué d'effet dommageable chez le rat et que la phase préclinique sur l'animal est nécessaire avant un essai clinique.

Objectifs

L'objectif du projet est, dans un premier temps, d'identifier une nouvelle cible thérapeutique pour le traitement de la polyarthrite rhumatoïde ; puis de tester l'efficacité d'un traitement par injection d'anticorps anti-CD45RC et enfin d'optimiser ce protocle de traitement dans l'objectif finale de réaliser une étude pré-clinique chez le rat pouvant aboutir sur un essai clinique.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait mettre en évidence le potentiel d'un nouveau traitement de la polyarthrite rhumatoïde et découler sur un essai clinique dont un grand nombre de patients pourrait bénéficier.

Procédures

Les animaux vont d'abord subir sous anesthésie une injection sous-cutanée au niveau de la base de la queue pour induire l'arthrite (10min de procédure de l'endormissement au réveil). Par la suite, les rats (vigiles) receveront un traitement par injection intrapéritonéale 3 fois par semaines pendant 2 semaines (pour chaque injection, 2min de procédure de la prise en contention à la fin de l'injection) . Deux fois au cours de la procédure, les animaux seront anesthésiés pour effectuer le prélèvement d'une petite quantité de sang dans la veine caudale après anesthésie locale (10min de procédure de l'endormissement au réveil).

Impact sur les animaux

Le modèle d'arthrite induite par injection de collagène chez le rat est déjà utilisé depuis plusieurs années. Celui-ci se caractérise par une inflammation des articulations avec, sur le long terme, une atteinte du cartilage, des os et l'installation d'une fibrose.

Devenir

A l'issue de chaque procédure les animaux seront euthanasiés pour permettre d'effectuer les différents prélèvement (sang, rate, ganglions et patte) et réaliser une analyse immunologique et anatomopathologique.

Remplacement

Le développement de nouvelles thérapeutiques pour le traitement de maladies humaines nécessite une phase d'étude pré-clinique réalisée chez l'animal lorsque le modèle expérimental existe. Le modèle d'arthrite induite par injection de collagène chez le rat reproduit les caractéristiques principales de la pathologie humaine. L'utilisation de celui-ci est nécessaire pour évaluer de manière exhaustive les effets ciblés, et potentiellement systémiques, du traitement sur les différents organes et fonctions de l'organisme.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés pour ce projet a été détermineé de manière à pouvoir effectuer différents tests statistiques qui pourront permettre d'obtenir des résultats significatifs pour conclure sur l'efficacité ou non du traitement. Par ailleurs, la réalisation d'une première étude pilote sur un faible nombre d'animaux permettra de s'assurer de l'intérêt et de la bio-sécurité du projet avant de faire entrer un plus grand nombre d'individus dans la procédure.

Raffinement

Avant même le début de la procédure les animaux seront entrainés à la contention de manière à ce que les injections répétés de traitement puissent se dérouler sans créer de stress supplémentaire. Les animaux seront surveillés quotidiennement par les animaliers et les symptômes seront évalués 3 fois par semaine par les personnes responsables de la procédure. Les rats seront hébergés à plusieurs dans des cages dont la surface sera adaptée au nombre d'individu et disposeront en permanence d'enrichissement (rouleau en carton, batôn de bois,...).

Choix des espèces

Le rat a été choisi car il est utilisé dans le modèle d'arthrite induite par injection de collagène depuis de nombreuses années. Ce modèle animal s'avère pertinent car il reproduit les caractéristiques principales de la pathologie humaine. De plus, nous avons déjà testé notre traitement dans d'autres modèles expérimentaux chez le rat, ainsi nous savons que notre produit n'a jamais induit d'effets dommageable chez cette espèce. Les rats seront utilisés au stade adulte (environ 8 semaines) qui est le stade le plus couramment utilisé pour le modèle d'arthrite induite par injection de collagène.

2040 rongeurs, 1440 souris et 600 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une intoxication au paracétamol leur est provoquée pour léser le foie, puis ils reçoivent un candidat médicament et jusqu'à cinq prélèvements de sang en une journée, avant d'être tués pour prélever leurs organes, afin de tester des traitements de l'insuffisance hépatique aiguë. Le porteur affirme que ces lésions du foie ne sont pas douloureuses et décrit une baisse d'activité et de température pendant au moins vingt-quatre heures. Il indique qu'aucune méthode de substitution ne modélise cette atteinte multi-organes et que l'animal est un passage obligatoire avant l'humain.

Objectifs

L’intoxication au paracétamol est la première cause d’insuffisance hépatique aigue (IHA) dans les pays industrialisés. Elle se traduit par une attaque brusque et massive du foie chez les patients. Il s’agit de situations d’urgence qui peuvent nécessiter une transplantation du foie dans les plus brefs délais. Le paracétamol est un composé chimique utilisé comme antalgique (anti-douleur) et antipyrétique (anti-fièvre), qui figure parmi les médicaments les plus utilisés et prescrits au monde. En cas de surdose, le paracétamol provoque une sévère toxicité pour le foie par la production d’une molécule toxique pouvant entrainer la mort des cellules du foie et donc une insuffisance hépatique aïgue (IHA). Aucun traitement efficace n'est actuellement disponible. Le but de ce projet est de tester le potentiel thérapeutique de nouvelles molécules sur l'intoxication au paracétamol. Ainsi, la capacité de candidats médicaments à stopper ou ralentir l'atteinte du foie et/ou à favoriser sa guérison sera évaluée. Pour cela, le modèle d’hépatite induite par une exposition aigue au paracétamol chez le rongeur (souris et rat) sera utilisé.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont la mise au point de nouveaux médicaments pour traiter l'insuffisance hépatique aïgue due une intoxication au paracétamol pour laquelle il n’existe pas de réelles solutions thérapeutiques, hormis chirurgicales à ce jour.

Procédures

Les animaux de ce projet subiront : -Une administration d'acetaminophène (APAP) à dose contrôlée par voie intrapéritonéale, intraveineuse ou orale (1 fois/animal) -Une administration du candidat médicament en une ou plusieurs administrations (1 fois /animal) -Une série de prélèvement de sang (maximum 5 prélèvements /24h) en respectant les recommandations du NC3R’s pour les volumes. -La mise à mort avec ou sans anesthésie préalable en fonction des prélèvements terminaux à effectuer. Ces interventions auront toutes une durée maximum de 2 min.

Impact sur les animaux

L'administration d'APAP entraine des lésions du foie chez l'animal. Ces lésions du foie ne sont pas douloureuses (pas de signes de douleur chez l'animal et documenté chez l'Homme). Une hypoactivité associée à une hypothermie pourra être observée dans les 2h suivant l'administration d'APAP et se poursuivre pendant au moins 24h. Ces signes cliniques sont la conséquence des effets antipyrétique (anti-fièvre) et analgésique (anti-douleur) de l'APAP. Les candidats médicaments qui seront testés devraient théoriquement améliorer l'état de santé des animaux. Toutefois, les effets potentiellement indésirables du/des candidats médicament font l’objet d’échange avec les responsables Bien-Etre Animal pour adapter les outils d’observations des animaux afin d'anticiper au mieux de potentiels signes cliniques.

Devenir

Mise à mort des animaux pour réaliser des prélèvements d’organes.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rongeur car il n’existe pas de méthode de substitution pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur l'hépatite aigüe due à une intoxication au paracétamol. Cette pathologie est un processus complexe faisant intervenir différents organes de l'organisme et n'est donc pas modélisable in vitro ou in silico. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, la souris et le rat sont les espèces les plus adaptées à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques adaptées. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 7-12 par groupe.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi régulier de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse.

Choix des espèces

Le rongeur (souris et rat) est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets bénéfiques d'un produit sur l'insuffisance hépatique aigüe due à une intoxication au paracétamol. Cette espèce permet en effet de modéliser ce qui se passe dans une pathologie sur des temps raccourcis à l’échelle de vie de cette espèce. Elle permet d’étudier les phénomènes en cinétique de la physiopathologie et de tester l’effet de candidats médicaments sur la prévention et/ou la thérapie de la pathologie. Les études sont réalisées sur des animaux adultes car elles nécessitent des animaux avec une fonction hépatique normale (mature) et ont pour but de traiter une pathologie qui affecte surtout des adultes.

360 cochons mâles en croissance vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis renvoyés au circuit d'élevage vers l'engraissement ou l'abattage. Chaque animal est logé seul et placé quatre jours en cage à surface réduite par cycle de douze jours, pour collecter ses excréments et mesurer la digestibilité d'aliments et de matières premières. Le porteur situe l'intérêt du côté des fabricants d'aliments et de la réduction des rejets dans l'environnement. Il affirme que cette mesure ne peut se faire que sur l'espèce d'élevage, la seule autre méthode étant l'abattage de l'animal pour prélever le contenu digestif.

Objectifs

Des essais de digestibilité sur porcs sont mis en place afin d’évaluer de la manière la plus précise possible la valeur nutritionnelle des matières premières, coproduits ou aliments destinés aux porcs. Les matières premières et coproduits ne cessent d’évoluer, par les changements des itinéraires techniques plus respectueux de l’environnement, l’apparition de nouvelles sources de protéines locales et l’optimisation des procédés qui génèrent des co-produits valorisables par les animaux. Les mesures de digestibilité permettent de faire le bilan entre les nutriments consommés par l’animal, ceux réellement absorbés et utilisés pour les fonctions physiologiques et de croissance, et ceux rejetés dans les déjections. Les résultats ainsi obtenus permettent aux fabricants d’aliments et aux éleveurs d’adapter au mieux la qualité nutritionnelle des aliments aux besoins des animaux. Cela contribue au maintien d’une flore digestive équilibrée (moins de fermentations indésirables) et à la bonne santé des animaux, mais aussi à réduire les rejets (azoté, phosphore, …) dans l’environnement. Par ailleurs, ce type de mesures permet de guider la recherche sur les procédés appliqués en vue d’améliorer la qualité des matières premières ou leur empreinte environnementale (ex. procédé de trituration de colza ou tournesol, production sans solvant des tourteaux de soja français non ogm, …). Ces résultats sont importants pour les filières animales et encore plus aujourd’hui avec le développement d’une alimentation locale avec des matières premières et coproduits diversifiés. Aucune autre méthode ne permet de faire la mesure avec un meilleur rapport bénéfice / risque. La seule autre technique est avec utilisation d’un marqueur et abattage de l’animal pour prélèvement du contenu. Dans ce type de protocole, l’utilisation de l’espèce d’élevage est indispensable, puisqu’il s’agit de la cible directe de la thématique.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de continuer l’acquisition de données de digestibilité fécale chez le porc nécessaires afin de formuler au mieux les aliments d’élevage pour limiter les désordres digestifs liées à un déséquilibre nutritionnel mais aussi les rejets dans l’environnement tout en développant les connaissances sur des matières premières notamment locales. Les essais de digestibilité permettent d’évaluer des hypothèses de manière fine et donner des valeurs de référence de la valeur nutritionnelle d’une matière première ou d’un aliment avec un nombre d’animaux très réduit. Les résultats produits depuis les années 90 sont utilisés en formulation et disponibles pour tous les éleveurs. Elles ont permis aussi de développer des équations de prédiction utilisées par les formulateurs. Les mesures in vivo permettent le maintien de la validité et l’adaptation continue de ces équations, et au développement d’autres pour des matières premières et co-produits qui ne cessent d’évoluer.

Procédures

Les porcs sont hébergés en individuel. A chaque série (12 jours), ils sont placés 4 jours en cage avec une surface au sol restreinte pour permettre de collecter les fèces sans contamination par les urines. Le reste du temps, ils sont dans un module loge + cage leur permettant une plus grande liberté de mouvement.

Impact sur les animaux

Peu de nuisances ou d’effets indésirables sont attendus pour les animaux, d’autant plus que les améliorations d’hébergement depuis 2017 ont beaucoup contribué au bien être des animaux (moins de restrictions, plus de surface, plus d’enrichissements). Seules les périodes de collecte, avec un hébergement en cage, contraignent les animaux à un espace réduit. Néanmoins, avec notre nouveau dispositif, ces périodes sont limitées à moins de 4 jours consécutifs. Le reste du temps (périodes d'adaptation aux aliments expérimentaux) les animaux sont libres de leurs mouvements : cage ouverte vers la loge en caillebotis plastique. Les régimes alimentaires évalués ne sont pas de nature à produire des désordres digestifs particuliers.

Devenir

Les porcs issus de la procédure d'hébergement individuel partent dans le circuit normal de consommation ensuite : soit à l’engraissement, soit directement à l’abattage.

Remplacement

La mesure de la digestibilité fécale des nutriments chez le porc ne peut aujourd’hui être réalisée que par des essais sur des animaux de l’espèce cible. Ce type d’essai a déjà contribué à établir des valeurs de référence largement utilisées dans le monde, mais la production de nouvelles matières premières et coproduits, d’additifs améliorants ou de process, nécessite d’établir de nouvelles références, qui ne peuvent être évaluées que par les études in vivo. Les références ainsi produites ont permis peu à peu de développer des équations de prédiction utilisées aujourd’hui par les formulateurs pour certains nutriments en remplacement des mesures sur animaux. Cependant, les mesures in vivo (très peu d’équipes en France les réalisent), restent importantes pour le maintien de la validité et l’adaptation continue de ces équations.

Réduction

Ce projet utilise 12 animaux pour évaluer entre 2 et 6 aliments. La plupart des essais se déroulent en 2 ou 3 séries et si ce n’est pas le cas, un essai contenant 2 aliments peut être associé avec un à 4. Le fait de fonctionner en séries de mesures permet d’avoir moins d’individus au total qu’auparavant, 12 contre 20 (en une seule série). Le dispositif choisi permet de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés par année dans ce type d'essai. Ce dispositif a été validé par notre service d’études méthodologiques et statistiques. 6 répétitions par aliment nous permettent d'obtenir une puissance suffisante pour mettre en évidence des différences significatives ayant un sens biologiquement sur les différents critères d'intérêt mesurés.

Raffinement

Le lieu d’hébergement a été spécifiquement construit pour ce type d’essai (loges et cages sécurisées sans éléments blessants, facilité d’accès pour les soins, matériaux faciles à nettoyer, enrichissement adapté, contrôle automatisé de la ventilation et de la température, …). Les hébergements sont disposés de manière à procurer aux porcs une perception visuelle, auditive et olfactive entre congénères. L’animalier vient au contact des animauxplusieurs fois par jour y compris les week-ends et les jours féries. L'expérience montre que les animaux s’habituent bien aux cages. Des objets d’enrichissement sont placés dans chaque hébergement. Les animaux s’en servent très souvent. La visite aux animaux, minimum 2 fois par jour, 7j/7, permet d’observer de manière individuelle, tout comportement anormal. Un arbre décisionnel a été défini en s'appuyant sur des points limites adaptés à l'espèce afin de préciser la conduite à tenir selon la durée et le degré des symptômes.

Choix des espèces

Ces essais concernent la mesure de la digestibilité fécale des nutriments chez le porc. L’espèce utilisée est celle utilisée en élevage, l’utilisation digestive des nutriments étant spécifique à chaque espèce. Des équations de prédiction des valeurs de digestibilité sont présentes dans la littérature pour un certain nombre de matières premières mais ne donnent qu’une valeur moyenne ne permettant pas l’étude des hypothèses de variation (effet de process, de la génétique, des additifs, etc.). Des nouvelles matières premières et coproduits ne peuvent être évalués que par les études in vivo. Les animaux sont en phase de croissance. Cela permet de refléter au mieux les animaux ciblés en élevage par ce modèle. La technique nécessite des mâles pour éviter les mélanges entre urine et fèces lors de la collecte, mais les résultats sont valides pour les mâles et les femelles (pas de différences avérées de digestibilité). La formulation des aliments ne se fait pas par sexe.

1176 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des prélèvements de sang répétés, jusqu'à seize sur la joue chez l'animal vigile, un prélèvement dans le fémur, des injections et des gavages, certaines lignées développant une leucémie suivie sur environ un an, pour étudier l'effet du vieillissement sur la formation du sang. Le porteur affirme que les points limites précoces font qu'aucun effet indésirable n'est à prévoir, malgré une gravité déclarée modérée. Il indique que la leucémie et le vieillissement forment des modèles intégrés que la culture in vitro ne peut reproduire.

Objectifs

Les deux objectifs de ce projet sont de déterminer l'impact du vieillissement sur l'hématopoïède normale et leucémique

Bénéfices attendus

La détermination de l’impact de l’âge sur la fonction des CSH pourrait aider à comprendre les mécanismes qui induisent la survenue de syndromes myéloïdes chez les sujets âgés et ainsi améliorer la prise en charge et les traitements des patients

Procédures

Prélèvements sanguins sur animaux vigiles en sub-mandibulaire, durée 1min, nombre : pour la procédure 3, 16 Prélèvement intrafémoral sur animaux anesthésiés, durée 2min, nombre : 1 fois pour toutes les procédures Injections intrapéritonéales sur animaux vigiles : durée 1 min, nombre : 1fois par expérience pour la procédure 2 Gavages sur animaux vigiles : durée 1min, 1 fois pour toutes les procédures

Impact sur les animaux

Les points limites étant précoces, aucun effet indésirable n'est à prévoir sur les animaux

Devenir

Tous les animaux seront sacrifiés à la fin de chaque procédure afin de récupérer les échantillons (tissus, sang) nécessaires pour étudier les mécanismes moléculaires mis en jeu (génétiques, transcriptomiques, étaboliques, protéiques, phénotypiques)

Remplacement

Les leucémies ainsi que le vieillissement sont des modèles intégrés qui font intervenir un grand nombre de mécanismes physiologiques et de tissus avoisinants qui ne peuvent être modélisés in vitro. Nous devons donc avoir recours à un modèle physiologique complet et fonctionnel pour cette dernière étape : le modèle animal. De plus, nos modèles murins permettent de suivre les cellules souches hématopoïétiques donnant la possibilité d’étudier leurs fonctions dans un environnement physiologique natif à la fois au cours du vieillissement mais également lors du développement de leucémies.

Réduction

les lignées transgéniques utilisées comportent 1. des systèmes inductibles qui vont permettre à la fois d’induire l’expression des transgènes dans un tissu spécifique mais également à un temps donné et 2. des systèmes rapporteurs fluorescents qui vont permettre d’analyser finement et spécifiquement l’évolution des cellules leucémiques et ainsi permettre de diminuer le nombre d’animaux utilisés. De plus lors de l’établissement des lignées, l'élevage sera minimisé le plus possible pour ne produire que les animaux nécessaires

Raffinement

les lignées transgéniques utilisées comportent 1. des systèmes inductibles qui vont permettre à la fois d’induire l’expression des transgènes dans un tissu spécifique mais également à un temps donné et 2. des systèmes rapporteurs fluorescents qui vont permettre d’analyser finement et spécifiquement l’évolution des cellules leucémiques et ainsi permettre à la fois de diminuer le nombre d’animaux utilisés mais également de détecter l’apparition de cellules leucémiques très précocement ce qui permettra d’améliorer le bien-être animal par une prise en charge plus rapide. Le bien-être de nos animaux sera pris en compte de leurs naissances à leurs morts, les animaux seront hébergés en groupe et l'enrichissement de leur milieu de vie sera systématique. Ainsi, la surveillance des souris sera faite quotidiennement ce qui permettra de prendre des mesures spécifiques pour le bien-être de ces animaux.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris (Mus musculus) comme le modèle de choix, en raison de ces similarités génétiques et physiologiques proches de l'homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. C’est la raison pour laquelle l’ensemble des techniques de la transgénèse chez les mammifères a débuté chez la souris. De surcroit, toute la collection des systèmes Cre-lox nécessaires à nos études n’existe que chez la souris. Nous utiliserons des souris jeunes de 8 à 10 semaines lorsqu’elles ont atteint leur maturité sexuelle pour les deux lignées murines. Les souris âgées auront 18 à 20 mois pour la lignée MAP17 Tomato et 12 mois pour la lignée KSB (puisque la cinétique de la maladie est d’environ 1an)

Une partie des souris porte un système immunitaire humanisé, sur des souches NXG, NCG, NOG ou BRG que le porteur dit maîtriser, et n'est utilisée qu'à partir de 16 semaines. 1 500 souris vont être utilisées en 50 études sur cinq ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes sont tuées à l'issue, sans que le résumé en donne la raison. Une inflammation de l'intestin leur est provoquée par du TNBS dissous dans l'éthanol, injecté dans le rectum sous anesthésie, puis elles reçoivent par gavage, dans l'eau de boisson ou par injection des molécules de laboratoires académiques, biotechnologiques et pharmaceutiques, avec un nombre d'administrations "à déterminer", et peuvent souffrir de diarrhées parfois sévères, de déshydratation, d'anémie et d'effets toxiques. Une souris dont le score de pathologie atteint 12, ou le score d'état général 7, est mise à mort, la perte de poids, les saignements et l'aspect des selles entrant dans le premier calcul.

Objectifs

La maladie inflammatoire chronique des intestins (MICI) est une pathologie caractérisée par une inflammation de la paroi du tube digestif entrainant une dégradation significative de la qualité de vie des patients. Les MICI les plus courantes sont la colite ulcéreuse (ou rectocolite hémorragique) et la maladie de Crohn. A l’heure actuelle, les mécanismes d’apparition de cette pathologie sont peu connus et aucun traitement curatif n’est disponible sur le marché. L’objectif de ce projet est de développer un modèle d’étude fiable des MICI pour permettre d’en accroitre la compréhension et d’évaluer les propriétés immunitaires, thérapeutiques et toxicologiques de molécules issues de laboratoires académiques, biotechnologiques et pharmaceutiques.

Bénéfices attendus

Les MICI sont des maladies inflammatoires. En basant notre modèle sur des souris ayant un système immunitaire humanisé, nous mettons à disposition des chercheurs un modèle permettant d'étudier les MICI et des potentiels traitements avec davantage de spécificité pour l’espèce cible de ces recherches : l’Homme.

Procédures

Administration intra-rectale sous anesthésie générale, durée de l'intervention 4 à 5 minutes. Administration des composés à visées thérapeutiques par voie enterale (gavage ou incorporation dans l'eau de boisson) ou parentérale (intraveineuse, intrapéritonéale, intramusculaire ou sous-cutanée). Leur nombre est à déterminer, leurs durées seront de 10 à 15 secondes chacune. Prélèvements sanguins pour le suivi de la pathologie et des effets des traitements selon un schéma établis par le vétérinaire d'établissement et le comité de bien-être. Chaque prélèvement aura une durée de 15 à 30 secondes, environ.

Impact sur les animaux

Les MICI se caractérisent par une diarrhée pouvant être sévère et entrainer une perte de poids, une déshydratation, des coliques ou une une anémie. Des nuisances peuvent également être induites par l'injection intra-rectale de TNBS solubilisé dans l'éthanol ainsi que par les prélèvements sanguins, l'administration des composés de recherche et les effets potentiellement toxiques de ces composés à visées thérapeutiques dans un contexte préclinique. Ces nuisances et effets indésirables peuvent se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de procédure.

Remplacement

Il n’est à l’heure actuelle pas possible de recréer in vitro un modèle étudiant les interactions complexes qui peuvent exister entre le système immunitaire et un système digestif fonctionnel qui permettrait de reproduire les MICI tout en objectivant les effets thérapeutiques et toxicologiques de composés médicamenteux destinés à leurs traitements. Les modèles murins constituent donc une approche scientifiquement valide, robuste et indispensable au développement et à la mise à disposition de thérapies innovantes pour les patients.

Réduction

Un total de 1500 animaux est demandé pour la réalisation de ce projet sur une durée de 5 ans, permettant de réaliser 50 études afin de mettre en place le modèle et de réaliser les premières études précliniques. Chaque étude comprendra un minimum de 4 groupes (contrôle négatif, contrôlé positif, plusieurs doses ou traitements à comparer) avec 5 à 10 animaux par groupe afin d’obtenir des résultats fiables malgré la variabilité intrinsèque liée au modèle. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum en se basant sur des tests statistiques adaptés aux effets attendus de la série.

Raffinement

Les administrations intra-rectales seront réalisées sous anesthésie générale gazeuse et le volume d'injection ne pourra dépasser 200 μL. Les souris seront hébergées en cage ventilée, par groupe social stable. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. La cage contiendra une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. Un morceau de bois permettant aux souris d’exprimer leur comportement de rongeur, ainsi qu’un nid en carton seront également disposés. Les souris recevront une période d’acclimatation de 7 jours, minimum, avant l’entrée en projet, et seront habituées à la présence de l’expérimentateur qui les manipulera régulièrement. Les pièces d’hébergement disposeront d’un cycle lumière obscurité (12h - 12h), d’une température (20 - 24°C) et d’une hygrométrie (45 - 65%) contrôlés en permanence. Les souris seront monitorées tous les jours pour vérifier l’absence de souffrance. La progression de la pathologie sera évaluée par une échelle cumulative de scores considérant : l’aspect des matières fécales, la présence de saignements, une perte de masse corporelle, par rapport à la mesure la plus élevée. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, l’état de santé sera évalué par une échelle cumulative de scores (donnés entre parenthèse) considérant : l’aspect du pelage, les mouvements, l’activité, la couleur des muqueuses, score corporel. Les souris seront évaluées quotidiennement et les scores enregistrés dans le cahier de laboratoire. Une souris avec un score ≥12 (score de pathologie) ou ≥7 (score d’état général) sera euthanasiée pour raison éthique. Par ailleurs, toute anormalité dans l’état de santé des souris non objectivable par l’échelle de score devra être rapportée au vétérinaire qui aura pleine autorité pour proposer un traitement ou imposer une euthanasie pour raison éthique si elle/il le juge nécessaire.

Choix des espèces

Nous maitrisons l'humanisation du système immunitaire sur les souches de souris NXG, NCG, NOG et BRG. En se basant sur cette expertise, il est essentiel de poursuivre sur cette espèce. Les animaux seront utilisés à partir de 16 semaines pour les animaux humanisés et à partir de 6 à 8 semaines pour les animaux non humanisés.