Procédures modérées

48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Mâles logés seuls, elles fournissent trois prélèvements de fèces et passent des tests d'effort sur tapis roulant et de force de préhension, avant une anesthésie sans réveil pour prélever leurs muscles. Le porteur teste l'effet d'un complément, les fructo-oligosaccharides, sur la performance musculaire et le microbiote, et vise des "allégations pour valoriser les produits" d'un industriel. Il reconnaît qu'aucun effet nocif n'est attendu de cette molécule déjà autorisée chez l'humain, mais affirme que le recours à l'expérimentation in vivo est "incontournable".

Objectifs

L'objectif de ce projet de recherche est d'identifier l'impact d'une supplémentation avec un produit naturel, la fructo-oligosaccharides à chaîne courte (FOS), sur la force musculaire et la nature du microbiote intestinal chez la souris. Ces effets peuvent être à l'origine d'une modulation de la performance sportive chez l'homme. Pour cela, nous allons mesurer la Vitesse Maximale Aérobie (VMA), le temps limite au seuil anaérobie (CMA) et la force maximale d’agrippement (Grip Strength) chez une population saine de souris mâles. Nous allons également observer si les changements des capacités musculaires peuvent être en relation avec un changement dans la composition du microbiote intestinal.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus permettront d'envisager d'autres analyses qui pourront conduire à des évaluations chez l'homme. Dans ce sens, les résultats vont permettre des allégations pour valoriser les produits naturels commercialisés par l'industriel.

Procédures

1. Trois prélèvements de Fèces à réaliser la semaine 8, la semaine 12 et la semaine 16, pour chaque souris : Pendant le déroulement du protocole, 3 échantillonnages de fèces seront réalisés pour chaque animal. Nous récoltons les fèces des animaux, au moment où ils sortent de l’orifice du rectum. Les échantillons sont congelé -80°C pour analyse et caractérisation du microbiote intestinal. 2. Evaluation de la Vitesse Maximale Aérobie (VMA), sur tapis roulant. C'est la vitesse à partir de laquelle la consommation d'oxygène est considérée maximale. Il s'agit d'une course réalisée 3 fois /16 semaines et avec une durée de 15-40 min environ. 3. Une fois la valeur de la VMA connue, nous ferons l'évaluation de la capacité maximale aérobie (CMA), également sur tapis roulant. Il s'agit du temps que la souris est capable de passer à courir à sa VMA. C'est une course réalisée 3 fois /16 semaines et avec une durée de 15-40 min environ. 4. Test pour mesurer la force musculaire : Grip Strength : 3 fois /16 semaines et avec une durée de 0-5 min.

Impact sur les animaux

Compte tenu que le produit que nous testons est une molécule qui est déjà autorisée et utilisée chez l’homme, aucun effet nocif, toxique ou secondaire n’est attendu. Les rongeurs sont des animaux naturellement coopératifs pour faire de l'activité physique. Si un problème survient pendant les tests d'évaluation ou une perte de poids supérieure à 20% sur la durée du protocole, ils seront considerés dans le point limite. Si ces changements sont observés, les animaux seront euthanasiés.

Devenir

A l'issue de la fin du projet, une anesthésie sans réveil est prévue pour la totalité des animaux. En fait, nous avons besoin de prélever des échantillons de muscles pour les analyses ultérieures. Ces analyses nous permettrons d'identifier les acteurs moléculaires qui vont participer dans les changements observés.

Remplacement

Dans ce projet, nous cherchons à identifier les effets d’une molécule (FOS) sur la performance musculaire . Pour cela nous avons besoin de mesurer la performance lors d'une activité physique. Il n'existe donc pas d'alternative in vitro pour ce type d'évaluation (activité physique). La nécessité de la recherche rend incontournable le recours à l'expérimentation in vivo.

Réduction

Les cohortes seront constituées de 16 souris, afin d’obtenir un nombre d'animaux suffisant pour juger du caractère significatif des résultats. Nous avons calculé le nombre d'échantillon nécessaire par groupe pour pouvoir juger de l'effet du produit. La taille correspond à 16 animaux/groupe. Nous avons conclu que 16 doit être le nombre d'animaux par groupe. Cela représente désormais 48 animaux. Des tests statistiques seront utilisés pour juger la significativité des donnés.

Raffinement

Les animaux utilisés dans ce projet nécessitent un hébergement en cage individuelle car il est indispensable de mesurer la consommation quotidienne de nourriture et eau mais des précautions sont prises. Les animaux seront hébergés dans des cages individuelles, côte à côte et enrichies avec de jouets et du matériel adapté ce qui permet de limiter l'isolement social et le stress. De plus, tout au long de la durée du protocole, les animaux suivront un contrôle quotidien effectué par les chercheurs via un registre journalier et individuel des animaux. Un questionnaire pour mesurer le niveau de souffrance des rongeurs est mis à disposition et disponible dans les locaux de l’animalerie. Le questionnaire fait ressortir les signes visibles de douleur et d’inconfort chez le rongeur (vocalisation, agressivité, retrait d’un membre, autres). En cas d'atteinte des points limites décrits dans chacune des procédures, nous procéderons à une injection intra-péritonéale d'anesthésiant en surdose.

Choix des espèces

La souris est très similaire à l’homme : 99 % de ses gènes présentent un gène homologue chez l'humain. Elle possède un développement rapide et une taille réduite. Nous avons choisi les BALB/c, mâles, car nous avions besoin d'un modèle de souris sain, robuste et avec une bonne disposition pour l'activité physique. De plus, ce sont des lignées consanguines ce qui reduit les écarts des réponses individuelles. Mâles, agés de 8 semaines, âge de maturité sexuelle et développement musculaire.

470 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une colite est provoquée chez elles par un traitement chimique ou par une modification génétique, pouvant entraîner perte de poids, saignements et diarrhées, avec administration orale quotidienne d'extraits végétaux et deux prélèvements sanguins, avant prélèvement des tissus. Le porteur veut formuler une association d'extraits végétaux à visée commerciale contre les maladies inflammatoires de l'intestin. Il affirme que l'évaluation de ces maladies "ne peut pas être réalisée in vitro".

Objectifs

Ce projet a pour objectif de formuler une association d’extraits végétaux permettant de limiter le développement de maladies chroniques de l’intestin (MICI) chez la souris. La formulation sera validée sur un modèle MICI pharmacologique induit par un traitement au dextran sulfate de sodium (DSS) puis la dose optimale sera déterminée dans une nouvelle étude sur ce même modèle. Afin de renforcer les résultats, la formule sera également évaluée sur un 2eme modèle MICI génétique faisant intervenir des souris IL10 KO. Ce projet a également pour objectif de renforcer les connaissances sur les bienfaits des extraits végétaux dans la prévention des MICI et d’identifier les mécanismes d’action mis en jeu.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de formuler une association d’extraits végétaux pouvant avoir une action bénéfique sur la prévention d’inflammation / dysbiose intestinale. Cette formulation pourra être portée au niveau clinique chez l’homme et permettre à terme d’aider les personnes souffrant de MICI. Ce projet permettra également de renforcer les connaissances sur les MICI et d’identifier les mécanismes d’actions apportés par certains actifs végétaux sur la prévention de ces maladies.

Procédures

Les animaux recevront une adminiastration orale d'extraits végétaux quotidiennement du début à la fin de l'étude. Cet acte a une durée de moins de 10 seconde, contention comprise. Deux prélèvements de faibles volumes sanguins (en début et fin d'étude) sont également prévus. Cet acte a une durée de moins d'une minute, contention comprise.

Impact sur les animaux

L’utilisation de souris IL10 KO et le traitement au DSS auront pour objectif de développer une dysbiose intestinale et une inflammation du colon. Cette dysbiose si elle est trop importante pourrait entrainer une perte de poids, des saignements ou des diarrhées.

Devenir

À la fin de chaque procédure, les tissus seront prélevés pour permettre la réalisation d'analyses complémentaires. Les animaux seront donc euthanasiés.

Remplacement

L’évaluation des MICI dans leur contexte global ne peut pas être réalisée in-vitro. Le recours à l’animal ne peut donc pas être remplacé.

Réduction

Pour réduire le nombre d’animaux dans ce projet, une procédure de validation de modèle est mise en place. Cette validation permettra de réduire le nombre de conditions des procédures suivantes visant à évaluer l’efficacité des différentes formulations et des différentes doses. Cela réduit globalement le nombre d’animaux dans le projet. La taille des groupes est choisie de manière à obtenir une puissance statistique suffisante pour les paramètres clés.

Raffinement

Tous les animaux de ce projet suivront une période d’habituation d’au moins une semaine avant de commencer les procédures, ils seront hébergés dans un environnement contrôlé et adapté (cages ventilées, 22°C, 30-70% d’humidité, cycle J/N 12 :12). Les cages seront enrichies à l’aide de matériel de nidification et d’un tube rouge permettant aux animaux de se cacher et aux techniciens de les manipuler. Un contrôle quotidien sera réalisé pour permettre de relever et documenter l’apparition de signes cliniques.

Choix des espèces

La souris B6.129P2-Il10tm1Cgn/J est une souris mutante qui développe spontanément une maladie inflammatoire chronique de l’intestin (MICI). Cette souche est adaptée à l’objectif recherché et est décrite dans la littérature. La souris C56BL/6 est largement utilisée dans la recherche sur les maladies métaboliques. Lorsque ces animaux sont exposés à du DSS dans de l’eau de boisson, ils développent également une inflammation de l’intestin. Ce modèle est également bien décrit dans la littérature. Les animaux seront utilisés à l’âge de jeunes adultes (6-8 semaines en début de procédure). Pour les souris DSS c’est à cet âge que les animaux sont classiquement utilisés dans la littérature en début d’induction. Pour les souris IL10 KO, l’inflammation apparait au cours du temps. En intervenant sur des jeunes adultes on intervient en amont de la maladie ce qui est l’objectif recherché dans ce projet.

1 632 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie d'injection d'un vecteur viral portant une forme humaine mutée de l'APP, la pose d'une fenêtre crânienne et une imagerie sous microscope tête fixée à l'état éveillé, avec des tests comportementaux nommés, reconnaissance d'objet et boîte clair-obscur. Le porteur décrit une douleur de trois à cinq jours après la chirurgie et un inconfort lié à la contention de la tête, et met au point ce modèle pour étudier le récepteur nicotinique dans la maladie d'Alzheimer. Il affirme que la souris est "irremplaçable pour l'instant" pour étudier ces circuits neuronaux.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer (MA) est une maladie neuro-dégénérative qui affecte principalement les personnes âgées et représente un problème majeur de santé publique, surtout dans les populations vieillissantes. Afin de pouvoir étudier les mécanismes neurobiologiques sous-jacents à cette pathologie, différents modèles ont été développés chez la souris. Cependant, ces modèles présentent de nombreuses limitations, notamment pour l’étude des différentes étapes du développement de la maladie. Le but de ce projet est de mettre au point une nouvelle approche innovante pour étudier le stade précoce de la maladie dans le cerveau des souris, ainsi que pour explorer l’implication de structures cérébrales spécifiques dans son étiologie et enfin étudier le rôle du récepteur nicotinique dans la MA L’une des caractéristiques majeures de la MA consiste en l’accumulation du peptide beta-amyloïde (Aβ) qui est obtenu par clivage séquentiel de la protéine APP (Amyloid Precursor Protein). Pour cette étude, nous avons construit un vecteur viral adéno-associé (AAV) qui exprime la séquence humaine de l’APP contenant des mutations pathogènes identifiées chez les patients ( « Swedish », « London » et « Austrian »). Il s’agit de mutations ponctuelles qui changent un seul acide aminé de l’APP humaine et augmentent la quantité du peptide Aβ produite. Au sein du cerveau des mammifères, les récepteurs nicotiniques sont constitués de 5 sous-unités protéiques α(2-7) et β(2-4) qui s’assemblent selon différentes combinaisons et donnent lieu à des récepteurs fonctionnels aux propriétés pharmacologiques et cinétiques diverses. Au cours de la MA, le nombre des récepteurs nicotiniques se trouve diminué et leur activité altérée. De plus, des données bibliographiques suggèrent une interaction entre certains récepteurs nicotiniques, notamment les sous-types contenant α7 ou β2, et l’Aβ. Tout d'abord, nous allons caractériser l’activité neuronale dans le cortex de la souris en présence et en absence de l'APP, chez les souris wild-type et chez des lignées de souris exprimant la protéine cre recombinase dans des populations spécifiques de neurones pyramidaux, et d'interneurones. Ensuite, pour identifier l’implication des différents sous-types de récepteur dans le développement de la MA, nous allons appliquer la même technologie des vecteurs AAV à des lignées de souris transgéniques .

Bénéfices attendus

L’utilisation de ces nouveaux modèles animaux devrait permettre une meilleure compréhension des mécanismes biologiques qui sous-tendent la maladie d’Alzheimer. D’autre part, ils devraient faciliter l’étude de l’implication des récepteurs nicotiniques, plus particulièrement au cours de la phase précoce du développement de la maladie. Ceci pourrait permettre à plus long terme de développer et tester des médicaments pour lutter de façon précoce contre le développement de la pathologie..

Procédures

Les souris seront soumises à une procédure chirurgicale pour l’injection du vecteur AAV contenant le gène de la protéine d’intérêt (durée estimée : 2 heures). Pour les animaux qui seront imagés sous le microscope à deux photons, l’indicateur calcique sera également injecté et une fenêtre crânienne pour l'imagerie chronique du cortex sera implantée au moment des injections (durée maximale de toute la chirurgie : 3 heures). Des tests comportementaux seront menés pour évaluer la mémoire (test de reconnaissance d’objet) et l’anxiété (boite claire obscure). En ce qui concerne le test de reconnaissance d’objet (RO), la préférence pour un nouvel objet nous permet d’estimer si la mémoire à court-terme est altérée et aussi de vérifier les capacités exploratoires et motrices des animaux ; la souris est placée dans une boîte pendant 30 minutes en présence d’objets. En ce qui concerne le test d’anxiété « clair-obscur » (CO), le dispositif expérimental se compose d'un petit compartiment noir et d'un grand compartiment blanc, connectés par un passage ; la souris est alors mise dans cet appareil pendant 30 minutes en libre exploration.

Impact sur les animaux

Nous estimons que les souris sont susceptibles de ressentir une douleur pendant les 3-5 jours après la chirurgie, pour laquelle nous administrerons des analgésiques. Habituellement, aucune perte de poids significative n'est enregistrée - les souris peuvent perdre jusqu’à 5% de leur poids initial dans les 24 heures suivant la chirurgie, mais ce poids est repris le lendemain. Pendant les premières 24 heures, des périodes de mobilité réduite peuvent aussi être repérées. Dans ces 3-5 jours qui suivent, nous remarquons que quelques animaux peuvent gratter un peu la zone immédiatement autour du ciment dentaire, mais ce comportement disparaît durant la première semaine de récupération. À part cela, nous prévoyons que la barre métallique qui est utilisée pour fixer la tête de la souris à la structure de support du microscope est une source supplémentaire d'inconfort. Néanmoins, après quelques jours (jusqu’à 2 semaines) la souris s’habitue et l’implant ne la gêne plus visiblement. Cette période de récupération après les craniotomies est cruciale et quelques problèmes peuvent être détectés, mais après 2 semaines, les souris ne manifestent plus de signes de stress, douleur ou altération d’activité. L'entraînement des animaux pour l’imagerie in vivo éveillée et leur habituation au microscope biphotonique est aussi susceptible de provoquer des nuisances. Après les premières séances d’entraînement, quelques souris sont plus stressées et leurs comportements sociaux peuvent devenir plus agressifs (pendant l’heure suivante). La préhension de la pièce métallique de la tête et la fixation de l'animal sont les étapes les plus stressantes et les plus inconfortables pour la souris, ce qui exige toujours la mise en place d'un protocole d'habituation minutieux.

Devenir

Toutes les procédures sont basées sur une injection de vecteur AAV localement dans le cortex pré-frontal (PFC). Il est essentiel pour l'analyse des données en imagerie et comportement de pouvoir confirmer la bonne qualité de l'injection, sa localisation précise, le volume du cortex couvert, et la quantité d'amyloide bêta produit. Les souris seront donc mises à mort, perfusées, le PFC coupé et analysé par histochimie.

Remplacement

Dans le cadre de cette étude il n’est pas possible de remplacer la souris par aucun autre modèle. Pour atteindre notre objectif d’identifier l’interaction entre l’amyloïde-beta et les récepteurs nicotiniques et son impact dans l’activité des neurones, il n'est pas possible d'utiliser des modèles mathématiques et bio-informatiques. Ces approches in silico peuvent seulement être utilisées à posteriori pour complémenter et modéliser les résultats in vivo. Il n’est pas non plus possible d'utiliser des lignées cellulaires ou des cultures de tissus, car celles-ci ne présentent pas la connectivité fonctionnelle requise pour ce projet. Concernant les organoïdes cérébraux, bien qu’ils commencent à être explorés pour analyser l’activité neuronale, les populations de neurones et l’organisation ne ressemblent pas à ceux du cerveau des mammifères en conditions physiologiques. Principalement pour étudier des circuits neuronaux axées sur le vieillissement et la neurodégénérescence, les modèles mammifères (comme la souris ou le rat) apportent des avantages significatifs et sont ainsi irremplaçables pour l'instant. De plus, notre étude implique des tests comportementaux s’intéressant à la mémoire, autre aspect critique de cette pathologie, qui ne peut pas être investigué par des études in vitro.

Réduction

L'estimation du nombre d'animaux à utiliser a été basée sur les résultats précédents obtenus avec ce modèle. Nous avons eu recours à des analyses statistiques pour déterminer le nombre minimal de souris nécessaire pour garantir des résultats significatifs. Le projet inclut 3 procédures d'imagerie chez la souris éveillée. L'estimation des individus à utiliser a été réalisée sur la base du précédent projet et d'autres articles publiés, et adaptée selon les effets attendus dans chaque procédure. En outre, nos articles d'imagerie in vivo dans le cortex et des études comportementales précédentes ont confirmé notre calcul. Afin de garantir l'utilisation d'un nombre minimal d'animaux, toutes les analyses post-mortem sur la caractérisation des lignées ou l’expression et distribution des protéines spécifiques, seront réalisées sur des animaux injectés et imagés précédemment. Sans compromettre l’obtention de résultats exploitables et fiables, seulement les expériences considérées comme indispensables seront réalisées et toutes répétitions inutiles seront éliminées. Pour utiliser moins d’animaux en expérimentation, nous allons aussi rédiger nos protocoles à l’avance et les optimiser. Chaque manipulation expérimentale sera planifiée dans le but de prévenir des problèmes éventuels, de décider des stratégies et de définir des critères d’interruption (« humane endpoints »).

Raffinement

Pour garantir que les animaux ne soient pas blessés et souffrent le moins possible, différentes mesures seront appliquées. Uniquement des souris adultes (8 semaines) seront soumises à des procédures chirurgicales et autant que possible les frères et sœurs resteront ensemble dans les cages, en groupe de 2 à 6. Les animaux seront injectés avec Buprenorphine 0.1mg/kg 30 min avant et l’analgésique local Lidocaïne (6mg/kg) 10 min avant la craniotomie. Durant les 30 min qui précèdent la chirurgie, les souris resteront sur un tapis chauffant. Pour une anesthésie profonde, on utilisera l’isoflurane. L’induction sera faite dans une chambre ventilée par un mélange d’isoflurane 4% et O2 2L/min. Pendant la procédure, les souris resteront anesthésiées sous un mélange d’isoflurane 1.5-2% et O2 0.6L/min. Leur température corporelle sera surveillée et maintenue à l’aide d’un tapis chauffant équipé d’une sonde rectale et la respiration et l’absence de réflexe de retrait de la patte seront également surveillées. Une solution saline isotonique (0.9%NaCl) sera chauffée et injectée à la fin – le volume dépend du poids de l’animal et de la chirurgie (lors de saignement nous injecterons plus). L’anti-inflammatoire Meloxicam 1mg/kg sera injecté 30 min avant la chirurgie pour prévenir la « soupe inflammatoire », et le jour suivant. Pour les 3 jours, la forme orale de Meloxicam 0.1mg/mL sera diluée dans une boite de complément alimentaire purifié Dietgel (7.5mL/souris/jour) et donnée aux souris. Pendant les 24 heures la souris restera dans sa cage sur un tapis chauffant pour empêcher une diminution brusque de sa température corporelle, garantir une meilleure récupération. Pendant les 5 jours, le poids, mouvement et comportement social des animaux seront surveillés de près, ainsi que la cicatrisation de la suture ou de la fenêtre crânienne. (Si la procédure chirurgicale a été correctement réalisée dans des conditions d'asepsie, aucune infection ne devrait se produire). Si aucun changement n'est remarqué ou si il y a une évidence de douleur ou un comportement anormal, des niveaux de surveillance seront mis en place. Si une souris souffre visiblement et reste en position prostrée, si elle a complètement cessé de manger ou s’il y a une perte considérable de poids (20% de son poids initial) la souris sera mise à mort. Chaque cage sera enrichie avec des petits cylindres de coton/morceaux de papier et un igloo en carton.

Choix des espèces

La souris est le meilleur modèle rongeur disponible actuellement, car elle nous permet d’étudier plus profondément les circuits neuronaux. Elle est petite et relativement facile à gérer dans le contexte d’un laboratoire, par rapport à d'autres modèles mammifères plus complexes. Un autre atout de l'utilisation des souris est la vaste liste de boîtes à outils disponibles, ce qui permet d'optimiser les pipelines expérimentaux plus rapidement, réduire l’utilisation de ressources et identifier plus facilement des problèmes possibles (comme la douleur post-chirurgie). En effet, elle est classiquement utilisée pour des études de modification de l’expression des gènes (modèles transgéniques ou expression induite par un vecteur viral). De plus, la plupart des tests comportementaux utiles dans le cadre d’un projet étudiant la MA (comportements liés à une perte de mémoire ou à une dégénérescence des synapses due à l’accumulation de plaques amyloïdes dans le cerveau) ont été développés chez la souris. Les injections intracérébrales seront faites sur des animaux adultes, d’au moins 8 semaines, afin que le développement de leur cerveau soit suffisamment mâture pour la réussite et la reproductibilité des injections. Les analyses fonctionnelles débuteront un mois après les injections, pour garantir que l’expression des vecteurs est assez élevée, et s’étendent jusqu’à 12 mois. Pour l’étude à long terme, les animaux seront également injectés à l'âge de 8 semaines, mais la fenêtre crânienne ne sera implantée qu'un an après l'injection de la protéine APP. Cela évitera que l'indicateur de calcium ne forme des agrégats et que la fluorescence ne s'estompe. Les études de comportement seront menées après vieillissement, à partir de 5 mois d’âge des souris, c’est à dire 2 mois après injection. Les mises à mort pour prélèvement des cerveaux seront effectuées après vieillissement, dans le cas du modèle AAV, qui nécessite un certain temps d’expression, jusqu'à 16 mois, procédure 2.

Tuées à l'issue de chaque procédure pour récupérer leurs organes, 1 152 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les groupes, elles sont nourries 16 semaines d'un régime riche en graisses pour les faire grossir, soumises 16 semaines à un exercice d'endurance sur tapis de course, et subissent des prises de sang éveillées, jusqu'à sept en deux heures lors des tests de tolérance au glucose et à l'insuline. Les effets néfastes se limitent, selon le porteur, à un risque d'irritation et d'infection aux points d'injection. Pour justifier le choix de la souris, le porteur cite sa "natalité importante", son "faible coût d'élevage" et la possibilité d'obtenir assez de "matériel" pour les analyses, puis conclut : "Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée."

Objectifs

Ce projet concerne l'étude d'une protéine cible de l'hypoxie et induite en réponse aux stress. Nous étudieorns son implication dans le développement de la résistance à l'insuline induite par un régime riche en graisses et nous déterminerons si la délétion de cette protéine dans les adipocytes potentialise les effets bénéfiques de l’activité physique. Ce projet ne duplique pas d'études déja publiées.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'établir d'une part, le rôle d'une protéine adipocytaire dans le développement de l'obésité et de la résistance à l'insuline, et d'autre part si son invalidation peut avoir des effets bénéfiques sur le traitement de l'obésité.

Procédures

Les souris seront soumises à un régime riche en lipides pendant 16 semaines afin d'induire une prise de poids. Les souris seront soumises à un protocole d'exercice d'endurance (tapis de course adapté à la souris) pendant 16 semaines. Les souris seront soumises à des prélèvements de sang sur souris vigiles lors des tests de tolérance au glucose (GTT) ou à l'insuline (ITT). Lors de ces tests, une goutte de sang est prélevée pour mesurer la glycémie au cours du temps (0, 15, 30, 45, 60, 90 et 120 minutes). Un prélévement de sang sur souris vigile sera effectué à la semaine 6, 14, 20, 22, 24 et 28 (max 100µl) de la procédure 1 et à la semaine 6, 20, 26 et 29 de la procédure 2.

Impact sur les animaux

Lors des injections en intra-péritonéale (lors des GTT, ITT ou tamoxifène) il pourrait y avoir un risque d'irritations et d'infection aux zones d'injection.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour récuperer les organes.

Remplacement

Pour satisfaire au remplacement, nous avons réalisé des études sur des cellules adipocytaires cultivées in vitro et nous avons montré que la protéine d'intérét est impliquée dans le développement de la résistance à l’insuline in vitro. Pour comprendre l’implication de cette protéine chez l’Homme, il est maintenant nécessaire de l’étudier sur l’animal car il n’existe pas de méthodes alternatives permettant de tenir compte de la physiologie et de toutes les interactions existantes entre cellules et organes dans un organisme.

Réduction

Pour satisfaire à la réduction, une gestion éthique de l’élevage nous permettra de ne pas générer trop d’animaux en excès. Chaque procédure utilise un nombre d’animaux minimum mais nécessaire à des études statistiques pertinentes. Le nombre d’animaux a été calculé pour limiter les variations inter-individus et atteindre un niveau statistique validé par une analyse prédictive. Les procédures seront répétées 3 fois. Cependant, si une différence statistiquement significative est observée après 2 répétitions, nous ne ferons pas la troisième répétition.

Raffinement

Les souris seront maintenues dans un milieu enrichi (igloo et tigettes qui permettent aux souris de réaliser un nid) et celles-ci seront hébergées en portoirs ventilés à raison de 5 souris maximum/cage (500cm2). Nous réaliserons aussi un suivi quotidien des animaux (par les expérimentateurs ou l'équipe zootechnique), ce qui permettra l'arrêt de l'expérience dès que les souris présenteront un mal-être ou une souffrance.

Choix des espèces

La souris est un modèle animal facile à utiliser grâce à sa natalité importante, son faible coût d’élevage et notre expertise nous permettant d’avoir des locaux d’hébergements et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. D’autre part, la similitude de leur patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet de pouvoir, dans la mesure du possible, extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. Les données in vivo de la littérature sont réalisées sur des souris et cette espèce nous permet d'obtenir assez de "matériel" pour faire des analyses protéiques et génomique et histologique. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. Seules les souris adultes seront utilisées dans ce projet. Pour l’étude du métabolisme, les souris seront mises sous régime alimentaire à 6 semaines. Ceci permet de diminuer la variabilité inter-animaux et donc de réduire les effectifs.

Selon leur groupe, des souris sont gavées six jours sur sept pendant quatre semaines, ou reçoivent chaque jour pendant deux semaines des injections intrapéritonéales ou des administrations par le nez, puis passent des tests comportementaux, un par jour, que le résumé ne nomme pas. 484 souris, dont des souris transgéniques qui développent des plaques amyloïdes, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyser leur cerveau. Une partie est exposée de façon chronique à l'acroléine, un composé qui provoque un stress carbonylé, pour tester un dérivé du phloroglucinol, le Phloro-OiP-DHA, censé contrer ce stress. Le porteur attend de cette exposition des "troubles comportementaux et de neurodégénérescence", et ne cite comme effet néfaste que l'inconfort des gavages et des administrations répétés.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer (MA) est la forme la plus fréquente de maladie neurodégénérative associée à une démence chez les sujets âgés. L'élaboration et la mise sur le marché de nouveaux traitements pour lutter contre ce fléau est un défi sanitaire et économique majeur. Le stress oxydant induit par de nombreux facteurs environnementaux (notamment l'exposition à des polluants chimiques) est un évènement extrêmement précoce et jouant un rôle majeur dans la maladie. En effet, l’oxydation des lipides et du glucose favorise l’accumulation d’espèces carbonylées réactives (ECR, stress carbonylé) dont la réaction avec les acides aminés entraîne des modifications et pertes de fonctions irréversibles des protéines cellulaires. Parmi les molécules capables de combattre ce phénomène, les polyphénols, métabolites secondaires du règne végétal, présents dans de nombreux fruits et légumes de notre alimentation, ont été largement étudiés. L'obstacle majeur à l'utilisation de ces composés en thérapeutique est leur très faible biodisponibilité. Pour contourner ce problème, une équipe de chimistes a synthétisé un composé capable de réduire à la fois le stress oxydant et le stress carbonylé. Un polyphénol naturel, le phloroglucinol (Phloro) a été modifié chimiquement afin de pouvoir piéger les espèces responsables du stress carbonylé. Afin d’augmenter sa biodisponibilité, le phloroglucinol modifié a ensuite été couplé à un acide gras à longue chaîne (DHA) pour donner le Phloro-OiP-DHA. Son activité a été validée in vitro et in vivo dans un modèle murin présentant une dégénérescence des photorécepteurs induite par la lumière. L'objectif de ce projet est de déterminer le potentiel thérapeutique de ce composé dans un modèle de stress carbonylé induit par une exposition chronique à une ECR (l'acroléine), mimant le développement de la maladie d’Alzheimer.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra : -de confirmer que l'exposition chronique à l'acroléine, conduisant à l'apparition d'un stress carbonylé, s'accompagne de troubles comportementaux et de neurodégénérescence. -de déterminer le potentiel thérapeutique du lipophénol Phloro-OiP-DHA dans ce modèle. Avec cette étude, nous posons donc l'hypothèse d'un mécanisme reliant le stress carbonylé aux processus neurodégénératifs asssociés à la maladie d'Alzheimer, et en particulier ceux associés à la formation des dépôts amyloïdes et l'hyperphosphorylation de la protéine tau. Ce projet nous permettra d'en appréhender les mécanismes biochimiques sur le long terme et de tester le potientiel thérapeutique d'une molécule ciblant le stress carbonylé, le Phloro-OiP-DHA.

Procédures

Les animaux, en fonction de leur groupe, pourront être soumis à : -un gavage quotidien pendant 4 semaines (6j/7) -des injections intrapéritonéales ou intranasales quotidiennes pendant 2 semaines - des tests comportementaux (un test par jour) - ils seront euthanasiés en fin de projet.

Impact sur les animaux

La dose d'acroléine utilisée est basée sur des travaux précédemment publiés . L'inconfort lié au traitement peut provenir de la répétition quotidienne du gavage pendant 4 semaines et/ou des administrations intranasales pendant 2 semaines.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de pouvoir procéder à des analyses biochimiques et immunohistologiques du tissu cérébral.

Remplacement

De manière générale, il est aujourd’hui très difficile en neurosciences d’étudier le fonctionnement du cerveau sur des modèles simplifiés (in vitro ou in silico) et donc de remplacer l’étude sur l’animal dans sa globalité. En effet, il n'existe pas de modèles alternatifs (in vitro ou in silico) validés pour étudier la neurodégénérescence et le déclin cognitif dans leur globalité. Il est primordial d’avoir des circuits neuronaux in vivo associés aux cellules gliales et vasculaires, pour caractériser les modifications moléculaires liées à la maladie d’Alzheimer d’un point de vue spatiotemporel. Les modèles utilisés sont acceptés, bien documentés, et très utilisés par la communauté des neurosciences.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au minimum pour répondre aux objectifs du projet. Le nombre d'animaux dans chaque groupe, ainsi que le nombre de groupes est basé sur une connaissance approfondie des modèles et de l'expérience acquise par notre équipe et a été déterminé par une analyse de puissance statistique basée sur nos études précédentes. Pour les analyses comportementales, histologiques et biochimiques, les tests seront de type non appariés, paramétriques sur les moyennes à variances égales ou différentes suivants les résultats des analyses précédentes. Ici, 10 animaux par groupe seront nécessaires pour observer d’éventuels changements. A ce nombre d’animaux une marge de 10% sera ajoutée afin de compenser les aléas expérimentaux.

Raffinement

Afin de minimiser les effets du stress qui pourraient fausser les résultats (en particulier sur les analyses comportementales), mais également de contrôler l’état général des animaux, les souris seront manipulées chaque jour par l’expérimentateur en charge de l’expérience, avant la procédure expérimentale. Tous les incidents et toutes observations anormales (comportement, poids, pelage, plaie,…) seront transmis à l’expérimentateur afin d’être traités dans les plus brefs délais et seront notés dans un tableau de suivi expérimental.

Choix des espèces

Il s'agit d'une espèce de choix au niveau international pour l’étude de la physiopathologie de la maladie d’Alzheimer. Ces études chez l’animal vigile sont nécessaires pour appréhender des mécanismes intégrés et pour évaluer la pertinence de traitements potentiels. De plus, l'utilisation d'animaux transgéniques (modèle Alzheimer) justifie également le choix de cette espèce. La maladie d'Alzheimer étant une maladie se déclarant chez l'adulte voire la personne âgée, les animaux seront utilisés et sacrifiés à l'âge adulte (6 mois). De plus, la caractérisation du modèle de souris transgéniques a déjà été effectuée dans notre laboratoire et nous avons montré que : -les déficits comportementaux commencent à partir de 3 mois -les modifications biochimiques (augmentation de la charge amyloïde, de la phosphorylation de la protéine tau, principaux marqueurs de la maladie d’Alzheimer) et histologiques (formation des plaques amyloïdes) sont visibles à l’âge de 6 mois

140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent deux chirurgies du genou droit, une injection intra-articulaire d'un vecteur viral puis une déstabilisation du ménisque pour induire une arthrose, avant d'être tuées pour analyses. Le porteur cherche une preuve de concept d'une thérapie génique augmentant la protéine alpha-Klotho contre l'arthrose post-traumatique, avec l'espoir d'un passage en clinique humaine. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne remplace l'animal pour tester un traitement de l'arthrose.

Objectifs

L'arthrose, est la plus commune des maladies rhumatismales et touche plus de 500 millions de personnes dans le monde. L’arthrose atteint l’ensemble des tissus de l’articulation (cartilage, os, membrane synoviale, muscle). A ce jour, aucun traitement n’est capable de reverser ni même de ralentir les atteintes arthrosiques et les traitements proposés aujourd’hui ne corrigent que les symptômes de la maladie. Étant donné que le vieillissement est l’un des principaux facteurs de risque de l’arthrose, nous proposons de tester un facteur anti-âge, la protéine alpha-klotho (a-KL), pour le traitement de cette maladie. En effet, un risque accru d’arthrose a été mis en évidence chez des patients qui présentaient des différences dans la séquence du gène codant pour la protéine a-KL. D’autre part, des niveaux différents d'ARN messager d’a-KL ont été rapportés entre le cartilage articulaire sain et arthrosique. L’objectif de cette étude est d’évaluer l’efficacité thérapeutique d’une thérapie génique visant à augmenter l’expression d’a-KL dans le traitement de l’arthrose. Cette approche de thérapie génique sera effectuée par l’injection intra-articulaire d’un vecteur viral codant pour la protéine d’a-KL dans un modèle d’arthrose chirurgicalement induite chez la souris.

Bénéfices attendus

La prise en charge des patients atteints d’arthrose est insuffisante puisqu’elle ne traite que les symptômes. Ce projet permettra de faire une preuve de concept sur l’efficacité d’un nouveau traitement de thérapie génique contre l’arthrose dans ce modèle d’arthrose post-traumatique chez la souris. Ce traitement adapté pour la clinique pourra ensuite être proposé pour des essais cliniques chez l’Homme.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux chirurgies d’environ 15 minutes chacune consistant en une injection intra-articulaire du genou droit et une semaine après, une déstabilisation du ménisque médial unilatérale (genou droit) effectuées dans des conditions d’asepsie strictes, sous anesthésie gazeuse et traitement anti-douleur pré et post-opératoire.

Impact sur les animaux

Dans les trois premiers jours suivant la chirurgie, si de la douleur est ressentie par l’animal celui-ci peut entrer dans un état de prostration, s’isoler des autres animaux dans la cage et cesser les interactions comme par exemple le toilettage social. Cette douleur pourrait être notamment causée par une dilacération du tissu cutané supplémentaire, inopinée et indépendante de l’incision initiale pendant les chirurgies. De plus, une infection pourrait intervenir au niveau des sutures post-chirurgicales. De façon générale, différents points limites (changement de poids corporel, apparence physique, comportement non provoqué…) seront attentivement regardés.

Devenir

A l’issue des procédures, tous les animaux seront mis à mort afin de collecter des tissus et procéder à des analyses radiologiques, histologiques et moléculaires.

Remplacement

L’articulation se compose de différents tissus et types cellulaires, ainsi que d’un liquide synovial à prendre en considération dans les modalités du transfert de gène en intra-articulaire. D’autre part, cette pathologie à des causes et conséquences multiples difficilement reproductibles dans un système vitro non intégré. C’est pourquoi, aujourd’hui, aucun autre modèle substituable aux modèles animaux ne nous permet de tester l’intérêt thérapeutique de traitements dans le cadre de l’arthrose.

Réduction

Compte-tenu d’études comparables déjà effectuées, le nombre d’animaux est réduit au strict minimum (20 maximum par groupe compte tenu de la variabilité du modèle chirurgical) mais suffisant pour démontrer des différences statistiquement significatives entre les groupes en utilisant les tests statistiques non paramétrique Kruskal-Wallis pour pouvoir comparer toutes les conditions, suivi du test de comparaison multiple de Dunn pour déterminer où sont les différences observées. Pour élucider les mécanismes moléculaires, le traitement est également testé in vitro sur des modèles de cellules en culture afin de limiter le nombre de souris par groupe.

Raffinement

Une analgésie chimique est assurée en pré- et post-opératoire. Les souris sont anesthésiées par inhalation d'un gaz durant toute la procédure. La chirurgie, même si celle-ci ne dure pas plus de 15 minutes, sera effectuée sur tapis chauffant afin d’éviter toute hypothermie éventuelle. Les souris seront ensuite transférées dans une cage également disposée sur tapis chauffant le temps de récupérer suite à ce réveil. Le reste du temps, les souris sont hébergées en groupes sociaux de 5 souris par cage avec de l'enrichissement de type frisottis (Sizzle-Dri) et si besoin ajout d’un dôme (Cello dome). Les souris sont observées quotidiennement pendant les 3 premiers jours post chirurgie puis 2 fois par semaine. Si des signes cliniques sont observés, la gestion de la douleur se fera comme suit : 1 signe notable: visite 3 fois/semaine des animaux, mise à disposition de croquettes humidifiées dans la cage; 2 signes notables: administration d'un analgésique chimique toutes les 12h; 3 signes notables ou un signe sévère (point limite): euthanasie. -Signes notables: Plaie/Traumatisme: Lésion sans effraction cutanée; Comportement/Mouvement : Agitation/Agressivité, Hypomobilité/Hyporéactivité, incoordination modérée, mouvement répétitifs; Aspect général: Poil piqué, Coloration anormale de la peau, muscle flasque, Gonflement abdominal, Zone ano-génitale souillée; Excrétion : Fèces liquides; Evolution pondérale : Perte de poids inférieure à 15%; Consommation de nourriture : diminution/absence de prise de nourriture -Signes cliniques sévères : Plaie/Traumatisme: Lésion sévère (automutilation, plaie suintante,…), Traumatisme, Saignement incontrôlable; Comportement/Mouvement: absence de mouvement, Difficulté/ Impossibilité de mobilisation, Incoordination marquée, tremblements généralisés, Convulsions; Aspect général: , Coloration jaune/bleue des muqueuses, courbure du dos; Excrétion: Absence de fèces, Urines rouges; Evolution pondérale: Perte de poids supérieure à 20%; Consommation de nourriture: absence de prise de nourriture>2 jours

Choix des espèces

Pour la majorité des études portant sur la thérapie génique, une espèce mammifère est requise pour avoir une pertinence clinique. L'utilisation de la souris est justifiée par l'existence de plusieurs modèles murins d’arthrose qui en fait l’espèce la plus décrite dans la littérature internationale dans l’étude de cette pathologie. D’autre part la possibilité de constituer des groupes d'animaux suffisamment larges pour pouvoir effectuer des calculs statistiques (n=20 par groupe) est nécessaire. Le modèle murin envisagé (C57BL/6J) est couramment utilisé dans le domaine de la thérapie génique et dans le domaine de la pathologie arthrosique. Notre protocole démarrera chez des souris arrivées à maturité squelettique et âgées de 9 semaines. Cet âge correspond à l’âge à partir duquel une induction de l’arthrose est possible et correspond aux autres études que nous réalisons dans le domaine.

3 mini-porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis gardés vivants et remis en stock. Chaque animal subit un unique prélèvement de liquide céphalo-rachidien sous anesthésie d'environ quarante minutes, avec un risque de désordre physique ou neurologique si le geste est mal réalisé. Le porteur met au point cette technique de prélèvement en vue de futures études sur le passage de la barrière hémato-encéphalique. Il affirme qu'il est "indispensable" de recourir à l'organisme entier et retient trois porcs comme minimum pour maîtriser le geste.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de mettre en place une technique de prélèvement de liquide céphalo rachidien chez le mini porc. Cela sera necessaire dans le cadre de futures études pour vérifier le passage de la barrière hémato encéphalique des produits qui seront testés.

Bénéfices attendus

Il est nécessaire de conduire ce projet pour mettre au point la technique de prélèvement de liquide céphalo rachidien qui sera utile dans de prochaines études. L'objectif étant de savoir si le produit testé passe la barrière hémato encéphalique.

Procédures

Le prélèvement de liquide céphalo rachidien se fera sur animal anesthésié. La durée de l'anesthésie est estimée à 40 minutes. Il y aura qu'un seul prélèvement par animal. La durée d'un prélèvement est de l'ordre de la minute. Tout geste technique fait à l'animal sera réalisé par un personnel formé avec la présence d'un vétérinaire conformément aux bonnes pratiques vétérinaires et à la réglementation en vigueur. Suite à ce prélèvement, pour le reveil des animaux, il y aura la possibilité d'héberger les animaux en individuel si besoin. Si c'est le cas la durée de l'hébergement individuel sera de courte durée, estimée à une heure environ.

Impact sur les animaux

Le prélèvement de liquide céphalo rachidien est un prélèvement bien spécifique. Il faut éviter que ce prélèvement soit contaminé par du sang. Ce prélèvement sera effectué par un personnel formé et de manière conforme à la réglementation en vigueur, selon les bonnes pratiques vétérinaires. Ce prélèvement se fera sous anesthésie générale de l'animal. Le risque dans ce projet est que le prélèvement de LCR soit mal fait et que cela entraine un désordre physique ou neurologique chez l'animal. Pour cela les animaux seront observés au minimum une fois par jour, et plusieurs fois par jour aprés le prélèvement de LCR ( minimum 2 fois). Le recours à des analgésiques est possible si nécessaire. Toutes décisions sur l'animal sera prise en accord avec le vétérinaire désigné.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie et retourneront dans le stock.

Remplacement

L'objectif de ce projet est de mettre au point la technique de prélèvement de liquide céphalo rachidien chez le miniporc. Il est indispensable de recourir à l'animal dans son ensemble pour ce type de projet.

Réduction

Dans ce projet le nombre d'animaux requis est 3. C'est le nombre d'animaux minimum pour pouvoir maitriser le geste technique.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe de 3. Dans les hébergements, une attention particulière sera portée à l'enrichissement du milieu. Présence de jouets type, balles, cordes seront présent au sol. Les animaux seront observés quotidiennement, et au minimum deux fois par jours aprés le prélèvement de LCR. Si besoin les animaux seront placés en hébergement individuel si c'est nécessire pour la phase de réveil.

Choix des espèces

Espèce de choix pour ce type d'étude Jeune adulte . A ce stade les animaux sont plus facile à manipuler.

12 lapins vont être utilisés, tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque lapin reçoit sous la peau, sous anesthésie générale, un biomatériau osseux à tester et un témoin, avant une analyse des tissus après mise à mort. Le porteur attend une réaction inflammatoire pouvant provoquer douleur locale, encapsulation ou abcès, et évalue la tolérance du matériau en vue d'un marquage CE. Il affirme qu'il "n'existe pas d'autre méthode" pour étudier la tolérance de l'hôte et justifie l'usage par la "nécessité" de poursuivre les recherches sur de nouveaux biomatériaux.

Objectifs

En médecine humaine, les biomatériaux osseux servent à combler un défaut après un traumatisme ou une chirurgie. Ils constituent une alternative à l’autogreffe osseuse. Le biomatériau osseux idéal devrait être biocompatible, biorésorbable, tout en présentant une intégrité structurelle similaire à celle de l’os, une matrice ostéoconductrice, et contenir des facteurs ostéo-inducteurs. Actuellement, aucun substitut osseux ne répond à toutes ces exigences et la greffe autologue avec ses complications qu’elle entraîne, reste le traitement majoritairement utilisé. C’est pourquoi il est nécessaire de poursuivre les recherches quant à la création de nouveaux biomatériaux. De plus, pour l’obtention du marquage CE, la biocompatibilité des matériaux développés doit être évaluée selon la norme ISO 10993-6 concernant l'évaluation biologique des dispositifs médicaux.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de s’assurer de la tolérance et l’inocuité tissulaire locale de ce biomatériau destiné in fine à un usage en médecine humaine pour la reconstruction osseuse.

Procédures

1 intervention chirugicale d'implantations sous la peau du biomatériau à tester et du biomatériau témoin sous anesthésie générale durant approximativement 1 heure 1 anesthésie générale terminale avant euthanasie

Impact sur les animaux

En raison de l’objectif de l’étude, l’effet indésirable majeur est le developpement d’une réaction inflammatoire prolongée au niveau des sites d’implantation, pouvant générer une douleur locale, une inflammation chronique avec encapsulation et/ou abcédation. Un retentissement systémique de cette réaction inflammatoire prolongée avec baisse d'activité et de l'appétit enraînant une perte de poids constitue un des points limites lorsqu'un échec thérapeutique à l'administration d'antalgiques et de soins locaux est constaté.

Devenir

Nécessité de réaliser une analyse histopathologique détaillée des sites d'omplantations, seulement réalisable après prélèvement des tissus post-mortem. Néanmoins, les 2 lapins supplémentaires prévus en cas de pertes d'animaux non liées au protocole seront affectés à un autre protocole dans le cas où ils ne seraient pas utilisés.

Remplacement

A l’heure actuelle, il n’existe pas d’autres méthodes d'étude de la tolérance de l'hôte permettant d’éviter ou de remplacer l’utilisation d’animaux pour l’approche thérapeutique abordée dans ce projet.

Réduction

Compte-tenu d’études comparables déjà publiées, le nombre d’animaux par groupe correspond au nombre minimal requis pour atteindre une significativité́ statistique. L’animal étant son propre témoin, cela nous permet de réduire la variabilité individuelle, d’augmenter la puissante du test statistique et de travailler sur des faibles effectifs (n=5) sans perdre la validité statistique.

Raffinement

Les manipulations se dérouleront dans le strict respect du bien-être des animaux. L’hébergement est assuré dans des cages individuelles conformément à la réglementation en vigueur. Le modèle chirurgical est maîtrisé et réalisé par des chirurgiens qualifiés. Des traitements analgésiques adaptés seront mis en place et ajustés au niveau de douleur identifiée individuellement sur chaque lapin. Toute maladie concomitante apparaissant pendant l’étude fera l’objet de soins et de traitements adaptés. L’échec aux traitements conventionnels et l’impact de la maladie sur les résultats de l’étude seront évalués comme point limite. Les animaux ont accès librement aux granulés spéciaux pour lapins et à l’eau de boisson (ad libitum). L’enrichissement du milieu se fait par des jouets et des blocs de foin compacté et une tablette surélevée permettant aux lapins de se placer au-dessus ou en dessous. Les moyens mis en œuvre pour détecter, identifier et mettre un terme sans délai aux douleurs, souffrance et angoisse potentielles consiste en une surveillance quotidienne des animaux et l'utilisation d'un arbre décisionnel d'intervention (soin, analgésie, euthanasie) à partir de la collection de comportements et de signes physiques anormaux identifiés sur les animaux. Par ailleurs, le soin des lapins est assuré par un personnel qualifié dans un hébergement conforme et enrichi. Les animaux sont manipulés dans un environnement calme et sous sédation ou anesthésie dès lors que la manipulation est stressante et source d’inconfort. L’immobilisation chimique est réalisée par voie sous-cutanée ce qui évite de requérir à une contention physique pour réaliser l’injection des produits sédatifs et analgésiques.

Choix des espèces

Le choix des lapins est fondé sur plusieurs critères : - Animaux adultes : maturité squelettique - Animaux faciles à gérer en stabulation ; - Modèle d’inflammation induite chez le lapin largement répondu et décrit dans la littérature. Animaux adultes : aspect anatomique (modèle validé)

6 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tuées à l'issue et une centaine réutilisées. Immunodéprimées, elles reçoivent une greffe de cellules ou de fragments de tumeurs humaines ou murines sous la peau ou dans la mamelle, avec suivi de la croissance tumorale et prélèvement terminal des tumeurs et organes. Le porteur situe ce projet en amont d'études d'efficacité de candidats médicaments anticancéreux et fixe un point limite à un volume tumoral de 2 000 mm³. Il affirme que seul "un organisme vivant complet" permet de mesurer les effets d'une molécule et qu'une mauvaise connaissance du modèle serait "incompatible avec la règle des 3R".

Objectifs

Le but de ce projet préliminaire, situé en amont des études d’activité et d’efficacité anti-tumorale de candidats médicaments, est de définir les caractéristiques de croissance, les conditions optimales de greffe (densité cellulaire, souche de souris,…), ainsi que les fenêtres de début des traitements à mettre en œuvre pour chacune des lignées tumorales qui constitueront nos modèles d’études de pharmacologie. Des greffes de tumeurs humaines ou murines, à partir de cellules ou fragments, vont ainsi être effectuées en sous-cutanée, en intra-mammaire ou en intradermique chez des souris. Des souris immunodéprimées seront utilisées pour limiter les problématiques de rejet. Les caractéristiques de croissance tumorale peuvent être évaluées selon deux méthodes : -par mesure au pied à coulisse ,technique non invasive et la plus classiquement utilisée. -par mesure via l’imagerie optique ,technique également non invasive, plus en plus utilisée en recherche car elle permet la détection beaucoup plus précoce de tumeurs en croissance, non visibles à l’œil nu ou non mesurables au pied à coulisse. Cette approche est fondamentale pour évaluer l’efficacité de nos traitements anti-cancéreux dans des modèles bien caractérisés.

Bénéfices attendus

En Europe comme aux Etats-Unis, le cancer est actuellement la seconde cause de mortalité après les maladies cardiovasculaires. En France, le cancer provoque environ 33% des décès chez les hommes et 23% chez les femmes. Il est donc primordial de s’intéresser à cette maladie et de trouver de nouvelles thérapies. Les cellules cancéreuses sont initialement des cellules normales qui ont acquis, au cours du temps, un certain nombre de mutations faisant qu’elles ne répondent plus aux différents mécanismes de régulation et prolifèrent indéfiniment engendrant la formation d’une tumeur maligne et/ou de métastases. Un enjeu majeur pour la recherche consiste à trouver de nouvelles thérapies ciblant spécifiquement les cellules cancéreuses, tout en limitant les effets secondaires sur l’organisme. Ce projet va ainsi consister à déterminer les conditions optimales de greffe de tumeurs et leurs caractéristiques de croissance tumorale afin de disposer de modèles fiables et robustes utilisables pour la sélection de candidats médicaments. Ces modèles de souris greffées par des cellules tumorales doivent au préalable être mis au point et caractérisés pour chaque modèle qui va être étudié (tumeurs d’origine humaine ou de souris). Ces mises au point sont primordiales puisqu’elles permettent d’acquérir une bonne connaissance des modèles et constituent un paramètre essentiel pour une évaluation pharmacologique optimale de nos produits anti-cancéreux. Une mauvaise connaissance du modèle conduirait à des études inexploitables et serait incompatible avec la règle des 3R.

Procédures

- Puçage : un dispositif sous cutané est implanté à chaque animal quelques jours avant l’étude par trocart afin d’être identifié - Greffe de cellules ou de fragments tumoraux : 1 fois dans l’étude (Pour la greffe de cellules tumorales par voie sous-cutanée et intradermique il est possible de le faire anesthésié ou vigile en fonction de l’aisance du technicien, injection en quelques secondes). Les greffes par voie intra-mammaires et de fragments de tumeurs (par trocart) sont toujours réalisées sous anesthésie (temps d’anesthésie gazeuse 5 minutes, geste 1min30) - La mesure du volume tumoral est réalisée soit chez l’animal vigile par mesure au pied à coulisse (avec légère contention de l’animal de quelques minutes 2 fois minimum par semaine voir 3 fois lors du pic de croissance tumorale(environ 30 sec). - Soit chez l’animal anesthésié par mesure par imagerie 2 fois minimum par semaine voir 3 fois lors du Pic de croissance tumorale (anesthésie gazeuse de quelques minutes) - Prélèvement de sang en fin d’étude sur animal anesthésié et sans réveil consécutif par ponction à la veine cave ou par ponction cardiaque (anesthésie + geste 2min environs). - Prélèvement terminal de tumeur : la tumeur sera prélevée sur les animaux préalablement profondément anesthésiés à l’Isoflurane et euthanasiés par dislocation cervicale.

Impact sur les animaux

Croissance tumorale sous cutanée limitée à 2000 mm3 (1500 mm3 pour les tumeurs intra-mammaires) Stress léger lié à la manipulation de l’animal vigile pour les gestes de : puçage sous cutanée (1 implant, 15sec), greffe sous-cutanée, (1 injection. Environ 15 sec) ; pesée et mesure de tumeur par pied à coulisse (environ 30 sec, 2 à 3 fois/ semaine le temps de l’étude). Au cours de ce projet, nous serons vigilants sur les effets indésirables rares qui peuvent survenir tout au long des études : Perte de poids >20% du poids maximal pouvant être associée au développement de la tumeur ou ascite.

Devenir

Lorsque le volume tumoral est proche de 2000 mm3, ceci constitue un point limite et l’animal concerné est alors euthanasié. A la fin de chaque étude, tous les animaux sont euthanasiés pour réaliser des prélèvements de sang, de tumeur et/ou d’autres organes. Ces prélèvements seront utilisés pour des études ultérieures (détermination de l’expression de protéines ou de gène d’intérêt, par immunohistochimie, génomique ou protéomique…). Les animaux ne développant pas de tumeur pourront être réutilisés dans un autre protocole, dans la mesure du possible et à la suite d’une validation par SBEA et/ou vétérinaire de leur bon état général.

Remplacement

Pour tester l’activité de nouveaux composés, des tests in-vitro sont systématiquement mis en place sur des cellules en culture, mimant artificiellement la pathologie de l’homme. Grâce à ces tests in-vitro, des molécules actives sont sélectionnées avant d’être testées, en seconde intention, dans des modèles in-vivo de souris porteuses de tumeurs afin de démontrer leur activité et leur efficacité anti-tumorale. C’est en effet dans un organisme vivant complet que l’on peut mesurer les effets pharmacologiques d’une molécule anti-cancéreuse. Pour pouvoir effectuer ces évaluations in-vivo, il est indispensable d’utiliser en premier lieu un modèle tumoral maitrisé et bien caractérisé en recréant la pathologie par implantation de cellules tumorales ou de fragments tumoraux chez la souris. L’animal porteur de tumeur devient ainsi un bon modèle expérimental pour évaluer les composés anti-cancéreux.

Réduction

Deux techniques d’évaluation de la croissance tumorale peuvent être employées : par pied à coulisse ou par imagerie optique (bioluminescence ou fluorescence). Ces 2 techniques, non invasives pour l’animal, présentent chacune leurs avantages et seront choisies en fonction des besoins expérimentaux. Le pied à coulisse permet ainsi une mesure rapide du volume de la tumeur chez l’animal éveillé. La bioluminescence permet une détection plus précoce des tumeurs ainsi qu’une détection de la prolifération métastatique pour certains types de tumeurs mais nécessite une anesthésie de la souris pendant la durée d’acquisition des données. Elles permettent toutes deux d’effectuer des mesures non douloureuses pour l’animal et de suivre l’évolution des tumeurs au cours du temps, ceci concourant à la réduction du nombre de souris nécessaires dans une même étude. D’autre part, un travail a été initié avec l’équipe de biostatistiques pour définir par simulation à partir des données observées dans l’étude de mise au point, des métriques quantitatives pour aider dans le choix des conditions pour évaluer l’efficacité des candidats médicaments. Ces métriques donneront des informations sur le jour de randomisation optimal, , la potentielle fenêtre thérapeutique ainsi que la taille de l’effet traitement qui pourra être évaluée avec 5 à 10 animaux par groupe en fonction de la variabilité de la croissance tumorale observée (utilisation d’un modèle statistique longitudinal basé sur une équation). Mais l’impact sur la réduction du nombre d’animaux est surtout présent pour les études qui seront effectuées grâce aux conditions prédéterminées dans le cadre de ce projet. Car si cette étape est optimisée techniquement et permet avec l’aide des biostats de quantifier la variabilité et le timing idéal pour la randomisation nous pourrons ajuster le nombre d’animaux. Et en connaissant au préalable le temps de la fenêtre thérapeutique nous pourrons garantir d’évaluer l’efficacité des candidats médicaments de la façon la plus relevante possible.

Raffinement

Tout au long de l’étude, les souris sont hébergées en groupes sociaux et un enrichissement de milieu adapté est apporté de manière à favoriser leur instinct de nidification. Cet enrichissement va également permettre de surveiller l’état général des animaux par l’observation de leur comportement vis-à-vis de celui-ci. L’état général des souris est surveillé régulièrement et les volumes tumoraux sont mesurés au minimum 2 /semaine, à la fois pour l’objectif de l’étude mais également pour identifier les éventuels signes de souffrance et appliquer les points limites prédéfinis dès que nécessaire. De plus, au-delà de 1500 mm3, (1000 mm3 pour tumeur mammaire) une surveillance accrue et une réduction de l’intervalle de temps entre les mesures est mise en place afin d’anticiper plus efficacement l’atteinte du point limite lié au volume tumoral.

Choix des espèces

En oncologie, l’utilisation de souris est largement décrite dans les publications en recherche pré-clinique : ces modèles sont davantage déployés chez la souris que chez le rat. La même souche de souris est utilisée pour l’ensemble des études in-vivo pour une tumeur donnée (DMA/DMT, pharmacocinétique, pharmacodynamie, efficacité). En effet, il peut exister des différences importantes en termes de tolérance et d’exposition plasmatique d’un produit en fonction de la souche murine considérée, pouvant impacter les résultats. Le choix de la souche ainsi que les conditions optimales de greffe seront déterminés dans le cadre de ce projet, en amont des études de pharmacologie. Les souris sont utilisées à l’âge jeune adulte, à partir de 7semaines soit un poids corporel d’environ 18-20g. C’est l’âge classiquement utilisé dans tous les protocoles qui seront réalisés dans la sélection des candidats médicaments.