Procédures modérées

Onze lapins vont être utilisés, dont huit réutilisés d'une étape à l'autre avant d'être tous tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit trois prises de sang et une chirurgie pouvant atteindre une heure et demie donnant accès au foie, décrite par le porteur comme une "chirurgie lourde pour le lapin", ainsi qu'un abord musculaire, pour tester un pansement hémostatique en poudre. Le porteur indique une douleur per et post-opératoire prise en charge par analgésie, et prévoit des prélèvements du foie à deux, treize et vingt-six semaines. Il affirme que le pansement doit être testé dans un environnement d'organes et de fluides corporels que le modèle in vitro ne peut reproduire.

Objectifs

Le pansement idéal n’existe pas. Mais il doit présenter certaines caractéristiques : maintenir la plaie en milieu humide et chaud, être modifié selon les stades de cicatrisation, être perméable aux échanges gazeux mais non aux bactéries, absorber l’excès d’exsudat produit par la plaie, ne pas coller à la plaie mais adhérer à la peau saine sans se décoller ou s’abîmer rapidement, le tout en étant facilement applicable et confortable, ne pas être toxique et être hypoallergénique, protéger des chocs, être transparent afin de pouvoir visualiser la plaie sans retirer le pansement, être le moins coûteux possible et réduire le temps de traitement. Le pansement à base d’alginate de calcium répond à l’ensemble de ces critères mais son utilisation est réservée à la prise en charge de plaies cutanée et très peu sur les organes internes lors de chirurgie. Pour maitriser les saignements, les chirurgiens ont recours à différentes techniques conventionnelles. Lorsque ces techniques sont insuffisantes, notamment lors d’hémorragies capillaires dites « en nappe », des hémostatiques chirurgicaux résorbables sont utilisés comme traitement.

Bénéfices attendus

Le projet est destiné à confirmer l’intérêt des propriétés hémostatiques du produit (sous format de poudre) sur le saignement d’un organe intra-abdominal comme le foie et sur un tissu non lésé (muscle) mais aussi de suivre la résorption du produit dans le temps au niveau des zones d’implantation. L’objectif est de pouvoir avoir un pansement hémostatique naturel (non synthétique) pour le traitement des plaies chirurgicales et qui ne nécessite pas son retrait avant fermeture de l’incision chirurgicale comme les pansements actuels commercialisés.

Procédures

-Prise de sang sur animal vigiles : 3 fois , le prélèvement est effectué après application d'un anesthésique local et dure moins d'une minute. -Chirurgie: une seule intervention comprenant un abord du foie dont la durée ne devrait pas excéder 1h30 (5 minutes pour l’abord, 5 minutes pour l’accès au foie, 25 minutes pour les temps de saignement, 10 minutes pour le contrôle final de l’arrêt du saignement, 20 minutes pour la fermeture des plans musculaire et cutané), puis un abord musculaire sur le flanc dont la durée ne devrait pas excéder 30 minutes (incision, dissection, implantation du produit, suture).

Impact sur les animaux

L’accès au foie est une chirurgie lourde pour le lapin. Afin de limiter l’impact et de ne pas risquer un incident de chirurgie, nous avons opté pour un abord sous costal (incision sous les côtes) à la laparotomie médiane (ouverture de l’abdomen). Le risque hemorrhagique suite à la lésion hépatique reste extrèmement limité par la taille de la lésion réalisée et les moyens d'hémostase à dispositon. La douleur attendue en per et post opératoire est prise en charge par une analgésie adaptée. La chirurgie est réalisée stérilement ce qui limite le risque de complications infectieuses. Les plaies sont protégées.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort, soit parce qu’ils auront atteint un point limite soit parce qu’ils auront atteint le temps du prélèvement final : J+2 semaines EU 1/2, J+13 semaines et J+26 semaines EU 2/2. L'étude histologique de l’intégration du pansement hémostatique dans l’organe sera réalisée et nécessite le prélèvement du foie.

Remplacement

L’objectif de cette étude est de vérifier l’efficacité hémostatique tissulaire d’application locale d’un produit à base d’alginate (produit naturel), de constater sa persistance sur le tissu lésé et de suivre sa résorption sur un tissu lésé et un autre non lésé. La preuve de concept de ce nouveau type de pansement hémostatique sous forme de poudre permettra de mettre au point un nouveau dispositif médical pour la gestion des saignements intra-cavitaire et cutanés en cours de chirurgie et d’observer son intégration sur le tissu à différents temps post-opératoire. Il nous est nécessaire de tester le pansement hémostatique dans un environnement avec les différents organes et les fluides corporels qui ne peuvent être reproduit en in vitro. Ce passage sur le modèle animal est la dernière étape de la preuve de concept.

Réduction

Nous utiliserons 11 lapins au total dont 9 animaux répartis en 3 groupes, il y a 2 animaux supplémentaires prévus afin de compléter l’un des groupes si nécessaires. Si le pansement ne permet pas de stopper le saignement et amène à faire une intervention chirurgicale pour l’arrêter nous stopperons le projet sans utiliser tous les animaux prévus. Pour réduire le nombre d’animaux, nous avons développé la voie d’abord sur des animaux décédés. Dans un principe de réduction, nous ferons simultanément un test de résorption sur tissus sain et un test d'hémostase/resorption sur le foie. Il s’agit d’une preuve de concept, le nombre d’animaux permettra d’obtenir des résultats suffisants pour cette étape du projet.

Raffinement

L’animal sera placé 3 semaines en acclimatation. Après une semaine et demie d’acclimatation, une puce d'identification électronique permettant de mesurer sa température corporelle sera implanté sous la peau, puis l’animal sera habitué au passage du lecteur et au pyjama pour faciliter le suivi post-opératoire. Le vétérinaire, sur place, intervient quotidiennement dans le suivi post-opératoire et prend en charge tout symptôme clinique: complication de plaie, hypo activité etc... Il prend également la décision de recourir à une mise à mort si l'état de l'animal le nécessite ou à son exclusion si le traitement nécessaire à sa prise en charge n'est pas compatible avec la poursuite du projet.

Choix des espèces

Le lapin est un animal de taille intermédiaire, dont le foie a une taille suffisante pour supporter les scarifications prévues et l’implantation de la poudre hémostatique (le produit) en quantité thérapeutique pour obtenir l'effet pharmacologique souhaité (hémostatique). Les animaux seront réceptionnés à 2.5-3 kg pour atteindre 3.5-4 kg (âge adulte). L’utilisation d’animaux adulte permet de bénéficier d’une taille permettant la chirurgie sur le foie.

639 rats bruns et rats noirs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une infection intranasale par le SARS-CoV-2 sous anesthésie, jusqu'à sept lavages nasaux, des prises de sang répétées et un gavage oral, pour évaluer si ces rongeurs peuvent constituer un réservoir sauvage du virus. Le porteur indique que l'infection respiratoire peut provoquer une baisse d'appétit et une perte de poids, les difficultés respiratoires ou une perte de poids au-delà de 20 % déclenchant la mise à mort. Il affirme que l'étude du potentiel de réservoir ne peut être menée que par des expériences in vivo.

Objectifs

Dès le début de la pandémie de COVID-19, la question de la contamination des animaux proches de l'homme a été posée. Plusieurs études expérimentales ont été menées pour déterminer le spectre d'hôtes du SRAS-CoV-2 apparu à Wuhan, en Chine. Il a été démontré que la sous-famille des Murinae, qui comprend les rats et les souris, n'était pas réceptive (la réceptivité étant la capacité de réplication virale) à l'infection par le SRAS-CoV-2, probablement en raison de différences essentielles au niveau du récepteur utilisé par le virus pour infecter son hôte. L'émergence de nouveaux variants du SARS-CoV-2, en particulier les variants préoccupants B.1.351 et P.1, qui peuvent infecter expérimentalement de jeunes souris, a modifié cette situation, d'où la nécessité de surveiller le risque que les rongeurs sauvages deviennent des réservoirs du virus, à partir desquels il pourrait évoluer et se propager à l'homme. Les rats, en particulier Rattus norvegicus sont devenus des habitants importants de nos villes, tandis que Rattus rattus est plus fréquent dans les zones agricoles et portuaires. Dans les villes où les égouts ne sont pas bétonnés, les estimations sont de 1,5 à 1,7 rats par habitant avec des pullulations reconnues dans les grandes villes comme Paris et Marseille, ou lors de conditions particulières comme les grèves des éboueurs. La proximité de ces espèces sauvages avec les humains ainsi que la possibilité de détecter du matériel génétique du SRAS-CoV-2 dans les effluents incitent à poursuivre les recherches sur le rôle que ces espèces pourraient jouer en tant que réservoir secondaire des variants du SARS-CoV-2, avec des implications dramatiques pour les risques de propagation et les efforts d'éradication putatifs et une mauvaise interprétation des concentrations virales dans les eaux usées si le virus est également excrété par les rongeurs vivant dans les égouts. L'objectif de ce projet est d'étudier le risque d'émergence de réservoirs de rongeurs par une approche d’essai de réceptivité et de transmission.

Bénéfices attendus

L’approche expérimentale couplée à une recherche du virus chez les rats piégés dans de grandes métropoles françaises permettra de répondre à la question de la possibilité de constitution d’un réservoir sauvage d’un des variants du SARS-CoV-2. L’approche expérimentale pemet de savoir si les animaux sont récéptifs et capables de se transmettre l’infection soit de façon directe (par projection d'aérosol entre individus), soit de façon indirecte par voie orale (par le biais des matières fécales). Les études sur le terrain permettront de voir si les rongeurs sont effectivement exposés car il reste toujours une incertitude sur le caractère infectieux du virus retrouvé dans les effluents.

Procédures

1/Lavage nasal sous anesthésie gazeuze (entre 1 à 7 fois selon les procédures et les groups de rats, à raison d'une durée de 30 secondes). 2/Infection intranasale sous anesthésie gazeuse (environ 15 secondes) .3/ Prise de sang à la veine caudale (durée 1 à 2 minutes) sous anesthésie gazeuse (5 répétitions à 3/4 jours d'intervalle sur un seul groupe de 6 rats) 4/ Prise de sang intracardiaque terminale (durée d'une minute environ) sous anesthésie (induction à l’isoflurane et injection intrapéritonéale de kétamine et de Xylazine) + analgésique. 5/ gavage oral sous anesthésie gazeuse (quelques secondes).

Impact sur les animaux

L’infection chez les rongeurs peut provoquer une baisse d’appétit et une perte de poids. Le contrôle visuel sera quotidien et le contrôle du poids effectué tous les 2 jours pour ne pas perturber les rats (Rattus rattus particulièrement). Tout signe inhabituel (tel qu'une baisse d’activité) entrainerait une observation 2 fois par jour. L’infection étant respiratoire, un point limite est fixé : l'observation de difficultés respiratoires, d'une toux très importante ou d'une perte de poids au delà des 20%, entraîne la mise à mort humaine de l'animal. Toute pathologie intercurrente qui ne peut être soignée ou entraînant une douleur qui ne peut être contrôlée entraînera une mise à mort compassionnelle. Les lavages nasaux seront effectués sous anesthésie gazeuse (isoflurane)

Devenir

mise à mort de tous les rats afin d'effectuer des prélèvements (organes et sang)

Remplacement

L'étude du potentiel de constitution d’un réservoir de SARS-CoV-2 sur une espèce sauvage ne peut être réalisée que par des expériences in-vivo. Des études in silico et in vitro d’inoculation de cellules de rats ont déjà montré une possible réplication du virus en fonction du variant.

Réduction

La construction du projet en procédures successives dont la mise en œuvre ne se fait que si la précédente est efficace permet de limiter le nombre d’animaux. L’utilisation de lot de 5 à 6 animaux permet en minimisant leur nombre d’appliquer des tests statistiques non paramétriques.

Raffinement

Les animaux seront observés et approvisionnés en nourriture fraîche quotidiennement. Ces rongeurs seront hébergés en cage de 2 à 3 individus avec un enrichissement composé de nombreux tunnels, abris (afin de satisfaire leur besoin de cachette particulièrement les rats noirs et les rats bruns), et de bâtonnets de bois à ronger. Tout signe inhabituel (telle qu'une baisse d’activité) entrainerait une observation 2 fois par jour. Un point limite est fixé : l'observation de difficultés respiratoires (dyspnée, tirage costal, toux très importante, perte de poids au delà des 20%) entraîne la mise à mort humaine de l'animal. Toute pathologie intercurrente qui ne peut être soignée ou entraînant une douleur qui ne peut être contrôlée entraînera une mise à mort compassionnelle. Les seuls prélèvements sont des lavages nasaux qui seront effectués sous anaesthésie gazeuses à l’isoflurane. La mise à mort des rongeurs sera effectuée suite à une anesthésie (induction à l’isoflurane puis injection intrapéritonéale de kétamine à 150mg/kg et de Xylazine à 10 mg/kg associée à une prise de sang terminale intra-cardiaque et une dislocation cervicale.

Choix des espèces

Rattus norvegicus et rattus rattus sont les 2 espèces de rats vivant dans les égouts ou espaces anthropisés suceptibles d’être exposés par les effluents contaminés ou proximité d’avec l’homme. Les rattus norvegicus de laboratoire seront issus d'un éleveur agréé. Les rats bruns et les rats noirs, bien que de type sauvage seront issus d'un élevage également. Seul le rat noir, dont aucun animal de laboratoire ne dérive, nécessite un certificat de capacité puisqu'il est considéré par les autorités comme un animal sauvage. Les essais de réceptivité/sensibilité chez les murinés ayant été menés chez des rongeurs adultes, les rats choisis ici sont des adultes d'un poids compris entre 200 et 300 grammes.

90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie crânienne d'une heure pour implanter des électrodes, puis des enregistrements de vingt minutes par jour pendant un mois dans un champ ouvert, pour étudier une atrophie du cervelet due à une mutation d'un canal calcique. Le porteur indique que les souris porteuses de la mutation peuvent développer une ataxie et une mort des cellules de Purkinje, et que la chirurgie peut provoquer une douleur modérée pendant la récupération. Il affirme que le modèle murin est "incontournable" et que les réseaux de neurones ne peuvent être obtenus en culture ni par modélisation.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier l’impact physiopathologique d’une mutation génétique conduisant à une réduction de la taille du cervelet (une atrophie) dès l'enfance (elle a été nommée atrophie céréelleuse infantile, ChCA). Cette maladie est due à un dysfonctionnement dans une protéine de transport du calcium qui se trouve à la surface de certaines cellules, notamment les cellules de Purkinje du cervelet. La mutation conduit à un plus grand influx de calcium dans les cellules de Purkinje dès l'enfance, ce qui pourrait induire la mort des cellules et donc une atrophie du cervelet. Seules les études in vivo et ex vivo peuvent permettre de déterminer l’impact de cette mutation sur le(s) dysfonctionnement(s) neurologique(s) observé chez les patients atteints de cette maladie. Pour ce projet, nous utiliserons un modèle murin chez lequel l'expression de la mutation pourra être induite sélectivement dans les cellules de Purkinje et ainsi étudier les conséquences de cette mutation dans le cervelet. Il s’agit du premier modèle animal de cette maladie et l’attente des patients et cliniciens est considérable, d’une part pour mieux comprendre cette pathologie, et d’autre part pour évaluer les traitements possibles.

Bénéfices attendus

Identifier les mécanismes pathogéniques dans l'atrophie cérébelleuse infantile. Préciser le rôle de la protéine mutée dans le développement du cervelet et le fonctionnement des cellules de Purkinje. Valider le modèle murin en tant que modèle préclinique de la maladie permettant d'évaluer des pistes thérapeutiques dans l'atrophie cérébelleuse infantile.

Procédures

Pour ce projet, 90 animaux subiront une chirurgie d'une durée de une heure pour l'implantation crânienne d'électrodes pour des enregistrements cellulaires. Sur ces animaux, les enregistrements (branchement d'un cable souple sur les électrodes implantées) dureront 20 minutes par jour pendant 1 mois pendant qu'ils se déplacent dans un champ ouvert.

Impact sur les animaux

Pour les animaux porteurs de la mutation, on peut s'attendre à des modifications précoces du fonctionnement des cellules de Purkinje du cervelet, puis à leur mort, ce qui peut conduire à une ataxie cérébelleuse et une réduction de la taille du cervelet (atrophie). Les chirurgies sous anesthésie destinées à implanter les électrodes peuvent induire une douleur modérée pendant la récupération.

Devenir

L'ensemble des animaux contribuant à la procédure seront mis à mort. Les organes, tout particulièrement le cerveau et le cervelet, seront prélevés pour des expériences sur tranches aigues ou des analyses immunohistologiques.

Remplacement

Le développement et la caractérisation d'un modèle souris est incontournable pour l'analyse pathophysiologique de la ChCA (ataxie cérébelleuse infantile). Son utilisation sera toutefois strictement limitée aux expériences ne pouvant être réalisées via une modélisation sur ordianteur ou des lignées de cellules humaines. Ainsi, les conséquences fonctionnelles de la mutation seront d'abord modélisées sur lignées cellulaires humaines et des approches in silico. Cependant, ces stratégies permettront de faire des prédictions sur l'impact de la mutation à l'échelle cellulaire mais pas à l'échelle de l'organe entier, à savoir le cerveau. En effet, les réseaux de neurones mis en place lors du neurodéveloppement ne peuvent pas être obtenus en culture ni par modélisation informatique. De même, les conséquences motrices des dysfonctionnements du cervelet nécessitent encore aujourd'hui de réaliser des expériences sur l'animal vivant.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour ce projet (estimé à 90) a été défini au plus juste pour nous permettre d’atteindre nos objectifs scientifiques de façon fiable et reproductible. Nous avons défini une stratégie de croisement que nous espérons la plus optimale possible. Nous utiliserons des individus des 2 sexes afin de réduire le nombre d’individus à produire. Pour définir statistiquement la taille des lots d'animaux à tester, nous nous appuyons sur des travaux publiés, ainsi que sur l'utilisation de logiciel approprié pour l'évaluation statistique du nombre d’animaux requis.

Raffinement

Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux sera strictement respecté et effectué quotidiennement. Des points limites spécifiques ont été définis et le raffinement s’appliquera selon une grille d'observation pour une prise en charge adaptée des animaux. Cette prise en charge comprend l’utilisation d’analgésiques, une adaptation des conditions de vie et lorsqu'une douleur ou un inconfort non reversibles apparaissent, l'euthanasie.

Choix des espèces

La souris est le modèle animal le mieux adapté pour i) modéliser de manière inductible la maladie neurologique étudiée et ii) développer l'ensemble des investigations anatomomorphologiques et fonctionnelles des atteintes cérébelleuses associées à la pathologie. La possibilité de contrôler l'expression de la mutation par une recombinase est également un atout majeur justifiant l'intérêt de modéliser cette pathologie dans l'espèce souris. Les connaissances actuelles sur ce modèle permettent de répondre au mieux à la règle des 3 R. Utilisation d'adultes pour étudier les conséquences neurodéveloppementales de l'expression de la mutation d'intérêt, en particulier les conséquences sur le développement et la physiologie du cervelet.

130 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souris âgées de 20 mois, choisies pour leur barrière hémato-encéphalique naturellement altérée, passent des examens d'IRM sous anesthésie, tandis que les rats subissent des examens de tomographie par émission de positons avec pose de cathéter, tous recevant cinq jours d'injections intrapéritonéales du peptide. Le porteur indique un stress lié aux anesthésies répétées et à la mise à jeun, et une surveillance accrue des animaux âgés plus sensibles. Il répète que l'expérimentation animale est "indispensable" et impossible à remplacer par des méthodes in silico ou in vitro, malgré des données in vitro déjà obtenues.

Objectifs

De nos jours, la maladie d’Alzheimer et le vieillissement cérébral sont des enjeux de santé publique majeurs. En effet, les maladies neurodégénératives et les pathologies entraînant une altération de la Barrière Hémato Encéphalique (BHE) ou une diminution de l’activité cérébrale peuvent entraîner de très importants déficits cognitifs. La spondine est une protéine spécifique du système nerveux central. Elle est active uniquement lors du développement cérébral et est impliquée dans la formation de nouveaux neurones. Dans ce contexte, un peptide dérivé de la spondine a été développé par le laboratoire comme nouvelle thérapie pour ces pathologies. Lors de tests préliminaires in vivo et in vitro, il a montré des effets bénéfiques, tels que l’augmentation de la résistance des couches de cellules des vaisseaux sanguins et l’amélioration de la transmission synaptique (amélioration de l’activité cérébrale). La présente étude vise désormais à évaluer l’effet de ce peptide in vivo sur : - l’intégrité de la BHE chez des souris âgées ayant une BHE altérée, par le biais de l’imagerie par résonance magnétique (IRM) avec injection de produit de contraste. Le peptide devrait restaurer l’intégrité de la BHE et cela devrait être objectivé par le fait que le produit de contraste ne pénétrera plus dans le cerveau. - l’activité cérébrale métabolique de rats jeunes et âgés, par le biais de la micro-tomographie par émission de positons (TEP) avec injection d’un sucre radioactif. Le peptide devrait augmenter l’activité cérébrale et la transmission synaptique, ce qui entraînerait une augmentation de la capture de sucre marqué dans les régions cérébrales concernées.

Bénéfices attendus

Cette étude est nécessaire au développement préclinique du peptide médicament, et aura un impact majeur pour son développement clinique dans diverses maladies neurodégénératives et conditions qui présentent une altération de la BHE et une diminution de l’activité cérébrale qui mènent à des déficits cognitifs tels que dans la maladie d’Alzheimer ou le vieillissement. Récemment, le laboratoire a démontré in vitro que le peptide était capable (1) d’améliorer la transmission synaptique (i.e. la communication entre les neurones) et (2) de’renforcer l'intégrité de la BHE. Ce projet va alors permettre de vérifier que les propriétés du peptide qui ont été découvertes sur des modèles in vitro sont bien extrapolables à un modèle in vivo. Les résultats obtenus à l’issue de ce projet auront donc un impact fondamental puisqu’ils pourront permettre de pousser plus avant le développement clinique du candidat médicament. À plus long terme, un des bénéfices majeurs de ce projet serait de pouvoir utiliser le peptide afin de traiter des patients présentant des déficits de la transmission synaptique et/ou un dysfonctionnement de la BHE. Ce type d’atteintes du système nerveux central ayant notamment été rapportées dans le cadre de la maladie d’Alzheimer, ou encore du vieillissement normal et pathologique.

Procédures

Durée totale de la procédure 1 = 18 jours avec 4 examens d’imagerie (1h20 dont 40 minutes d’anesthésie par examen), et 5 jours d’injections quotidiennes d’un traitement en intra péritonéal. Durée totale de la procédure 2 = 18 jours avec 4 examens d’imagerie d’une durée de 30 minutes chacun, sous anesthésie générale, et 5 jours d’injections quotidiennes d’un traitement en intra péritonéal. Les animaux seront soumis à 4 examens d’imagerie sous anesthésie générale. Chaque examen TEP aura une durée totale de 1h20 dont 40 minutes sous anesthésie générale. Les rats seront mis à jeun 4h avant l’examen, puis ils seront soumis à une pose de cathéter veineux en condition vigile. Chaque examen IRM aura une durée totale de 30 minutes sous anesthésie générale. Les souris seront soumises à une pose de cathéter veineux. Dans les deux cas, les animaux (rats et souris) auront une administration quotidienne du traitement ou du véhicule en intra péritonéal pendant 5 jours.

Impact sur les animaux

La dose du peptide médicament utilisée dans cette étude est très inférieure aux doses maximales ne présentant pas d’effet nocif observé dans des études toxicologiques réglementaires. Cependant, l’administration répétée du traitement en intrapéritonéal (IP), la mise à jeun pendant 4h lors des examens TEP, l’injection intraveineuse (IV) du radiotraceur chez l’animal éveillé (rat), l’injection IV de produit de contraste (souris), ainsi que l’induction de l’anesthésie peuvent entrainer un stress. D’autre part, les animaux âgés, pouvant être plus sensibles, feront l’objet d’un suivi plus étroit.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour prélever le cerveau en vue d'analyses immunohistochimiques et biochimiques post-mortem.

Remplacement

Des études antérieures menées par le laboratoire ont permis de démontrer in vitro un effet bénéfique du peptide sur l'intégrité de la barrière hématoencéphalique (BHE) et sur la transmission synaptique. Bien que des brevets aient déjà été déposés pour chacune de ces propriétés, des résultats obtenus dans des modèles in vitro ne peuvent se substituer à une preuve de concept in vivo de l’effet de la molécule dans le cadre du développement d’un candidat médicament. L’expérimentation animale est donc indispensable si l’on veut pouvoir faire progresser le développement préclinique puis clinique de la molécule. Dans le cas de ce projet, il est donc impossible de remplacer les animaux par des méthodes in silico et/ou in vitro. Toutefois, la société a pris le soin de réaliser plusieurs études in vitro en amont afin de s’assurer de la robustesse de l’effet du peptide. Les principaux résultats de ces études sont les suivants : - le peptide promeut l'étanchéité et la résistance de monocouches de cellules endothéliales in-vitro. - le peptide améliore la transmission synaptique basale (activité cérébrale). Cela nous donne la garantie de réduire au maximum le risque que ce projet d’étude in vivo, bien qu’indispensable, soit effectué vainement.

Réduction

L’utilisation de méthodes d’imagerie permet un suivi longitudinal des animaux ce qui entraine une réduction notable des effectifs nécessaires à l’obtention de résultats significatifs, ceci augmenté par le fait que chaque animal inclus est son propre contrôle (diminution de la variabilité inter individuelle). Les inclusions des animaux seront faites séquentiellement et les résultats de chaque lot seront analysés avant de démarrer un nouveau lot. En TEP nous souhaitons avoir 5 rats jeunes traités avec le véhicule (qui serviront de groupe témoin et permettront de prendre en compte un potentiel effet du suivi longitudinal), et 10 rats jeunes traités avec le peptide. Ainsi que 5 rats âgés traités avec le véhicule, et 10 rats âgés traités avec le peptide. Nous prévoyons 5 rats âgés supplémentaires afin de prendre en compte les risques accrus liés à l’anesthésie. Cependant, la procédure sera finalisée dès que l’effectif de 15 rats âgés sera obtenu, ne nécessitant pas forcément de commander ces 5 rats supplémentaires. Toutes ces images seront analysées voxel à voxel et comparées à la baseline de chaque sujet. En IRM, nous souhaitons avoir 10 souris âgés traitées avec le véhicule, 10 souris âgées traitées avec le peptide et 5 souris jeunes traitées avec le véhicule. Nous choisissons un modèle d’altération de la BHE naturellement existant chez les souris âgées. Chez l’homme, 30% des individus présentent une BHE altérée à partir de 55 ans. Par analogie, nous estimons que 30% des souris testées pourraient être incluses dans le protocole. Cette étude étant prospective et n’ayant pas de certitude concernant le pourcentage d’animaux présentant une BHE altérée nous calculerons nos effectifs avec 20% des souris testées incluables. A nouveau, les inclusions des animaux seront faites séquentiellement et les résultats de chaque lot seront analysés avant de démarrer un nouveau lot. Si moins d’un tiers des souris testées présentaient une BHE altérée, le protocole serait immédiatement arrêté.

Raffinement

Les animaux arriveront à l’animalerie minimum une semaine avant le début du protocole pour une période d’acclimatation. Les souris seront hébergées par groupe de 6 et les rats par groupes de 5, ce qui leur permettra d’exprimer des comportements sociaux. Les mises à jeun nécessaires aux imageries TEP seront réalisées séquentiellement et dans une cage commune. De ce fait la mise à jeun sera précisément de 4h pour tous les rats sans stress supplémentaire lié à un isolement. Les imageries TEP et IRM seront réalisées sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane avec un monitorage continu du rythme respiratoire. Cette méthode d’anesthésie permet de régler finement et en temps réel la quantité nécessaire à la sédation de l’animal et limite les risques de surdose. Tout au long du protocole les animaux seront suivis quotidiennement avec une grille de score permettant de détecter précocement tout signe de mal être.

Choix des espèces

En IRM, la souris est choisie car sa taille est compatible avec les spécifications de la machine. Des souris de 20 mois seront incluses dans ce projet car elles présentent naturellement une rupture de la BHE, qui sera visible grâce à l’administration de produit de contraste. Les souris jeunes serviront de contrôle expérimental d’une activité cérébrale dite « normale » et d’une BHE intègre respectivement. Seuls les animaux âgés seront utilisés comme des modèles de « condition pathologique » chez lesquels l’efficacité de la molécule pourra être évaluée. Il est donc nécessaire d’utiliser un nombre d’animaux âgés suffisant pour pouvoir conclure quant à l’effet de la molécule d’intérêt. Le nombre d’animaux dits « contrôles » peut en revanche être réduit, ce qui explique le déséquilibre entre les effectifs d’animaux jeunes et âgés. En TEP, le recours au rat est indispensable. En effet, sur cette procédure on ne cherche pas à observer un effet global mais à identifier quelles zones cérébrales sont impactées par le traitement, il est donc plus favorable de faire l’étude sur un cerveau de plus grande taille. Des sujets jeunes (2 mois) et âgés (20 mois) seront inclus dans ce projet. Il est nécessaire de recourir à des rats jeunes et âgés pour évaluer l’activité cérébrale métabolique à l’état basal en fonction de l’âge et évaluer l’effet du peptide dans ces deux conditions. En effet, des études electrophysiologiques in vitro antérieures ont montré une augmentation de l’activité synaptique en présence du peptide.

180 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux injections intramusculaires d'un candidat vaccin peptidique contre la dengue sous anesthésie, ainsi qu'une à deux prises de sang par voie rétro-orbitale, avant d'être tuées pour prélèvement des organes. Le porteur indique qu'aucun signe clinique n'est attendu, le vaccin étant "faiblement immunogène", et que les mâles sont écartés pour éviter le stress lié à un dominant. Il conclut que la réponse immunitaire antivirale ne peut être reproduite in vitro.

Objectifs

La dengue ou « grippe tropicale » est une maladie virale transmise par piqûre de moustique. Chaque année, on rapporte 400 millions de cas de dengue dont 500 000 cas sont associés à des fièvres hémorragiques. A l’heure actuelle, il n’existe pas de vaccin efficace sur le marché. L’objectif de ce projet est d’évaluer la capacité d’un candidat vaccin à induire une réponse immunitaire protectrice de type cellulaire contre le virus de la dengue. Pour cela, des souris recevront deux injections intramusculaires du candidat vaccin (Une immunisation et un rappel 21 jours après). Trois adjuvants différents seront comparés afin de choisir celui permettant d’induire la meilleure réponse cellulaire. Les animaux seront mis à mort à 7 jours ou 28 jours post-rappel afin de permettre la mesure de la réponse cellulaire. Ce projet nécessite l’utilisation de 180 animaux.

Bénéfices attendus

A l’heure actuelle, il n’existe aucun vaccin permettant l’induction d’une protection efficace contre le virus de la dengue. Ce projet permettrat de démontrer l’efficacité d'un candidat vaccin à induire une réponse immunitaire cellulaire contre le virus de la dengue.

Procédures

2 injection intramusculaires ( 50 uL) à jours 0 et 21 sur animaux anesthésiés à l'isofluorane. 1 à 2 prélèvements sanguins (150 uL) par voie retro-orbitale sur animaux anesthésiés à l'isofluorane.

Impact sur les animaux

Le candidat vaccin est un vaccin de type peptidique, donc faiblement immunogènes. Ainsi, aucun signe clinique (fièvre, perte de poids…) n’est attendu suite à la vaccination. Les adjuvants sélectionnés sont des adjuvants de type liposomes, couramment utilisés pour l’évaluation de l’immunogénicité de candidats vaccin chez la souris. Les composants de ces adjuvants permettent l’induction d’une inflammation locale modérée au niveau du muscle et du ganglion drainant le muscle, nécessaire à l’initiation de la réponse immunitaire. Cependant, ces adjuvants sont très bien tolérés et aucune réaction locale ou systémique n’est observée après une ou deux injections.

Devenir

Mis à mort pour prélèvement des organes (mesure des paramètres immunologiques)

Remplacement

La réponse immunitaire antivirale est un phénomène biologique complexe faisant intervenir de multiples types cellulaires dans différentes localisations (muscle, ganglions drainants, rate …). La procédure ne peut donc être reproduite in vitro.

Réduction

Nous utiliserons 5 animaux par groupe expérimental, analysés individuellement. Un test de Mann-Whitney sera réalisé́ car la comparaison porte sur 2 groupes avec un faible nombre d’échantillons, et aucune hypothèse n'est présupposée. En considérant des différences de moyenne d'au moins 20% avec une déviation standard inférieure à 5% et un seuil minimal du risque alpha à 5%, un groupe de 5 animaux permet d’obtenir une puissance de test d'environ 0.8. Les expériences seront répétées une fois pour vérifier la reproductibilité́ et la validité des résultats (Giles, J. The trouble with replication. Nature 442, 344–347 (2006)). La procédure sera réalisée avec des femelles. En effet, les souris mâles sont à écarter dans les expériences longues (> 3 semaines) afin d’éviter le stress éventuel généré par la présence d'un mâle dominant dans la cage. Si aucune réponse CD8 n’est observée 7 jours après rappel, le projet s’arrêtera et la réponse à jour 28 ne sera pas évaluée.

Raffinement

Une semaine d'acclimatation sera réalisée avant la mise en place de chaque expérience. A la réception, des groupes seront réalisés et maintenus tout au long de la procédure pour créer des groupes sociaux et éviter le stress dû à l'isolement. Tous les traitements/prélèvements sont administrés sous PSM II afin de prévenir tout risque d’infection opportuniste. Précautions particulières : - Immunisation par le candidat vaccin : Les injections intramusculaires sont réalisées sous brève anesthésie à l’isofluorane. Aucun signe clinique, local (douleur à la patte) ou systémique (fièvre, perte de poids…) n’est attendu suite à l’immunisation. Les animaux feront néanmoins l’objet d’une surveillance dans les minutes qui suivent l’injection, le lendemain, puis chaque semaine afin de s’assurer qu’aucun signe de souffrance ne soit observé. Une attention particulière sera portée au boitillement évocateur d’un douleur à la patte ayant reçue l’injection. Si une souris présente des signes de souffrance tel que le pelage hérissé, la prostration ou l'absence de réponse aux stimuli extérieurs, elle sera exclue de la procédure et immédiatement mise à mort par dislocation cervicale. - Prélèvements de sang : un collyre anesthésique est appliqué à l’œil avant la procédure pour réduire toute douleur. Les prélèvements de sang sont réalisés sous brève anesthésie à l’isofluorane. Dans le cas où l'œil montrerait des signes d'inflammation après l’injection, il sera soigné par l'application d'une pommade vétérinaire ophtalmique associant un corticostéroïde et un antibiotique (Framycétine).

Choix des espèces

Les éléments immunogènes du candidat vaccin sont capable d'être reconnu par le système immunitaire de la souris. Les souris seront âgées de 8-12 semaines au démarrage de l’expérience, le système immunitaire de ces animaux doit être complètement mature et non vieillissant.

98 macaques à longue queue vont être utilisés, dont 22 réutilisés et les autres tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par le virus de la variole du singe après immunisation, puis subissent des prises de sang jusqu'à trois fois par semaine, des lavages broncho-alvéolaires, des biopsies de ganglions, de peau, de poumon, de moelle osseuse et d'intestin, ainsi que des ponctions lombaires. Le porteur décrit des lésions cutanées douloureuses s'étendant sur tout le corps pendant deux à trois semaines, de la fièvre et une fatigue importante, et signale un risque rare de pneumothorax après biopsie pulmonaire. Il affirme que le primate non humain est le "seul modèle" réunissant les éléments nécessaires à l'évaluation de vaccins.

Objectifs

Le projet a pour objectif d’évaluer l’efficacité de protection et thérapeutique de différents candidats vaccins ou de molécules contre le virus responsable de la récente épidémie de variole du singe. En effet, un nouveau virus circulant issu des souches virales d’Afrique de l’ouest semble capable de se répandre dans la population par des voies de contamination qui n’avaient pas été observées jusqu’alors pour ce virus. Il est donc nécessaire : 1) de vérifier l’efficacité de l’arsenal thérapeutique disponible actuellement, 2) de proposer de nouvelles thérapies et permettre le nouveau positionnement de molécules/vaccins existant. A l’heure actuelle, il existe des vaccins de deuxième et troisième génération contre la variole qui ont permis une éradication de cette maladie dans les années 70-80. Toutefois, l’efficacité de ces vaccins contre la variole du singe n’est pas connue actuellement or la vaccination est une étape critique de la prévention de la maladie. En effet, il n’existe qu’un seul traitement curatif reconnu contre la variole. Certains molécules anti-virales pourraient être utilisées, mais avec la disparition de la variole en 1977, celles-ci n’ont pas été testées chez l’homme. Le but de ce projet est donc de mettre en place un modèle de variole du singe chez le primate non humain en mimant les voies d’entrée du virus responsable de la maladie récemment décrites chez l’homme. Une fois ce modèle établi, nous pourrons tester l’efficacité de candidats vaccins, soit déjà reconnus pour leur efficacité dans le contexte de la variole, soit de nouveaux vaccins innovants. En parallèle, ce nouveau modèle permettra de tester des traitements médicamenteux préventifs ou curatifs. Ces molécules seront soit déjà pressenties pour le traitement de la variole soit de nouvelles molécules innovantes afin de s’adapter au mieux au contexte sanitaire.

Bénéfices attendus

La recherche et/ou la validation de vaccins et de traitements efficaces contre la variole du singe est un enjeu de santé publique. La variole du singe est une pathologie présente dans les régions d’Afrique centrale et occidentale. Bien que moins grave que la variole, son tableau clinique est relativement semblable et présente un taux de mortalité comprise entre 1 et 10% du fait, notamment, d’un manque d’accès à des soins adaptés. Le nouveau virus proche de la souche d’Afrique de l’ouest qui circule actuellement en dehors de ces territoires endémiques semble avoir un taux de mortalité très faible, cependant la grande majorité des nouveaux patients sont dans un contexte de soin favorable. A l’heure actuelle, cette épidémie est encore relativement circonscrite dans une frange définie de la population, le manque d’outil thérapeutique adapté nous laisserait démunis si celle-ci prenait de l’ampleur. Les bénéfices de ce projet sont donc doubles : fournir un arsenal thérapeutique adapté afin de protéger des populations vulnérables mais également de proposer un ensemble d’options préventives et curatives dans l’éventualité de l’aggravation de l’épidémie actuelle.

Procédures

- L’ensemble des procédures sera effectué sur des animaux anesthésiés pour éviter toute souffrance. - L’immunisation ou le traitement des primates sera effectuée par différentes voies, le temps de l’intervention est inférieur à 30 minutes. L’immunisation par voie intestinale ou gastrique peut prendre jusqu’à 1h30. Nous effectuerons l’épreuve virale et cela durera environ 30 minutes par animal. Des puces de température pourront être implantées sous la peau pour suivre la température corporelle en continu (intervention 45 minutes). - Nous effectuerons des prélèvements de sang au maximum 3 fois par semaine pendant la phase aïgue qui représente 4 semaines environ. Ceci nécessitera un temps d’anesthésie de 20 minutes environ. Pour suivre l’évolution de la charge virale, nous effectuerons des prélèvements sanguins, prélèvement des liquides des pustules et de fluides ou lavages des sites infectieux et muqueuses au maximum 3 fois par semaine (10 minutes) pour un nombre total de 30 maximum pour toute l’étude. Pour accéder au tractus respiratoire inférieur, nous effectuerons des lavages broncho-alvéolaires (BAL) avec 4 jours d’intervalle minimum entre chacun des lavages (30 minutes) pour un nombre total de 10 maximum. Différents types de biopsie pourront être réalisés en fonction des besoins de l’étude, comme des prélèvements de ganglions lymphatiques avec deux semaines d’intervalle minimum et 3 prélèvement maximum (45 minutes). Des ponctions lombaires pour accéder au liquide cérébrospinal (1 fois par semaine au maximumet 3 au maximum) et des biopsies de peau pourraient être envisagées (20 min d’intervention). Nous pourrions avoir besoin d’effectuer des biopsies pulmonaires pour évaluer la réponse locale ainsi que des biopsies de moelle osseuse et des biopsies intestinales par endoscopie (90 minutes d’intervention maximum). - Nous utiliserons aussi des méthodes non invasives pour l’analyse de nos candidats thérapeutiques en utilisant deux techniques d’imagerie 5 fois au maximum au cours de l’étude(90 minutes maximum).

Impact sur les animaux

L’infection par le virus responsable de la variole du singe induit de petites lésions au niveau de la peau qui grattent beaucoup et peuvent s’avérer douloureuses dans certains cas. Ces lésions pourront s’étendre sur tout le corps et persisteront 2 à 3 semaines. Par ailleurs, les animaux pourront développer de la fièvre, des courbatures, des céphalées et une fatigue importante. Enfin dans certains cas assez rare, l’animal pourrait se dégrader fortement et une euthanasie pourra être requise afin de limiter sa souffrance. Par ailleurs, l’hébergement individuel lors des phases d’infection avec le virus pourrait entrainer un stress qui sera compensé par un programme défini par la cellule « bien-être animal » de l’établissement pour l’enrichissement plus important de leur milieu de vie. Au niveau des procédures expérimentales, peu d’effets indésirables sont attendus à l’exception de la répétition des anesthésies qui peut entrainer des déficits de l’alimentation et une fatigue chez l’animal. Dans de très rares cas, un pneumothorax (présence anormale d'air dans la cavité pleurale) ou un hémothorax (épanchement de sang dans la cavité pleurale) sont possibles à la suite des biopsies pulmonaires et seront observables en direct lors de l’endoscopie. Les biopsies digestives par endoscopie sont parfois associées à des saignements digestifs. Il est possible que les biopsies entrainent des inflammations et plaies locales qui seront surveillées quotidiennement jusqu’à la récupération complète de l’animal.

Devenir

Dans la majorité des cas, la variole du singe n’est pas mortelle chez le macaque. Toutefois, ce nouveau virus est encore mal connu et le passage à l’humain est connu et documenté. Ceci impose donc la plus grande prudence. Certains animaux seront euthanasiés afin d’accéder aux tissus (histologie) afin de valider le modèle mais également de tester l’innocuité des candidats vaccins et des molécules thérapeutiques testés, pour vérifier l’absence de toxicité. Par ailleurs, si une dégradation de l’état clinique de l’animal est observée, dans le but d’éviter toute souffrance inutile et du fait du risque que représente ce virus pour l’homme, les animaux seront euthanasiés. Si lors de l’établissement du modèle, il est validé qu’un animal qui récupère de la pathologie est complètement exempt de charge virale persistent et de séquelles qui diminueraient fortement le bien-être de l’animal à long terme, alors les animaux qui ne seront pas engagés dans des protocoles d’histologie pourront être réutilisés.

Remplacement

L’évaluation d’approches thérapeutiques dans le contexte de la variole du singe nécessite un modèle expérimental permettant d’étudier les différentes composantes des réponses immunitaires et les changements induits suite à l’immunisation et/ou à l’infection virale. A ce jour, ces différents éléments ne peuvent pas être étudiés à l'aide de simulations informatiques ou dans des modèles in vitro. L'utilisation d'un modèle animal reste donc nécessaire pour reproduire les symptômes et réponses immunitaires induits pas un virus. Le primate non humain est choisi comme modèle animal dans cette étude, car il présente une réponse immunitaire et vaccinale semblable à celle de l’humain pour la plupart des infections. De plus, les outils nécessaires sont disponibles et maitrisés chez cette espèce.

Réduction

Nous devons mettre en place un modèle de variole du singe chez le primate afin de permettre de tester à la fois les vaccins et les molécules thérapeutiques dans les conditions les plus proches de l’homme. Durant cette phase de mise en place du modèle, les essais se feront de manière séquentielle. A l’heure actuelle, il est difficile de savoir si la première dose testée pour chacune des voies sera celle choisie et l’essai suivant ne sera mené qu’en fonction des résultats du précédent. A ce titre, si la dose nécessaire à l’établissement du modèle est trouvée rapidement, certains animaux pourront être utilisés pour confirmer la dose, les restant ne seront pas utilisés. Par ailleurs, la première dose testée repose sur une analyse de la littérature scientifique solide afin de maximiser notre chance de réussite rapide. Concernant les études d’efficacité et thérapeutiques de candidats vaccins des groupes de 6 primates seront utilisés dans les groupes traités ou vaccinés. Dans le cas des groupes contrôles, dans la mesure du possible, des contrôles « historiques » (données issues d’animaux utilisés dans une autre étude précédente, y compris la mise en place du modèle) seront utilisés au maximum.

Raffinement

Tous les animaux sont des animaux d’élevage, toutes les procédures seront effectuées sur des animaux anesthésiés. De plus, des protocoles pour supprimer la douleur ont été définis et validés par l’équipe vétérinaire afin de la réduire au maximum à chaque intervention. Un suivi quotidien de l’état général des animaux par une équipe formée à reconnaître les signes de mal-être ou de souffrance est mis en place. Les hébergements en individuel sont limités au maximum et lorsque cela sera nécessaire, les animaux seront hébergés de manière contiguë. Cet hébergement individuel contigu permet des interactions sociales (conservation du contact physique par le haut de la cage et sensoriel par la mise en place de plaques translucides entre les cages latérales, et cages face à face séparées d’environ 2m). L’enrichissement sera augmenté (distribution 2 fois par semaine d’enrichissements destructibles au lieu d’1). Les interventions par chirurgie mini-invasive, ciblant des organes et tissus préalablement identifiés par imagerie médicale seront privilégiées afin de raffiner les méthodes expérimentales employées et ainsi réduire la douleur postopératoire. Grâce à l’utilisation de différentes techniques d’endoscopie les tissus cibles seront prélevés avec précision en un nombre réduit d’incisions. Les volumes de sang prélevés seront réduits au minimum nécessaire. En cas d’apparition de signes locaux suites aux prélèvements, un traitement symptomatique local pourra être instauré après examen par le vétérinaire. Pour les prélèvements des fluides, une attention sera portée aux animaux lors de ce geste. Le suivi des animaux, la mise en place des points limites et le signalement au vétérinaire s’effectuera suivant une grille d’évaluation clinique validée à la fois par le vétérinaire de l’installation et la structure du bien-être animal. Si l’animal montre des signes de douleur trop importante, un traitement symptomatique pourra être mis en place par le vétérinaire responsable. Si l’état général de l’animal ne s’améliorait pas malgré la prise de mesures, alors l’euthanasie de l’animal serait envisagée.

Choix des espèces

Les espèces de primates non-humains retenues pour cette étude ont été sélectionnées pour deux raisons : - elles représentent le seul modèle réunissant les éléments nécessaires à l’évaluation de vaccins : les réponses immunitaire et vaccinale sont similaires à celles de l’humain, et les techniques et outils d’exploration de la réponse immunitaire et de la réponse vaccinale sont disponibles et maitrisés chez ces espèces, contrairement à d’autres modèles d’infections respiratoires régulièrement utilisées comme le furet. - elles ont déjà fait l’objet de publications scientifiques en tant que modèles d’infection par le virus de la variole du singe historique, et présentent un tableau clinique présentant de forte similarité avec l’homme qui permettra une évaluation satisfaisante des stratégies thérapeutiques qui seront testés. La physiologie, le système immunitaire et la réponse vaccinale évoluent en fonction du stade de développement et de l’âge des individus. Les candidats thérapeutiques étudiés étant susceptibles de faire l’objet d’essais cliniques chez des individus présentant un système immunitaire « mature », il est donc nécessaire de réaliser ces études chez un animal présentant un système immunitaire au même stade. Par ailleurs, l’objectif de ce projet est de mettre en place un modèle de pathologie modérée, or il est connu que la sévérité de la pathologie provoquée par le virus diminue chez les animaux adultes. Pour ces deux raisons, nous utiliserons des animaux adultes, âgés de plus de 2 ans.

192 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes subissent une électroporation in utero sous anesthésie, puis la moitié des mères et de leurs portées passent huit jours dans un air appauvri en oxygène, pour modéliser l'hypoxie de la grande prématurité. Le porteur indique une mortalité fœtale pouvant atteindre 10 % et des lésions cérébrales diffuses chez les souriceaux, qui sont ensuite tués pour prélèvement du cerveau. Il affirme que l'approche in vivo est "incontournable" car les modèles in vitro ne reconstituent pas la complexité des connexions nerveuses.

Objectifs

La grande prématurité résulte fréquemment en des périodes de manque d'oxygène (appelées périodes d'hypoxie) du fait notamment de l’immaturité des poumons, et aboutit donc à des perturbations profondes de la capacité du cerveau à utiliser et produire de l'énergie (on parle de capacité métabolique), et à des lésions diffuses du cerveau. Bien que le cerveau du nouveau-né présente une capacité à se réparer supérieure à celle du cerveau adulte, des études récentes suggèrent que cette réparation pourrait être imparfaite ou même inadaptée. Ainsi, la probabilité d’apparition de troubles cognitifs est très fortement augmentée à l'adolescence, chez les enfants grands prématurés par rapport à ceux nés à terme, possiblement du fait de la mise en place de réseaux neuronaux anormaux. Objectif du projet : Cette étude a pour but de tester comment les perturbations survenant autour de la naissance et notamment l’hypoxie périnatale entraîne une perturbation durable de l’activité métabolique cérébrale, et notamment de l’activité des mitochondries, qui sont les organelles responsables de l’essentiel de la production d’énergie cellulaire. Ces perturbations métaboliques entraîneraient à long terme des anomalies du développement des réseaux neuronaux qui peuvent expliquer la survenue plus tard dans la vie de troubles neurologiques variés. Ce projet utilisera un modèle murin de naissance très prématurée (hypoxie néonatale chronique), combiné à une méthode chirurgicale permettant d’exprimer des protéines fluorescentes dans des populations ciblées de neurones du cortex cérébral chez la souris. Il permettra de répondre en même temps à deux questions : - Quelles sont les conséquences de l’hypoxie périnatale sur le développement à long terme du cerveau - Est-ce que ces défauts sont associés à un défaut métabolique persistant dans ces neurones.

Bénéfices attendus

Ce projet a une double finalité, à la fois fondamentale et translationnelle (préclinique) : -Sur un plan translationnel, ce projet permettra de mieux prédire les conséquences à long terme de lésions cérébrales survenant tôt dans la vie (pendant la période périnatale). Les données issues de ce projet permettront également de comprendre quels sont les mécanismes qui font que la réparation cérébrale n’est pas totalement efficace, ce qui pourra conduire à l’identification d’indicateurs biologiques ou de pistes thérapeutiques ultérieures. -Sur un plan fondamental, ce projet pourra fournir des hypothèses de recherche et des pistes de mécanismes cellulaires pour les chercheurs travaillant sur l’étude du développement cérébral.

Procédures

Des femelles gestantes seront soumises une fois, à une procédure de chirurgie sous anesthésie et avec analgésie péri/post-opératoire, appelée électroporation in utero, d’une durée de 30 minutes Après la naissance, la moitié des animaux (femelles et portée) seront soumis pendant 8 jours à un environnement appauvri en oxygène Les prélèvements seront réalisés postmortem pour l’étude du cerveau par histologie. La mise à mort sera réalisée par une éthode dérogatoire seule à même de préserver les tissus cérébraux.

Impact sur les animaux

Pour les femelles : La procédure permettant l'expression de marqueurs fluorescents dans les neurones et mitochondries, implique une approche chirurgicale invasive avec réveil. Dans de rares cas, nous pouvons observer une difficulté de mise bas. Les infections sont en théorie possibles, mais en pratique jamais observées suite au respect des règles d’asepsie. Pour les souriceaux : Une mortalité foetale (estimée à 10 pour cent maximum des embryons sur lesquels la procédure est effectuée est constatée, bien qu’il soit difficile de déterminer si la résorption fétale résulte de l’élimination spontanée de fétus surnuméraires pendant la gestation, ou d’une mortalité liée à la procédure chirurgicale. La procédure n’a pas de conséquence sur le développement du souriceau. Une réduction périnatale de l'oxygène ambiant (hypoxie) entraîne un retard de croissance et des lésions cérébrales diffuses. Après la période de réduction de l'oxygène ambiant, les souriceaux rattrapent leur retard de croissance et les lésions cérébrales apparaissent réparées au niveau macroscopique. Des altérations à long terme de la connectivité cérébrale résultant de l’hypoxie périnatale peuvent en théorie entraîner des déficits cognitifs (défauts d’apprentissage, d’activité spontanée et de comportements sociaux) qui peuvent être détectés lors de tests de comportement mais sont généralement impossibles à détecter dans l’observation de comportements spontanés de souris élevées en cage.

Devenir

Les femelles ayant subi une procédure chirurgicale ne seront pas soumises à une nouvelle procédure pour raison éthique. Une réutilisation des femelles n'ayant pas subi de procédure chirurgicale sera envisagée, notamment comme souris allaitante pour les expériences suivantes. Une utilisation des souriceaux surnuméraires sera envisagée, notamment pour la collecte de tissus. Les souriceaux doivent être mis à mort pour la réalisation de prélèvements post mortem.

Remplacement

Les hypothèses de travail ont été au préalable validées dans des modèles in vitro et justifient à présent de confirmer par une approche in vivo, incontournable pour ce projet de recherche. En effet, les séquelles neurologiques observées suite à une oxygénation insufisante, dépendent de mécanismes complexes (interactions cellulaires, rôle de la réponse immunitaire, inflammation tissulaire) impossibles à reproduire in vitro d’où la nécessité d’un modèle animal pour étudier la pathologie. De plus les modèles in vitro ne permettent pas de reconstituer totalement la complexité des connections nerveuses entre régions du cerveau, qui est l’objet de ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux inclus dans l’étude a été calculé sur la base de notre expérience préalable. Certains animaux devront être exclus de l’analyse à postériori pour des raisons techniques (mauvaise qualité du marquage des neurones et des mitochondries qu'ils contiennent ou de préparation histologique). Les animaux seront traités deux à deux (deux femelles, soit deux portées, en parallèle : groupe expérimental et groupe témoin) et les portées seront analysés au fur et à mesure afin d’atteindre au plus vite le nombre d’animaux cible de l’étude, ce qui permettra de ne pas utiliser d’animaux inutilement. De plus l’étude est prévue sur 4 âges correspondant à 4 stades de développement distincts, mais nous commencerons par les âges J11 et J45 qui correspondent aux effets les plus forts attendus dans notre étude. Dans le cas où les résultats à ces âges invalideraient notre hypothèse (étude négative), nous arrêterions l’étude sans procéder à l’étude des autres âges. L’analyse des projections nerveuses sera réalisée sur des cohortes d’animaux des deux sexes, par un test statistique approprié. Cette analyse permettra de déterminer la part de la condition expérimentale (normoxie/hypoxie), du sexe, de l’environnement, et leur interaction, sur le phénotype observé. Nous tirerons par conséquent un maximum d’information des animaux inclus dans l’étude. La méthode d’échantillonnage utilisée permet non seulement un échantillonnage homogène de notre région d’intérêt, mais aussi l’utilisation des mêmes cerveaux pour des marquages immunohistochimiques variés, permettant de minimiser le nombre d’animaux nécessaire à ce projet. Enfin, un système de préservation de toutes les séries de coupes non utilisées a été mis en place pour optimiser sur le long terme l’utilisation du tissu tout en réduisant le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Ce projet repose sur des procédures maitrisées. L’approche chirurgicale sera réalisée selon les standards de la médecine vétérinaire (asepsie, anesthésie et analgésie). Un soin particulier sera porté à la récupération postopératoire, et à la limitation du stress autour de la période de la naissance, au moyen notamment d’un enrichissement varié stimulant la nidation. Les souriceaux entrant dans la procédure seront sélectionnés par l’observation transcranienne de la fluorescence au moyen d’une lampe LED. Un suivi journalier des souriceaux sera effectué afin de détecter immédiatement tout signe d’inconfort des animaux. Les femelles seront échangées tous les 2 jours entre les cages normoxiques et hypoxiques, afin de préserver la quantité et la qualité du lait qu’elles produisent pour nourrir leurs souriceaux, et de minimiser au maximum le stress conséquent à la procédure sur les animaux. Une méthode d’imagerie et d’analyse innovante sera utilisée pour tirer encore plus d’information par animal, en permettant d’observer les projections axonales dans l’ensemble des régions du cortex.

Choix des espèces

L’architecture du cerveau de la souris est très proche de l’architecture du cerveau humain dans sa structure et son fonctionnement. Le modèle murin est un modèle animal reconnu dans le cadre des études des pathologies neurodéveloppementales ainsi que dans le développement et le fonctionnement du cortex cérébral. Par ailleurs, les méthodes ont été établies dans cette espèce ce qui nous assure que le projet est faisable et permettra de répondre à la problématique scientifique. Les femelles gestantes seront des adultes entre 8 et 24 semaines, selon la disponibilité des animaux chez le fournisseur agréé. Les souriceaux seront utilisés aux âges suivants afin d'étudier les effets d'une réduction de l'oxygène ambiant à des étapes clés de la mise en place des réseaux de neurones du cerveau: -J(our après la naissance) 11, correspondant à la fin de la période de réduction de l'oxygène ambiant. -J21, correspondant à l’âge ou les connections nerveuses sont établies, mais où elles sont encore immatures -J45, correspondant à un âge où les connections nerveuses maturent. Cet âge est également pertinent car il correspond à la maturité sexuelle chez les souris (adolescence/jeune adulte), qui est un âge auquel plusieurs maladies neuropsychiatriques sont détectées (par exemple schizophrénie) -J90-J120, correspondant à un stade adulte et qui est également le stade où nous observons des déficits comportementaux.

54 animaux non-humains, poules pondeuses et porcelets, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont nourris avec du sol antillais contaminé au chlordécone, avec ou sans biochar de Sargasse, et confinés dans des compartiments individuels pour contrôler leur exposition, avant d'être tués pour doser le pesticide dans leurs muscles et leur foie. Le porteur indique que le confinement peut perturber les comportements sociaux et provoquer du piquage entre poules, atténué par des objets placés dans les cages. Il affirme que cette expérimentation sur ces deux espèces autoconsommées aux Antilles est "nécessaire" et ne peut être remplacée.

Objectifs

Les Antilles (Guadeloupe et Martinique) sont soumises à une forte pollution des sols, des végétaux, animaux et de la population aux pesticides organochlorés tels que le chlordécone (CLD). La pollution initialement présente dans les sols a atteint la population antillaise par le transfert des pesticides dans la chaine alimentaire (sol --> végétaux --> animaux --> Hommes). L’objectif général du projet est d’évaluer l’efficacité d’une matrice carbonée (le biocharbon) issu de Sargasse (une algue invasive aux Antilles) à séquestrer ces pesticides (plus particulièrement le CLD) et à étudier l’impact sur leur transfert du sol à différents biotes (végétaux et animaux). Les matériaux utilisés sont des biochars, matrices poreuses obtenues par pyrolyse en condition anoxique (sans oxygène) et ont été préalablement employés avec succès dans un précédent projet ANR démontrant une réduction de transfert in vitro et in vivo. Les biotes cibles ont été sélectionnés sur la base de leur contribution à l'exposition de la population antillaise par l'alimentation (spécifiquement par l'autoconsommation). En première étape, nous nous assurerons en conditions de laboratoire de l'efficience de ces matrices avant de procéder à des expérimentations sur animaux. La seconde étape a pour objectif d’évaluer la biodisponibilité relative du chlordécone après exposition orale (alimentation) d’animaux à du sol antillais (Nitisol et Andosol) avec du biochar de Sargasse ou non afin de sélectionner la matrice la plus efficace. Ce projet portera sur deux espèces particulièrement utilisées aux Antilles françaises, autoconsommées et autoproduites : la poule pondeuse et le porc.

Bénéfices attendus

Cette expérimentation permettra de valider ou non une matrice carbonée (biocharbon de Sargasse) à des fins de séquestration de la CLD (pesticide particulièrement présent aux Antilles Française et imprégnant plus de 90% de la population). Ce projet permettra de contribuer à la production de denrées animales saines dans ce contexte de pollution.

Procédures

Les poules pondeuses et les porcelets seront pendant des périodes de temps limitées contenus dans des compartiments afin de contrôler finement leur exposition au sols antillais avec ou sans biochars.

Impact sur les animaux

La période de mise en cage individuelle pourra avoir une incidence sur les comportements sociaux des animaux. Des jouets seront insérés dans les cages afin de limiter cet impact. Pour les porcelets cette claustration sera limitée à quelques minutes à 2h. Pour les poules du fait de piquage entre congénères, cette stratégie ne pourra être réalisée sur un temps aussi court et se déroulera la journée.

Devenir

Du fait des prélèvements envisagés (prélèvement d'organes comme des muscles, le foie) et de leur importance pour l'animal la mise à mort est rendue nécessaire.

Remplacement

Dans le cadre de ce projet, cette expérimentation sur ces espèces est nécessaire et ne peut être remplacée. Cependant, des essais in vitro ont été réalisés au préalable afin de vérifier l’effet du biochar sélectionné sur la séquestration du CLD.

Réduction

Afin de réduire les expérimentations des tests en amont ont permis de sélectionner le biochar de Sargasse et donc de limiter le nombre de matrice à tester (et par conséquent le nombre d’animaux à utiliser). De plus, ces tests préalables ont montré que le biochar de Sargasse est plus efficace dans les Nitisols (sols antillais) que dans les Andosols (sols antillais) ce qui nous a permis de réduire le nombre de porcelet nécessaire pour les modalités avec Nitisols à n=4 (au lieu de n=6).

Raffinement

Des objets adaptés aux espèces seront déposés dans les compartiments des poules (os de seiche, CD, miroirs, paille et perchoirs) et porcelets (cordes, ...). La période de claustration a été envisagée pour être la plus réduite pour les espèces considérées (pour les porcs < 2h, pour les poules du fait du piquage la période de claustration sera la journée). Dans tous les cas, les interactions sociales inter-individus seront préservés par des contacts visuels,olfactifs, auditifs pendant ces périodes de mise en compartiment individuel. Au-delà de ces conditions, un contrôle quotidien sera réalisé en vérifiant quotidiennement la prise alimentaire, l’état de la peau et du plumage, l’absence de plaie ou de parasites (poux) et le suivi du poids de l’animal..

Choix des espèces

Du fait de l'objectif final de ce projet (contrôler la sécurité chimique des denrées animales auto-produites aux Antilles), les espèces choisies correspondent à celles auto-consommées par la population antillaise. Les porcelets qui prendront part aux expérimentations auront de 30 à 55 jours afin qu'ils soient sevrés (plus représentatifs des porcs adultes), castrés (représentatifs des conditions d'élevage classique). Les poules pondeuses seront adultes (au moins 18 semaines à l'arrivée dans nos installations) pour obtenir une ponte régulière (après une période d'hébergement au sol en collectif dans nos installations).

1 008 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un cathéter est posé dans leur veine jugulaire pour qu'ils s'auto-administrent une drogue lors de dizaines de séances de six heures, certaines associant la prise à des chocs électriques sur les pattes pour mesurer jusqu'où ils la poursuivent. Le porteur qualifie ces chocs de "légers" et rappelle que l'animal peut à tout instant cesser de répondre, les rats étant tués pour analyses moléculaires. Il affirme que ce type d'étude de l'addiction ne peut être mené que sur un animal vivant aux réseaux neuronaux intacts.

Objectifs

L’addiction est une maladie comportementale et psychiatrique chronique pour laquelle il n’existe pas de traitements efficaces et qui apparaît chez certains consommateurs de substances d’abus. Afin de trouver des stratégies thérapeutiques efficaces, il est nécessaire de mieux comprendre les mécanismes responsables de l’apparition de cette pathologie. Pour cela, ont été développés chez les rongeurs, des modèles d’addiction, qui miment les critères de diagnostics de l’addiction chez l’Homme, comme, par exemple, leur incapacité à limiter la recherche ou la prise de drogue malgré des effets désagréables. Ce projet a pour but de mimer et caractériser cette difficulté à contrôler la consommation de drogues malgré les conséquences négatives associées à cette dernière. Dans un modèle d’addiction chez le rat, nous nous focaliserons sur la capacité individuelle des rats à contrôler leur prise de drogue quand celle-ci est associée à des effets désagréables. Pour étudier cette vulnérabilité individuelle, nous utiliserons une approche qui permet de déterminer l’effet désagréable maximal qu’un rat est prêt à recevoir pour obtenir des injections de drogue et ainsi déterminer un seuil de vulnérabilité à développer une addiction pour chaque rat. Ce modèle servira donc à distinguer les animaux développant une addiction des animaux capables de contrôler leurs prises de drogues. Ce projet pourrait apporter une explication au fait que parmi tous les utilisateurs de drogues, seule une proportion devient addict, et perd le contrôle de sa consommation et de rechercher les mécanismes neurobiologiques impliqués. Ce projet vise à caractériser la distribution du comportement compulsif vis à vis de la drogue au niveau d’une population de rats et les informations obtenues seront utilisées dans le futur pour raffiner les prochaines expériences utilisant le même modèle.

Bénéfices attendus

Cette approche a plusieurs bénéfices. Notre procédure présente 2 avantages par rapport aux procédures traditionnelles : 1) elle « s’auto-ajuste », c’est à dire que l’intensité des conséquences gênantes de la prise de drogue s’adapte au comportement individuel de l’animal avec la possibilité d'arrêter la prise de drogue à des niveaux de stress très faible et éviter ainsi des stress de durée plus importante. Au contraire, les procédures traditionnelles imposent un niveau de sanction fixe qui est souvent plus élevé de ce que les rats auraient supportés s’ils avaient le choix. 2) elle permet de mesurer finement la résistance à la sanction en une seule session en déterminant le niveau maximal de sanction qu’un animal est prêt à supporter pour recevoir de nouvelles doses de drogue. En effet, les procédures traditionnelles imposent un niveau de sanction fixe qui permet une distinction entre les rats résistants et vulnérables à la punition. D’un point de vue plus général, les 2 variations de paramètres proposées nous permettent de se rapprocher de ce que l’on peut observer dans l’addiction chez l’Homme. En effet, l’utilisation d’un délai entre la prise de drogue et la punition (paramètre 2) nous permet de mimer le fait que, chez l’Homme, la conséquence négative n’est pas instantanée et arrive plutôt de façon décalée temporellement après la prise de drogue. L’autre paramètre (1), donne la possibilité de distinguer la recherche et la prise de drogue et nous permettra de caractériser plus facilement les différents mécanismes motivationnels sous-jacents à la persistance de la recherche et de la prise malgré des conséquences désagréables. La découverte des mécanismes neurobiologiques impliqués dans nos effets pourrait aider à une meilleure prise en charge de ces pathologies, tenant compte de la vulnérabilité / résistance individuelle aux effets désagréables associées à la prise de drogues.

Procédures

Tous les rats seront soumis à une chirurgie d’implantation de cathéter dans la veine jugulaire sous anesthésie générale de 15 minutes pour pouvoir s’auto-administrer les drogues. Ils suivront ensuite tous des sessions d’entrainement d’auto-administration sans sanction pour développer un comportement de prise de drogue stable (15 sessions, 1 session par jour), 6h/ jour. Une fois le comportement opérant de prise acquis et stable, tous les animaux suivront des sessions d’auto-administration sans et avec sanction (6h maximum / session, 1 session / jour), 50 sessions. Ils suivront également des sessions d’auto-administration pour déterminer le niveau individuel de motivation de l’animal qui est le niveau de réponse maximale fournit par l’animal pour obtenir la drogue (1 session par semaine, 6h maximum / session), 10 sessions.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues pour cette procédure sont : - cathéter : gène, risque d'infection ou de démangeaisons - auto-administration : La prise de drogue chronique (bien que volontaire) peut causer un stress modéré chez certains individus, ce qui est attendu car, comme chez l’Homme, un état « addict » chez le rat peut être associé à un état émotionnel négatif. - sanction / stress : Les stress délivrés lors des phases de sanction sont de légers stress au niveau des pattes des rats (sur la grille du sol des cages). Les stress utilisés ne sont pas d’intensité et/ou durée telle d’induire des conséquences négatives durables, les animaux pourront à chaque instant éviter le stress induit (et diminuer son intensité) en renonçant à répondre pour obtenir la drogue.

Devenir

Tous les animaux, à l’issue de tous les tests d’auto-administration avec et sans sanction, seront mis à mort afin de procéder à des analyses moléculaires.

Remplacement

Ce type de recherche, visant à comprendre les bases d'une maladie psychiatrique telle que l’addiction aux drogues, peut-être uniquement menée sur un animal vivant. En effet, l’étude de cette pathologie comportementale et psychiatrique nécessite la présence de réseaux neuronaux intacts et fonctionnels qui sont uniquement accessibles dans des modèles d’animaux intègres et donc vivants. Il n’est donc pas envisageable d’utiliser des méthodes de substitution à l’animal entier.

Réduction

Des études statistiques nous ont permis de définir les effectifs nécessaires à la réalisation de ce projet de façon à mettre en évidence des différences significatives tout en limitant au maximum le nombre d’animaux utilisés. Nous minimiserons le nombre d'animaux utilisés par des méthodes expérimentales validées et reproductibles et en ayant recours à des analyses statistiques de type ANOVA et un calcul de puissance qui permet de calculer le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Ainsi, le nombre d'animaux nécessaires par groupe sera de 12. Nous estimons un ajout de 2 animaux par groupe dus aux pertes liées à la compléxité du geste des procédures chirurgicales (lors de l’insertion du cathéter dans la veine, la veine peut céder) ou liées à la durée du projet avec le risque que le catheter se bouche sur la longueur de la période d’auto-administration. Ainsi 14 animaux par groupe, seront nécessaires à notre étude. Avec 18 lots (9 lots mâles et 9 lots femelles) soit 1008 animaux au maximum.

Raffinement

Nous avons planifié ce projet en gardant à l'esprit la nécessité de réduire, sinon de soulager l'inconfort, la douleur, la détresse ou l'angoisse des animaux, et dans le but d'obtenir plus d'informations pertinentes à moindre coût en terme de "mal être" animal. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière des animaux selon une grille de suivi de bien-être animal. En cas d’apparition de signes de mal-être, et suivants des points limites établis, une prise en charge adaptée sera appliquée et un traitement antalgique sera mis en place si nécessaire. Le bien-être animal est également assuré par l’apport d’enrichissement spécifique aux rongeurs dans le milieu (tunnels, stick de bois (pour répondre à leur besoin naturel de ronger) et le recours à l’anesthésie générale, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgiques, pendant laquelle l’animal sera placé sur un tapis chauffant pour assurer le maintien de sa température corporelle. Dès leur arrivée à l’animalerie, les animaux seront hébergés à deux par cage en conditions normales (température et humidité contrôlées, cages ventilées) et accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Les procédures débuteront après une période d’acclimatation de 10 jours minimum. Les manipulations sont réalisées par des expérimentateurs expérimentés et compétents.

Choix des espèces

Le rat est, avec la souris, l’animal le plus utilisé pour l’étude de l’addiction dans les modèles animaux car les rats ont des réponses aux drogues qui sont similaires à celles de l’Homme et ils s’auto-administrent toutes les drogues abusées par l’Homme de façon spontanée. Nous utiliserons des rats de la lignée « Sprague-Dawley ». Il s’agit de rats « outbred », c’est à dire avec un niveau de consanguinité limité ce qui permet une variabilité génétique majeure entre les individus. Les rats Sprague-Dawley sont les plus utilisés dans le domaine biomédical. Dans cette étude, nous utiliserons des rats « jeunes adultes » de 7-8 semaines au début du projet (qui durera environ 5 mois) afin de limiter le risque de variabilité qui pourrait être lié à l’utilisation de rats en phase d’adolescence (juvéniles).