Procédures modérées

24 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour modéliser l'ataxie de Friedreich, elles reçoivent une anesthésie par injection puis une électromyographie mesurant l'activité du nerf sciatique, l'objet étant d'améliorer la détection d'une onde difficile à enregistrer. Le porteur indique que ces souris développent des déficits moteurs dès cinq semaines et une mortalité par crises d'épilepsie vers vingt semaines, et prévoit de les tuer à quinze semaines. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne permet ces mesures et qu'il est "indispensable" de les réaliser sur l'animal.

Objectifs

L’ataxie de Friedreich est une maladie neurodégénérative progressive incurable à ce jour. Cette maladie se manifeste par des troubles de l’équilibre et de la coordination des mouvements volontaires (ataxie) liés à une dégénérescence des neurones sensitifs. L’ataxie de Friedreich rare touche environ 1 personne sur 50 000, soit environ 1 300 patients en France. Apparaissant généralement vers l’âge de 9–14 ans, son évolution et ses symptômes varient d’un patient à l’autre. Toutefois, une incapacité à marcher survient généralement 10 à 20 ans après les premiers symptômes. L’électromyographie (EMG) permet d’analyser l’activité électrique des nerfs et des muscles chez l'Homme. En complément de l’examen clinique, il aide au diagnostic de différentes pathologies nerveuses et musculaires. L'EMG est utilisée chez la Souris pour étudier les maladies neuromusculaires. Après stimulation électrique du nerf sciatique, la réponse électrique au niveau du muscle du pied est enregistrée. Deux ondes sont présentes dans cette réponse électrique, une onde motrice (onde M), correspondant à la réponse du muscle à la stimulation des fibres motrices du nerf sciatique, et une onde sensitive (onde H) correspondant à la réponse du muscle à la stimulation des fibres sensorielles du nerf sciatique. Cette onde H est difficile à détecter à l’heure actuelle. L'objectif de ce projet est d'améliorer la détection de cette onde grâce à un électromyographe plus performant et des modifications du protocole d’enregistrement. Pour valider cette nouvelle méthode d’enregistrement, nous souhaitons mesurer l'onde H chez des souris génétiquement modifiées qui présentent une diminution de l’amplitude de l’onde H à partir de l’âge de 5 semaines et qui sont utilisées pour la recherche de nouvelles thérapies contre l'ataxie de Friedreich.

Bénéfices attendus

L'optimisation de la mesure de l'onde H permettra d'améliorer la détection de la dégénérescence des neurones sensitifs et ainsi de mieux caractériser l'effet de potentiels traitements sur cette dégénérescence présente dans l'ataxie de Friedreich. En améliorant la qualité des études précliniques, nous augmenterons les possibilités de trouver une thérapie efficace chez l'Homme pour traiter l'ataxie de Friedreich.

Procédures

Les animaux seront soumis aus interventions suivantes: - Injection intra-péritonéale du mélange kétamine - xylazine (durée = 5 secondes). - Electromyographie permettant la mesure neurophysiologique de la fonction motrice et sensorielle (durée = 10 minutes). - Injection sous-cutanée d'antisedan (durée = 5 secondes).

Impact sur les animaux

Les souris génétiquement modifiées permettant d'étudier l'ataxie de Friedreich, présentent une mortalité liée à l'apparition de crises épileptiques à partir de l'âge de 20 semaines, âge qui ne sera pas atteint au cours de notre protocole, les animaux étant euthanasiés à l'âge de 15 semaines. Par ailleurs, des déficits de coordination motrice apparaissent à l' âge de 5 semaines. Ces déficits augmentent au cours du temps et à l'âge de 15 semaines, ces animaux présentent des troubles de la démarche marqués mais non délétères. De la nourriture en gelée sera placée sur le sol de la cage durant toute l'étude. Ce modèle a été décrit de manière précise par une équipe de recherche sur notre site, notamment dans son décours et sa sévérité. Lors de l'EMG, si un animal commence à se réveiller au cours du test, l'expérience sera immédiatement stoppée. Si un animal présente des difficultés respiratoires, l'expérience sera également stoppée.

Devenir

Les souris utilisées commencent à mourir à l'âge de 20 semaines. Tous les animaux seront mis à mort à l'âge de 15 semaines.

Remplacement

L'électromyographie est couramment utilisée chez l'homme pour étudier les neuropathies. Ces neuropathies sont généralement associées à des troubles moteurs visibles. Les modèles murins de ces neuropathies présentent également des troubles moteurs. Pour étudier l'efficacité thérapeutique d'une molécule d'intérêt, ces troubles moteurs sont évalués au cours du temps et les mesures électromyographiques viennent compléter les phénotypes observés. Nous ne disposons actuellement d'aucun modèle in vitro ou in silico permettant de déterminer l'impact d'une mutation génétique sur la coordination motrice. Il est donc indispensable de pouvoir réaliser des mesures électromyographiques sur l'animal.

Réduction

Pour cette étude, nous avons prévu d'utiliser 12 animaux par groupe expérimental. Ce nombre de 12 animaux par groupe a été établi par étude de puissance sur les mesures électromyographiques réalisées précédemment dans notre laboratoire. Il constitue un bon compromis entre puissance d'analyse et réduction du nombre d'animaux utilisés. La latence et l'amplitude de l'onde H seront les paramètres analysés et nous comparerons les résultats obtenus chez les souris génétiquement modifiées avec ceux obtenus chez les souris non génétiquement modifiées. Nous utiliserons 24 souris au total pour cette étude.

Raffinement

Un certain nombre de procédures seront mises en place afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si des difficultés de locomotion apparaissent, de la nourriture sera placé dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupe de 2 à 4 par cage et la qualité de l’air sera assurée par une ventilation. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole et à la mise à mort de l'animal.

Choix des espèces

La souris est un animal dont la modification génétique est aisée et nous disposons justement d'un modèle d'intérêt pour étudier l'ataxie de Friedreich. Par ailleurs, ce mammifère permet une première approche informative concernant les mécanismes physiologiques, fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine. Les souris utilisées pour modéliser l'ataxie de Friedreich montrent une diminution progressive de l'amplitude de l'onde H à partir de l'âge de 5 semaines. Un premier EMG sera réalisé à l'âge de 5 semaines, avant que l'amplitude de l'onde H ne commence à diminuer. Un deuxième EMG sera réalisé à l'âge de 15 semaines, lorsque l'amplitude de l'onde H est fortement diminuée chez ces souris. Les animaux seront mis à mort à la fin du protocole , à l'âge de 15 semaines, avant l'apparition des crises d'épilepsie.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes subissent l'implantation chirurgicale d'un micro-endoscope au-dessus du nerf optique sous anesthésie, une partie recevant en plus du tamoxifène ou une injection d'AAV dans la rétine, avant des séances d'imagerie répétées jusqu'à dix fois dans l'année, certaines sur animal éveillé. Le porteur indique que la chirurgie peut provoquer une inflammation et une douleur transitoire et que l'injection dans l'œil peut le léser. Il affirme que l'étude du couplage neurovasculaire exige de travailler sur "l'animal entier et normal" et que de nombreuses données in vitro se sont "révélées fausses".

Objectifs

Le but du projet de notre équipe est d’analyser les bases cellulaires de l'hyperémie fonctionnelle dans le nerf optique, c'est à dire le lien entre l’activation nerveuse et l’augmentation réflexe du flux sanguin, lien qui est à la source de l’imagerie fonctionnelle cérébrale de type fIRM chez l’homme. Plus précisément, nous souhaitons caractériser les différents types cellulaires participant à la régulation de ce phénomène. Pour cela, nous irons étudier dans le nerf optique de souris anesthésiées, sédatées ou éveillées, les liens entre les réponses cellulaires et vasculaires, suite à des stimulations visuelles.

Bénéfices attendus

Dans la plupart des neuropathies optiques l’atteinte fonctionnelle cellulaire précède la mort cellulaire. La réponse de l’électrorétinogramme est un bon marqueur non-invasif du signal de sortie généré par les cellules ganglionnaires et son altération reflète un dysfonctionnement de ces cellules. Notre projet permettra de caractériser le signal de sortie de cellules (en direction du cerveau) au niveau de la partie intracrânienne et myélinisée du nerf optique in situ. Nous étudierons la propagation électrique du signal nerveux, le couplage neurovasculaire et la réponse métabolique du nerf au cours d’une stimulation visuelle physiologique. Cette approche, jamais tentée précédemment, sera établie dans un premier temps chez l’animal normal, aboutissant à l’établissement d’un nouvel outil préclinique. Dans un deuxième temps, cet outil permettra de comparer le fonctionnement du nerf optique intracrânien normal et pathologique, et surtout, de tester diverses approches de neuroprotection.

Procédures

Une partie des animaux (120 animaux) recevra une dose de tamoxifène injectée par voie intra péritonéale sur 3 jours (1 injection/jour). Tous les animaux subiront une seule procédure chirurgicale d’une heure sous anesthésie profonde et en conditions stériles. La chirurgie d'environ 1h consistera en l’implantation d’un micro endoscope au-dessus du nerf optique. Pour cela les animaux recevront des doses d’analgésiques avant et après la chirurgie. Une partie des animaux (80 animaux) recevra une unique injection d’AAV dans la rétine d’un seul œil, sous anesthésie gazeuse. L’injection ne dure que 10 minutes. Les animaux sont observés en microscopie biphotonique éveillés, sédatés ou anesthésiés. Les animaux observés éveillés effectuent au préalable une habituation progressive de plusieurs jours au poste d’enregistrement. Les cessions d’enregistrements durent au maximum 2 heures. Les animaux reçoivent juste avant l’enregistrement une injection de colorants par voie intra veineuse rétro-orbitale, sous anesthésie générale. Durant les cessions, les animaux peuvent être soumis à des stimulations visuelles de 1 à 30 secondes : grille contrastée sur un écran placé devant l’œil de l’animal. Les animaux seront observés jusqu’à 10 fois selon les observations, durant l’année qui suit la procédure chirurgicale. Après les cessions d'imagerie, une partie de animaux (60 souris) est mise à mort lors d'une perfusion intracardiaque sous anesthésie profonde pour pouvoir prélever leurs cerveaux. A la fin du projet tous les animaux sont mis à mort.

Impact sur les animaux

- L'injection de tamoxifène intrapéritonéale pourra induire une perte de poids transitoire. - L'acte chirurgical pourra provoquer une inflammation locale ainsi qu'une douleur transitoire. - L'injection d'AAV dans le vitré de l'oeil peut entrainer une lésion de l'oeil si le geste n'est pas effectué correctement. - L'imagerie peut provoquer un stress durant le temps de l'expérience particulièrement chez l'animal éveillé. – Lors d'une perfusion intra-cardiaque, un animal peut souffrir si l'anesthésie n'est pas suffisante.

Devenir

Les animaux sont tous euthanasiés à la fin du projet, selon différentes méthodes en fonction des besoins expérimentaux, pour vérifier l'exactitude des données obtenue en imagerie.

Remplacement

Jusqu’à présent, le nerf optique a été étudié in vitro. Toutes études métaboliques et celles s’attaquant à la régulation du flux sanguin nécessitent de travailler chez l’animal entier et normal. En effet, une grande partie des données obtenues in vitro se sont révélées fausses ou non utilisables en recherche clinique.

Réduction

Nous utiliserons 360 animaux dans notre projet. Les procédures mises en place pour ce projet participent à réduire le nombre d'animaux en expérimentation, en utilisant une technique comme l'injection d'AAV qui nous permet de marquer d'autres types cellulaires de manière peu invasive et sans utiliser plus d'animaux, et en travaillant sur des animaux chroniques qui sont réutilisés pour plusieurs expériences d'imagerie (jusqu'à 10 expériences / animal). Par ailleurs, nous nous engageons à réduire l'utilisation d'animaux autant que possible en développant les analyses statistiques et les modèles mathématiques.

Raffinement

Durant notre projet, nous prêterons attention à raffiner la méthodologie utilisée : - en améliorant les conditions expérimentales par l'administration d'anesthésiques (kétamine/médétomidine, dexmédétomidine et lidocaïne) et analgésiques (buprénorphine) chaque fois que nécessaire (chirurgie, soins postopératoires, injection dans l'oeil et imagerie sous anesthésie/sédation) - en introduisant des points limites à chaque acte expérimental qui permettent d'éviter toute souffrance à l'animal et sa mise à mort lorsque celle-ci ne peut être prise en charge - en garantissant des conditions d'hébergement appropriées aux animaux (ajouts d'enrichissements dans les cages et contrôle stricte des paramètres environnementaux) - en effectuant une surveillance quotidienne du bien-être des animaux, par un personnel formé et une surveillance régulière par un membre de la SBEA.

Choix des espèces

Il n'existe pas de méthode alternative possible à l'utilisation d'animaux vivants dans l’étude du couplage neurovasculaire. La souris est la seule espèce de mammifère chez laquelle il est aisé de générer des animaux transgéniques. Les souris seront utilisées entre P45 et 2 ans. Il est nécessaire d’utiliser des animaux chez lesquels les processus régulant le couplage neurovasculaire sont matures.

524 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour modéliser l'autisme, elles apprennent une tâche comportementale de 200 essais par jour sous contention partielle de la tête, avec un accès à l'eau restreint à un hydrogel pour les motiver et une perte de poids plafonnée à 10 pour cent. Le porteur décrit ces contraintes comme brèves et réversibles et n'attend pas d'effet indésirable majeur. Il affirme qu'un modèle animal est "absolument nécessaire" pour reproduire la complexité des circuits neuronaux et écarte les approches sur cellules ou sur la mouche.

Objectifs

L’autisme est un trouble neurodéveloppemental caractérisé par des déficits sociaux, des comportements stéréotypés répétitifs et les réactions sensorielles atypiques. Il est estimé qu'à l'échelle mondiale, environ un enfant sur 54 est atteint d'autisme. Malgré la prévalence du trouble du spectre de l'autisme (TSA), les mécanismes neurobiologiques qui sous-tendent les anomalies du comportement ne sont pas bien compris. Une meilleure compréhension de la base neurobiologique des TSA est cruciale pour la gestion des symptômes des TSA et pour le développement d'approches thérapeutiques innovantes, ainsi que pour l'identification de biomarqueurs diagnostiques. L'objectif global de ce projet est de développer de nouveaux biomarqueurs physiologiques et comportementaux chez les modèles génétiques murins de TSA. Ces mesures seront ensuite utilisées pour le développement et l'élucidation de nouvelles approches thérapeutiques. Dans cette étude, nous avons choisi de nous concentrer sur une région du cerveau qui est très bien conservée entre la souris et l'homme. Pour mener à bien nos études, nous proposons de développer et d'exploiter une nouvelle tâche comportementale qui nous permettra d’identifier, à la fois les altérations comportementales ainsi que les modifications physiologiques liées à une altération du fonctionnement du cerveau des souris portant certaines modifications génétiques lié à l’autisme. Ces mesures nous permettront, par la suite, mesures physiologiques afin de mettre en évidence les mécanismes cellulaires et physiologiques associés aux altérations comportementales et cognitives liées à l’autisme. Enfin, nous testerons la capacité de cette tâche à mesurer les conséquences d'une intervention pharmacologique. Pour cette dernière, nous utiliserons une molécule expérimentale qui a déjà été testée dans des essais cliniques chez l'homme et dont le profil de sécurité et la pharmacocinétique sont bien définis.

Bénéfices attendus

Des études de dépistage à grande échelle menées aux États-Unis suggèrent que la prévalence de l'autisme est de 1 enfant sur 54. Bien qu'il n'existe pas d'études de cette ampleur en Europe, la prévalence de l'autisme est probablement similaire. Les symptômes sensoriels affectent la grande majorité des personnes atteintes d'autisme et ont des conséquences fortement négatives sur la vie quotidienne des personnes concernées, comme la capacité à s'intégrer dans une salle de classe, à tolérer certains vêtements, à manger certains aliments. Ces symptômes sont une source majeure de stress pour les familles concernées. La compréhension des processus neurophysiologiques qui sous-tendent les difficultés sensorielles peut apporter des informations importantes sur la façon dont le fonctionnement du cerveau est altéré dans l'autisme. De telles études peuvent conduire à l'élucidation des mécanismes moléculaires, cellulaires et des circuits qui sous-tendent les perturbations sensorielles, révélant ainsi de nouvelles cibles pour le développement de traitements pharmacologiques visant à améliorer des symptômes tels que la surcharge sensorielle ou l'hyperréactivité sensorielle, ou de biomarqueurs permettant d'évaluer le succès de traitements expérimentaux dans un cadre préclinique. De telles études nécessitent des approches invasives et des manipulations qui ne sont pas possibles dans un cadre clinique. Nous pensons que notre étude permettra de mieux comprendre les types de cellules et les circuits impliqués dans l'altération de la perception sensorielle tactile. Elle fournira des biomarqueurs précliniques pour l'évaluation de nouveaux médicaments expérimentaux. Elle nous permettra d'évaluer l'efficacité d'un médicament expérimental existant qui a été proposé comme traitement de l'autisme. Notre étude a le fort potentiel de fournir des informations qui, à terme, amélioreront la vie des personnes diagnostiquées autistes. Ces connaissances peuvent également renforcer l'autonomie et bien être des personnes autistes en leur permettant de comprendre pourquoi elles se sentent comme elles le font dans certaines situations.

Procédures

Pour comprendre les mécanismes neurobiologiques sous-jacent de l'autisme, les animaux apprendront à effectuer une tâche comportementale non aversive , basé sur les récompenses, où ils subiront une session de 200 essais par jour. En même temps, nous effectuons des mesures physiologiques afin d'enregistrer l'activité des neurones du cerveau. Afin de permettre cet enregistrement, les animaux sont entraînés à accepter une contention partielle (immobilisation de la tête). Pour s'assurer que les animaux ne ressentent ni stress ni anxiété, ils seront progressivement habitués à l'installation et à l’immobilisation de la tête. Cette habituation commencera par une exploration libre de la chambre d'enregistrement, puis se poursuivra par une très brève immobilisation initiale. L'habituation se poursuivra très progressivement pendant une semaine, permettant à l'animal d'apprendre que cette immobilisation sera brève et réversible. Lorsqu'ils seront à l'aise dans le dispositif (pas de signes de détresse, capables de manger et boire), l'entraînement à la tâche comportementale commencera. Pendant cette période, chaque animal restera dans le dispositif pendant 30 minutes, une fois par jour.

Impact sur les animaux

Nous ne prévoyons pas d'effet indésirable majeur. Pour réaliser les expériences, les animaux doivent être motivés à consommer de l'eau. Pour cette raison, leur accès à l'eau pendant la journée sera limitée et uniquement sous forme d’hydrogel. Des études antérieures suggèrent que la souris est capable d'adapter son comportement et sa physiologie lorsqu'elle se trouve dans des régions arides. Nos études préliminaires n'ont montré aucune conséquence négative de cette restriction. D'autre part, les animaux seront habitués à une contention partielle (immobilisation de la tête). Cette habituation se poursuit très progressivement, permettant à l'animal de s'adapter à cette contrainte et d'apprendre que cette manipulation sera brève et réversible. Cet apprentissage très progressif est nécessaire afin de réduire au maximum le stress lié à une contention partielle et le rythme d'entraînement est adapté pour chaque animal.

Devenir

À la fin des expériences comportementales, les animaux seront euthanasiés sous anesthésie.

Remplacement

Les expériences proposées dans cette étude nécessitent des circuits intacts et des mesures à la fois physiologiques et comportementaux. Un modèle animal est absolument nécessaire pour reproduire la complexité de ces interactions neuronales et ne peut pas être remplacé par les études in vitro ou in silico. Les études cliniques ne sont pas adaptées à notre objectif expérimental car il s’agit d’une population clinique fragile et car les approches invasives sont nécessaires pour répondre à notre question scientifique. Les circuits neuronaux sont bien conservés chez les différentes espèces mammifères et sont donc susceptibles d'être fonctionnellement similaires chez les rongeurs et les humains. L’utilisation des modèles de plus faible sensibilité neuronale (tels que la mouche à vinaigre) n’est pas adapté à notre projet, parce que cet organisme manque la structure cérébrale ciblée par notre étude.

Réduction

Une conception expérimentale soignée garantira la reproductibilité des résultats et, avec des techniques d'analyse statistique appropriées, l'utilisation d'animaux sera réduite au minimum. Une première étude pilote a été réalisée pour établir les protocoles comportementaux ainsi que les protocoles techniques nécessaires au suivi des réponses neuronales. Cette première étude nous a permis de déterminer le nombre d'animaux nécessaires pour réaliser ces expériences et avoir des résultats statistiquement valides. Cela nous a permis d'assurer la crédibilité de nos résultats avant de procéder à l'étude principale. Les données comportementales et physiologiques seront recueillies auprès des mêmes animaux. Tous les animaux seront d'abord soumis à la tâche de détection tactile, puis seront entraînés à la tâche de discrimination tactile. Les neurones pyramidaux et inhibiteurs seront suivis simultanément et distingués par l'expression de rapporteurs spécifiques. Ces mesures nous permettront de réduire considérablement le nombre d'animaux utilisés dans l'étude et de mesurer simultanément plusieurs paramètres.

Raffinement

Dans cette étude, nous tiendrons compte de toutes les connaissances disponibles concernant le bien-être des animaux et nous surveillerons systématiquement les animaux pour détecter tout signe de douleur, de souffrance ou de détresse. Les expériences seront conçues et menées de la manière la plus humaine possible. Des souris transgéniques seront utilisées pour explorer les déficits neurophysiologiques chez les modèles de souris de l’autisme. Aucune souffrance inhérente n'est prévue pour les souches utilisées lors de ces expériences. Le bien-être des animaux est impératif pour cette étude, car les expériences comportementales exigent que les animaux se sentent à l’aise et ne sont pas soumis à une douleur ou une détresse inutile ce qui peut être préjudiciable à l'interprétation de notre expérience. Afin de minimiser la douleur, la souffrance, l'angoisse ou les dommages durables pour les animaux, toutes les procédures seront effectuées avec une technique soigneuse et un équipement adapté, par un personnel autorisé, compétent et formé de manière appropriée. Tous les animaux seront manipulés en utilisant les techniques les moins stressantes possibles, conformément à la littérature : des tunnels de cages domestiques seront utilisés pour transférer les animaux et une fois que les animaux seront habitués à l'expérimentateur, ils seront manipulés en utilisant la technique qui prend en compte le bien- être de l’animal. Tous les animaux seront pesés quotidiennement et la ration d’eau sera ajustée afin de s'assurer qu'ils ne dépassent jamais une perte de poids de 10%. Un tube et du matériel de nidification seront placés dans chaque cage afin de s'assurer que tous les comportements normaux des animaux se poursuivent. Les animaux sont hébergés en cage collective. Les animaux seront progressivement habitués à la contention partielle afin de réduire à minimum le stress.

Choix des espèces

Ce modèle (la souris transgénique) a été sélectionné pour rester cohérent avec les études antérieures utilisant les modèles genetiques de troubles neurodéveloppementaux. Les rongeurs ont un système neuronal très développé, présentent des comportements compliqués et sont considérés comme une espèce modèle pour les études concernant une variété de réponses comportementales. De plus, à ce jour la souris est la seule espèce de mammifère pour laquelle il est possible, en routine, de modifier le génome afin de créer des modèles de maladies humaines. L'étiologie de l'autisme a une forte base génétique. Les modèles transgéniques impliquant la manipulation (suppression ou modification des gènes à haut risque pour l'autisme) sont considérés comme les modèles ayant une forte « valeur de construction ». 8 semaines au début de la procédure expérimentale. Justification: Conformément aux études précédentes, les animaux auront 8 à 10 semaines au début de la période de apprentissage.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries dix-sept semaines avec un régime obésogène, elles reçoivent un gavage quotidien pendant cinq semaines, des prélèvements de sang et des tests de tolérance au glucose et à l'insuline, pour évaluer des métabolites du lycopène de la tomate contre l'obésité. Le porteur mentionne un stress lié à l'isolement pendant les tests et une douleur possible aux incisions de la queue et au perçage des oreilles. Il renvoie les retombées à un programme plus large visant "in fine" à améliorer les désordres métaboliques, et retient la souris comme modèle "reconnu" du métabolisme.

Objectifs

La consommation de lycopène, un caorténoïde de couleur rouge et présent en grande quantité dans la tomate, est classiquement associée à des effets bénéfiques sur la santé cardiométabolique. Cependant, les métabolites actifs du lycopène étaient inconnus jusqu’alors. Nous avons pour la première fois identifié plusieurs métabolites du lycopène qui montrent des effets positifs in vitro. Notre objectif est maintenant de montrer que les effets de ces dérivés du lycopène permettent de limiter le développement de la masse grasse et de l’insulino-résistance dans un modèle de souris.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre l'impact métabolique du lycopène en identifiant ses métabolites actifs. Ce projet s’insère dans un projet plus large qui permettra in fine d’améliorer les désordres métaboliques associés à l'obésité par le biais d'approches nutritionnelles utilisant des métabolites actifs de molécules naturelles.

Procédures

Les animaux seront nourris durant 17 semaines avec une régime obésogène. De la 12ème à la 17ème semaine, un gavage sera réalisé quotidiennement, afin de controler parfaitement la dose de molécules administrée. Un prélèvement de sang sera réalisé en semaine 12, une mesure de prise alimentaire sera réalisée en semaine 12 et 16. Un test de tolérance à l'insuline et un test oral de tolérance au glucose seront pratiqués respectivement en semaine 15 et 16.

Impact sur les animaux

Stress social lié à l'isolement de l'animal de ses congénères lors de l'ITT, de l'OGTT (durée estimée à 3 heures au maximum pour chaque procédure). Douleurs possibles lors de l'incision à la queue pour les prises de sang, du perçage des oreilles pour l'identification des animaux et lors de la distribution des métabolites du lycopène ou des doses de glucose (OGTT) et d'insuline (ITT).

Devenir

Les animaux de cette procédure seront mis à mort afin de prélever les tissus d'interet quei seront ensuite étudiés (expression génique, histologie, dosages protéiques) et de démontrer les effets métaboliques des métabolites du lycopène.

Remplacement

L’étude d’une supplémentation en métabolites du lycopène sur la santé métabolique ne peut s'envisager que dans un modèle in vivo. Les souris C57Bl/6J sont un modèle largement utilisé et reconnu pour les études sur le métabolisme.

Réduction

Le nombre d'animaux (10 par groupes) est le nombre minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences significatives entre les groupes, notamment en ce qui concerne la prise de poids.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cage de 3 ou 4, et l'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique et de matériel de nidification (bandelettes de papier kraft). Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Une crème anesthésique (lidocaïne/prilocaïne 5%) sera appliquée localement lors du perçage des oreilles pour identification et avant incision pour les prélèvements de sang à la queue. Des conflits entre animaux au sein d’une même cage pourraient se produire et engendrer des blessures. Dans ce cas, l’animal blessé sera soigné et placé dans une cage individuelle permettant de garder des contacts visuels, olfactifs et auditifs avec ses congénères jusqu’à la fin du protocole. Les animaux seront manipulés régulièrement afin de réduire leur stress. Et une phase d'habituation au gavage sera réalisée pendant 3 jours avant le début de l'étude. Des points limites gradés et précis ont été définis pour chaque acte expérimental. Un arbre décisionnel en focntion des observations faites permettra l'applicatiob des points limites et la mise en application de critères d'arret.

Choix des espèces

Le modèle souris est un modèle reconnu pour les études portant sur l’obésité et les pathologies associées. Les mécanismes d’adaptation à une alimentation riche en matière grasse chez la souris sont très proches des mécanismes observés chez l’Homme. Les animaux seront âgés de 6 semaines à l’achat et d’environ 7 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondants tels que le vieillissement.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées, elles sont soumises à un régime riche en graisse et en sucre pour induire un diabète de type 2, puis à des injections intrapéritonéales répétées de glucose et d'insuline et à des prélèvements de sang à la queue. Le porteur décrit une douleur légère possible liée au modèle et annonce une mise à mort finale pour prélever les organes. Sur le remplacement, il affirme que l'usage d'animaux est "indispensable" pour démontrer in vivo l'implication d'une protéine avant d'en faire une cible thérapeutique.

Objectifs

L’obésité est une maladie chronique que consiste à un excès de masse grasse et à une modification du tissu adipeux. Elle est due à différents facteurs, tel que l’alimentation, la prédisposition génétique et aussi à facteurs environnementaux. Une des consequences métaboliques majeures de l’obesité est le développement du diabète de type 2. Afin de pouvoir traiter le diabète, une meilleure compréhension du dialogue entre les cellules est nécessaire. L’implication du système immunitaire dans la physiopathologie du diabète de type 2 n’est pas connue, ainsi, nous souhaitons ici comprendre l’interaction du système immunitaire avec le pancréas dans l’installation et le maintien de la pathologie. Nous avons mis en évidence la présence de la cytokine IL34 chez l’homme et la souris au niveau des îlots pancréatiques. Son expression se trouve augmentée dans des pancréas issus de patients atteints de diabète de type 2. Suite à ces observations, nous avons créé une lignée de souris déficientes en IL34 au niveau du pancréas. Le modèle a été mis en place par croisement entre une lignée IL34LoxP et PdxCre. Ainsi, nous cherchons à comprendre l’impact de l’inhibition de la cytokine au niveau du pancréas dans des conditions physiologiques et pathologiques de diabète de type 2 en comparant les souris IL34 KO avec les souris IL34 contrôles issues du croisement.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre d’identifier la cytokine d’intérêt comme un nouveau biomarqueur ou une nouvelle cible thérapeutique dans le diabète de type 2. Il aiderait également à mieux comprendre le rôle du système immunitaire dans la pathologie au niveau du pancréas et plus particulièrement des îlots de Langerhans.

Procédures

Le test de tolerance au glucose et à l'insuline (GTT et ITT) nécessitent des injections intra péritonéales de glucose et insuline (10 ip par souris, 1ip de glucose et 1ip d’insuline 1 fois par mois, durée environ 3 seconds). Cette voie permet une distribution systémique rapide des produits injectés. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est pas obligatoire. Aucun effet indésirable lié à cet acte n’est attendu Des prélèvements de gouttes de sang à niveau de la veine caudale pour mesurer la glycémie des animaux. Il y aura 8 prélèvements d’une goutte de sang par souris pour un même test. Pour chaque prélèvement, les animaux sont anesthésiés localement au niveau de la queue (lidocaïne, sous forme de pommade). Ces tests seront effectués au début du protocole, après 1, 2, 3 et 4 mois de regime.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à une régime alimentaire riche en graisse et sucre afin d’induire le diabète de type 2 lié à l’obésité. Les souris pourront présenter (i) aucun signe clinique particulier (asymptomatique), (ii) certains signes cliniques et comportementaux traduisant une douleur potentielle. La réaction attendue dans le modèle de diabète peut être de douleur légère. Les tests de tolérance au glucose et à l’insuline nécessitent des injections intra péritonéales de glucose et insuline (10 ip par souris). Cette voie permet une distribution systémique rapide des produits injectés. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est pas obligatoire. Aucun effet indésirable lié à cet acte n’est attendu. Des prélèvements de gouttes de sang à niveau de la veine caudale pour mesurer la glycémie des animaux seront aussi nécessaires. Il y aura 8 prélèvements d’une goutte de sang par souris pour un même test. Le prélèvement sanguin à niveau de la veine caudale, sous anesthésie locale, permet de récupérer des quantités minimes de sang pour l’évaluation répétée des paramètres circulants, sans traumatisme et sans douleur. Aucun effet indésirable lié à cet acte n’est attendu.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de la procedure pour prélèvement d'organes pour des analyses post mortem.

Remplacement

L’utilisation des animaux est indispensable avant de proposer cette protéine comme cible thérapeutique, nous devons démontrer son implication in vivo. En effet, seule la suppression de celle-ci dans un modèle in vivo nous assure de son implication dans des conditions physiopathologiques proches de la réalité clinique.

Réduction

Les modèles seront réalisés sur un nombre nécessaire et suffisant d’animaux (120 souris). Ce nombre a été défini afin d’exploiter des résultats statistiquement fiables.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des conditions adaptées à l’espèce avec un enrichissement du milieu. Le protocole expérimental comprend un suivi quotidien des animaux, des indicateurs comportementaux et physiques prédéfinis (état général, prostration, poil hérissé, suivi pondéral de l’animal) seront évalués quotidiennement, et constitueront les points limites de l’expérience (mise à mort de l’animal). Pour éviter toute souffrance de l’animal au cours du protocole expérimental des analgésiques seront donnés. Ce projet s’inscrit ainsi dans une gestion éthique de l’expérimentation animale et est donc en accord avec les réglementations européennes et françaises de bonnes pratiques de laboratoire.

Choix des espèces

Les modèles de diabete de type 2 chez la souris sont connus et utilisés dans la littérature chez la C57BL/6J et les souris KO pour IL34 au niveau du pancréas sont de fond génétique C57BL/6J. Des souris de 4 semaines environ seront utilisées. A cet âge les animaux peuvent être nourris avec un régime riche en graisse sans risque de compromettre leur développement.

39 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux injections d'un antibiotique, le méropénème, puis un prélèvement sanguin par ponction intracardiaque sous anesthésie, suivi d'une mise à mort par dislocation cervicale, pour reconstituer la courbe pharmacocinétique du produit. Le porteur indique que la dose n'est pas toxique et qu'une souris montrant une douleur intense lors de la ponction serait tuée immédiatement. Il affirme que le recours à l'animal est une étape "obligatoire et réglementaire" du développement des médicaments.

Objectifs

L’objectif du projet est de caractériser la pharmacocinétique sanguine du méropénème sur une période de 5h post-injection, après deux administrations intra-péritonéales.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de reconstruire la courbe pharmacocinétique du méropénème sur 24h chez la souris et ainsi d’adapter les fréquences d’administration dans un modèle de pneumonie à CRAb. En effet, la suite cette étude (qui fera l’objet d’un autre projet) sera d’évaluer l’efficacité du méropénème en association avec la rifampicine qui a déjà montré une diminution bactérienne dans les poumons de souris infectées à CRAb dans d’autres études.

Procédures

L’injection du méropénème se fera par voie intra péritonéale par du personnel expérimenté. La dose administrée est non toxique pour les animaux. Les souris seront ensuite soumises à un prélèvement intracardiaque sous anesthésie fixe (kétamine 50mg/kg + xylazine 10mg/kg). La profondeur de l’anesthésie est vérifiée par pression des voutes plantaires. Malgré tout, si l’animal présente un signe de douleur intense lors de la ponction cardiaque (ex : l’animal se recroqueville sur lui-même lors de l’injection), alors il sera mis à mort immédiatement par dislocation cervicale.

Impact sur les animaux

Après l’injection du méropénème, les animaux seront observés sur la totalité de l’étude (jusqu’à 5h). Par ailleurs, il s’agit d’une inoculation sans infection et d’une dose non toxique. Les prélèvements sanguins par ponction intracardiaque auront lieu sous anesthésie fixe de kétamine (50 mg/kg) et xylazine (10mg/kg), administrée par voie IP. La méthode de mise à mort sera appliquée par dislocation cervicale après exsanguination par une ponction cardiaque.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort 5h après le début de l’expérience

Remplacement

Dernièrement, des études in vitro et in vivo ont démontré une activité intéressante de la rifampicine chez Acinetobacter baumannii multi résistants (en fonction des résistances). Or, cet antibiotique ne peut être administré en monothérapie à cause de la sélection de mutants qu’il génère. Une des dernières lignées thérapeutiques serait de l’associer à un carbapénème (ici le méropénème) pour lutter contre ces infections à CRAb. La mesure de l’efficacité de ces molécules ne peut se faire sans avoir recours au modèle animal ce d’autant que certains échecs de traitement ne peuvent être anticipés autrement. Pour l’heure, le recours à des animaux est une étape obligatoire et règlementaire dans le développement de molécules à visée thérapeutique.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire pour répondre aux hypothèses et permettre une analyse statistique robuste a été réduit à 3 par groupe grâce à l’expérience acquise lors d’études précédentes.

Raffinement

Un gros travail bibliographique a été réalisé en amont de cette étude afin de s’assurer que la dose utilisée ne soit pas toxique pour les animaux. Il s’agira d’une étude sans infection où aucune toxicité n’est attendue. De plus un enrichissement du milieu (jouets en plastique, igloos en carton) sera utilisé et une surveillance accrue sera également réalisée pour cette étude. Des critères d’arrêts de l’étude ont été définis afin d’assurer le bien-être des animaux.

Choix des espèces

Les souris Balb/c représentent classiquement un des modèles de choix pour l’évaluation de la pharmacocinétique. D’autre part, il s’agit de l’espèce utilisée pour la mise au point du modèle d’infection pulmonaire à Acinetobacter baumannii dans d’autres projets. Souris de 8 semaines de façon à avoir un poids corporel d’environ 20-22g (même poids que pour les précédentes études).

265 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses de glycogénoses de type I ou III, elles suivent trois mois un régime induisant une fibrose du foie, avec prélèvements sanguins mensuels, avant une chirurgie de perfusion du foie menée sous anesthésie sans réveil. Le porteur indique que ces souris risquent des hypoglycémies pouvant être fatales, contrôlées par une surveillance et des apports de glucose. Il affirme que ces tumeurs et cette pathologie hépatique ne peuvent se reproduire en culture cellulaire et exigent l'"organisme en entier".

Objectifs

Le carcinome hépatocellulaire est le cancer primitif du foie le plus fréquent. Son développement est souvent associé à une accumulation de graisses dans le foie (stéatose), qui peut évoluer vers une une cirrhose du foie. Cependant, dans certains cas, ces tumeurs se développent en absence de signe de fibrose (accumulation de fibres de collagènes) ou de cirrhose, en particulier dans des maladies métaboliques comme l’obésité. De façon intéressante, le développement de tumeurs hépatiques est aussi observé chez les patients atteints de glycogénose de type I (GSDI) ou de type III (GSDIII), deux maladies métaboliques rares. Dans ces deux pathologies, une perte ou une diminution significative de la production de glucose par l’organisme entre les repas ou lors de période de jeûne mène à des hypoglycémies (faibles taux de sucres dans le sang) et à l’accumulation de glycogène (stock de sucre) dans le foie menant à des foies anormalement gros chez le nouveau-né. Les hypoglycémies peuvent entrainer des convulsions, voir un coma ou être fatales en l’absence d’un contrôle très précis de l’alimentation des patients (apport régulier de sucres à digestion lente ou un resucrage rapide lors d’une baisse importante de la glycémie). Ces maladies se caractérisent aussi par le développement de complications hépatiques importantes, avec en particulier le développement de tumeurs hépatiques. De façon intéressante, la comparaison de ces deux maladies a montré des différences importantes de la progression tumorale, avec la présence ou l’absence de graisses dans le foie, associée ou non à une inflammation du foie et d’une fibrose. Dans ce projet, nous caractériserons le rôle de la réaction inflammatoire et du développement de la fibrose qui sont classiquement associés à l’apparition de tumeurs hépatiques. En effet, les cellules immunitaires jouent un rôle central dans le développement inflammatoire et tumoral. Pour cela, nous caractériserons l’environnement immunitaire des foies de souris atteintes de GSDI ou de GSDIII, en comparaison avec des souris saines (contrôles). Les différentes cellules du foie seront isolées et purifiées à un stade précoce de la maladie, avant le développement tumoral. Ce projet devrait permettre de mieux définir les mécanismes moléculaires du développement tumoral en lien avec la présence ou non d’inflammation et de fibrose hépatique.

Bénéfices attendus

A terme, ce projet devrait permettre de mieux caractériser l’importance de la réaction immunitaire et l’initiation du développement de fibrose dans le développement de la pathologie hépatique et la tumorigenèse dans le cadre de deux maladies métaboliques que sont la glycogénose de type I et la glycogenénose de type III. La comparaison de ces deux pathologies pourra aussi éclaircir les mécanismes moléculaires impliqués dans la tumorigenèse hépatique liée à l’obésité ou d’autres maladies métaboliques.

Procédures

Les animaux atteints de GSDI ou GSDIII seront soumis pendant 3 mois à un régime connu pour induire une fibrose hépatique. Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles seront réalisés en veine submandibullaire tous les mois. En fin d’étude, les animaux subiront une chirurgie sans réveil avec perfusion du foie pour dissocier et isoler les différentes cellules du foie qui doivent être ensuite analysées.

Impact sur les animaux

Ce projet concerne deux pathologies caractérisées par le développement d’hypoglycémies lors de jêunes courts (entre les repas) et par des atteintes hépatiques menant au développement de tumeurs du foie. Nous disposons de modèles de souris viables atteintes de GSDI et de GSDIII et qui reproduisent toute la pathologie hépatique observée chez l’homme. Sans contrôle nutritionnel strict, les hypoglycémies peuvent être fatales et mener à la mort. Afin d’éviter la mort des animaux atteints de GSDI, la délétion du gène qui est muté chez les patients a été induite uniquement dans le foie des souris, ce qui permet d’éviter les hypoglycémies au cours d’un jeûne grâce à la production de glucose par les reins et l’intestin. Cependant, ces souris peuvent développer des hypoglycémies car elles ne peuvent pas utiliser leur stock de sucres accumulé dans le foie. La connaissance du modèle animal a permis de définir des points limites, en contrôlant les risques d’hypoglycémies. Pour cela, des croquettes sont accessibles aux souris directement dans la cage pour leur éviter la perte d’énergie nécessaire pour atteindre les mangeoires. De plus, dès qu’un animal ne réagit pas à un stimulus, il est injecté avec une solution de glucose (sucre), ce qui permet d’augmenter instantanément sa glycémie. Les souris atteintes de GSDIII présentent des glycémies plus faibles que les souris contrôles mais ne développent pas d’hypoglycémie fatale car elles sont capables de produire du glucose par une autre voie que la dégradation des stocks de glycogène du foie. Ces souris sont invalidées pour le gène muté chez les patients dans tous les tissus ; elles présentent donc aussi une accumulation de glycogène au niveau des muscles, entrainant une faiblesse musculaire mais qui n’a pas d’impact sur la mobilité des souris. Même si aucun phénotype musculaire délétère n’a été rapporté à l’âge de 3 mois, de la nouritture est aussi accesible directement dans la cage afin de limiter les efforts musculaires pour atteindre les mangeoires. Ces deux modèles de souris développent autour de 15 mois des tumeurs hépatiques ce qui ne constitura pas un point limite dans ce projet puisque les procédures seront limitées à 3 mois.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement du foie par une méthode éthiquement autorisée. Les cellules immunitaires du foie seront isolées pour des études moléculaires afin de caractériser leur implication dans le développement de la pathologie hépatique des glycogénoses de type I et de type III.

Remplacement

Aucune approche en culture cellulaire ne permet de développer les tumeurs et les caractéristiques de la pathologie hépatique des glycogénoses. Notre étude nécessite donc de travailler sur l’organisme en entier pour conserver le développement de ces tumeurs qui requière un dialogue complexe, entre divers types de cellules hépatiques, mais aussi avec d’autres organes du système immunitaire.

Réduction

Le nombre de souris a été calculé au plus juste à partir des connaissances des pathologies étudiées, des modèles animaux, et du métabolisme, mais aussi des résultats d’études précédentes ayant permis de valider la preuve de concept. Afin de pouvoir faire une analyse statistique, des groupes de 10 souris seront analysés. Au total, ce projet réalisé sur 3 ans nécessitera l’obtention de 265 souris (mâles ou femelles) transgéniques et contrôles, sans compter les souris d’élevage qui ne développent pas de pathologie. Un lot d’animaux sera dédié à la validation de l’isolement et la purification des cellules immunitaires obtenues après perfusion de foie et cytométrie de flux. Le nombre exact d’animaux atteints de GSDI ou GSDIII sera ajusté après l’étude de ce premier lot d’animaux en comparaison avec des souris non malades.

Raffinement

Afin d’éviter la mort précoce des animaux atteints de GSDI, la pathologie a été induite uniquement dans le foie des souris ; ceci permet d’éviter les hypoglycémies au cours d’un jeûne long grâce à la production de glucose par les reins et l’intestin. La connaissance des modèles animaux a permis de définir des points limites, en contrôlant les risques d’hypoglycémies et en limitant les efforts des souris pour trouver de la nourriture. Pour cela, des croquettes sont accessibles aux souris directement dans la cage. Un suivi de glycémie sera aussi réalisé si un animal est retrouvé prostré dans une cage, et ne répondant pas ou peu au stimulation du zootechnicien. En cas d’hypoglycémie (glucose inférieur à 30-40 mg/dL), la souris sera injectée avec une solution de glucose et une partie de sa cage sera placée sur une plaque chauffante afin de maintenir sa température corporelle. Les souris seront hébergées par groupe, dans un milieu enrichi pour favoriser la nidation et des morceaux de bois seront ajoutés car la nourriture utilisée pour induire la fibrose est riche en graisses et est molle. L’ajout de graisse à cette nourriture permet d’éviter la perte de poids des animaux. Les animaux seront pesés de façon hebdomadaire pour suivre leur prise de poids. De plus, l’état de bien-être sera évalué quotidiennement par l’observation des signes physiologiques (perte de poids, aspects du pelage, mouvement/posture de la souris, morsures...). En cas de petites plaies causées par les souris, une crème à base de teintures mères et d’huiles essentielles naturelles aux propriétés cicatrisantes et antispetiques sera systématiquement appliquée par les zootechniciens en charge du suivi du bien-être animal. Les souris seront mises à mort à la fin du protocole ou lors de l’atteinte d’un point limite défini dans le projet selon les méthodes autorisées par la législation. Avant la chirurgie réalisée pour prélever le foie, les souris sont traitées avec un analgésique pour éviter la douleur liée à la perfusion du foie. La chirurgie est réalisée sous anaesthésie profonde, et l’animal est mis à mort sans réveil.

Choix des espèces

Souris (Mus musculus) En ce qui concerne la production de glucose par l’organisme, les études réalisées sur des vertébrés inférieurs tels que le poisson montrent que les régulations observées ne sont pas les mêmes que chez les mammifères. Les expériences seront donc réalisées avec des modèles animaux dont les systèmes de régulation sont semblables à l’homme et qui reproduisent toute la pathologie hépatique observée chez les patients. Par ailleurs, le modèle murin est compatible avec une étude en laboratoire en raison de sa petite taille, de sa manipulation aisée et des nombreux outils d’analyse disponibles (anticorps, kits biochimiques…). Les protocoles seront réalisés avec des souris adultes âgées de 3 mois.

8 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie d'environ 2 h 30 sous anesthésie pour mettre en place une anse intestinale, puis est euthanasié pour prélever l'intestin, afin de tester des acides aminés encapsulés dans l'alimentation du porcelet au sevrage. Le porteur indique un risque de douleur abdominale, de déhiscence de la plaie et de péritonite. Il présente les bénéfices attendus d'abord pour la croissance des porcs et pour les éleveurs, la filière et le consommateur.

Objectifs

Le sevrage précoce et brutal des porcelets tel que réalisé dans la majorité des élevages à travers le monde est une période à risque pour la santé des porcelets. En effet, les porcelets sont sevrés généralement entre 3 et 4 semaines, un âge où leurs systèmes digestif et immunitaire sont encore immatures. Le développement de solutions nutritionnelles a depuis de nombreuses années mobilisé les acteurs de l’alimentation animale et de la recherche pour accompagner la démédicalisation du sevrage des porcelets. Parmi ces solutions nutritionnelles, celles ciblant le microbiote digestif et la production de métabolites bactériens d’intérêt peuvent limiter la dysbiose et l’inflammation digestive résultant du sevrage et pouvant générer des troubles digestifs. Les acides aminés (AA), nutriments essentiels à la croissance et à la santé des porcs, sont aussi des nutriments pour les micro-organismes présents dans le tube digestif. La fermentation de certains AA par les micro-organismes produit des métabolites exerçant des propriétés antiinflammatoires, trophiques, antioxidantes, etc. sur la muqueuse digestive. L’objectif général de ce projet est d’évaluer l’intérêt d’apporter dans l’alimentation du porc des AA libres et encapsulés pour ne pas être absorbés par l’intestin grêle et être disponibles pour produire, par fermentation, des métabolites dans les parties distales du tube digestif. Des effets positifs de ces métabolites sur la physiologie et les défenses intestinales et in fine sur la santé du porcelet au sevrage sont attendus. Les questions de recherche sont : 1-L’identification de métabolites d’intérêt et de leurs AA précurseurs exerçant des effets sur la fonction de barrière de l’épithélium intestinal in vitro et des effets antiinflammatoires et immunorégulateurs sur la muqueuse digestive in vivo (anses intestinales isolées et chez le porc). 2-La caractérisation de l’enveloppe lipidique garantissant la délivrance des AA précurseurs sur le site de fermentation (intestin distal). Les anses intestinales reprises dans le présent document concernent la première question. Les autres objectifs sont présentés au lecteur afin de lui fournir tout le contexte de l’étude.

Bénéfices attendus

Outre d’être des nutriments pour l’animal, les acides aminés (AA) sont aussi des nutriments pour le microbiote digestif. Certains de ces acides aminés vont modifier la composition du microbiote et leur fermentation par ce microbiote produit des métabolites bactériens qui peuvent exercer des effets bénéfiques sur la physiologie et les défenses intestinales. Le projet vise à identifier, pour le porc, des métabolites et les AA précurseurs d’intérêt ainsi que la réponse du tissu intestinal et du microbiote digestif en présence des AA ou des métabolites des AA, à caractériser la matrice AA/capsule lipidique qui permet la délivrance des AA précurseurs dans les parties basses de l’intestin et de réaliser un essai in vivo en conditions d’élevage contrôlées afin de montrer les effets favorables de l’apport d’AA encapsulés sur la santé et la croissance des porcelets en période de post sevrage. À court terme des connaissances scientifiques vont être générées et feront l’objet de publications. Dans un second temps il y aura : Bénéfice pour la santé des porcs et de manière plus générale pour leur bien-être (moins de trouble intestinaux) ; Bénéfice en terme de croissance pour les porcs bénéficiant des ces AAs (croissance optimisée) ; Bénéfice pour les éleveurs de porcs (des porcs plus sains qui grandissent mieux) ; Bénéfice pour le consommateur (une viande de qualité accrue encore plus sûr en terme microbiologique) et Bénéfice pour l’industriel

Procédures

Anesthésie générale et chirurgie de mise en place d’une anse intestinale : tous les animaux du projet, 1 chirurgie par animal, sur animaux anesthésiés et sous traitement analgésique, durée envison 2H30. Prise de sang : Un tube de 10 mL sur tous les anx du projet, 2 fois/porc (le jour de l’anesthésie pour la chirurgie et 48H après), sur animaux anesthésiés, 2 minutes

Impact sur les animaux

Suite à l’intervention, les animaux pourraient ressentir une douleur abdominale malgré l’analgésie. Ils sont donc susceptibles d’être apathiques, prostrés et de ne pas s’alimenter. Exceptionnellement, on pourrait avoir une déhiscence de plaie (rupture des sutures cutanées), une infection sur la ligne de suture ou une perméabilité de la suture termino-terminale de l’intestin qui engendrerait une péritonite. L’imperméabilité de la suture est vérifiée après sa réalisation.

Devenir

Le projet est de réaliser un modèle animal pour tester finalement l’AA préalablement sélectionné sur organoide intestinal, le modèle est celui des anses intestinales qui nécessite une chirurgie. Les animaux à la fin de la procédure seront tous euthanasiés pour réaliser les prélèvements d’intestins afin d’analyser l’expression de transcrits associés à la réponse immune intestinale et de déterminer la composition du microbiote intestinal et le métabolome de contenus digestifs par résonnance magnétique nucléaire et par spectrométrie de masse.

Remplacement

Les AAs ont été sélectionnés et évalués au préalable en utilisant des organoïdes porcins. Toutefois les organoïdes (uniquement constitués de cellules épithéliales) ne peuvent pas remplacer totalement les anses ligaturées qui se rapprochent beaucoup plus de la réalité (nombreux types cellulaires, apport sanguin et lymphatique…). Les anses qui peuvent être réalisées en grand nombre chez un même animal (>10 dans le jéjunum) permettent de limiter le nombre d’animaux utilisés par rapport à des approches plus conventionnelles.

Réduction

Ce modèle d’anses intestinales permet d’évaluer l’impact de l’AA sélectionné sur la muqueuse intestinale de façon précise et ciblée (espace restreint, sans transit). Nous pouvons ainsi plus facilement tester le bienfait de l’acide aminé sur la muqueuse intestinale et le microbiote porcin. Le modèle animal d’anses instestinales permettra de tester un acide aminé (2 « boudins ») versus un témoin sur 4 animaux. Le nombre d’animaux et le nombre de replicats (boudins) par animal est calculé de facon à avoir une représentativité statistique suffisante pour réaliser un test non paramétrique pour l’analyse de l’expression génique.

Raffinement

Les expérimentations seront menées à bien selon le principe des 3R. Les porcs seront hébergés par 2 afin d’éviter un isolement et pour laisser libre court à leurs interactions sociales dans une case dont la température ambiante sera contrôlée (25 ± 2 °C, adaptée à l'âge des animaux). Ils auront à disposition des chaines ou jouets suspendus pour machouiller et un ballon. Une surveillance bi-quotidienne des animaux sera mise en œuvre afin de veiller à leur bien-être. Les animaux seront sous anesthésie générale avec ventilation mécanique assistée et monitoring de paramètres physiologiques (température, saturation en oxygène, fréquence cardiaque). Un analgésique (buprénorphine) sera administré avant même le début de la chirurgie et le traitement analgésique sera continu sur la période post-opératoire. Les animaux seront manipulés dans le calme. Les deux animaux de chaque journée seront choisis comme étant des partenaires sociaux d’un même groupe. Pendant la semaine d’acclimatation au nouvel établissement, les animaux seront familiarisés à leurs soigneurs par l’administration de récompenses sucrées (type fraise tagada). Pendant le suivi post-opératoire, les visites seront plus fréquentes avec un passage en soirée.

Choix des espèces

Le porc est l’espèce cible du projet. Les animaux auront entre 28 et 40 jours d’âge. À ce stade ; les animaux péseront entre 8 et 15 kg, ce qui facilitera leur manipulation, la chirurgie et le suivi post-opératoire.

860 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une ou deux chirurgies cérébrales d'environ une heure sous anesthésie, puis sont mises à mort deux à trois semaines plus tard pour prélever leur cerveau, afin d'étudier les circuits entre le télencéphale basal et le bulbe olfactif. Le porteur décrit une perte de poids et une gêne liée aux sutures dans les jours suivant la chirurgie. Il reconnaît ne pouvoir prévoir le nombre d'expériences ni fixer une hypothèse statistique et relie ce travail exploratoire à un possible signe précoce de la maladie d'Alzheimer.

Objectifs

Des neurones localisés dans les noyaux cholinergiques du télencéphale basal projettent dans le bulbe olfactif, le premier relai de traitement de l’information sensorielle olfactive dans le cerveau. Ces neurones auraient pour fonction de moduler l’activité du bulbe olfactif, et donc les performances olfactives, en fonction du contexte comportemental (par exemple les conditions d’attention, de stress ou d’éveil) ou métabolique (par exemple l’état de satiété) de l’animal. Cependant, les projections en provenance du télencéphale basal sont massives et diverses et toutes leurs cibles et actions dans la bulbe olfactif n'ont pas été caractérisées. Il y a en outre dans le télencéphale basal plusieurs populations de neurones cholinergiques ou GABAergiques et chacune a probablement des cibles spécifiques dans le bulbe olfactif. Les objectifs de ce projet sont : 1) identifier les sous-populations de neurones du télencéphale basal qui projettent dans le bulbe olfactif, 2) déterminer leurs cibles dans le bulbe olfactif, 3) évaluer l’impact de cette innervation neuromodulatrice sur l’activité du bulbe olfactif.

Bénéfices attendus

Les voies de neuromodulation des circuits olfactifs et les conditions de leur mise en jeu in vivo ont été peu étudiées. Pourtant, la modulation de l’odorat en fonction du contexte comportemental et physiologique de l’animal a une importance considérable dans la vie des animaux qui dépendent de leur odorat pour survivre. Chez l’homme, la récente épidémie de Covid nous a rappelé combien les troubles de l'olfaction peuvent affecter la vie quotidienne des patients. Par ailleurs, les troubles de l’olfaction sont parmi les premiers symptômes de la maladie d’Alzheimer et d'autres neuropathologies dégénératives, apparaissant des années avant les symptômes cognitifs. Le lien entre odorat et Alzheimer n’est pourtant pas clairement établi. Il y a en revanche un consensus sur le fait que les voies neuromodulatrices cholinergiques dégénèrent précocement dans la maladie d’Alzheimer. Décrire chez l’animal l’organisation et l’influence des noyaux cholinergiques sur les circuits olfactifs devrait renforcer l’idée que les troubles olfactifs chez l’homme doivent être considérés comme un signe précoce annonciateur d’une possible maladie neurodégénérative.

Procédures

Les animaux subiront une intervention chirurgicale, d'une durée d'environ 1 h, ou deux interventions chirurgicales à deux semaines d'intervalle d'une durée d'environ 1 h chacune. Chaque chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale et analgésie profonde.

Impact sur les animaux

Les chirurgies entrainent inévitablement un stress et éventuellement des douleurs chez la souris, même si tout est mis en œuvre au moment de la chirurgie pour les réduire. Une perte de poids est souvent constatée les jours suivant la chirurgie mais l’animal récupère son poids initial en 3-4 jours. Les fils de suture peuvent aussi entrainer une gêne ou des démangeaisons qui poussent l’animal à se gratter et, très rarement, à endommager sa cicatrice. Cette gêne disparait également en quelques jours.

Devenir

Tous les animaux entrant en procédure sont mis à mort 2 à 3 semaines après le début de la procédure afin de prélever leur cerveau. Des expériences d'électrophysiologie seront alors réalisées sur des tranches de bulbe olfactif ou des expériences d'immunohistochimie et/ou microscopie sur des tranches de télencéphale basal ou de bulbe olfactif.

Remplacement

Les expériences de ce projet ont pour but d'étudier les voies de modulation des circuits olfactifs chez la souris. Ces voies impliquent des aires cérébrales éloignées les une des autres qui sont semblables à celles trouvées dans le cerveau humain. Ces circuits sont impossibles à reconstituer avec des techniques de remplacement de type culture cellulaire et doivent être intacts pour pouvoir être étudiéś. Ils sont impossibles à modéliser numériquement car leur organisation est encore méconnue. Nous utiliserons des souris car c'est dans cette espèce que les outils d'ingénierie génétiques sont les plus développés. De plus, de nombreux résultats démontrent que les découvertes chez la souris peuvent être utilisées comme outils précliniques chez l'homme.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé sur la base de nos études antérieures menées sur le même sujet, avec la même stratégie et les mêmes approches expérimentales. Il s’agit ici de décrire des propriétés de circuits de neurones qui n’ont jamais été étudiées auparavant. Une série de tests expérimentaux sera réalisée pour caractériser dans le détail les propriétés et fonctions de ces circuits neuronaux. La nature et le nombre de ces expériences ne peuvent pas être anticipée car ils dépendront de l'originalité de ce qui sera découvert. Par conséquent, une étude statistique prédictive pour estimer le nombre d’animaux qui sera nécessaire pour tester une hypothèse énoncée à l’avance n’est pas envisageable ici. Notre stratégie pour réduire le nombre d’animaux est: (i) de faire des expériences pilotes sur un petit nombre de souris pour sélectionner des lignées transgéniques d’intérêt (ii) d’analyser les résultats au fur et à mesure et d’arrêter les expériences dès qu’un résultat original a été établi ou observé dans un nombre suffisant de cellules (en général autour de 10), (iii) de baser notre approche expérimentale sur une manipulation sélective de neurones ce qui réduit le nombre d’animaux nécessaires pour identifier et caractériser des circuits synaptiques.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des animaleries dont le fonctionnement a été conçu pour maximiser le confort et limiter la souffrance des animaux. En particulier, les souris sont hébergées en cohorte, elles font l’objet d’observations régulières et l'enrichissement des cages est systématique (bâton à ronger, matériaux de nidification). Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie pré et post-opératoire, à température stable et contrôlée grâce à un tapis chauffant thermostaté. Les yeux sont protégés avec du gel pendant la chirurgie. L’état de santé des animaux est surveillé quotidiennement après la procédure chirurgicale et des points limites ont été établis permettant de soustraire l'animal à la souffrance.

Choix des espèces

La diversité neuronale est telle dans le cerveau que les souris transgéniques sont nécessaires pour identifier (grâce à des marqueurs fluorescents par exemple) et manipuler (grâce à l’optogénétique par exemple) des populations neuronales spécifiques. Les lignées de souris transgéniques qui seront utilisées dans ce projet permettent toutes ces expériences sur des populations de neurones déterminées. L’utilisation de ces modèles transgéniques simplifie l’interprétation des résultats et permet in fine de réduire le nombre d’animaux utilisés. Animaux utilisé à partir de 3 semaines, c'est à dire assez âgés pour pouvoir être placés sur un appareil stéréotaxique.

220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Injectées avec un virus dès l'âge de trois à cinq jours, ces souris transgéniques subissent des enregistrements cardiaques sous anesthésie puis une stimulation intracardiaque chirurgicale, suivie systématiquement de l'euthanasie et du prélèvement du cœur. Le porteur indique qu'il n'attend pas de phénotype sévère car les animaux ne sont pas maintenus jusqu'aux signes cliniques de la maladie. Il affirme que le cardiomyocyte adulte ne peut se cultiver et que l'efficacité de la thérapie ne peut s'évaluer que sur l'animal.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont de mettre au point une nouvelle approche thérapeutique pour le traitement de troubles du rythme cardiaque héréditaires pouvant être mortels. Nous testerons l'effet de différents traitements (pharmacologiques et géniques) dans des lignées de souris transgéniques reproduisant la pathologie en étudiant leurs effets sur les arythmies déclenchées par stimulation électrique du cœur.

Bénéfices attendus

L'étude de ces modèles murins nous permettra de mieux comprendre la physiopathologie des maladies liées à la conduction cardiaque et à ses troubles. Nous espérons définir de nouvelles approches thérapeutiques pour le traitement de ces arythmies pouvant être mortelles chez l'Homme et pour lesquelles nous ne disposons pas de traitement efficace.

Procédures

La totalité des 220 animaux de ce projet subiront la procédure expérimentale "Étude des effets de nouveaux traitements sur la susceptibilité aux arythmies de 2 modèles murins de troubles du rythme cardiaque". Cette procédure expérimentale se déroule en 4 interventions qui se succèderont chez chaque animal: 1) Injection des virus à l'âge de 3 à 5 jours: quelques secondes par animal. 2) Enregistrement de l'échocardiographie sous anesthésie légère à l'âge de 9 semaines pour une lignée et de 23 semaines pour l'autre lignée: 10 minutes par animal. 3) Enregistrement de l'ECG de surface sous anesthésie légère à l'âge de 9 semaines pour une lignée et de 23 semaines pour l'autre lignée: 10 minutes par animal (40 minutes par animal pour le groupe recevant l'antiarythmique). 4) Stimulation endocavitaire sous anesthésie (unique procédure chirurgicale du projet): 40 minutes par animal (1 heure par animal pour les lots recevant l'antiarythmique) suivie systématiquement par l'euthanasie de l'animal.

Impact sur les animaux

Le phénotype des souris génétiquement modifiées utilisées ne sera pas considéré comme dommageable car aucune ne sera maintenue jusqu’au stade où apparaissent les signes cliniques des modèles concernés. Les potentiels effets néfastes de l'injection d'un AAV dans la circulation systémique d'une part, et de la surexpression de la GFP dans le cœur des souris d'autre part, seront évalués par comparaison des groupes recevant l'AAV-GFP avec les groupes recevant du sérum physiologique. On peut s’attendre à ce qu'il n'y ait pas de différence notable sur les paramètre ECG et échographiques entre les différents groupes au vu de résultats obtenus précédemment. L'introduction de la sonde de stimulation intra-cardiaque dans le ventricule droit de la souris via la jugulaire comporte un risque pour l'animal, risque lié à l'anesthésie et à la chirurgie.

Devenir

A l'issue de l'unique procédure de ce projet, toutes les souris seront euthanasiées par une injection létale dans le but de réaliser des analyses ultérieures. Les cœurs seront alors prélevés et congelés immédiatement dans l’azote liquide pour les expériences de biochimie, de biologie moléculaire et d'immunohistologie.

Remplacement

Le myocyte cardiaque adulte ayant atteint un état de différenciation terminale, il ne se divise pas, il ne peut être conservé en culture primaire plus de quelques jours et il ne peut être transfecté par des agents de transfection non viraux. D'autre part, aucun modèle d'expression in vitro ne reproduit les conditions physiologiques spécifiques du cardiomyocyte (expression de protéines spécifiques dans des domaines cellulaires spécifiques). De ce fait, l'utilisation d'animaux ne peut être remplacée par des modèles d'expression in vitro ou ex vivo. D'autre part, les lignées murines étudiées dans ce projet constituent d'excellents modèles pour tester de nouvelles thérapies car ces lignées sont plus susceptibles aux arythmies déclenchée électriquement que les souris sauvages. Nous utiliserons cette susceptibilité pour évaluer l'efficacité de notre approche thérapeutique, ce qui ne peut être réalisé que sur des animaux.

Réduction

Dans le but de réduire le nombre d'animaux utilisés, nous utiliserons les contrôles les mieux adaptés et nous n'utiliserons que des préparations virales dont le titre aura été évalué afin d'utiliser la dose minimum efficace dans la transduction in vivo. Nous utiliserons les données acquises sur tous les animaux: mâles et femelles, sauvages et mutés. Les fonds génétiques des souris sauvages et transgéniques sont identiques. Nous injecterons le même virus dans l'ensemble d'une portée. Nous exploiterons toutes les naissances et nous ne ferons pas faire naître d'animaux non nécessaires au projet. En tenant compte de tous ces critères, le nombre total d'animaux de ce projet s'élève à 220 animaux.

Raffinement

Les animaux seront observés tous les jours par les membres qualifiés de l'animalerie et tout comportement anormal sera directement communiqué à la personne responsable du projet. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (6 par cage maximum) et l'isolement est évité au maximum. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire au maximum toute douleur, souffrance ou angoisse que pourraient subir les animaux: enrichissement du milieu (lanières de papier Kraft, maisons ou tunnels en carton), acclimatation d'une semaine avant toute manipulation, hébergement en groupe autant que possible, formation technique des utilisateurs. Afin de réduire au maximum la douleur chez les animaux utilisés, nous injecterons les virus (dilués dans une solution physiologique) par voie systémique, ce qui évite la chirurgie cardiaque lourde liée à une injection intracardiaque. Les caractéristiques physiologiques cardiaques de la maladie seront évaluées par des méthodes non invasives : enregistrements échocardiographiques et électrocardiographiques. Seul l'acte de déclenchement des arythmies nécessite quelques minutes de chirurgie qui sera effectuée sous anesthésie et analgésie.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris pour les raisons générales suivantes : 1) leur développement et leur physiologie sont bien connus. 2) le fonctionnement du système cardiovasculaire est proche de celui de l’Homme (échocardiographie, ECG). 3) de nombreux modèles physiopathologiques sont disponibles et caractérisés. 4) la reproduction rapide de ces rongeurs permet d’obtenir le nombre d’animaux requis pour les analyses statistiques des résultats. 5) la souris est le modèle animal le plus utilisé pour caractériser les vecteurs viraux AAV à tropisme cardiaque que nous allons utiliser. 6) les modèles pathologiques que nous souhaitons utiliser pour nos tests de thérapie génique sont murins. Les AAV seront injectés chez des animaux de quelques jours dans le but de limiter la réponse immunitaire des animaux et de limiter les volumes de virus à produire. De plus, les délais d'expression des AAV étant relativement longs, l'injection à un âge précoce, au lieu d'utiliser des animaux adultes, nous permettra de gagner beaucoup de temps et donc de place dans l'animalerie. L'étude de l'effet potentiellement thérapeutique des virus sera effectuée sur des animaux d'au minimum 9 semaines afin qu'ils aient atteint une taille adulte et que les transgènes soient exprimés.