Procédures modérées

25 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur leur est greffée pour reproduire des métastases péritonéales, puis ils subissent trois anesthésies avec chirurgies par cœlioscopie et administration de chimiothérapie en aérosol pressurisé. Le porteur indique qu'une anorexie, une perte de poids et une accumulation de liquide dans l'abdomen sont attendues, les animaux étant tués en fin de protocole pour prélèvements. Il présente ce projet comme "indispensable" avant tout essai chez l'humain, la souris étant jugée trop petite pour la technique.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’implication de la réponse aux traitements par nanomédicaments de platine/Doxorubicine administrés via PIPAC (Chimiothérapie intrapéritonéale pressurisée par aérosol) dans un modèle animal immunocompétent. Cette approche validera l’utilisation de l’approche immunothérapeutique pour traiter les métastases péritonéales d'origine gastrique. L’évolution de la tumeur primaire et des métastases péritonéales (PM) sera étudiée dans un modèle animal lapin. Des modèles existants de lapins présentant des métastases après injection de tumeur VX2 (carcinome à cellules squameuses de lapin transplantables) vont être traités par chimiothérapie pressurisée par voie coelioscopique (groupe test) versus contrôle (injection de sérum physiologique).

Bénéfices attendus

Ce projet est indispensable avant de réaliser les tests d'efficacité de traitements chimiothérapeutiques sur des individus qui ne sont pas pris en charge par la thérapie curative de nos jours. Au-delà de la valorisation scientifique, les applications en santé humaine seront facilement transposables en raison de l'absence d'études dans ce domaine.

Procédures

Tous les animaux (25) sont soumis à 3 anesthésies générales d'une durée totale maximum d'1h30. Ils reçoivent les mêmes gestes chirurgicaux (incision, insertion de trocart, biopsie et aérosolisation) durant les anesthésies par laparotomie légère et coelioscopie pour chaque PIPAC. La seule différence est le type d'agent thérapeutique administré. Un scanner est réalisé en plus (10 min maximum) lors de la 1ère anesthésie avant la chirurgie. Une dernière anesthésie générale permet de réaliser un 2ème scanner (10 min) avant mise à mort.

Impact sur les animaux

Une anorexie et une perte de poids peuvent apparaître, ainsi qu’une altération de l’apparence physique et du comportement en conséquence. Une augmentation du diamètre abdominal est à prévoir en raison de l'accumulation du liquide d'ascite dans la cavité péritonéale, en particulier les dernières semaines post greffe, d'où la décision de limiter la durée de la manipulation jusqu’aux semaines 5 à 7. Le fonctionnement du transit intestinal peut aussi être perturbé (selles liquides).

Devenir

À l'issue de la procédure, les 25 animaux sont euthanasiés dans le but d'effectuer des prélèvements et des analyses tissulaires et moléculaires.

Remplacement

Des études in vitro ont déjà été effectuées sur ce sujet mais ont montré leurs limites. Les modèles in vitro ne permettent pas de modéliser la complexité de la réponse histologique d’un organisme entier face à l’administration de thérapeutiques, et encore moins en prenant en compte l'environnement tumoral (une métastase en 3 dimensions ne répondra pas aux traitements chimiothérapeutiques de la même façon qu'une culture en 2 dimensions) et la coopération avec le système immunitaire. Ils sont aussi insuffisants pour envisager des essais cliniques chez l’Homme. Les modèles de lapins de carcinose péritonéale sont bien décrits et permettent de mimer le phénomène observé chez l’Homme.

Réduction

Le modèle de carcinose péritonéale et hépatique est maitrisé par l’équipe et les porteurs de ce projet, ce qui permet de limiter des étapes de mises au point, déjà réalisées par le passé dans des laboratoires de renom. De plus, des expériences in vitro ont déjà permis de définir les valeurs de la gamme de concentration des cellules de cancer colorectal murin selon leur cinétique de croissance. Celles in vivo sont organisées dans un ordre précis, avec des témoins choisis de sorte à limiter la répétition d’expériences. Le lapin est l’espèce modèle la plus adaptée pour ces études précliniques.

Raffinement

Les animaux sont élevés dans des conditions d’hébergement (température et hygrométrie de l’environnement, présence systématique d’enrichissement, change régulier de la litière (qui n'est pas en contact avec les animaux mais dans un plateau sous la grille de la cage), nourriture et eau ad libitum, surveillance quotidienne de l’état général des animaux) qui respectent leur bien-être. Une attention particulière sera apportée à l'hydratation des animaux pour surveiller d'éventuels troubles du transit. De plus, l’ensemble des procédures sera réalisé de manière à limiter le stress et la souffrance des animaux (anesthésie, tapis ou lampe chauffante pendant la chirurgie, analgésique post opératoire).

Choix des espèces

Pour l’étude des métastases péritonéales, la souris est l’animal le plus couramment utilisé. Néanmoins, la coelioscopie et la surpression due à la PIPAC/ePIPAC n’est pas compatible avec la taille de la souris à ce jour. Le modèle de lapin est ainsi le plus approprié pour étudier les métastases péritonéales gastriques. Le lapin est un animal avec une durée de vie plus longue que la souris, ce qui permet de réaliser des plans expérimentaux répétés sur de plus longues périodes. Il a une anatomie abdominale et une physiopathologie péritonéale proche de celle de l’homme, ce qui en fait un modèle stratégique en cancérologie digestive. Les lapins seront des jeunes individus (2.5-3.5 kg) pour ne pas interférer avec les processus de vieillissement (si animaux plus âgés) ou des processus de croissance juvénile (si animaux plus jeunes).

212 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une instillation de plutonium dans la trachée sous anesthésie, provoquant une irradiation pulmonaire chronique, puis des traitements par inhalation, injection ou gavage et des séjours en cage métabolique, pour tester des associations destinées à éliminer le radioélément. Le porteur indique que des signes précurseurs de fibrose devraient apparaître et que les animaux sont tués après six semaines ou trois mois pour prélever leurs organes. Il justifie le recours à un "organisme entier" par la biocinétique complexe du plutonium, difficile à reproduire in vitro.

Objectifs

L’objectif de ce projet de recherche est d’améliorer la prise en charge thérapeutique suite à une contamination interne avec du plutonium (Pu). Ces situations peuvent se rencontrer dans les domaines civil et militaire (travailleur du nucléaire, accident, acte de malveillance etc.). Les traitements utilisés actuellement consistent à favoriser l’élimination du radioélément (décorporation) avec une molécule capable de le piéger (chélateur), tel que l’acide diéthylène triamine penta acétique (DTPA) dans le cas du plutonium. Cependant, ce traitement a une efficacité limitée sur les formes peu solubles de plutonium et son effet sur les conséquences biologiques induites à long terme par la contamination n’a pas été étudié à ce jour. Notre approche innovante consistera donc à combiner ce traitement de référence avec des molécules possédant des mécanismes d’action complémentaires afin de favoriser l’élimination du plutonium et de limiter ses effets biologiques. Deux molécules candidates ont été retenues pour ce projet : un anti-inflammatoire, qui devrait permettre de limiter l’inflammation résultant de la contamination et les pathologies associées (fibrose pulmonaire notamment) et un mucolytique, qui devrait favoriser l’élimination du plutonium en fluidifiant les sécrétions bronchiques qui seront éliminées par la toux. L’association de ces molécules avec le DTPA permettra, en cas de libération de Pu à partir des lésions inflammatoires par exemple, de favoriser son élimination sous forme de complexe Pu-DTPA et d’empêcher sa fixation à d’autres organes. Des expériences préliminaires prometteuses avec ces associations thérapeutiques ont été réalisées sur des modèles cellulaires in vitro. Dans ce projet, nous étudierons l’influence de ces associations thérapeutiques sur la biodistribution du plutonium dans l’organisme et sur les effets biologiques induits, tels que l’apparition de fibroses pulmonaires dans le cas de contaminations pulmonaires.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu suite à ce projet porte sur l’amélioration de la prise en charge thérapeutique en cas de contamination pulmonaire par du plutonium. Cette nouvelle stratégie thérapeutique aura pour objectif de limiter les conséquences biologiques de la contamination à moyen et long terme, au premier rang desquelles l’apparition de fibroses pulmonaires. Les résultats obtenus pourront, à terme, contribuer à l’élaboration de nouvelles recommandations thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront contaminés, sous anesthésie, par une instillation intra-trachéale unique (durée maximale 5 secondes). Les traitements seront délivrés par inhalation (bi-hebdomadaire, durée 15 minutes) et/ou injection (hebdomadaire, durée maximale 5 secondes) et/ou gavage gastrique (administration unique après la contamination, durée maximale 10 secondes) après induction d’une anesthésie générale puis per os (dans l’eau de boisson) durant 6 semaines ou 3 mois.

Impact sur les animaux

Les séjours en cage à métabolisme, d’une durée de 1 à 5 jours maximum, génèreront du stress et de l’inconfort pour les animaux. Les cages à métabolisme sont des hébergements individuels permettant le recueil des excrétas (urines et selles) des animaux en vue d’analyses futures (mesures de la radioactivité par exemple). Les animaux sont placés sur des grilles sous lesquelles un système de séparation et de collecte des excrétas est installé. Ces effets indésirables seront temporaires et disparaitront lors du retour des animaux en hébergement classique. Le plutonium possède une toxicité radiologique, mais pas de toxicité chimique. Il induira une irradiation pulmonaire chronique durant 3 mois au maximum. Ce délai est trop court pour donner lieu à l’apparition de pathologies cancéreuses ou des fibroses pulmonaires déclarées. Des signes biologiques précurseurs devraient néanmoins être observés (lésions préfibrotiques, sécrétion de certaines cytokines, accumulation de collagène, etc.).

Devenir

Tous les animaux utilisés pour ce projet seront euthanasiés 6 semaines ou 3 mois après la contamination afin de prélever différents organes et tissus. Ces prélèvements seront nécessaires pour étudier la biodistribution du plutonium dans l’organisme et l’apparition de phénomènes inflammatoires ou fibrotiques en présence des différents traitements.

Remplacement

La contamination interne par des radioéléments résulte principalement d’une exposition accidentelle par inhalation ou via une blessure. Cette contamination interne implique un passage à travers plusieurs barrières physiologiques indicatives d’un système complexe et intégré. Les approches de décorporation doivent agir à la fois localement (au niveau du site d’entrée) et de façon globale dans l’organisme afin de diminuer la rétention des radioéléments dans les organes cibles (foie et os notamment), et de faciliter leur élimination par les voies naturelles. En raison de la biocinétique complexe des radioéléments dans l’organisme, l’évaluation de l’efficacité des traitements ne peut se limiter à étudier leurs effets sur un type cellulaire particulier ou sur un modèle in vitro non intégré. De même, les anti-inflammatoires sont des molécules agissant sur plusieurs cibles et les mucolytiques fluidifient les sécrétions bronchiques qui seront éliminées par la toux, phénomène qui ne peut être obtenu sur des modèles in vitro. Ce projet nécessite donc de travailler sur un organisme entier (in vivo). Des expériences préliminaires à ce projet ont par ailleurs été menées in vitro afin de confirmer la pertinence des traitements envisagés en amont du recours à l’expérimentation animale.

Réduction

La stratégie adoptée s’appuie sur les données du laboratoire. L’expérience suggère que des groupes de 5 à 7 animaux sont suffisants pour démontrer une efficacité thérapeutique du DTPA ou d’autres traitements par voie veineuse, par voie pulmonaire ou par voie orale chez le rat après analyse statistique. Un effectif de 6 animaux par groupe a donc été retenu pour la conduite de notre projet. Pour des raisons réglementaires inhérentes au travail en installation nucléaire il n’est pas possible de réaliser une campagne de contamination sur plus de 30 animaux simultanément. Ces contraintes justifient la conduite de plusieurs campagnes de contamination. Par ailleurs, en raison de la variabilité inhérente à la préparation des solutions de plutonium et à la contamination, chaque campagne devra inclure un groupe contrôle contaminé non traité ainsi que les traitements simples avec une seule molécule (6 animaux par groupe). L’analyse statistique comparera chaque groupe traité au groupe non traité et au groupe traité avec une seule molécule (dans le cas des associations de traitements) au sein d’une même campagne.

Raffinement

Après contamination les animaux sont hébergés individuellement dans des cages à métabolisme (5 jours maximum) en plastique transparent à travers desquelles les rats peuvent se voir les uns les autres, s’entendre et se sentir. Un enrichissement de type jouet à ronger est ajouté dans les cages à métabolisme. Par la suite, les animaux sont hébergés en groupe (3 animaux par cage) avec des enrichissements matériels et nutritionnels (tunnel ou boule en plastique, bâtonnets en bois, papier, grosse croquette etc..). La contamination et le gavage des animaux seront réalisés après induction d’une anesthésie générale afin de limiter le stress et l’inconfort lié à ces actes. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés 2 fois par semaine minimum (ou plus si besoin pour expérimentation ou surveillance accrue). Mise en place de points limites identifiés pour ce projet et l’utilisation d’analgésique pour soulager l’animal en cas de souffrance. Une vigilance particulière sera également portée à l’apparition de potentiels symptômes respiratoires (dyspnées, essoufflements, éternuements et toux), une réponse inflammatoire pulmonaire pouvant faire suite à la contamination.

Choix des espèces

Le rat est l'espèce animale retenue pour nos études du fait de la richesse des données issues de la littérature sur la contamination par les radioéléments de la même famille que le plutonium, d'un point de vue de la biocinétique et des tests de traitements de décorporation des radioéléments. En effet, le rat est un modèle pertinent pour la contamination interne pulmonaire : sa taille, supérieure à celle de la souris, permet de réaliser des prélèvements biologiques suffisamment conséquents pour obtenir des niveaux de radioactivité mesurables et des informations exploitables sur un certain nombre de paramètres biologiques. De plus, de nombreuses données historiques obtenues sur cette espèce sont disponibles. Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet seront âgés de 4 à 6 semaines au moment de la réception car les risques de contamination interne avec des radioéléments concernent principalement les travailleurs jeunes adultes et adultes). Les rats présenteront initialement des poids allant de 150 à 200 g, de façon à faciliter leur hébergement en groupe et leur assurer un meilleur confort lors du séjour en cage à métabolisme.

410 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de neuroblastome qui provoque des métastases au foie, puis des injections d'anticorps et des prélèvements sanguins, pour mettre au point un modèle destiné à tester de futurs traitements de cancers pédiatriques. Le porteur indique que les animaux non traités développent des effets liés à la croissance des tumeurs, et que toutes les souris sont tuées pour prélever le foie. Il présente ce modèle comme "indispensable et non substituable", un test in vitro existant ne reproduisant pas le système immunitaire entier.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de mettre au point un modèle animal permettant de tester dans l’avenir des anticorps thérapeutique anti- O-Acétyl GD2. Cette possibilité de combiner les anticorps ou d’utiliser des anticorps bispécifiques (qui seront utilisés suite à cette optimisation de modèle) ouvre la voie à de nouveaux traitements permettant une réponse thérapeutique et des rémissions plus importantes chez les patients. Dans ce modèle, les animaux reçoivent une greffe d’une lignée de neuroblastome murin par voie intraveineuse ce qui conduit à obtenir des métastases hépatiques (tumeur) et sont ensuite traités avec les anticorps thérapeutiques. Ainsi dans ce projet, nous testerons différentes voies et le nombre d’administrations de nos anticorps permettant ainsi de limiter le stress des animaux et par conséquent de diminuer les variations expérimentales induites, tout en conservant l’efficacité du traitement.

Bénéfices attendus

Le bénéfice à court terme de ce projet est d’améliorer le modèle sur lequel nous avons démontré l’efficacité de nos anticorps, de façon à limiter le stress des animaux pour une meilleure reproductibilité des résultats et une meilleure comparaison des traitements pour nos futurs projets. Sur le long terme, nous utiliserons ce modèle (via d’autres demandes d’autorisation de projet) pour tester de nouveaux traitements et démontrer leur efficacité. Ces nouvelles biothérapies (anticorps bispécifiques ou combinaison d’anticorps) sont plus efficaces en termes de réponse thérapeutique et plus respectueuses de la qualité de vie.

Procédures

Pesée des animaux (10 pesées, 1 minute maximum chacune, soit 10 minutes au total). Injection des traitements (7 injections maximum, 3 minutes maximum chacune, soit 21 minutes au total). Prélévement de sang (4 prélèvements maximum, 2 minutes maximum chacune, soit 8 minutes au total).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont : premièrement le stress et la douleur liée à la manipulation (traitements, prélèvements de sang et pesées) et la contention des souris lors de l’administration des traitements (injections intraveineuse et intrapéritonéale). Deuxièmement, l’injection de cellules tumorales conduit à la formation de métastases hépatiques, et des effets indésirables peuvent apparaître chez les animaux en fin d’expérimentation notamment sur les groupes témoins non traités avec des anticorps (au fur et à mesure de la croissance des tumeurs métastatiques). Ces effets indésirables sont pris en compte dans l’annexe 1 attachée à cette demande de projet.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés afin de permettre la réalisation de prélèvements des foies pour évaluer l’efficacité thérapeutique des anticorps.

Remplacement

Il existe à ce jour un test in vitro nommé ADCC (Test de cytotoxicité à méditation cellulaire) qui permet de contrôler que l’anticorps peut reconnaitre et lier la cellule cible à la cellule effectrice. Nous avons réalisé ces tests sur l’anticorps notifié dans cette saisine et les résultats se sont avérés probants. Cependant, ce test est loin de remplacer le système immunitaire dans son ensemble. Les immunothérapies impliquent le système immunitaire de l’hôte. Cette étude donc nécessite impérativement un tissu tumoral en place dans un système physiologique et pharmacodynamique et comprenant un réseau vasculaire capable de se remodeler à partir de toute cellule de l’organisme. Le modèle animal reste indispensable et non substituable pour de telles études et donc un passage obligé avant de pouvoir commencer les études chez les patients.

Réduction

Dans ce projet, nos effectifs sont determinés et nos résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Nous assurerons une surveillance quotidienne des animaux par l’expérimentateur (en plus de celle réalisée quotidiennement par le personnel animalier) et nous fixerons des points limites qui conduiront à la mise à mort des animaux dès leur apparition. Nous assurerons aux souris un hébergement de qualité avec 5 souris par cage enrichie (frisotis). Concernant les injections (cellules tumorales ou traitements), une application de crème anesthesiante sera effectuée sur le site d’injection quelques minutes avant injection.

Choix des espèces

La souris est un modèle de référence. Grâce à beaucoup d’études, de nombreux outils cellulaires et moléculaires ont été développés. Chez la souris, la distribution de l’antigène ciblé, l’O-Acétyl GD2 est semblable à celle décrite chez l’Homme : absence d’expression dans les tissus sains et surexpression dans les cancers chez la souris De plus, nous utilisons un modèle de souris sur lequel notre équipe a déjà évalué des traitements à base d’anticorps et pour lequel nous connaissons bien le développement. Les animaux sont âgés de 8 semaines, soit un poids approximatif de 20g au début des expérimentations, ce qui est idéal pour la bonne réalisation des injections intraveineuses (veines caudales bien visibles et suffisamment grosses). De plus, ce choix s’inscrit dans la continuité des études précédentes pour lesquelles des souris de 8 semaines avaient également été utilisées dans des traitements similaires avec d’autres anticorps

140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souris transgéniques reçoivent pendant 6 à 12 mois une alimentation enrichie d'un mélange de six pesticides, avec suivi de la glycémie, séjours en cage métabolique, tests de tolérance au glucose et à l'insuline par injection puis prélèvements sanguins répétés, pour explorer un lien entre pesticides, maladie de Parkinson et diabète. Seuls des mâles sont exposés, et les animaux sont tués pour prélever cerveau, pancréas et autres organes. Le porteur affirme que ces liens n'ont "jamais été explorés" et écarte les modèles cellulaires ou invertébrés comme inadaptés à sa question.

Objectifs

Notre projet vise à apporter des connaissances sur les liens potentiels qui n’ont jamais été explorés à notre connaissance entre exposition alimentaire à des pesticides et des maladies humaines chroniques fréquentes, les maladies de Parkinson (MP) et le diabète, à l’aide d’un modèle « humanisé » développant une maladie neurodégénérative caractérisée par l'accumulation anormale d'agrégats de la protéine alpha-synucléine dans le cerveau. Ce projet s’inscrit dans un contexte ou certaines données épidémiologiques suggèrent que le diabète serait associé à un risque accru de maladie de Parkinson. Par ailleurs, plusieurs méta-analyses confirment le lien entre exposition professionnelle aux pesticides et MP. Dans ces conditions, notre projet envisage l’évaluation de la toxicité d’un mélange de 6 pesticides à des doses individuelles supposées ne pas exercer d’effets sur la santé chez l’homme mais rapportées pour induire en mélange un surpoids et/ou un diabète chez des souris non transgéniques. En utilisant ce mélange, nous étudierons alors le lien entre les perturbations métaboliques observées et les mécanismes qui sous-tendent le développement de la MP dans un modèle de souris transgéniques.

Bénéfices attendus

Le projet vise à apporter des éléments de connaissance concernant le rôle de l’exposition quotidienne à de faibles doses de pesticides en mélange via l’alimentation dans l’incidence des maladies neurodégénératives associées à la protéine alpha-synucléine (comme la maladie de Parkinson) et du diabète. Par ailleurs, ce projet doit permettre d'investiguer le lien entre le diabète et la maladie de Parkinson.

Procédures

Premièrement, 40 souris (10 par lot) feront l'objet d’un suivi périodique de la glycémie sur 6 mois (semaine 9, 17, et 24). Après une période de jeûne de 4-6h des prélèvements de sang seront effectués pour la lecture de la glycémie avec un glucomètre (3 minutes par animal). Deuxièmement, 40 souris (10 par lot) feront l’objet de prélèvements urinaires et d’un suivi des paramètres métaboliques (glycémie et test de tolérance au glucose) sur 12 mois. Les animaux seront mis individuellement dans des cages métaboliques pour récupérer les urines sur une période de 24h (semaine -1, 6, 27 et 52). Pour le suivi périodique de la glycémie, les modalités du point 1 seront appliquées en semaine 9, 24, 29 et 42. Enfin, Pour les tests de tolérance au glucose (semaine 16, 36, et 48) après une période de jeûne de 4-6h, une injection intrapéritonéale d’une solution saline de D-Glucose stérile sera réalisée. Huit prélèvements de sang seront effectués, pour la lecture de la glycémie avec un glucomètre sur une période de 2h30min. Par ailleurs, deux prélèvements sanguins supplémentaires seront réalisés pour un dosage ultérieur de l’insuline plasmatique qui sera mesurée 30 min avant et 15 minutes après l’injection du DGlucose. Troisièmement 20 souris (5 par lot) feront l’objet de tests fonctionnels et d’un suivi des paramètres métaboliques selon les mêmes modalités que le point 2 (glycémie et test de tolérance au glucose) sur 12 mois. Les tests fonctionnels (semaine 0/1, 12/13, 25/26, 38/39 et 51/52) seront réalisés afin d’évaluer les conséquences fonctionnelles de l’exposition aux pesticides, en comparaison avec le vieillissement normal. Lors de chaque test, les animaux seront évalués pendant 7 minutes. Quatrièmement 40 souris (10 par lot) feront l’objet de tests fonctionnels (selon les mêmes modalités que le point 3) et d’un suivi des paramètres métaboliques (glycémie et test de tolérance à l’insuline) sur 12 mois. Pour le suivi périodique de la glycémie, les modalités du point 1 seront appliquées en semaine 9, 24, 29 et 42. Enfin pour les tests de tolérance à l'insuline intrapéritonéal (semaine 15, 35 et 47) les souris seront mises à jeun pendant 4-6h puis une injection intrapéritonéale d’une solution d'insuline (0,75U insuline/kg de poids corporel) sera réalisée. Huit prélèvements de sang seront effectués pour la lecture de la glycémie avec un glucomètre sur une période de 2h30min.

Impact sur les animaux

L'administration d'aliment enrichi avec le mélange de 6 pesticides a déjà été réalisée chez la souris sans complication observée pour elles-mêmes. Le taux de mortalité lié à ce régime est nul. Les suivis envisagés sont couramment utilisés et n'induisent pas d'effet indésirable particulier en dehors de la douleur ou du stress induit par l'acte lui-même. En cas de souffrance (blessure, absence de prise de poids ou perte de poids supérieure à 20%), les souris seront mises à mort. Concernant les animaux qui seront soumis à un ensemble de tests fonctionnels, la planification des tests est prévue afin de limiter le stress des animaux et garantir un niveau d’activité. En particulier, lors de chaque session, les tests seront étalés sur 2 semaines et aucun suivi des paramètres métaboliques ne sera réalisé durant la période de suivi des capacités motrices des souris.

Devenir

Les souris seront mises à mort à la fin de chaque procédure afin de procéder au prélèvement des organes nécessaires à l'exploitation des résultats : cerveau, pancréas, foie, moelle épinière, tissu adipeux, intestin, fèces, yeux et sang.

Remplacement

L'étude des liens entre la maladie de Parkinson et le diabète de type 2 en condition d'exposition chronique à un mélange de faibles doses de pesticides à l'aide de cellules, organoïdes, modèles numériques ou modèles animaux moins sensibles (invertébrés) constituerait des approches différentes qui ne pourraient pas répondre aux questions que nous souhaitons aborder. Par ailleurs, l'étude des mécanismes moléculaires au niveau pancréatique dans un modèle murin de synucléinopathie n’a jamais été réalisée, et encore moins dans des conditions d’exposition alimentaire à un mélange de pesticides à faibles doses, pertinente au regard de l’évaluation des risques de l’alimentation humaine.

Réduction

Les animaux exposés seront tous étudiés dans les différentes expériences (tests fonctionnels, suivi métabolique) et ils seront analysés avec les différentes techniques choisies. Les souris seront mises à mort après 6 mois ou 12 mois afin de mimer une exposition d'un consommateur humain durant 15 et 30 ans. Ces choix de durée d’exposition sont également motivés par les caractéristiques spécifiques de l’évolution de la neuropathologie dans la lignée M83 d’une part et par les données déjà publiées sur l’évolution des troubles métaboliques chez la souris conventionnelle d’autre part. La quantité d'animaux par groupe de 35 animaux/groupe est le nombre minimum d’animaux requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre l’objectif scientifique du projet. Une fois les données relevées (comparaison de la masse des souris (en g), mesure de la glycémie, réponse au test de tolérance au glucose, réponse au test de tolérance à l’insuline, capacité motrice, étude des perturbations métaboliques et des mécanismes liés au développement de la MP) des tests statistiques sont prévus pour la comparaison des 2 groupes entre eux (exposé, non-exposé). En accord avec les récentes observations publiées, seules les souris mâles seront exposées de façon continue, à l’aliment enrichi (ou non) par le mélange de 6 pesticides pendant 12 ou 6 mois.

Raffinement

Les animaux seront suivis par le personnel qualifié de l'animalerie, avec une attention particulière pour le suivi métabolique des animaux (la mesure du poids, la quantité de nourriture ingérée, tests de tolérance au glucose intrapéritonéal, prise d'urine, mesure de la glycémie) et la mise en œuvre des tests fonctionnels. Les souris seront hébergées avec un environnement enrichi. Elles auront à leur disposition de la boisson et de la nourriture, des huttes, des feuilles de papier pour jouer et des baguettes de bois à ronger. Lors des études précédentes, la tolérance du régime était bonne, aucune sur-mortalité n'avait été enregistrée. En cas de mal être: blessure, poids trop faible (si la perte de poids est de plus de 20%), déshydratation, les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

La lignée de souris transgéniques (M83) exprimant l’alpha-synucléine humaine sera utilisée et exposée (ou non) au mélange de pesticides via l’alimentation, parallèlement aux souris Bl6/C3H, fond génétique de la lignée M83. Les travaux sont proposés à partir de la lignée de souris transgéniques M83 exprimant l’alpha-synucléine humaine mutée A53T. Ce modèle murin, dont l’agrégation protéique est facilitée par la mutation, permettra d’évaluer l’impact du mélange sur la neuropathologie. Nos résultats préliminaires montrent la présence très précoce d’alpha-synucléine phosphorylée en sérine 129 dans les ilots pancréatiques des souris transgéniques. Les souris seront exposées à l’aliment enrichi avec le mélange de 6 pesticides à partir de l’âge de 4 mois (stade adulte) pour nous conformer à la publication de référence.

6 macaques à longue queue vont être utilisés, réutilisés à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un antipsychotique en injection, une quinzaine d'examens d'imagerie sous anesthésie, puis une craniotomie avec pose d'une chambre d'enregistrement laissée en place pour six mois d'enregistrements et une trentaine d'injections intracérébrales sur animal vigile. Le porteur décrit un risque d'infection au niveau de la chambre et des lésions cérébrales possibles, mais conserve les animaux vivants pour un usage ultérieur en raison de leur "grande valeur scientifique". Il qualifie le modèle primate d'"irremplaçable", notamment pour certains traceurs d'imagerie.

Objectifs

L’aripiprazole est un antipsychotique de troisième génération indiqué dans le traitement de différentes maladies neuropsychiatriques présentant un déséquilibre dopamine-sérotonine, telles que le syndrome de Gilles-de-la-Tourette, la schizophrénie et les troubles bipolaires. Bien que son utilisation s’accroisse, les mécanismes d’action de l’aripiprazole restent peu compris. Les objectifs du présent projet sont d’identifier où et comment ce traitement agit dans les différentes régions cérébrales pour moduler de multiples fonctions cognitives et motrices.

Bénéfices attendus

Ce projet est conçu pour répondre à des questions en lien avec des problématiques cliniques, mais aussi pour enrichir nos connaissances fondamentales concernant le fonctionnement cérébral et l’importance de la balance dopamine-sérotonine dans le contrôle comportemental. Ainsi, notre projet va permettre de recueillir des informations inédites concernant le mode d’action de l’aripiprazole, désormais traitement de première intention pour de nombreux patients atteints de troubles psychiatriques. Une meilleure compréhension des mécanismes d’action de l’aripiprazole et des effets cognitifs induits par ce traitement ouvrira certainement une meilleure prise en charge thérapeutique de ces patients, avec une approche de plus en plus individualisée. En combinant différentes modalités d’imagerie cérébrale, nous allons avoir l’opportunité de caractériser comment la balance dopamine-sérotonine module l’activité neuronale de repos à l’échelle du cerveau entier. Cette balance étant défectueuse dans de nombreuses pathologies (ex : dépression, anxiété, schizophrénie, Tourette, addictions), nos résultats seront donc d’intérêt pour de nombreuses applications. En complément, l’apport de l’electrophysiologie va nous permettre d’étudier des aspects plus fonctionnels de l’action de l’aripiprazole et de la balance dopamine-sérotonine au niveau des neurones du striatum. Nos résultats devraient ainsi démontrer l’importance de cette structure sous-corticale dans le contrôle de certains biais décisionnels, et définir quels types de troubles émergent lorsque la balance dopamine-sérotonine devient dysfonctionnel dans cette région du cerveau.

Procédures

(i) Traitement pharmacologique systémique par aripiprazole en semi-chronique (plusieurs périodes de 2 semaines, injections en IM). Ces tests s’étendront sur 4 mois, afin de tester comportementalement plusieurs doses de traitement. (ii) Examens d’imagerie cérébrale sous anesthésie générale. L’action de l’aripiprazole sur les systèmes dopaminergiques et sérotoninergiques sera étudiée via 5 traceurs ciblant différents récepteurs (5 traceurs x 3 doses d’aripiprazole = 15 scans par animal). Ces imageries s’étendront sur une période de plus d’un an. (iii) Implantation chirurgicale d’un plot de tête et d'une chambre avec craniotomie sous anesthésie générale (1 fois,

Impact sur les animaux

La partie pharmaceutique du projet impliquant un traitement chronique par aripiprazole ne constitue pas une source potentiel de nuisances importantes. L’aripiprazole est une molécule fréquemment utilisée en clinique humaine avec très peu d’effets secondaires nuisibles, il est rapporté un effet sédatif et orexigène (augmente l’appétit) bien moindre que pour les autres neuroleptiques. Les imageries cérébrales vont nécessiter l’injection d’un produit de contraste pouvant induire des élévations du taux de fer sanguin et potentiellement des troubles hépatiques. Pour limiter ces risques, les imageries seront espacées d’au moins deux semaines et des analyses sanguines seront réalisées pour contrôler les enzymes hépatiques. Ainsi, aucun effet nuisible significatif n’est spécifiquement prévu suite à l’accumulation des imageries sur animal anesthésié. La partie électrophysiologique du projet implique l’implantation d’un plot de tête et d’une chambre d’enregistrement par l’intermédiaire de vis en titane chirurgicalement implantées sur la tête de l’animal. La chambre d’enregistrement donnera sur une craniotomie (10 x 10mm) permettant l’accès à la dure-mère et au cerveau pour pouvoir y positionner une électrode au moment des sessions d’expérimentation. La présence de cette chambre d’enregistrement constitue une source potentielle d’infection requérant une attention particulière, avec des soins fréquents adaptés. De potentiels lésions cérébrales engendrées lors de la pénétration de l’électrode dans le cerveau sont à prévoir avec la répétition des sessions d’enregistrement. Le suivi comportemental quotidien des animaux nous informera sur la présence ou non d’une lésion débilitante. Cette possibilité demeure toutefois extrêmement rare. Il n’est pas démontré que l’effet cumulatif entre les phases d’imagerie, de pharmacologie et d’électrophysiologie de l’étude soit délétère pour la santé de l’animal. La partie de l’étude intégrant les examens d’imagerie et le traitement par aripiprazole étant classée en procédure légère, nous estimons que la sévérité totale du projet demeure modérée pour les animaux.

Devenir

A la fin du protocole, en concertation avec le vétérinaire réfèrent et dépendamment du degré réel de sévérité de la procédure pour chaque animal, les singes seront préférentiellement réutilisés pour une autre étude. Ces animaux auront acquis une grande valeur scientifique, du fait de leur entrainement à réaliser des taches cognitives sur écran tactile. Les animaux ayant une chambre implantée seront préférentiellement réutilisés pour une autre étude nécessitant des approches invasives telles que l’électrophysiologie ou des perturbations intracérébrales. De ce fait, nous ne prévoyons pas de désimplantation chirurgicale à la fin de notre protocole. Également, notre protocole ne nécessite pas l'euthanasie de ces animaux pour des fins scientifiques.

Remplacement

L’utilisation du modèle primate non-humain apparait essentiel pour la réalisation de cette étude pré-clinique, combinant des approches d’imagerie TEP/IRM avec de l’électrophysiologie. Phylogénétiquement, ce modèle d’étude pré-clinique est le plus proche de l’humain dans l’expression de ses comportements et dans son organisation anatomo-fonctionnelle du cerveau. Ainsi, les informations obtenues seront plus facilement transposables et identifiables à une application chez l’humain. De plus, des taches comportementales variées peuvent être réalisées par ces animaux permettant ainsi l’étude d’un large spectre de comportements complexes. Enfin, certains radiotraceurs TEP utilisés dans cette étude ne sont disponibles et utilisables que chez le primate non-humain, faisant de ce modèle un élément irremplaçable pour la conduite de cette étude.

Réduction

Au total, nous prévoyons la possibilité d’inclure 6 animaux dans le protocole. Ce nombre a été choisi sur la base du nombre minimum standard d’animaux (n=4) défini par la communauté scientifique abordant des problématiques pharmacologiques chez le primate non-humain, et sur la possibilité d’avoir à remplacer des animaux en cours de protocole (n=2). Nos approches seront réversibles et complémentaires, ce qui permettra de répéter les tests et de comparer différentes doses d’agents pharmacologiques sur les mêmes animaux pour ainsi optimiser la puissance statistique de notre étude. Les données électrophysiologiques recueillies sur quatre animaux permettront également d’atteindre un échantillon de neurones striataux importants le plus représentatif possible en fonction des différents territoires cérébraux étudiés.

Raffinement

Notre méthodologie expérimentale a été planifiée afin de minimiser l’impact de notre étude sur la santé et le bien-être des animaux. Un suivi quotidien des animaux sera effectué permettant de contrôler différents facteurs tels que le poids, la prise de nourriture, le comportement social et la mobilité. Dépendamment du score des animaux sur notre grille d’évaluation comportementale, un traitement adapté sera fourni et l’étude pourra être suspendue, voir définitivement arrêtée si les points limites sont atteints. L’imagerie constitue une approche non-invasive qui va nous permettre d’étudier l’activité neuronale dans le cerveau entier des animaux sans engendrer d’effets délétères. En combinant simultanément différentes modalités d’imagerie grâce à une caméra hybride, nous allons réduire (/2) le nombre de scans pour pouvoir collecter un jeu de données suffisants. Les animaux ne seront implantés qu’au moment d’initier la phase d’électrophysiologie de l’étude. La craniotomie réalisée chirurgicalement sera la plus petite possible à l’intérieur de la chambre d’enregistrement, minimisant ainsi le possible risque d’infection. Des traitements analgésiques seront utilisés en périodes pré-, per- et postopératoires. Notre grille d’évaluation de la douleur permettra d’adapter le traitement et le protocole si nécessaire en fonction de divers points limites. Les enregistrements seront effectués avec des microélectrodes fuselées à faible diamètre (150microm) pour ne pas créer de lésion significative au niveau de la structure cérébrale d’intérêt. Les imageries réalisées au préalable nous permettront de cibler avec précision les régions cérébrales à enregistrer et nous indiqueront comment positionner l’électrode pour être le plus efficace possible dans la collection de données électrophysiologiques. En dehors des sessions comportementales qui seront réduites le plus possible, les animaux seront hébergés dans un environnement social avec accès à de grandes volières incluant du matériel de fourrage et de multiples formes d’enrichissement. Pour favoriser des interactions sans stress excessif entre l’animal et l’expérimentateur, les animaux seront entrainés à la technique d’association positive entre un son (clicker), une action, et une récompense alimentaire.

Choix des espèces

Pour cette étude, le modèle primate non-humain (macaque) apparait essentiel pour plusieurs raisons : - Phylogénétiquement, ce modèle animal préclinique est le plus proche de l’humain dans l’expression de ses comportements et dans son organisation anatomo-fonctionnelle. -Différents troubles comportementaux ont déjà pu être induits chez le macaque suite a une perturbation d’activité localisée au niveau du striatum antérieur. -Des taches comportementales variées peuvent être réalisées par ces animaux permettant ainsi l’étude d’un large spectre de comportements complexes. -Toute information physiologique ou physiopathologique obtenue chez le primate non-humain est plus facilement transposable à une application chez l’humain. Les animaux reçus sont généralement des adolescents (3 ans). Ils arrivent souvent déjà en groupe et sont socialement compatibles permettant de les pairer pour leur hébergement. Une recommandation sera formulée en ce sens auprès de nos fournisseurs pour favoriser des groupes sociaux compatibles.

360 souris au maximum vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des lignées génétiquement modifiées sont exposées à une chaleur croissante de 33 à 44 °C mimant une canicule et à des mesures cutanées sous anesthésie, pour étudier le rôle du récepteur TRPV3 dans les défauts de thermorégulation au cours du vieillissement. L'exposition à la chaleur est arrêtée si la température rectale monte de 4 °C, et les souris sont tuées par dislocation cervicale pour des prélèvements terminaux. Le porteur qualifie ses techniques d'indolores et annonce, "à terme", des pistes de traitement pour les personnes âgées vulnérables aux vagues de chaleur.

Objectifs

Ce projet est un projet de recherche fondamentale sur la thermorégulation vasculaire de la peau. Avec le réchauffement climatique et le vieillissement de la population, les vagues de chaleur vont avoir un effet critique grandissant sur notre système de santé. En effet, la population âgée est particulièrement vulnérable aux épisodes caniculaires dû à une altération de la thermorégulation conduisant à une incapacité à dissiper la chaleur et pouvant entraîner de graves complications voire un décès. Bien que ces défauts soient rapportés au cours du vieillissement depuis longtemps, les mécanismes qui sous-tendent ces défauts fonctionnels ne sont pas encore connus, ce qui limite fortement les approches thérapeutiques envisageables pour les personnes âgées. Les thermorécepteurs TRPV3 exprimés dans la peau sont mis en jeu dans les processus de sensation de température et dans la thermorégulation vasculaire cutanée. Ce projet vise à caractériser le rôle de TRPV3 et des nerfs sensoriels de l’épiderme (couche superficielle de la peau) dans les mécanismes neurovasculaires cutanés de la thermorégulation au cours du vieillissement, en utilisant des lignées de souris génétiquement modifiées permettant de bloquer la fonction de TRPV3 ou ayant un défaut d’innervation cutanée.

Bénéfices attendus

La compréhension des mécanismes de la thermorégulation au cours du vieillissement permettra, à terme, de proposer des pistes de traitement adaptées aux défauts de thermorégulation qui peuvent affecter la population âgée.

Procédures

Les lignées de souris nécessaires pour ce projet sont déjà disponibles et présentent à l’âge adulte jeune un défaut de réponse vasculaire au chauffage local mais ne présentent pas de trouble susceptible d'affecter leur bien-être dans les conditions d’hébergement standard. Les souris seront anesthésiées (durée environ 45 minutes) afin d’effectuer des mesures non invasives pour caractériser la fonction barrière et leur capacité vasculaire cutanée lors d’une exposition à un chauffage local ou un chauffage global mimant un épisode de canicule. Une exposition à une chaleur croissante (33 à 44°C ; +1°C/minute) sera également envisagée chez des souris vigiles afin de mesurer leur capacité à maintenir leur température interne stable dans ces conditions thermiques mimant une canicule. Les techniques utilisées sont indolores ; elles sont également utilisées chez l’homme. Afin d’étudier le rôle de TRPV3 et des nerfs sensoriels de la peau au cours du vieillissement nous étudierons des souris d’âge différents (jeunes, matures et âgées).

Impact sur les animaux

Toutes les techniques envisagées sont non invasives et utilisées dans les études cliniques. Aucune douleur n’est attendue. Pour les mesures sur souris vigiles, l’utilisation de tubes de contention peut générer un stress qui sera minimisé grâce à une habituation préalable. Pour cela, les souris seront placées dans un tube de contention pendant 10 minutes, deux jours différents dans les 7 jours précédents. Sous anesthésie générale, l’exposition à un chauffage local (augmentation de la température de la peau de 33 à 44°C à +1°C/min) sur 1 des pattes ne représente pas de nuisances particulières d’après notre expérience. L’exposition à un chauffage globale de la souris va déclencher des mécanismes de thermorégulation périphériques et centraux, induire une sudation afin de préserver une température interne le plus stable possible. Notre étude précédente a montré que les souris exposées à un chauffage passif de 33 à 44°C à raison de +1°C/min induisait une augmentation de la température rectale d’environ 3°C (en vigile et sous anesthésie). Afin de limiter les effets indésirables, l’exposition à la chaleur sera immédiatement arrêtée si l’augmentation de la température rectale atteint +4°C (en vigile ou sous anesthésie). Les souris ne présentent pas de phénotype dommageable. Au cours du vieillissement, les souris peuvent perdre du poids et baisser leur température interne. Ces deux paramètres seront suivis au minimum 1 fois par semaine pour les souris âgées de 15 mois et plus.

Devenir

Mise à mort par dislocation cervicale. Cette étude vise à comprendre le rôle de TRPV3 et de l’innervation épidermique dans le défaut de thermorégulation au cours du vieillissement. Pour cela plusieurs prélèvements terminaux doivent être réalisés, en particulier pour analyser l'effet du vieillissement sur la réactivité vasculaire (mesures ex vivo sur vaisseaux isolés) et l'expression de TRPV3 dans la peau.

Remplacement

Ce projet nécessite l'utilisation d'animaux car il est actuellement impossible de reproduire la réactivité vasculaire cutanée en réponse au chauffage qui repose sur une interaction fonctionnelle des systèmes nerveux et vasculaires.

Réduction

Le nombre total de souris prévues pour ce projet est de 360. Ce nombre maximal inclut la possibilité de reproduire les expériences en cas d'imprévu, donc il est très vraisemblable que le nombre réel d'animaux utilisé sera inférieur à ce nombre maximal. Nous prévoyons de valoriser au maximum les animaux utilisés, en constituant des banques de matériel biologique qui pourront être utilisées pour répondre à d'autres questions sur ces mêmes modèles.

Raffinement

Les souris seront suivies avec un soin particulier, elles seront observées 3 fois par semaine au minimum et pesées une fois par mois avant 15 mois puis plus régulièrement pour les animaux vieillissants (pesée hebdomadaire). Les points limites sont clairement définis, afin de détecter précocement tout signe de souffrance.

Choix des espèces

Les modèles murins, bien que présentant certaines limites par rapport à la physiologie humaine, restent largement utilisés pour étudier l’intégrité fonctionnelle de la peau. Cette espèce possède une physiologie vasculaire proche de celle de l'Homme et permet d'étudier la fonction vasculaire par les même approches (laser Doppler, iontophorèse), tout en complétant l'analyse jusqu'aux étages cellulaire et moléculaire. De plus, ce projet inclut des expériences utilisant des modèles animaux modifiés génétiquement disponibles uniquement chez la souris. Nous utiliserons des souris âgées minimum de 10 semaines lorsque leur système sensoriel et vasculaire est développé. Afin d’étudier le rôle de TRPV3 et de l’innervation épidermique au cours du vieillissement, les souris seront utilisées à 3 âges différents (18 mois).

Pour tester cinq variantes d'un composé censé faire régénérer les cellules bêta du pancréas, qui produisent l'insuline, 600 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour examiner leurs organes. Chaque souris reçoit des injections de protéines, quotidiennes ou hebdomadaires, subit une prise de sang par semaine, puis, en fin d'expérience, un jeûne de cinq heures suivi d'une injection qui élève sa glycémie et de six prélèvements de sang à la queue en deux heures. Une partie d'entre elles développe un diabète que le porteur dit "modéré", n'entraînant pas de "souffrance particulière", et le résumé ne nomme ni la lignée ni la façon dont ce diabète apparaît. Sur le remplacement, le porteur affirme que l'étude du diabète "sur l'animal intact est essentielle et ne peut être remplacée", et revendique une "application stricte de la règle des 3R".

Objectifs

Le pancréas joue un rôle clef dans le maintien du taux de sucre sanguin. Cet organe contient de nombreux types cellulaires dont les cellules bêta sécrétant de l'insuline, une hormone permettant de diminuer le taux de sucre sanguin en cas d'apport sucré. Notre recherche se concentre sur le diabète de type 1, une maladie qui se caractérise par la perte sélective de cellules bêta. Sans traitement, cette maladie peut avoir de graves conséquences telles que des dommages vasculaires, des risques de cécité, d’amputation, ou même la mort. Les traitements actuels consistent en l’injection d'insuline pour compenser la déficience en cette hormone. Cependant, des facteurs environnementaux (l'alimentation, l'age, le stress, etc...) peuvent provoquer de fortes variations dans les niveaux de glucose sanguin, malgré un traitement à l'insuline, et donc éventuellement conduire aux complications présentées précédemment. Dans le but de pallier aux limitations des thérapies actuelles, nous nous intéressons à la régénération des cellules beta. Nous avons ainsi récemment identifié un composé pharmacologique capable d'induire la régénération des cellules beta pancréatiques. Le but de notre projet est donc de tester 5 différentes variations de ce composé (visant à le rendre encore plus efficace) dans un modèle de diabète. Nous utiliserons 600 souris afin d’évaluer et comparer les capacités de ces composés à contrer un diabète. Une attention particulière est portée sur l’application stricte de la règle des 3R.

Bénéfices attendus

Le but de ces travaux est de démontrer une activité accrue de l’une (ou plusieurs) de nos protéines afin d'induire la régénération des cellules beta pancréatiques et ainsi contrer les effets de la perte des cellules beta pancréatiques.

Procédures

Les animaux recevront des injections quotidiennes ou hebdomadaires de protéines. Des prélèvements sont prévus pour suivre la glycémie des animaux (1 fois par semaine, 1 goutte de sang). En fin d'expérience, il sera réalisé un test nécessitant une mise à jeun de 5 heures puis une injection d’un produit augmentant transitoirement la glycémie suivie de 6 prélèvements d’une très faible quantité de sang à la queue (classiquement, l'expérimentateur fait perler le sang et 6 "perles" sont ainsi utilisées pour lectures de glycémie) à des intervalles de temps de plus en plus longs (entre 15 et 120 minutes).

Impact sur les animaux

Les effets attendus sont un inconfort modéré dû aux piqures, aux prélèvements et à la mise à jeun de 5 h. Une partie des animaux développeront un diabète modéré n’entrainant pas de souffrance particulière.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour examen post-mortem des organes et du pancréas en particulier.

Remplacement

Le diabète est une maladie complexe. C'est une pathologie qui s’exprime à l’échelle d’un organisme et qui fait intervenir tous les organes susceptibles de stocker ou consommer du glucose (la plupart donc). Son apparition et sa gravité résultent donc de plusieurs défauts et son étude sur l’animal intact est essentielle et ne peut être remplacée.

Réduction

Nous utiliserons un nombre d’animaux aussi faible que possible. L’application de tests statistiques nous a permis de réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire à l’obtention de résultats exploitables et sans prévoir de répétition des expériences.

Raffinement

Durant toute la procédure, les animaux seront suivis en s’appuyant sur une grille de score permettant d’évaluer et d’objectiver les éventuelles souffrances, et de mettre en oeuvre des points limites précoces et adaptés. La bonne santé ou la souffrance des animaux seront observés selon des grilles d'évaluations indiquées. En amont de chaque procédure, des dispositions (habituation) sont prises pour minimiser tout stress aux animaux. Les animaux seront hébergés dans les conditions habituelles d’animalerie avec un environnent enrichi (maisonettes et buchettes), en groupes sociaux et en accord avec la réglementation en vigueur.

Choix des espèces

Le diabète est une maladie d’origine multifactorielle (y compris environnementale). Son apparition et sa gravité résultent donc de l’intégration de plusieurs défauts et son étude sur l’animal intact est essentielle et ne peut être remplacée. Les souris utilisées ici représentent un modèle de choix pour nos travaux visant à contrer un diabète : il est en effet très difficile de trouver une autre espèce animale développant un diabète provenant d'une attaque des cellules beta pancréatiques. Nous utiliserons des animaux âgés de 8 à 10 semaines, cet interval d'âges correspondant à une période sans diabète. Nous souhaitons en effet initier nos traitements avant l'apparition du diabète (et ainsi contrer son développement).

576 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie cérébrale à la naissance puis, à l'âge adulte, une seconde intervention et une mesure par voltamétrie sous anesthésie, avant de recevoir du THC pour modéliser l'effet du cannabis sur la schizophrénie. Les rates nouveau-nées sont tuées dès le sevrage à 21 jours, les mâles gardés pour la suite puis tués pour contrôle histologique. Le porteur affirme que l'étude de la maladie chez des patients non traités est difficile sur les plans éthique et pratique, ce qui rendrait la modélisation chez le rat "irremplaçable".

Objectifs

La schizophrénie est une maladie neuropsychiatrique complexe qui apparaît à l'adolescence et au début de l'âge adulte, avec un risque plus élevé d'apparition chez les individus de sexe masculin. La schizophrénie est une maladie mentale très invalidante (1ère source de handicap et de suicide des 25-35 ans) touchant environ 1% de la population, évoluant dans +60% des cas vers un état chronique. Son coût global pour la société est considérable. Les causes et les mécanismes biologiques mis en jeu dans la schizophrénie ne sont pas entièrement compris. Actuellement, on considère que la schizophrénie résulterait de connexions défaillantes entre différentes régions cérébrales ayant pour origine une perturbation du développement cérébral, notamment au niveau du cortex antérieur. Ces connexions défaillantes pourraient contribuer au dysfonctionnement des neurones dopaminergiques ; il s’agit d’un groupe de neurones dont l’implication dans l’expression des symptômes schizophréniques est communément acceptée. Récemment, un certain nombre de travaux laissent penser que l’usage du cannabis peut précipiter l’apparition de la schizophrénie ou aggraver les symptômes caractéristiques de cette maladie aussi bien lors d’une consommation chronique, qu’aigüe. Il s’agit non seulement d’un problème de société actuel de première importance, mais aussi d’un problème de santé majeur en raison de la consommation croissante du cannabis dans la population des adolescents et jeunes adultes. L’abord de cette question chez les malades atteints de schizophrénie non-traités par des antipsychotiques, est très difficile à mettre en œuvre, tant sur le plan éthique que pratique, en raison même de la nature de la pathologie, ce qui rend la modélisation chez l’animal tout à fait irremplaçable. Le projet proposé a pour but de mieux comprendre l’impact de l’inactivation néonatale de la partie antérieure du cortex cérébral sur les réponses comportementales et dopaminergiques lors de l’administration du principal composé du cannabis pouvant induire des troubles psychotiques, le delta-9 tétrahydrocannabinol (THC), chez l'animal (rat mâle) jeune adulte.

Bénéfices attendus

Le projet proposé se situe dans le cadre d’une modélisation chez l’animal de la physiopathologie de la schizophrénie. Il pourrait permettre de mieux comprendre certains aspects de la physiopathologie de la schizophrénie. Il pourrait contribuer in fine au développement de nouvelles approches thérapeutiques ; les traitements existants n’étant pas totalement satisfaisants.

Procédures

Les interventions prévues sont les suivantes : 1)Intervention chirurgicale chez l’animal nouveau-né (intervention unique ~15 min); 2) Intervention chirurgicale chez l’animal adulte (intervention unique 1h30 à 2h00); 3) Etude pharmacologique à l’aide de la voltamétrie in vivo (intervention unique~3h).

Impact sur les animaux

Dans le cadre de la réalisation de ce projet, les animaux sont soumis à deux interventions chirurgicales à l’issue desquelles ils peuvent ressentir de la douleur. Pour ce qui est de la chirurgie réalisée chez l’adulte, les animaux peuvent présenter une légère perte de poids variable selon les animaux. Pour la majorité d’entre eux le retour vers des valeurs normales s’observe au bout de 7jours. Lors de l’étude pharmacologique les animaux peuvent ressentir une légère douleur transitoire au niveau du site d’injection, due à l’aiguille, lors de l’administration de THC. Par contre, le THC lui-même n’est pas décrit comme induisant de douleur, ni de détresse. Les réponses comportementales mesurées sont les réponses spontanées de l’animal. Il n’y a donc aucun effort à fournir par l’animal lors de cette étude.

Devenir

Intervention chirurgicale chez l’animal nouveau-né : Les nouveaux-nés femelles sont mis à mort lors du sevrage au 21ème jour, puis soumis à un contrôle histologique. Lors du sevrage, tous les animaux mâles sont gardés en vie pour être soumis à l’Intervention chirurgicale chez l’animal adulte, puis à l’étude pharmacologique. A l'issue de cette étude, tous les animaux adultes implantés sont mis à mort, puis soumis à un contrôle histologique.

Remplacement

La schizophrénie étant une maladie mentale se traduisant notamment par des troubles comportementaux, il n’y a pas de méthodes alternatives permettant de remplacer les protocoles mis en œuvre chez l’animal vivant, en situation comportementale, et en interaction avec l'environnement. En particulier, l’étude de l’apparition ou l’aggravation de symptômes schizophréniques suite à la consommation de cannabis (notamment de THC) sont très difficiles à étudier chez des malades non-traités, pour des raisons non seulement pratiques, mais surtout éthiques.

Réduction

Dans ce projet, le nombre total d’animaux, maintenu aussi faible que possible, est contraint par le nombre des animaux mâles nécessaires pour réaliser l’étude pharmacologique à l’âge adulte. En effet, pour des raisons de reproductibilité de l’expérience, et d’application du principe de réduction chez les animaux adultes, seuls les animaux mâles sont utilisés. L'utilisation des femelles nécessiterait l'utilisation d'un nombre d'animaux beaucoup plus important que celui proposé. Un nombre de 12 rats mâles par groupe a été déterminé à partir de travaux publiés concernant des études pharmacologiques du même type. Ce nombre apparaît nécessaire pour obtenir des résultats suffisamment robustes d’un point de vue statistique. L’analyse statistique des résultats sera réalisée en prenant en compte la répétition des mesures dans le temps pour un même animal. Cette stratégie de mesures répétées, conduit grandement à réduire le nombre d’animaux mâles utilisés et, en déterminant le décours temporel des réponses, permet de raffiner l’analyse de celles-ci.

Raffinement

Dans le cadre de la réalisation de ce projet, plusieurs éléments de raffinement sont mis en oeuvre. Ainsi, les interventions chirurgicales chez le rat nouveau-né et chez le rat adulte sont réalisées à l’aide d’une anesthésie gazeuse ce qui permet de contrôler au mieux la profondeur de l’anesthésie. Des analgésiques sont aussi utilisés pendant la phase chirurgicale. Pendant la phase post-opératoire, chez le nouveau-né, la bonne cicatrisation de l’incision est suivie quotidiennement en même temps que la pesée des animaux. Chez l’animal adulte, pendant la phase post-opératoire d'au moins 7j, l'eau et la nourriture sont placés dans des récipients adaptés situés directement sur le fond de la cage afin de faciliter la récupération des animaux. Pendant cette phase de récupération post-opératoire les animaux recoivent un traitement analgésique. Les animaux sont aussi habitués à être manipulés. Des points-limites permettant de soustraire les animaux à une éventuelle souffrance ont été établis et feront l’objet d’une attention quotidienne (voire 2 à 3 fois par jour). Un suivi régulier de la littérature sera effectuée tout au long de ce projet pour identifier l’émergence de nouvelles procédures permettant de raffiner celles mises en œuvre dans le projet.

Choix des espèces

Une grande part, pour ne pas dire la majorité des études visant à modéliser chez l'animal la physiopathologie de la schizophrénie ont été réalisées chez le rat, notamment en raison de la grande homologie qui existe entre les réponses comportementales et pharmacologiques observées chez le rat et chez l'homme. L'ensemble des données acquises chez le rat constitue donc un cadre de référence justifiant le choix de cette espèce pour conduire notre projet. Les animaux (rats) nouveau-nés subiront une première intervention chirurgicale au 8ème jour postnatal qui représente un moment crucial du développement cérébral chez le rat, comparable à la fin du second trimestre de gestation chez l’homme, période qui est considérée comme une période de grande vulnérabilité au développement de la schizophrénie. Dans la mesure où la modélisation animale proposée concerne une pathologie (la schizophrénie) ayant une origine neurodéveloppementale, s’exprimant chez le jeune adulte, les animaux mâles ayant subi l'intervention néonatale seront ensuite utilisés à l'âge adulte (11 semaines) pour tester leur réactivité au THC.

1 344 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès le stade juvénile ou adolescent, ils subissent une chirurgie d'injection d'un lentivirus dans l'amygdale, puis des tests comportementaux d'anxiété et de comportement social et un apprentissage de la peur par "légers chocs électriques", certains recevant des électrodes implantées, avant d'être tués. Le porteur veut comprendre comment une hyperactivité de l'amygdale à l'adolescence modifie durablement les comportements émotionnels, avec en vue le stress post-traumatique chez l'humain. Il affirme que ces réseaux neuronaux ne peuvent être étudiés ni in silico, ni sur cellule isolée, ni chez les invertébrés.

Objectifs

L’amygdale, une structure cérébrale située en profondeur du lobe temporal, est composée de plusieurs noyaux, chacun jouant un rôle différent dans la fonction amygdalienne et possédant ses propres projections vers des structures cérébrales différentes. Le noyau basolatéral (BLA) est la principale zone d’entrée des informations provenant du système sensoriel et des structures plus intégrées telles que le cortex préfrontal. Les neurones du BLA projettent aussi bien en dehors de l’amygdale que vers la circuiterie intra-amygdalienne. Au cours du développement postnatal, les connexions neuronales entre les structures des circuits de la peur (comme l’amygdale et le cortex préfrontal médian) sont modelées selon leur état de maturation et l’expérience de l’animal. Chez l’humain, l’hyperactivité amygdalienne est souvent corrélée avec des dysfonctionnements sociaux et émotionnels. De plus, l’adolescence correspond à une période du développement particulièrement sensible au stress dont l’impact pourrait être observable chez l’adulte. Vu son rôle primordial dans les comportements émotionnels et le fait que l’amygdale arrive tôt à sa maturité fonctionnelle, il est suggéré qu’un dysfonctionnement de l’amygdale à l’adolescence pourrait être à l’origine d’un développement altéré de sa connectivité avec, entre autres, le cortex préfrontal médian, ce qui pourrait avoir des conséquences sur des comportements émotionnels à long terme (chez l’adulte). Nous chercherons à perturber l’activité de l’amygdale chez le rat aux stades de l’adolescence et la préadolescence (juvénile) grâce aux injections d’un lentivirus qui a pour but d’augmenter l’activité d’une voie de signalisation ubiquitaire, exclusivement dans les neurones principaux de cette structure. Nous étudierons l’impact de cette sur-activation sur les propriétés membranaires des neurones principaux du BLA et des neurones du cortex préfrontal médian, sur la plasticité synaptique de la voie mPFC-BLA, ainsi que sur les comportements de type anxieux et émotionnels chez les jeunes animaux et chez les adultes, ainsi que sur l‘activité du réseau pendant les comportements de peur. Le but de notre recherche à long terme est donc de comprendre les mécanismes impliqués dans des dérèglements émotionnels déclenchés pendant l’adolescence et ayant des conséquences importantes chez l’adulte.

Bénéfices attendus

Nous avons précédemment montré que la modification de l’amygdale (par l’injection d’un virus) lors de l’adolescence réduit l’extinction et augmente la généralisation de la peur chez l’adulte dans un protocole de conditionnement aversif. La quantification d’un marqueur de l’activité neuronale dans les structures du circuit lié à la peur montre que les modifications comportementales sont associées à une augmentation de l’activité neuronale des neurones du cortex préfrontal. Ce projet vise à comprendre comment le virus modifie l’activité électrique des neurones principaux de l’amygdale et comment cette modification peut impacter la connectivité du circuit neuronal sous-tendant le comportement de la peur. Concernant des bénéfices du projet à court terme, il semble fondamental et essentiel de connaitre les effets sur les propriétés électriques et la plasticité des neurones de l’amygdale. Une hyperactivité ou une hyper-réactivité de ces neurones pourrait conduire à des changements durables dans la connectivité des réseaux neuronaux connectés à l’amygdale et contribuer aux modifications comportementales observées chez l’adulte. A long terme, des connaissances apportées par ce projet nous aideront à mieux comprendre comment la modulation de l’amygdale pendant la période critique de l’adolescence pourrait conduire aux effets durables sur la cognition émotionnelle et sociale, qui persistent jusqu’au stade adulte. Nos résultats nous permettront de mieux comprendre les mécanismes sous-tendant la prédisposition à certains syndromes psychiatriques chez l’Homme tel que le stress post-traumatique (PTSD).

Procédures

Tous les animaux subiront une chirurgie pour injection virale chez le jeune (préadolescent ou adolescent) dans l’amygdale, procédure invasive qui nécessite une anesthésie générale (~1h) et un suivi post-opératoire après réveil. Quatre séries expérimentales sont ensuite planifiées : (1) 2-3 semaines plus tard, les animaux sont profondément anesthésiés pour l’extraction et analyse du cerveau frais. (2) A l’âge adulte, les animaux seront à nouveau anesthésiés pour la totalité de l’expérimentation sous anesthésie (~4h) puis mis à mort sans réveil. (3) Les animaux adolescents seront soumis à des tests comportementaux (anxiété, stress, comportement social ; 1 semaine), puis à un apprentissage de peur à l’âge adulte (1 semaine). (4) Une fois adultes, les animaux sont anesthésiés pour l'implantation d'électrodes suivi de réveil pour enregistrement de l’activité neuronale chez l'animal éveillé pendant qu’il est soumis à un apprentissage de peur (4-5 semaines). Ils sont tous euthanasiés sous anesthésie, suivi d’une exsanguination pour certains afin de réaliser une perfusion intracardiaque permettant de fixer le cerveau.

Impact sur les animaux

Tous les animaux subissant une chirurgie pourraient potentiellement montrer des signes de douleur ou d’infection : perte rapide de poids > 15%; forte réactivité à la manipulation ou posture anormale (dos rond, yeux mi-clos, tête basse). Dans ce cas, l’animal sera traité (selon conseils du responsable de l’animalerie ou du vétérinaire) et placé sous surveillance maximale durant 48h. S’il n’y a pas de signes d’amélioration, l’animal sera euthanasié avec accord du responsable de l’animalerie. Selon nos études antérieures, le virus injecté dans l’amygdale n’entraine pas d’effets comportementaux majeurs, à part lorsque les animaux sont soumis à des tests particuliers pour produire un état légèrement anxieux (espace éclairé) ou émotionnel (légers chocs électriques). Ces états ne perdurent pas en dehors des tests. En dehors de ces cas, aucun effet indésirable n’est prévisible.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort , soit pour l'expérimentation, soit pour analyse histologique.

Remplacement

Ce projet de recherche fondamentale s’inscrit dans le champ des Neurosciences Cellulaires et Comportementales. L’évaluation des réseaux neuronaux et comportementale d’une modification cérébrale au cours du développement post-natal jusqu'à l'adulte nécessite l’utilisation d'animaux vivants possédant les structures et les connectivités cérébrales requises. Cela ne peut donc pas être réalisé in silico ou en cellule isolée ou chez les invertébrés.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera le strict minimum permettant un analyse statistique valide des expériences. Les analyses statistiques seront celles classiquement utilisées dans la littérature (voir Joly et al, 2022), incluant, après vérification de l'homogénéité des variances et la normalité des données, des analyses de variance à un ou plusieurs facteurs en fonction des expériences, suivies d'analyses post-hoc appliquant une correction pour la répétition des comparaisons (ex. Bonferroni ou False-Discovery-Rate). Il est à préciser que les femelles et les mâles issus de la colonie de reproduction seront utilisés dans cette étude.

Raffinement

Nous réduirons au maximum les techniques douloureuses ou stressantes, et utiliserons de l’anesthésie combinée quand approprié à une analgésie pendant les chirurgies et la mise à mort des animaux. Chaque animal sera suivi tout au long de l’expérience afin de détecter tout indicateur de souffrance et déterminer si besoin l’arrêt de l’expérimentation en accord avec le SBEA et les conseils vétérinaires. Après chirurgie, une surveillance accrue permettra de détecter tous signes de douleur ou stress induit et de traiter les animaux si besoin avec des antalgiques et antibiotiques selon les conseils du vétérinaire référent. Les animaux seront hébergés par groupes (2 à 4) avec de l’enrichissement autant que possible. Les animaux en situation comportementale seront habitués à l’expérimentateur par manipulation au cours des jours précédents.

Choix des espèces

Le rat est le modèle du choix du laboratoire. En raison de la cohérence avec nos études précédentes, nous poursuivons ce projet sur Rattus norvegicus. La littérature scientifique pertinente à ce projet, en particulier les analyses des comportements sociaux et anxieux, est riche en études réalisées sur le rat. Nous bénéficierons et nous contribuerons donc d’une base de donnés importante. Il est connu que la période de l’adolescence est associée à une susceptibilité au stress et un développement important des structures impliquées, notamment l’amygdale, dans les réponses à la peur. Toutefois de nombreuses structures impliquées dans les comportements émotionnels sont encore immatures à l’adolescence. Nous voulons modifier l’activité de l’amygdale à deux stades du développement, le stade de préadolescence (juvénile) et le stade d’adolescence, qui correspondent à des périodes critiques dans le processus de connectivité de l’amygdale avec d’autres structures du réseau. Les expériences commenceront donc dès l’âge préadolescence jusqu’à l'adulte.