Procédures modérées

2880 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur est greffée sous leur peau, puis elles reçoivent des injections d'un anticorps avant un prélèvement sanguin terminal, pour valider chez la souris un anticorps humain déjà testé sous forme murine contre le cancer du poumon. Le porteur indique que la nécrose de la tumeur peut ouvrir une plaie qui s'agrandit par frottement ou cannibalisme, et compte cette nécrose parmi ses mesures d'efficacité. Il présente ce passage chez l'animal comme une étape "nécessaire et obligatoire" imposée par la réglementation avant un essai clinique.

Objectifs

Notre projet de recherche est focalisé depuis de nombreuses années sur le rôle d’une hormone la neurotensine et son récepteur, le couple NTS-NTSR1 dans le cancer. Ainsi nous avons démontré que la neurotensine était un facteur lié à l’agressivité des tumeurs, en ayant une action sur la croissance tumorale et le développement des métastases. Le récepteur de cette hormone est surexprimé dans presque tous les cancers solides (tumeurs qui font des amas). Nous avons montré que l’expression élevée de NTSR1 est un marqueur de mauvais pronostique pour les cancers du poumon, du sein, et pour de nombreux autres cancers. La présence de cette hormone au sein des tumeurs est associée à la résistance aux traitements anticancéreux. Nous développons des stratégies thérapeutiques qui vont inhiber cette hormone dans le but de diminuer l’agressivité des tumeurs et de restaurer la réponse aux traitements. Plus précisément, nous avons développé des anticorps neutralisants dirigés contre les formes précurseurs de cette hormone qui peuvent être utilisés en thérapie humaine. Le projet décrit ici a pour but de démontrer l’efficacité thérapeutique de ces anticorps sur des modèles de tumeurs expérimentales en particulier sur la croissance tumorale, évasion métastatique, et surtout la réponse aux traitements standards proposés aux patients avec un cancer du poumon en récidive. L’ensemble des résultats obtenus seront inclus dans la demande d’autorisation pour pratiquer une phase 1 chez l’homme.

Bénéfices attendus

Nous avons établi la preuve de concept de l’efficacité d’un anticorps dirigé contre les formes longues de la neurotensine sur la croissance tumorale, invasion métastatique et la réponse aux chimiothérapies à base de sels de platine avec un anticorps murin. Ces résultats ont été publiés. L’étape suivante de développement du projet est de valider l’utilisation d’un anticorps humain en utilisant des procédures similaires dans le but de l’inclure dans les traitements actuels proposés aux patients. La réglementation exige que les médicaments destinés à la thérapie humaine soient testés dans plusieurs modèles animaux. Les tests de l’efficacité thérapeutique de ces anticorps dans un modèle murin sont une étape préalable, nécessaire et obligatoire avant de poursuivre vers les études réglementaires de toxicologie et un essai clinique.

Procédures

Les animaux commerciaux seront acclimatés durant une semaine puis ils seront soumis à une injection sous-cutanée de cellule tumorale sur animal vigile (15 seconde/animal). Après quelques jours (environ 7 jours), les animaux seront traités avec les molécules thérapeutiques par injection intraveineuse sur animal vigile (15 seconde/animal) à raison de 3 à 6 injections maximum par animal. Enfin, les animaux subiront un prélèvement sanguin terminal unique sous anesthésie profonde (5 minutes) puis seront immédiatement euthanasié sans réveil de l’animal.

Impact sur les animaux

L’implantation des cellules tumorales sur le flan de l’animal provoque le développement d’une tumeur solide. Les tumeurs se développent sous la peau. Les tumeurs sont à priori pas innervées innervées et elles n’entrainent donc pas de douleur en tant que telles. En revanche la taille de la tumeur peut provoquer des difficultés de déplacement des souris surtout si après l’implantation en sous cutanée la tumeur se développe dans le creux de la patte postérieure. Ce phénomène arrive parfois, il n’est pas contrôlable. L’efficacité de la thérapie que nous développons se traduit par une réduction de la taille tumorale, ralentissement de la pousse, mais aussi par une nécrose plus ou moins importante qui démarre au centre de la tumeur. Ce phénomène de nécrose peut atteindre la surface de la tumeur et provoquer une plaie. Cette plaie peut s’agrandir soit par frottement soit par cannibalisme. Dès l’apparition d’un point de nécrose nous appliquons des soins adaptés. Cependant, plus le traitement est efficace plus la nécrose va se développer à l’intérieure de la tumeur qui est un phénomène inévitable, et un paramètre que nous comptabilisons pour évaluer l’efficacité de la thérapie.

Devenir

L’ensemble des animaux impliqués dans ce projet (n=2880) seront euthanasiés à la fin de la période de maintien prévu ou plus tôt en cas d’atteinte de points limites afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses ultérieures (les tumeurs, les ganglions, la rate et le sang) afin d’analyser le mode d’action de nos anticorps.

Remplacement

Le criblage in vitro va nous permettre de remplacer l’utilisation d’animaux en utilisant les techniques de culture cellulaire. L’objectif étant de sélectionner les meilleurs anticorps candidats. Ces clones sélectionnés seront utilisés pour la partie in vivo qui fait l’objet de la présente demande. Néanmoins, Un système vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans le développement tumoral et les effets thérapeutiques de nos molécules qui sont au cœur de ce projet. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu.

Réduction

Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. Un nombre de 10 souris par groupe est prévu afin de pouvoir réaliser des statistiques. Un total de 2880 souris sera nécessaire pour la mise en œuvre de ce projet.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (points limites adaptés) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Dans ce projet, l’administration des traitements devrait apporter un bénéfice pour les animaux avec un ralentissement de la progression tumorale. De plus, l’ensemble des gestes techniques qui sont réalisés sur animal vigile sont pratiqués par des personnes formées et expérimentées avec du matériel adapté permettant de réduire significativement les nuisances liées aux actes techniques.

Choix des espèces

Justification de l’espèce/modèle : Le choix de l’espèce est justifié à travers différents aspect : - La physiologie de la souris qui est un mammifère comme l’Homme ; - La possibilité de recréer un modèle de cancer pulmonaire métastatique ; - Une espèce couramment utilisée et reconnue en oncologie ; - Un modèle ayant permis de déterminer l’importance du protocole d’administration, l’influence du volume tumoral et la toxicité des traitements ; - La réglementation demande à ce que tout développement de médicaments soit testé chez deux modèles animaux différents avant toute administration chez l’humain. La souris Nude est le standard pour les études précliniques relatives à l'évaluation in vivo des effets anti-tumoraux sur des cellules humaines. Nous utiliserons la souche NMRI Nude-Foxnu afin de ne pas avoir d’interaction du système immunitaire sur les effets observés de nos anticorps. Justification du stade : Les souris seront achetées à 5 semaines d'âges et entreront en protocole après 1 semaine d’acclimatation, le poids des animaux se stabilisent entre 28 et 35 jours d’âge. Ce stade de développement est couramment utilisé et validé par la communauté scientifique. Justification du sexe : Toutes nos études avec l’anticorps murin ont été réalisées sur des mâles. Nous travaillerons donc exclusivement sur les mâles afin de pouvoir comparer nos résultats aux études antérieures. Ce choix a été fait en amont pour limiter les problèmes hormonaux, puisqu’il est connu que certains cancers sont hormono-dépendants.

225 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur de vessie est greffée dans leur flanc, puis elles reçoivent deux injections par semaine pendant six semaines et deux prélèvements de sang dans l'œil, avant une exsanguination terminale sous anesthésie, pour comparer deux candidats médicaments en doses croissantes. Le porteur indique que la pousse tumorale peut gêner les déplacements et qu'aucun anti-inflammatoire ne peut être administré car l'inflammation participe au mécanisme testé. Il affirme que ces expériences sur petit animal ne peuvent être remplacées par des cultures in vitro.

Objectifs

La cible du candidat médicament est un récepteur l’immunité et est exprimé par les cellules normales mais aussi dans de très nombreuses cellules tumorales. L’activation de ce récepteur par certaines molécules entraîne une mort spécifique des cellules cancéreuses (mais pas des cellules normales), ainsi qu’une activation de l’immunité ayant un effet antitumoral. La conjugaison de ces deux mécanismes induit une vaccination à long terme contre la tumeur empêchant ainsi les récidives cancéreuses. Des études précédentes (utilisant le même modèle de cancer de la vessie que celui de ce protocole) ont démontré l’ensemble des effets cités ci-dessus (guérisons complète de 45% des souris traitées et vaccination à vie des souris guéries contre les récidives dans 66% des cas). Ces résultats ont été obtenus lors d’injections intratumorales de d’une toute nouvelle famille de molécules activant ce récepteur (spécifique, utilisable en clinique et bien tolérée). Dans la présente étude, deux candidats médicaments (CM1 et CM2) adaptées à une injection dans le système veineux (ici une injection intrapéritonéale) vont être comparées en doses croissantes pour leur : (1) efficacité antitumorale, (2) tolérance et (3) mécanismes d’action (dont leur action sur le système immunitaire). Pour ce faire, le modèle de cancer de la vessie sera utilisé pour que l’activité de ces candidats médicaments puisse être directement comparables aux études précédentes et à venir. Sept doses croissantes de chacun des deux candidats médicament seront testées sur des groupes de 12 souris rentrant en protocole. Ajouté au groupe contrôle, cela donne 15 groupes de 12 souris en traitement. Pour ce faire, 225 souris seront injectées avec des cellules cancéreuses de vessie. Sachant que 80% des souris injectées développent des tumeurs pouvant entrer protocole, cela donne 180 souris qui intègreront les 15 groupes de traitement. Les molécules seules (sans autre molécules ajoutées), seront administré deux fois par semaine pendant 6 semaines.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra d’effectuer un choix/classement entre deux molécules lors d’une injection par voie sanguine. Elle permettra d’affiner les doses à utiliser dans les futures études ainsi qu’en clinique. Il s’agit d’une étude de recherche à la fois fondamentale et translationnelle en vue de définir les fondements d’une étude clinique chez l’homme en injection par voie sanguine.

Procédures

Cette étude nécessite : - Une injection de cellules tumorales dans le flanc de la souris (sous anesthésie) - Des traitements injectés par voie sanguine (piqure d’aiguille sur souris vigiles). - Deux prises de sang intermédiaires de petits volumes (100µl - 3 à 4 minutes anesthésie incluse), espacés de deux semaines (sous anesthésie) - Une exsanguination terminale pouvant induire un arrêt cardiaque (sous anesthésie générale - environ 4 min anesthésie incluse), immédiatement suivie d’une mise à mort par dislocation cervicale (toujours sous anesthésie générale).

Impact sur les animaux

225 souris C3H/HeN (de phénotype non dommageable), sont acclimatées pendant une semaine à daté de leur réception. Les animaux subiront un stress lors des contentions, préparations, greffes, traitements, suivis et prélèvements ainsi que lors de leurs anesthésies : 1/ Anesthésie par voie gazeuse (isoflurane) pour permettre : (i) leur numérotation par poinçonnage auriculaire, (ii) la tonte pour préparer (iii) la greffe tumorale. 2/ Stress à la contention et à la piqure lors des traitements par injections sanguine sur souris vigiles (2 fois par semaine). 3/ Stress à la contention lors des pesées et mesures de la croissance tumorale par pied-à-coulisse sur souris vigiles. 4/ Les deux prélèvements de sang intermédiaire rétro-orbitaux de 100µl de sang après le premier et le 5eme traitement peuvent générer de la douleur au niveau de l’œil prélevé c’est pourquoi chaque œil sera prélevé une fois. Les volumes et fréquences de ces prélèvements sont adéquats pour ne pas engendrer de stress volémique chez ces souris. 5/ La pousse tumorale peut engendrer une gêne dans la locomotion (pris en compte dans la grille de score => Mise à Mort). 6/ Exsanguination intracardiaque terminale sous anesthésie générale (kétamine/Xylazine), immédiatement suivie d’une mise à mort par dislocation cervicale.

Devenir

A la fin de l'unique procédure, tous les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale sous anesthésie (pour permettre des analyses d’efficacité et de mécanismes d’action post-mortem).

Remplacement

De nombreuses expériences in vitro ont déjà permis de mettre en évidence l’activité et les mécanismes d’action de ces deux candidats médicaments. A présent, seules des études sur le petit animal permettront d’étudier les interrelations complexes des facteurs physiologiques susceptibles d’influencer l’effet de la molécule testée, et surtout le système immunitaire complet qui permettra d’étudier l'effet vaccinal contre le cancer de ces deux candidats médicaments. Ces expériences sur petits animaux ne peuvent donc pas être Remplacées. Ces expériences s'inscrivent dans le cadre du développement d'une application thérapeutique et fournira des données précliniques précieuses pour la conception d'un essai clinique.

Réduction

Les expériences menées lors de précédentes études démontrent que le nombre de souris par groupe (12 souris par groupe), prévu pour cette expérience est adapté sans mettre en péril une interprétation statistique des résultats, tout en utilisant les méthodes statistiques adaptées aux petits nombres.

Raffinement

Le « Raffinement » sera respecté par la mise en place d’une définition précise de points limites précoces et prédictifs, sur la base d'une grille de score validée sur ce modèle et sur ce type de traitement. Une surveillance adaptée des animaux 3 fois par semaine permettra d'éviter toute souffrance des animaux. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 puis avec nourriture et de l’eau ad-libitum avec des bâtonnets à ronger et du coton comme enrichissement en excès. Les prélèvements seront réduits au maximum en quantité et en durée grâce à nos méthodes d’analyses. Les deux prélèvements intermédiaires rétro-orbitaux de 100µl de sang s’effectueront sous anesthésie, respectivement après le premier et le cinquième traitement (J0 et J14). Une goutte de tétracaïne sera déposée sur l’œil 1 min avant le prélèvement afin de réduire la douleur au réveil. Les prélèvements terminaux pratiqués sous anesthésie et antalgie, suivis d'une mise à mort sans réveil. Le maximum d’analyses sur les différents prélèvements intermédiaires et finaux seront effectuées afin de tirer le plus d’informations possibles. Des traitements antiseptiques et cicatrisants sont prévus en cas de plaies. cf. grille de score. Note : Les anti-inflammatoires ne peuvent être utilisés, le processus inflammatoire étant important pour notre mécanisme d'action.

Choix des espèces

Des souris possédant un système immunitaire complet seront utilisée. La souris est un modèle mammifère bien caractérisé pour les études pharmacologiques et immunologiques : (1) En plus d’être un modèle pertinent, la souris est un modèle de petite taille, facile à manipuler et génétiquement bien caractérisé, avec des grilles de comparaison entre la souris et l'homme très bien définis pour les injections sanguines. (2) La réponse immunitaire chez cette espèce est également très bien définie. Or, seul le modèle animal possédant un système immunitaire complet permet l'étude de l'effet vaccinal contre le cancer. Les expériences s’effectueront sur des souris de 9 à 11 semaines après 7 jours d'acclimatation dans l’établissement utilisateur. A ce stade de développement, la croissance tumorale est plus reproductible et bien tolérée, de plus, le système immunitaire est suffisamment mature pour induire une réponse vaccinale. Les souris utilisées seront toutes des femelles afin de limiter le risque d’agressivité inter-individu par rapport aux mâles. De plus, les études précédentes ayant été faites sur des souris femelles, cela nous permettra de comparer les résultats de cette étude.

165 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris, porteuses de lésions musculaires induites lors de projets antérieurs, sont soumises à des examens d'imagerie par résonance magnétique sous sédation répétée, puis tuées pour confronter les images à l'analyse des tissus, afin de chercher des marqueurs non invasifs de la fibrose musculaire. Le porteur décrit l'imagerie elle-même comme atraumatique et sans douleur. Il affirme qu'aucun protocole in vitro n'atteint le niveau d'organisation du muscle et conclut que les études in vivo sont "indispensables".

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’exploiter des outils IRM (imagerie par résonnance magnétique) et SRM (spectroscopie par résonnance magnétique) pour caractériser certains modèles murins de pathologies musculaires et de les confronter à l’histologie, dans le but de trouver des marqueurs RMN permettant d’évaluer la fibrose musculaire de manière non-invasive.

Bénéfices attendus

les bénéfices attendus de notre recherche visent au développement de nouvelles connaisances portant sur les lésions musculaires observées au cours de diverses pathologies musculaires. A terme ces connaissnaces doivent permettre le développement de nouveaux biomarqueurs pour ces pathologies. L'avantage évident d'une approche RMN réside dans le caractère non invasif de l'examen et dans sa capacité à réaliser des examens 'corps entier' et non seulement localisés à une région. L'aspect translationnel de notre recherche est renfocé par la modélisation chez le mammifère non humain (souris) de pathologies humaine.

Procédures

durant les examens RMN les aniamux ne sont soumis à aucune intervention nuisible pour leur état de santé, dans la mesure où les examens se limitent à les évaluations par imagerie ou spectroscopie. Le stress des animaux est limité dans la mesure où tout examen RMN se fait sous sédation, avec un monitorage continu de la respiratoire.

Impact sur les animaux

Les examens RMN appliqués à l'animal nesont pas différents dans leur nature de ceux utilisé chez l'homme et restent donc parfaitement non invasifs. Les modèles murins mis à notre disposition ont pour certains subis une intervention visant à créer un modèle de lésion et régénération. Au stade où ils seront utilisés en RMN les lésions seront cicatrisées et on n'observe pas d'invalidité chez ces animaux. Le degré de récupération fait partie intégrant du projet de recherche.

Devenir

les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de pourvoir réaliser une confrontation anatomo-pathologiques avec les images obtenues par RMN.

Remplacement

Le muscle est un ensemble organisé de fibres musculaires, cellules hautement différenciées et spécialisées, et du tissu interstitiel. La fonction musculaire est dépendante du fonctionnement des cellules musculaires, mais aussi d’une combinaison des fonctions vasculaire et nerveuse de l’individu. A l’heure actuelle, il n’existe aucun protocole in vitro permettant d’atteindre ce niveau de différenciation et d’organisation, ce qui rend les études in vivo indispensables pour les études sur la structure et le fonctionnement du muscle.

Réduction

La réduction du nombre d’animaux est assurée par la minimalisation de la variabilité entre individus : un fond génétique Rag2-/-Ilr2b-/- pour l’étude de la dégénérescence/régénération et de la fibrose musculaire et un fond génétique C57Bl/6J Rj pour la mise au point des outils méthodologiques, et tous les animaux d’une même lignée proviennent d’un même fournisseur pour minimiser les variations sanitaires.

Raffinement

Le raffinement avant l’expérimentation sera fait par enrichissement de l’environnement avec du papier absorbant ou des tubes en carton et par élevage des souris en groupes (maximum 5 individus par groupe) dans des portoirs ventilés munis de cages jetables contenant de la litière de contact. La température est maintenue à 23 ± 1 °C avec une hygrométrie entre 40% et 70% et le cycle d’éclairage est de 10h/14h. Les animaux seront observés quotidiennement afin de s’assurer de leur bonne santé et une prise de poids sera effectuée avant chaque examen RMN. Toute perte majeure de poids, modification importante du comportement ou de l’état général pouvant laisser supposer une douleur sera considéré comme point limite. Enfin toutes les expérimentations RMN se feront sous anesthésie gazeuse afin de maintenir les animaux immobiles tout le long des acquisitions. L’imagerie et la spectroscopie RMN étant atraumatiques par définition et les animaux sédatés tout au long de l’acquisition, aucune analgésie n’est nécessaire.

Choix des espèces

Du fait de leur petite taille et de la facilité pour les héberger, les souris sont un ordre animal facile à manipuler. De plus, de nombreux modèles de pathologies neuromusculaires ont été développés chez la souris. Par sa petite taille, la souris est aussi un candidat idéal pour une étude histologique du muscle entier, ce qui est particulièrement intéressant, voire fondamental, pour une étude comparative entre l’IRM et l’histologie. Les espèces de l’ordre des souris sont donc appropriées pour la recherche dans le domaine des maladies neuromusculaires. Au laboratoire, un grand nombre d’outils ont été développés pour la recherche en imagerie et en spectroscopie par résonance magnétique nucléaire pour étudier le muscle squelettique des rongeurs, en particulier des souris. Tous les animaux auront atteint l’âge adulte, les greffes musculaires étant effectuées au minimum à 2 mois. Tous les animaux auront donc atteint leur taille adulte au moment de la greffe et des expérimentations RMN. Le génotypage par tatouage des phalanges sera effectué par l’équipe UMRS 974 dans les projets antérieurs à l’actuel projet (réutilisation des animaux). Les animaux de génotype différent seront maintenus dans des cages différentes afin de s’affranchir de toute erreur de génotype lors des expérimentations.

339 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie d'implantation sous la peau de biomatériaux ensemencés de cellules musculaires humaines, puis est tué pour prélever ces implants, afin d'étudier une ossification anormale des muscles observée chez des patients paralysés. Le porteur indique qu'une perte de poids peut suivre l'anesthésie et l'intervention. Il affirme que les cultures in vitro ne rendent pas compte de la complexité de la pathologie et justifie le recours au modèle murin.

Objectifs

Les patients polytraumatisés paralysés présentent de nombreuses complications qui impactent leur récupération et leur qualité de vie. Parmi ces complications, les paraostéoarthropathies neurogènes (POAN) sont un développement anormal de tissu osseux au sein du muscle, à proximité des articulations (hanche, coude, genou et épaule). Ces ossifications entraînent des douleurs, des raideurs articulaires et des compressions des nerfs et des vaisseaux qui ont des conséquences majeures chez ces patients déjà lourdement handicapés. A ce jour, il n’existe aucun traitement médical efficace et la seule option thérapeutique est de retirer chirurgicalement le tissu osseux anormal. Ce traitement tardif et palliatif expose ces patients fragiles à de nombreux risques anesthésiques et opératoires. Du fait de son mécanisme d’apparition inconnu, il est impossible actuellement de proposer des thérapeutiques préventives.

Bénéfices attendus

Nos travaux de recherche ont permis de caractériser une population cellulaire du muscle à l’origine de ce développement osseux. Grâce à nos modèles de culture in vitro, nous avons identifié de petites molécules exprimées par ces cellules, des micro-ARN, qui sont susceptibles de contribuer au développement de POAN. Ce projet vise à étudier le rôle des micro-ARN identifiés dans le développement de tissu osseux. Pour cela nous étudierons notre modèle murin d’ossification ectopique par biomatériaux cellularisés. Ces biomatériaux sont ensemencés avec les cellules musculaires humaines isolées à partir de résidus opératoires de muscle de patients. Ils sont ensuite implantés en sous-cutané chez des souris immunodéficientes « Nude » (pour éviter le rejet des cellules humaines) puis prélevés afin d’analyser le processus d’ossification.

Procédures

Procédure chirurgicale d'implantation sous-cutanée de biomatériaux d’une durée de 10-15 minutes et réalisée sous anesthésie et analgésie contrôlée.

Impact sur les animaux

Suite à l'anesthésie et à l'intervention, une perte de poids peut être observée.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour procéder au prélèvement des biomatériaux.

Remplacement

Depuis la première description de cette complication, toutes les recherches sur patients humains n’ont pas permis de comprendre les mécanismes de développement des POAN ni de trouver un traitement préventif. Le diagnostic des POAN est retardé car les symptômes initiaux sont peu spécifiques et passent inaperçus. De plus, la limitation articulaire est tardive (6ème semaine post-traumatique) et ces complications ne sont pas systématiques. En conséquence, les facteurs de risques publiés chez l’humain sont rétrospectifs et confondants. Si l’étude in vitro de cellules issues de résidus opératoires de patients POAN nous a permis d’identifier les populations cellulaires et signaux moléculaires possiblement impliqués dans la genèse des POAN, cette approche ne peut pas rendre compte de la complexité de la pathologie. L’utilisation de ce modèle d’ossification ectopique in vivo par biomatériaux permet de caractériser et d’étudier le devenir de notre population cellulaire humaine d’intérêt en modélisant un système biologique.

Réduction

Ce projet nécessite un nombre maximal de 339 souris. Les protocoles expérimentaux seront réalisés de manière séquentielle dans le but d’optimiser les temps de prélèvement des biomatériaux, identifier les micro-ARN les plus intéressants et ainsi appliquer le principe de réduction et limiter le nombre d’animaux nécessaires.

Raffinement

Afin de raffiner nos procédures et réduire au maximum le stress et la douleur, nous utiliserons des protocoles établis d’anesthésie et de prise en charge de la douleur (analgésie) en respectant les points limites d’arrêt du protocole. Le suivi post-opératoire associé à une surveillance clinique rapprochée sont strictement réalisés. Enfin, les conditions d’hébergement des animaux sont contrôlées avec le respect d’une période d’acclimatation et la mise à disposition d’un enrichissement adéquat.

Choix des espèces

La souris est un modèle in vivo communément utilisé dans l’étude du métabolisme osseux et de la physiologie musculaire. Les gestes chirurgicaux sur ces animaux sont parfaitement maîtrisés par les personnels impliqués qui sont par ailleurs formés pour évaluer et prendre en charge la douleur chez ces animaux. Les souris seront utilisées au stade jeune adulte pour un âge compris entre 6 et 8 semaines. Il s’agit du stade le plus largement décrit et validé dans les publications. A cet âge, nous limitons les biais liés à l’utilisation de souris vieillissantes. De plus, leur taille est suffisante pour une manipulation aisée lors de l’implantation des biomatériaux.

Nourries d'un régime gras et sucré jusqu'au prédiabète, des souris subissent sous anesthésie des plaies par excision ou par pression, le retrait de leur croûte, l'application d'un substitut cutané humain et, pour les souris immunodéprimées, une greffe de peau humaine, ainsi que des incisions répétées de la queue pour les tests de glycémie. 1 072 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur reconnaît que les plaies et le retrait de la croûte peuvent causer une douleur, que l'isolement en cage peut priver les souris d'interactions et que les souris immunodéprimées s'infectent plus, pour une étude de la cicatrisation des plaies chroniques chez les patients diabétiques. Le résumé ne mentionne aucun antidouleur ni le nombre de plaies par souris, et annonce des points limites "clairement définis" sans les donner.

Objectifs

Ce projet est un projet de recherche fondamentale sur la compréhension de l’intégration de cellules humaines dans la problématique des plaies chroniques non cicatrisantes afin de déterminer la contribution des cellules du donneur versus hôte dans la régénération tissulaire. Les plaies chroniques sont des plaies de pression qui apparaissent chez les patients diabétiques, qui persistent dans le temps, ne cicatrisent pas et mettent la survie ou la qualité de vie du patient à risque pouvant entraîner de graves complications voire un décès. La thérapie locale des ulcères du pied repose principalement sur le débridement de la plaie et la protection des plaies à l’aide de pansements mais la cicatrisation reste longue et peut échouer. Il y a une urgente nécessité à trouver de nouveaux traitements et augmenter la compréhension du défaut de cicatrisation. Les études d’efficacités des pansements et peaux artificielles incluant des cellules sont principalement effectuées sur des animaux sains avec quelques études sur des animaux pathologiques et exclusivement réalisées sur des plaies aigues de type coupure. Toutefois, la peau d’un patient diabétique ou d’un sujet sain sont différentes, de même qu’une plaie liée à la gravité par application de la pression du corps est très différente d’une coupure. L’objectif de ce projet est de caractériser le rôle d’une peau artificielle humaine dans l’amélioration significative de la durée et de la qualité de la cicatrisation de la peau après coupure et application de pression chez des souris non et pré- diabétiques, mâles et femelles.

Bénéfices attendus

La compréhension des mécanismes de contribution des cellules du donneur versus hôte dans la formation du nouveau tissu permettra, à terme, de proposer des pistes de traitement adaptées aux défauts de cicatrisation qui peuvent affecter les patients diabétiques et améliorer leur qualité de vie.

Procédures

Les souris seront soumises à un régime hypercalorique riche en graisse et sucre afin d’induire un pré-diabète. Des plaies d’excision, de pression, l’enlèvement de la croûte, la greffe de peau humaine et l’application du substitut cutanée humain seront effectuées sous anesthésie générale. Il existe une répétition d’anesthésie pour l’induction des plaies de pression suivie de l’enlèvement de la croûte. La détermination du temps de régime hypercalorique nécessaire pour induire un prédiabète nécessite la répétition de tests de tolérance au glucose et de tests de sensibilité à l’insuline. Les tests de tolérance au glucose nécessitent une incision de la queue répétée. La répétition de prise de photo sera effectuée sur souris vigile sauf si l’activité de certains animaux ne le permet pas et alors une anesthésie sera effectuée.

Impact sur les animaux

Les souris immunodéprimées sont sujettes à plus d’infection. La génération de la plaie et l’enlèvement de la croûte peuvent engendrer une douleur. La durée des expérimentations peut engendrer des signes excessifs d’agressivité et l’apparition d’irritations ou de griffures cutanées ou l’apparition d’apathie, de prostration ou d’immobilité. La mise en cage isolée des souris pour préserver les plaies induites et ne pas avoir de sur-blessure peut engendrer une perte d’interaction.

Devenir

Mise à mort en fin d’expérimentations et prélèvement des tissus.

Remplacement

La cicatrisation est un processus naturel qui permet à la peau de se refermer. Souhaitant étudier les défauts de cicatrisation liés au diabète (régime enrichi en sucre/gras), et l’effet de la pose d’un substitut cutané sur les blessures, notre projet requiert une approche intégrée qui n’est rendue possible que par l’utilisation du modèle souris. Aucune méthode alternative ne peut se substituer à l’utilisation des animaux. Ce projet de recherche fait suite à des résultats cellulaires obtenus et des travaux in vitro se poursuivent en parallèle.

Réduction

Le nombre total de souris prévues pour ce projet est de 1072 incluant les 2 sexes. Ce nombre maximal inclut la possibilité de reproduire les expériences en cas d'imprévu, donc il est très vraisemblable que le nombre réel d'animaux utilisé sera inférieur à ce nombre maximal. Nous prévoyons de valoriser au maximum les animaux utilisés, en constituant des banques de matériel biologique qui pourront être utilisées pour répondre à d'autres questions sur ces mêmes modèles.

Raffinement

Les souris seront suivies avec un soin particulier, elles seront observées tous les jours et pesées 1 fois par semaine. Les points limites sont clairement définis, afin de détecter précocement tout signe de souffrance.

Choix des espèces

Les modèles murins, bien que présentant certaines limites par rapport à la physiologie humaine, restent largement utilisés pour étudier l’intégrité fonctionnelle de la peau. Cette espèce possède une physiologie et une organisation cutanée proche de celle de l'Homme et permet d'étudier l’induction des plaies et les processus de cicatrisation, tout en complétant l'analyse jusqu'aux étages cellulaires et moléculaires. Nous utiliserons des souris âgées minimum de 3 semaines pour débuter les régimes hypercaloriques et pour que les souris soient sexuellement matures au moment de l’induction des plaies. Excepté pour les souris NSG qui auront 6 semaines d’âge au moment de la greffe de peau humaine.

144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont soumises à un régime gras pendant vingt-quatre semaines pour induire une obésité et une résistance à l'insuline, avec des injections répétées et des incisions de la queue pour prélever le sang, afin d'étudier le rôle de certains lipides dans la graisse brune. Le porteur relie ce travail au développement de thérapies nutritionnelles contre l'obésité humaine. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut remplacer l'"organisme entier" pour ces questions faisant intervenir plusieurs organes.

Objectifs

L’obésité (accumulation de masse grasse blanche appelée tissu adipeux blanc) est un problème de santé publique dû à un apport calorique trop important, à une sédentarité mais aussi à un déséquilibre dans les lipides ingérés, avec une consommation trop importante en lipides ω6 (huile de tournesol) par rapport aux lipides ω3 (huiles de poisson, colza). Selon les recommandations, un ratio adéquat de lipides ω6/ω3 inférieur à 5 devrait être trouvé dans l’alimentation or actuellement en France ce ratio dépasse 12 en moyenne. L’obésité induit une inflammation chronique responsable du développement de pathologies dites métaboliques comme le diabète de type 2. Une autre masse grasse existe en petite quantité chez l’homme, le tissu adipeux brun qui permet une dissipation de l’énergie ingérée sous forme de chaleur et limite ainsi l’accumulation de tissu adipeux blanc. Il a été montré que cette masse grasse brune est déficiente chez les personnes obèses. Enfin il a aussi été décrit que dans certaines conditions comme l’exposition au froid, du tissu adipeux brun pouvant apparaitre au sein de la masse grasse blanche et ce phénomène est appelé brunissement. À ce jour, il n'existe aucun traitement efficace de l'obésité et une perspective serait de développer des stratégies médicamenteuses ou nutritionnelles favorisant la formation du tissu adipeux brun ou favorisant le brunissement du tissu adipeux blanc. Nous avons montré en culture qu’un lipide dérivé des acides gras ω6 empêchait le brunissement des adipocytes blancs. Des études, montrent qu’une alimentation riche en lipides ω3 contrôle les niveaux de ce lipide et ont des effets bénéfiques sur la santé. Il est ainsi possible d’envisager que ces effets bénéfiques puissent passer par une réactivation de la masse grasse brune du fait d’une diminution de ce lipide. Nous envisageons donc de soumettre des souris à une alimentation grasse avec un fort ratio ω6/ω3 pendant 12 semaines afin d’induire une obésité. Après 12 semaines, les animaux passeront à des régimes avec de faibles ou de forts ratio ω6/ω3 pendant 12 semaines supplémentaires. Nous vérifierons si ce changement alimentaire améliore l’obésité des animaux et l’inflammation associée et si ces effets sont sous-tendus par une augmentation de la masse grasse brune ou du brunissement de la masse grasse blanche. En parallèle nous doserons dans le sang et les tissus la quantité du lipide dérivé des ω6.

Bénéfices attendus

Nous nous attendons à ce que ce travail nous permette de comprendre l’impact des lipides ω6 et ω3 dans le développement de la graisse brune et du brunissement de la graisse blanche, ouvrant la voie au développement de thérapies nutritionnelles pour lutter contre le surpoids/obésité et les troubles métaboliques associés.

Procédures

Les animaux recevront différents régimes pendant 24 semaines. Ils seront placés dans une armoire thermostatée à 30°C pour leur confort thermique. Lors des tests métaboliques aux semaines 12, 22 et 23, les animaux recevront des injections intrapéritonéales et auront des prélèvements (sur animaux vigiles) d'une goutte de sang à la queue. Concrètement, suite à une injection (durée max 5 secondes) de glucose (S12 et S22) ou d'insuline (S23), une légère incision (durée 1 à 2 secondes, une incision unique pour tout le test) est réalisée à la queue et une goutte de sang (5µL, il faut environ 3 à 5 secondes pour que la goutte de sang se forme à la queue par massage de celle-ci) sera prélevée à 0, 15, 30, 45, 60, 90 et 120 minutes pour doser la glycémie. Au cours de la dernière semaine (S24), les souris recevront une injection intrapéritonéale quotidienne (durée d'une injection max 5 secondes; 7 injections au total) d’un activateur adrénergique ou d'une solution saline. 10 minutes après la première injection, une goutte de sang sera pélevée (incision 1 à 2 secondes ; formation de la goutte 3 à 5 secondes) à la queue pour un dosage du glycérol, représentatif de l’activité lipolytique des tissus adipeux. Au total un même animal pourra recevoir au maximum 10 injections sur une période de 24 semaines et 195 µL de prélèvement sanguin.

Impact sur les animaux

Dans le programme présenté les nuisances prédictibles pour l’animal sont liées 1) au régime riche en graisse qui induira l’obésité et l'insulinorésistance ; 2) aux douleurs provoquées par les injections intrapéritonéales qui sont nécessaires à différents stades de l’expérimentation pour réaliser les tests métaboliques et 3) aux prélèvements sanguins à la queue pendant ces mêmes tests métaboliques.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure. Après 24 semaines de régime alimentaire, les animaux seront anesthésiés (injection intrapéritonéale), une analyse de la composition corporelle sera réalisée par tomographie (rayons X) et le sang sera prélevé. Les animaux seront ensuite mis à mort et le prélèvement d’un maximum de tissus/organes à la fin de la procédure sera réalisé. Les tissus seront pesés, une partie sera congelée pour les analyses ultérieures (ARN... ) et l’autre partie fixée pour des analyses histologiques. Notre programme vise à étudier l'impact de différents régimes alimentaires (ratio ω3/ω6), sur la fonction des tissus adipeux et sur le métabolisme insulino-glucidique qui implique de nombreux organes (tissus adipeux, foie, muscles, ...), ce qui nous contraint à mettre à mort les animaux afin d'accéder à ces organes.

Remplacement

Ce programme vise à découvrir les liens qui existent entre composition alimentaire en lipides (ratio ω3/ω6), fonction des tissus adipeux blancs, bruns et brites et l’insulino-résistance ou le diabète de type 2. Ces processus pathologiques complexes touchent la régulation du métabolisme insulino-glucidique et impliquent de nombreux organes dont le pancréas, le foie, les tissus adipeux et les muscles. Il n‘existe pas pour l’instant de modèle in vitro qui pourrait remplacer l‘expérimentation sur un organisme entier pour répondre aux questions posées ici. De plus ces expériences font suite à de nombreuses expériences menées in vitro sur des cellules en culture qui ont permis de cibler les hypothèses les plus pertinentes à poser in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été calculé afin d’obtenir des résultats significatifs à partir d’un nombre minimum d’animaux. Nous débuterons par des groupes de 8 souris mâles (72 souris au total) puis nous réitérerons l’expérience par des groupes de 8 souris femelles (72 souris au total) et 4 souris par cage. Le nombre total de souris (cf. ci-dessus) nous permettra d’obtenir en quantité suffisante tous les échantillons tissulaires nécessaires à notre étude. Ce nombre de souris nous permettra également de réaliser des études statistiques adaptées en comparant les groupes deux par deux (régime alimentaire versus régime contrôle, ou encore régime alimentaire versus traitement mimant l’exposition au froid). Si aux termes de la première expérience avec les souris mâles nous n’avons aucun résultat concluant, nous ré-évaluerons l’intérêt de réaliser l’expérience avec les souris femelles.

Raffinement

Les souris utilisées sont des souris contrôles. Toutes les expériences et manipulations des animaux seront effectuées avec le souci de préserver le bien-être de l‘animal : maintien à la thermoneutralité donc à leur température de confort (30°C) ; enrichissement de l’environnement; surveillance régulière; suivi selon une grille d’évaluation prévoyant le recours à des points limites précoces et adaptés (absence de toilettage, perte de poids) ; prélèvements sur animaux vigiles effectués par des personnes expérimentées; prélèvements espacés dans le temps au maximum et volumes prélevés correspondant au minimum nécessaire.

Choix des espèces

Nous envisageons d'utiliser des souris C57Bl6J. Ce modèle correspond à l'espèce et à la souche sur laquelle nous travaillons dans notre laboratoire et pour laquelle nous avons plusieurs données de référence pour notre étude. De plus la souche C57Bl6J est connu pour répondre aux régimes riches en graisse en développant une obésité et une insulinorésistance. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 10 semaines. Ces expériences étant d’une durée maximum de 24 semaines, l’âge maximum des souris en fin d’expérience sera d’environ 34 semaines. L’obésité nutritionnelle prend du temps à se mettre en place et nous voulons examiner des sujets adultes.

260 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie du crâne pour la pose de canules puis des stimulations cérébrales répétées destinées à provoquer aversion, évitement et troubles anxio-dépressifs, avant divers tests de comportement. Le porteur indique que cette aversion et ces troubles sont attendus et ne peuvent être évités car ils sont l'objet de l'étude. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne peut remplacer l'observation chez l'"animal entier" vivant.

Objectifs

Les neurones de l'aire tegmentale ventrale (VTA) constituent le point de départ du système de récompense du cerveau. Ils sont donc impliqués dans les processus motivationnels et dans la récompense, mais également dans l’aversion et dans les troubles de l’humeur (anxiété et dépression). Les neurones de la VTA sont régulés différents niveaux et notamment par des structures inhibitrices telles que la "queue de la VTA" (tVTA). Les données pionnières sur la tVTA ont conduit à de premières études fonctionnelles montrant un potentiel rôle de cette région dans les processus aversifs chez le rat. Néanmoins l’absence de marqueur spécifique de la tVTA ne permettait pas de manipuler et d’étudier spécifiquement cette région. Récemment un marqueur spécifique des neurones de la tVTA a été mis en évidence et nous avons à présent des souris permettant de manipuler spécifiquement ce marqueur et donc la tVTA. Ces souris nous permettent de spécifiquement stimuler ou enregistrer l’activité des neurones de la tVTA grâce a des approches virales Le but de ce projet est de définir le(s) rôle(s) de la tVTA dans la réponse à des stimuli aversifs. Pour se faire nous allons 1/définir si des stimulations de la tVTA sont aversive, 2/ enregistrer l’activité des neurones de la tVTA dans des taches aversives 3/définir si une stimulation chronique de la tVTA induit un phénotype anxio-dépressif. Ces expériences seront réalisées chez la souris vigile libre de ses mouvements impliqués dans diverses taches comportementales. Des souris mâles et femelles seront utilisées.

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est d'étudier le rôle de la tVTA dans la réponse aux stimuli aversifs ainsi que d’évaluer une potentielle implication de la tVTA dans l’anxiété et la dépression. Le but premier de cette étude est fondamental, mais il amènera également des avancées permettant de révéler de nouvelles cibles thérapeutiques, potentiellement différentes chez le mâle et la femelle.

Procédures

Les animaux pourront subir une chirurgie de 1h30, et des tests comportementaux d’aversion et d’évaluation des troubles anxieux et dépressifs. Maximum 1 test par jour (allant de 5min à 6h). Des stimulations chroniques de la tVTA (20min par jour pendant 10 jours) seront également effectuées. Les animaux subiront au maximum 7 tests ce qui correspond à 20 jours de procédures. 2 tests de 1 jour de procédure pourront etre répétés 2 fois (inclue dans les 20 jours).

Impact sur les animaux

La chirurgie peut induire de la douleur post-opératoire et une inflammation locale transitoire autour du dispositif des canules (peau du crane). Les stimulations de la tVTA peuvent induire une aversion (comportement d’évitement et arrêt comportemental) et le développement de troubles anxio-dépressifs. Cela est attendu et ne peut être évité, car c'est l'objet de l'étude. Les tests comportementaux génèrent un stress pendant le test. Cela est inhérent à ces tests qui interrogent le niveau d'anxiété et/ou de dépression des animaux. Cela est attendu et ne peut être évité. Le stress s'arrête dans tous ces cas à l'arrêt du test.

Devenir

les animaux seront mis à mort pour prélèvements de tissus

Remplacement

Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, le développement des troubles anxio-dépressifs nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal entier vivant et vigile.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire le nombre d’animaux, mais en obtenant le maximum d’information scientifique par test. Les effectifs ont été calculés grâce à deux facteurs. A : un calcul statistique pour calculer le nombre de sujets nécessaires pour tirer des conclusions scientifiques statistiquement fiables de notre étude. B : Les effectifs ont été augmentés de 30% pour prendre en compte la variabilité comportementale interindividuelle des animaux et d'éventuelles mauvaises positions des injections virales et des canules. En effet, la littérature et notre expérience dans le domaine de l’anxiété et de la dépression montrent une forte variabilité (physiologique) dans les niveaux de base d’anxiété et de dépression des animaux naïfs. Certains animaux naïfs peuvent montrer des niveaux d’anxiété et de dépression élevés nécessitant leurs exclusions. Ensuite, comme dans tout modèle d’anxiété et de dépression (conformément à ce qui se passe chez l’homme) tous les animaux ne montrent pas une aversion à un stimulus aversif et ne développent pas de phénotype anxio-dépressif en réponse à des stimuli aversifs répétés. Ces animaux dits résilients nécessitent une augmentation des effectifs. Ces facteurs de variabilités interindividuelles nous amènent à augmenter de 20% nos effectifs. Enfin, nous évaluons a 10 % la perte d’animaux du a des mauvais placements des injections virales et des canules pendant la chirurgie dû à la taille réduite de la structure cible. Toujours dans l’idée de diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés, les animaux subiront un enchaînement de gestes expérimentaux. 20 souris mâles ou femelles sont également ajoutées afin de réaliser des essais de chirurgie et de comportement et de raffiner au mieux les expériences

Raffinement

Les animaux sont hébergés en animalerie (température, humidité et le cycle jour/nuit contrôlé). Nourriture et boisson sont disponibles à volonté. Les animaux sont hébergés en cohorte de 2 à 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Des carrés de coton seront placés dans la cage pour favoriser la nidation, et des barreaux de bois à ronger pour limiter les comportements d’agressivité. Nous travaillerons en cycle jour/nuit inversé (lumière allumée de 21h à 9h), pour éviter les manipulations durant le temps de sommeil des animaux et ainsi diminuer le stress. Les tests comportementaux, à l’exception des tests du labyrinthe en croix surélevé basé sur l’aversion a la lumière) se fond en lumière rouge afin de limité au maximum la perturbation du cycle circadien des animaux. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement suivit afin de déceler tout signe de mal-être. Durant les chirurgies des méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont utilisées. En cas de signes de souffrance de l’animal, des soins (désinfection, suture de plaie), une administration d’antalgique ou d’anti-inflammatoire, une séparation (blessures entre congénères) sera réalisée après concertation avec le vétérinaire ou la SBEA. Des points limites adaptés, un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance est sont utilisé tout au long des experiences. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, elle pourrait être intégrée dans nos procédures.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris modifié génétiquement pour cibler spécifiquement la tVTA. Ceci implique l'utilisation de souris spécifique et ne permet pas l'utilisation d'autres espèces Étant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures, des animaux adultes seront utilisés (début des procédures à partir de 8 semaines, poids supérieur à 20g). La limite d’âge supérieur est de 1an afin d’éviter les facteurs liés au déclin cognitif des animaux âgés

810 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un diabète leur est induit et un traitement au tamoxifène est administré, sans recours à l'analgésie ni à l'anesthésie que le porteur écarte pour ne pas perturber le développement embryonnaire, afin d'étudier les malformations cardiaques chez des souris génétiquement prédisposées. Le porteur indique que le tamoxifène peut être délétère voire mortel pour les femelles gestantes et provoquer des défauts de développement des embryons. Il affirme qu'aucune méthode de substitution ne permet d'étudier l'effet d'une surcharge en glucose sur le développement du cœur.

Objectifs

Lors de la grossesse, le tabac, le diabète, l’obésité et l’âge de la mère sont associés à un risque accru d’avoir un enfant présentant une malformation cardiaque. Les mécanismes sous-jacents sont encore mal compris. Les facteurs épigénétiques induits par les changements environnementaux influent profondément sur l’occurrence et le spectre des malformations chez l’homme et les modèles animaux. Par conséquent, une compréhension détaillée de ces facteurs et les altérations génétiques sous-jacentes est cruciale pour un meilleur diagnostic. Les 3 formes d’hyperglycémie maternelle (diabète de type I, II, gestationnel) sont associées à diverses malformations cardiaques congénitales notamment des anomalies de latéralité (hétérotaxie), des anomalies de type conotroncale (ventricule droit à double issue, transposition des grandes artères, tronc artériel commun, ventricule unique), des défauts de septation des cavités cardiaques et d’hypertrophie cardiaque. Ce projet a pour but d’étudier l’effet du diabète pre gestationnel sur le développement embryonnaire de souris génétiquement prédisposées aux malformations cardiaques.

Bénéfices attendus

Le diabète prégestationnel chez la mère augmente le risque de malformations cardiaques chez l'enfant de 5 fois. La prévalence du diabète prégestationnel (type 1 et 2) a d'ailleurs presque doublé au cours des dernières années avec une tendance à augmenter encore plus. Cependant, les mécanismes par lesquels les altérations de l'homéostasie du glucose maternel perturbent le développement cardiaque reste encore largement incertain. Par conséquent, le but de ce travail proposé est d'acquérir une meilleure compréhension des processus compromettant le développement cardiaque dans les cardiopathies induites par le diabète. Cette connaissance nous permettra d'avoir une meilleure prédiction des risques et la possibilité d'identifier des cibles thérapeutiques pour des thérapies individualisées et de prévention. De plus, en utilisant le modèle de méthylation de l'ADN dans le sang, nous serons en mesure de présenter une gamme plus large d'outils de diagnostic pour l'identification et la quantification des facteurs environnementaux contribuant à un développement cardiaque perturbé.

Procédures

Les animaux seront soumis aux suivantes : injection sous cutanée et prélèvement sanguin de 10 microlitres au niveau de la queue..L’induction du modèle sera réalisée par une injection sous cutanée de tamoxifène (médicament bien connu) qui devrait engendrer peu de douleurs aux animaux. Dans cette étude, nous n’avons pas recours à l’administration d’analgésiants et anesthésiants, une procédure pouvant impacter sur le développement embryonnaire compte tenu de l’interaction gènes-environnement et des effets épigénétiques sous-jacents. Dans le cas d’une souffrance légère, la surveillance de l’animal sera renforcée avec une observation bi journalière. L’eau sera remplacée par une eau enrichie en pyruvate 1% jusqu’à la fin du protocole expérimental. Les prélèvements sanguins nécessaires aux mesures de la glycémie, seront limités à un volume de 10 ul par animal et réalisés au niveau de la queue. Ceci est rendu possible par l’utilisation de glucomètre à bandelettes réactives.

Impact sur les animaux

Le paradigme expérimental, induction du diabète, est susceptible d’être générateur de souffrance ou de stress. Un suivi journalier et un scoring au minimum deux fois par semaine seront réalisés sur les animaux afin d’établir les niveaux de douleurs, de souffrance et d’angoisse éventuellement générés lors du projet. Les souris dont les paramètres physiologiques seront modifiés seront mises à mort. Suivant les scores obtenus l’eau complémentée en sucrose pourra être remplacée par une eau sans sucrose jusqu’à la fin du protocole expérimental. L’injection de Tamoxifène peut avoir un effet délétère voir potentiellement mortel pour les femelles gravides si l’administration a lieu en début de gestation. L’administration de Tamoxifène durant la gestation est associée à des défauts de développement du placenta avec pour conséquences des défauts de formation des embryons. Des défauts embryonnaires peuvent aussi être directement liés à l’exposition au Tamoxifène. Bien qu’aucun défaut cardiaque n’ait été décrit à ce jour nous prévoyons d’inclure des groupes supplémentaires afin d’exclure l’impact du Tamoxifène sur l’apparition d’anomalies du coeur et n’envisageons pas d’administration pendant la gestation mais prévoyons une seule injection 7 jours avant la mise en accouplement, à ce stade d’injection le tamoxifène n’aura pas d’effet délétère.

Devenir

Tous les animaux entrant dans cette procédure seront mis à mort.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude d’une surcharge en glucose sur le développement du cœur.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. 810 (540 en procédure 1, 270 en procédure 2) correspond au nombre minimum d’animaux à utiliser afin d’obtenir des données scientifiquement robustes sans augmenter inutilement la souffrance infligée aux animaux. Il s’agit d’une analyse de biologie fondamentale visant à observer l’apparition potentielle d’un phénotype dans un contexte donné et de caractériser ce phénotype. Nous n’utilisons donc pas d’approche statistiques.

Raffinement

Le modèle animal de diabète pre gestationnel qui sera utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et est un excellent modèle au regard de la pathologie humaine. Par ailleurs, le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Notamment, les prélèvements sanguins nécessaires aux mesures de la glycémie, seront limités à un volume de 10 microlitres par animal. Afin d'assurer le bien-être des animaux, nous respecterons la réglementation européenne concernant la densité d'animaux par cage et les cycles d’éclairage diurne. Les souris seront au nombre de 5 maximum par cage de 542 cm2 afin de respecter leur instinct grégaire. L’environnement sera enrichi à l’aide de dômes en cartons et de bandelettes de kraft. Les reproducteurs ne seront pas mis en accouplement dans la semaine suivante leur déménagement de pièce ou avant 8 semaines d’âge. Les mères auront au maximum trois portées en production et nous ferons le maximum pour que ces portées ne soient pas immédiatement successives. Bien que le protocole soit relativement peu invasif, un suivi journalier des animaux permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Avant chaque procédure, nous nous assurerons que l’animal présente un bon état général. Après l’injection de tamoxifène, nous nous assurerons qu’aucun animal ne présente de signe d’infection au site d’injection. Le paradigme expérimental, induction du diabète, est susceptible d’être générateur de souffrance ou de stress. Un suivi journalier et un scoring au minimum deux fois par semaine seront réalisés sur les animaux afin d’établir les niveaux de douleurs, de souffrance et d’angoisse éventuellement générés lors du projet. Les souris dont les paramètres physiologiques seront modifiés seront mises à mort. Suivant les scores obtenus l’eau complémentée en sucrose pourra être remplacée par une eau sans sucrose jusqu’à la fin du protocole expérimental. L’animal pourra être hydraté par injection intra péritonéale de solution saline. Pour limiter leur stress, nous doublerons l’enrichissement (bandelettes de kraft et maisonnettes en carton).

Choix des espèces

Notre sujet de travail porte sur les malformations cardiaques causées par une hyperglycémie maternelle. A ce jour, les souris génétiquement modifiées sont les seuls modèles animaux permettant de mimer assez fidèlement ces pathologies. En effet, il existe une excellente homologie des gènes Kir6.2 et Nkx2.5 chez l'humain et chez la souris. Les cœurs humains et murins ont un développement anatomique remarquablement similaire. Par ailleurs, des outils génétiques robustes ont été développés chez la souris ce qui en fait l’un des meilleurs modèles d’étude pour comprendre la formation du cœur. Ce projet utilisera des femelles âgées de 12 à 14 semaines afin d’exclure l’impact de l’âge maternel sur l’apparition d’anomalies cardiaques.

338 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie de quatre heures, une privation de sommeil de dix-huit heures et une épreuve d'endurance respiratoire sous contention, pour étudier le lien entre manque de sommeil et fatigue des muscles respiratoires. Le porteur relie ce travail au sevrage de la ventilation en réanimation, une retombée située dans le futur. Il affirme qu'aucune méthode substitutive comme la culture cellulaire ne peut remplacer l'étude du comportement veille-sommeil chez l'animal.

Objectifs

L’un des enjeux majeurs pour les patients en service de réanimation est le sevrage de l’aide artificielle à la respiration (ventilation mécanique). En effet, les patients en échec de sevrage chez qui il est nécessaire de maintenir la ventilation mécanique ont plus de risques de décéder au cours de leur hospitalisation en réanimation. L’endurance des muscles respiratoires joue un rôle essentiel lors du sevrage de la ventilation mécanique, puisqu’elle doit être suffisante pour permettre une respiration spontanée non assistée. Il a été proposé que le manque de sommeil puisse diminuer cette endurance inspiratoire, les patients en réanimation ayant un sommeil diminué et fragmenté. Des études ont effectivement montré chez l’être humain une diminution de l’endurance inspiratoire après une privation d’une nuit de sommeil. Une étude précédemment menée au laboratoire a démontré qu’il existe un lien entre la privation de sommeil et l’endurance inspiratoire chez le rat. Les objectifs de ce projet sont 1) de comprendre les mécanismes cérébraux à l'origine de la fatigue des muscles respiratoires suite à une privation de sommeil et 2) de tenter de limiter la fatigue musculaire en administrant des médicaments qui sont connus pour avoir un effet "éveillant"

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre une meilleure compréhension du fonctionnement du lien entre endurance inspiratoire et sommeil. Le projet devrait aussi permettre dans le futur de proposer de nouveaux médicaments pour faciliter le sevrage à la ventilation assistée pour les patients en réanimation. D'un point de plus large, ce projet ouvre la voie à des pistes thérapeutiques pour soulager les patients atteints de maladies respiratoires chroniques très souvent associées à des troubles du sommeil.

Procédures

chirurgie (4h), injection intrapéritonéale de molécules (moins de 1 min), enregistrement de l'activité de l'animal +/- privation de sommeil (18h), épreuve d'endurance respritoire (1h)

Impact sur les animaux

Stress lié à l'isolement des animaux en post chirurgie, à la privation de sommeil et à la contention lors de l'épreuve d'endurance respiratoire

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin de prélever leur cerveau pour les analyses post-mortem.

Remplacement

Ces approches nécessitant des expériences comportementales avec interaction entre différents organes (système respiratoire et système nerveux) et ce en fonction de deux états très différents de l’organisme (la veille et le sommeil), il n’est pas envisageable d’utiliser des méthodes substitutives à l’expérimentation animale telles que la culture cellulaire ou les analyses informatiques.

Réduction

Des études statistiques préalables nous ont permis de définir les effectifs nécessaires à la réalisation de ce projet de façon à mettre en évidence des différences significatives tout en limitant au maximum le nombre d’animaux utilisés. Un calcul de puissance statistique a été utilisé pour minimiser le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des données significatives. Pour satisfaire à ces critères, ceci implique d'utiliser des groupes expérimentaux composés de 13 rats. De plus, le nombre d'animaux contrôles sera réduit en utilisant un même lot contrôle pour plusieurs molécules médicaments ayant le même solvant, il a été possible de réduire le nombre d’animaux pour ces groupes contrôles. Des tests statistiques seront utilisés pour l’analyse des résultats.

Raffinement

Nous avons planifié ce projet en gardant à l'esprit la nécessité de réduire, sinon de soulager l'inconfort, la douleur, la détresse ou l'angoisse des animaux, et dans le but d'obtenir plus d'informations pertinentes à moindre coût en termes de "mal être" animal. L’évaluation et la prise en charge de la douleur, la souffrance et l’angoisse seront effectuées lors du suivi quotidien des animaux. Des critères de points limites gradés précis sont définis dans une grille de suivi (perte de poids, apparence, comportement de l’animal…). Un animal atteignant un des points limites définis nécessitant une intervention est pris en charge sans délai. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape, une pesée 2 fois par semaine, l’apport d’enrichissement spécifique aux rongeurs dans le milieu et le recours à l’anesthésie générale, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgiques ainsi que d’un maintien de la température et d’une hydratation régulière des tissus lors des procédures de chirurgie. Les animaux sont hébergés en groupe de deux avec accès à la nourriture et à l’eau à volonté et à un enrichissement (bâton de peuplier et baguette de papier compressé) pour assouvir leur besoin naturel de ronger. Le stress lié à la nouveauté sera diminué par l’habituation de l’animal aux différents appareils (non fonctionnels). Les expérimentateurs sont compétents en chirurgie.

Choix des espèces

L’espèce animale utilisée est le rat (Rattus norvegicus) de souche Sprague-Dawley. Il s’agit de l’espèce la plus pertinente pour l’étude combinée du sommeil et de la fonction respiratoire. La lignée Sprague-Dawley a été choisie en raison d’une variabilité inter-individuelle faible et des données déjà disponibles. Âge adulte (8 semaines à 12 semaines) pour s’approcher au mieux des données de la littérature et des résultats obtenus par le laboratoire