Procédures modérées

200 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit dans l'abdomen une suspension de toxoplasmes et de cellules de sarcome, puis est tuée par dislocation cervicale 65 à 75 heures plus tard pour récolter le liquide d'ascite riche en parasites, matière première de kits de dépistage de la toxoplasmose. Le porteur reconnaît que des signes de douleur apparaissent au-delà de 60 heures et prévoit une injection d'anti-inflammatoire la veille de la récolte. Il affirme qu'aucun mode de production sur une source non animale n'a pu être validé à ce jour.

Objectifs

La production de suspension de toxoplasmes est utilisée dans la production de kits d’immunoessais associés au diagnostic de la toxoplasmose chez l’Homme. Toxoplasma gondii est un parasite protozoaire dont les hôtes définitifs sont les félidés. Le parasite est toutefois capable d’infecter de nombreuses espèces animales, dont l’Homme, en tant qu’hôtes intermédiaires. La toxoplasmose est une affection alors transmissible de la mère au fœtus et qui peut entrainer des séquelles très invalidantes pour l’enfant. Il est donc primordial de savoir si la mère est protégée en début de grossesse ou sinon d'effectuer un suivi sérologique mensuel au cours de la grossesse. Ainsi, le diagnostic de la toxoplasmose est obligatoire en France dans le cadre du suivi prénatal. Les 4 réactifs de diagnostic concernés par le projet permettent de diagnostiquer les infections récentes ou passées en dosant, dans le sérum des patients, les immunoglobulines dirigées contre la forme proliférative du parasite.

Bénéfices attendus

Les kits de diagnostics concernés par le projet sont basés sur une méthode immuno-enzymatique, reposant sur la capacité d’un anticorps à reconnaître et à se lier spécifiquement à une molécule. Pour assurer la révélation des anticorps dirigés contre les toxoplasmes, ces kits sont composés de toxoplasmes entiers produits sur ascite de souris. Ce mode de production permet une affinité forte et une reconnaissance complète des différents types d’anticorps existants. L’intérêt est de garantir la fiabilité du résultat rendu : un faux résultat (faux positif, faux négatif ou erreur de dosage) rendu par le test dans un laboratoire clinique peut avoir un impact grave sur la santé, le suivi médical et la prise en charge des patients testés avec ces méthodes.

Procédures

- inoculation en intrapéritonéale d’une suspension contenant des toxoplasmes et des cellules sarcomes TG180 - 48 heures après inoculation initiale : injection sous cutanée d’analgésique de type ketoprofene. - 65 à 75 heures après inoculation initiale : mise à mort par dislocation cervicale

Impact sur les animaux

Les souris sont inoculées avec une suspension contenant des toxoplasmes et des cellules sarcomes. Cela provoque la colonisation des cellules sarcomes par les toxoplasmes. Ce dernier étant un parasite intracellulaire strict, il n'est pas agressif pour la souris tant qu'il est dans la cellule et n'a pas de conséquence sur son état sanitaire. Au-delà de 60 heures d’incubation, des signes de douleurs peuvent apparaitre. Après un temps d’incubation compris entre 65 et 75 heures, l’animal est mis à mort et l’ascite des souris est récoltée. Pour diminuer l’impact douloureux du protocole sur l’animal, il est prévu systématiquement, 48 heures après l’inoculation et 24 heures avant la récolte d’ascite, d’induire une analgésie par injection sous cutanée d’un anti-inflammatoire non stéroïdien de type ketoprofene.

Devenir

La nature du parasite inoculé ne peut conduire à une autre issue que l’euthanasie de l’animal à la fin du protocole. Ce protocole, avec une durée d’incubation optimisée, est celui qui réduit au maximum l’impact pour l’animal, tout en garantissant l’objectif du projet.

Remplacement

Pour assurer la révélation des anticorps dirigés contre les toxoplasmes, ces kits sont composés de toxoplasmes entiers produits sur ascite de souris. Ce mode de production permet une affinité forte et une reconnaissance complète des différents types d’anticorps existants. L’intérêt est de garantir la fiabilité du résultat rendu : un faux résultat (faux positif, faux négatif ou erreur de dosage) rendu par le test dans un laboratoire clinique peut avoir un impact grave sur la santé, le suivi médical et la prise en charge des patients testés avec ces méthodes. Ce protocole est le seul mode de production aujourd’hui validé pour garantir les performances requises des kits de diagnostic concernés. Aucun mode de production de ces toxoplasmes sur une source non animale n’a pas pu être validé à ce jour.

Réduction

Après un temps d’incubation compris entre 65 et 75 heures, l’ascite des souris est récoltée en un prélèvement unique sur l’animal euthanasié. Un rinçage de la cavité péritonéale avec 5mL de sérum physiologique est effectué, dans le but de récupérer le maximum de toxoplasmes afin de diminuer le nombre de souris utilisées. De même l’injection couplée de toxoplasmes et de cellules sarcome TG180 permet d’amplifier la production de toxoplasmes et donc de réduire le nombre d’animaux (le toxoplasme étant un parasite intracellulaire strict). Cette méthode optimisée entraine la production d’un volume moyen de 1mL d’ascite très concentré en toxoplasmes par souris de 30g. Le nombre d'animaux utilisés est calculé au plus juste en fonction des besoins de production. La quantité produite par animal est constante et le calcul du nombre d'animaux dépend du volume de produit commandé. Ce nombre d’animaux a été optimisé au fil des années d’expérience et permet d’être ajusté au plus près des besoins. 200 000 souris sont nécessaires sur les 5 années de durée du projet. Ce nombre de souris permettra de produire et de mettre à disposition 20 millions de tests de diagnostic à travers le monde, au service de la santé publique.

Raffinement

Les animaux entrent en production après une période d'acclimatation de 14 jours, de manière à ce qu'ils s'habituent aux conditions d'élevage, limitant ainsi le stress lors des différentes manipulations. Ils sont hébergés sur litière (sciure/lanières de carton) assurant l'enrichissement du milieu et permettant aux souris de faire leur nid. Un tunnel PVC est introduit dans la cage permettant aux souris de répondre à un besoin physiologique de bien-être animal. Un suivi quotidien par cage permet de contrôler l’état sanitaire des souris. De même l’injection couplée de toxoplasmes et de cellules sarcome TG180 permet de limiter la colonisation des cellules de la souris de la 1ère heure à la 60ème heures et donc de diminuer la douleur (le toxoplasme étant un parasite intracellulaire strict). Au-delà de la 60ème heure le toxoplasme libéré dans le péritoine colonise alors les cellules de la souris et devient agressif et des signes de douleurs apparaissent. Pour diminuer l’impact douloureux du protocole sur l’animal, il est prévu systématiquement, 48 heures après l’inoculation et 24h avant la récolte d’ascite, une analgésie par injection sous cutanée d’un anti-inflammatoire non stéroïdien de type ketoprofene.

Choix des espèces

La culture de toxoplasmes a été validée sur souris pour assurer la performance des tests de diagnostic in vitro. Les animaux utilisés ont un poids moyen de 30 g. Après une période d'acclimatation de 14 jours les animaux entrent en production.

2400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur leur est injectée sous la peau, puis elles reçoivent des chimiothérapies et des immunothérapies par voie intrapéritonéale avec un suivi de la tumeur pendant environ deux mois, pour tester comment compenser la perte d'un gène clé de la réponse immunitaire aux cancers du sein et colorectaux. Le porteur décrit une masse tumorale pouvant se nécroser et retient un effectif de 2400 souris qu'il juge nécessaire à une interprétation fiable. Il affirme que l'implication du système immunitaire dans le développement tumoral ne peut être étudiée qu'in vivo.

Objectifs

Les dernières années ont vu l'émergence du concept de l'activation du système immunitaire contre le cancer, qui à son tour détermine le succès à long terme des traitements anticancéreux. Nous allons étudier comment compenser la perte de fonction d’un gène clé dans l’établissement de la mort cellulaire immunogène pour restaurer l’efficacité de la chimiothérapie in vivo. Les modèles expérimentaux in vivo sont les seuls moyens d’approche possibles car la réponse immunitaire n’a pas lieu dans les modèles in vitro ou ex vivo. Ce projet vise à une compensation des défauts associés à la perte de fonction de ce gène, un facteur pronostique négatif pour la réponse aux traitements anti-cancéreux à base d’anthracyclines et oxaliplatine, afin d’orienter la conception de nouvelles stratégies thérapeutiques chez les patients atteint de cancer du sein ou colorectal.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à une compensation des défauts associés à la perte de fonction d’un gène clé dans l’établissement de la mort cellulaire immunogène, un facteur pronostique négatif pour la réponse aux traitements anti-cancéraux à base d’anthracyclines et oxaliplatine, afin d’orienter la conception de nouvelles stratégies thérapeutiques chez les patients atteint de cancer du sein ou colorectal. Nous préconisions que l’accomplissement de ce projet fournira des connaissances sur la régulation de la réponse immunitaire aux cancers pour la mise en place de stratégies thérapeutiques ciblées.

Procédures

Les animaux seront soumis a : - L’injection unique de cellules tumorales en sous cutané sur l’animal anesthésié par inhalation d’isofluorane durant moins d’une minute par animal - L’injection des traitements intra péritonéaux par contention de l’animal vigile : injection unique pour les chimiothérapies et 3 injections pour chacune des immunothérapies durant moins d’une minute par injection par animal - Une contention sur animal vigile permettant le suivi de la croissance tumorale trois fois par semaine pendant environ 2 mois durant moins de deux minutes par animal .

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis a : - Une injection sous-cutanée de cellules tumorales à l’origine du développement d’une masse tumorale entraînant potentiellement la nécrose de la tumeur. - L’injection des traitements cités par voie intrapéritonéale par contention de l’animal vigile (une unique injection pour MTX et CTX et trois injections pour les autres molécules) pouvant induire du stress de courte durée chez l’animal. L’injection de cellules tumorales sera faite sur le dos de l’animal afin de réduire les phénomènes de gêne que peut engendrer la croissance tumorale. La tumeur se développe localement et n’induit pas de métastases ou effets cliniques secondaires. Le suivi sera réalisé sur un à deux mois selon la croissance tumorale.

Devenir

Les souris seront euthanasiées dès l’atteinte des points limites préalablement définis.

Remplacement

La question scientifique ne peut être abordée qu’in vivo car il n’est pas possible d’étudier l’implication du système immunitaire sur le développement du cancer dans des systèmes in vitro.

Réduction

Nous souhaiterons effectuer cette étude sur un total de 2400 souris pour permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Notamment, les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si nous constatons que notre hypothèse n’est pas confirmée par nos résultats expérimentaux. Le modèle choisit est très bien documenté, permettant ainsi de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Nous utiliserons des souris commerciales transgéniques ou non, viables, fertiles, de taille normale et ne présentent pas d'anomalies physiques ou comportementales. Pour l’injection de cellules, les souris seront anesthésiées et recevront 100 µL de PBS contenant les cellules tumorales par voie sous-cutanée le 1er jour de l’expérimentation à l’aide d’une seringue de 1ml dotée d’une aiguille de 25G. Les animaux sont ensuite replacés dans leur cage en position ventrale et sont surveillés jusqu’au réveil Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et/ou tunnels en cartons). Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale. Il assure également une veille scientifique continue, évitant toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques : - Les souris âgées de 6 à 10 semaines seront utilisées dans cette étude afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature. Les paramètres étudiés étant le développement de la masse tumorale après injection de cellules cancéreuses ou l’apparition de lésions cancéreuses induites, une souris juvénile ou trop âgée induirait un biais dans l’expérimentation. Les protocoles expérimentaux d’induction tumorale sont bien établis. - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Nous utilisons principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce.

384 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des ratons sont séparés de leur mère trois heures par jour de J2 à J12, et des rats "démonstrateurs" reçoivent dans une patte un agent inflammatoire provoquant une douleur aiguë ou un œdème persistant deux semaines, pour mesurer par un test de transfert social de la douleur l'empathie liée à un stress néonatal. Le porteur présente ce modèle comme celui d'une prématurité humaine et indique surveiller le bien-être des animaux non-humains. Il affirme qu'aucun modèle in silico ou in vitro ne reconstitue les réseaux neuronaux de l'empathie et de la douleur.

Objectifs

Dans le cadre de l’utilisation d’un modèle animal mimiquant les conséquences d’une prématurité chez l’humain, le but du projet est d’affiner la compréhension de l’impact d’un stress de séparation maternelle précoce (SMP) sur certains processus émotionnels associés à la douleur. L’objectif du projet est donc d’évaluer chez le rat, les conséquences d’une SMP sur les interactions sociales ainsi que sur l’empathie à la douleur à l’aide du test de « transfert sociale de la douleur » qui a été validé dans la littérature comme étant un bon indicateur de l’empathie chez ce dernier.

Bénéfices attendus

Le modèle de séparation maternelle néonatale a permis de décrypter nombre de mécanismes et d’altérations du système nerveux qui sont retrouvés chez les enfants prématurés humains. Dans ce cadre, cette étude permettra de mieux comprendre l’impact d’un stress néonatal non douloureux (i.e. une séparation précoce avec la mère) sur les processus cognitifs et émotionnels associés à la douleur chez un jeune individu encore en pleine maturation durant une période critique de son développement.

Procédures

La moitié des animaux seront soumis au protocole de SMP et seront séparés de leur mère 3 heures par jour du deuxième au douzième jour postanal. Pour le test de transfert social de la douleur, les animaux « démonstrateurs » recevront une injection sur une patte arrière d’agents inflammatoires créant soit une douleur aigue soit une douleur prolongée sous anesthésie générale d’une durée maximale de 5 minutes. Des tests d’évaluation de la douleur (durée de 5 à 10min) et n’induisant pas de stress accru chez l’animal, seront effectués à la suite du test de transfert (test unique d’une durée de 45 min) puis à nouveau 1x/h pendant 4h pour un premier groupe expérimental et 1x/J pendant deux semaines en plus pour le deuxième groupe ainsi que le groupe contrôle. Le nombre total de tests de douleur pour le protocole "douleur aigüe" est de 10 tests. Pour le protocole "douleur prolongée", les animaux sont en plus testés 1 fois par jour durant deux semaines ce qui fait un total de 36 tests.

Impact sur les animaux

La séparation maternelle induit au niveau comportemental une anxiété accrue chez la mère. Les injections du premier agent inflammatoire provoquent une douleur temporaire, qui s’arrêtent spontanément au bout d’une heure, celles du second provoquent un œdème cutané dont la sévérité sera surveillée et qui se résorbe après deux semaines. Les tests d’évaluation de la douleur prévus sont courts (de 5 à 10min) et n’induisent qu’un stress mineur chez l’animal.

Devenir

A la fin de toutes les procédures, les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Les comportements sociaux, l'empathie et la douleur étant des processus intégrés impliquant différentes structures sensorielles, cognitives et émotionnelles, ce projet nécessite l’étude de sujets vivants dotés d’un cortex développé. Il n’existe pas encore de modèles alternatifs in silico ou in vitro capable restaurer les réseaux neuronaux impliqués dans les comportements observés.

Réduction

Le nombre d’animaux est basé sur l’expertise de l’équipe vis-à-vis des différentes procédures et prend en compte les variabilités interindividuelles) pour obtenir des résultats statistiquement significatifs lors des tests utilisés pour évaluer l’impact du stress néonatal de séparation maternelle sur le comportement de contagion à la douleur chez le rat. Le projet évaluera également les différences entre les mâles et les femelles, qui ont été démontrées pour les réponses à la douleur et dans différents modèles de stress périnataux.

Raffinement

Les animaux sont suivis quotidiennement par les zootechniciens de l’animalerie et par les expérimentateurs afin d’être alertés dès les premiers signes de dégradation du bien-être animal en portant une attention particulière à tout changement de l’état général (perte de poids supérieure à 10%, défaut de toilettage, plaie ouverte, blessure) ainsi qu'à l'état comportemental (prostration, dos arqué, réticence au déplacement, léthargie, agressivité, vocalises). Si des changements sont observés, le vétérinaire sera contacté pour prendre la décision adéquate : soins, retrait de l’animal de l’étude ou mise à mort de l’animal. Durant la séparation maternelle, les ratons sont placés sous lampes chauffantes afin d’éviter toute hypothermie. Les injections des produits inflammatoires dans la patte se font sous anesthésie gazeuse afin de limiter tout stress chez l’animal. Le poids des animaux est mesuré hebdomadairement, et quotidiennement suite aux injections. Les tests nociceptifs sont effectués après une semaine d’habituation afin de réduire le stress. L’étude portant sur la douleur, celle-ci ne pourra pas être prise en charge lors des tests comportementaux. Des points limites ont été mis en place pour éviter d’éventuelles souffrance inutiles dépassant le cadre de l’étude.

Choix des espèces

Des études précédentes ayant étant réalisées sur le rat, ce modèle animal sera conservé dans le cadre de ce projet car son comportement est bien connu. Le modèle de séparation a déjà été bien décrit et caractérisé chez cette espèce, permettant ainsi de confirmer la robustesse des résultats obtenus. De plus le modèle chez le rat nous permet de modéliser l’état de développement d’un fœtus lors du 3e trimestre de gestation, puisqu’à la naissance le système nerveux du rat est au même niveau de maturation que celui du fœtus au début du 3e trimestre de gestation. L’étude des comportements complexes comme les comportements sociaux ou l’empathie implique que l’étude porte sur une espèce qui possèdent les fonctions et capacités cognitives nécessaire à l’expression de ces derniers, ce qui est le cas chez le rat. Afin de mesurer l’impact à long terme de cette séparation maternelle, les tests comportementaux seront ensuite effectués à l’âge adulte. Les animaux seront donc utilisés entre 2 jours et 2 mois dans cette étude.

316 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules leucémiques leur sont transplantées par voie intraveineuse, puis elles reçoivent trois injections de molécules ou d'anticorps, pour tester de nouveaux traitements de la leucémie aiguë lymphoblastique, un cancer surtout pédiatrique. Le porteur décrit un point limite tardif, l'animal cessant de s'alimenter et présentant une pâleur liée à l'aplasie avant d'être euthanasié. Il indique avoir testé les composés in vitro au préalable et affirme que les études précliniques exigent le modèle murin.

Objectifs

La leucémie est un cancer des cellules précurseurs du tissu hématopoïétique caractérisé par un blocage de maturation et une prolifération excessive des cellules appelées blastes. La Leucémie Aiguë Lymphoblastique (LAL) concerne les cellules de la lignée issue du progéniteur lymphoïde. Elle représente environ 1,5 nouveau cas pour 100000 habitants par an, soit environ 1000 nouveaux cas par an en France. Elle se déclare en majorité chez l’enfant de 2 à 5 ans, 75% des malades ont moins de 18 ans, et représente 30% des cancers de l’enfant. La LAL est une maladie hétérogène qui touche les précurseurs des lymphocytes T ou B dans respectivement 25% et 75% des cas. Nous disposons de plusieurs modèles in vitro et in vivo incluant des xénogreffes de LAL-T et LAL-B issues de patients. Malgré les améliorations du traitement des LAL, les taux de rechute, de l’ordre de 25%, restent élevés avec des chances de survie faible, inférieures à 30%. Ainsi, pour réduire l’intensité de la chimiothérapie et traiter avec succès les patients en rechute, il est encore nécessaire de développer de nouvelles thérapies.

Bénéfices attendus

En effectuant des expérimentations in vitro sur nos modèles de leucémies (culture cellulaire), nous avons identifié trois nouveaux composés qui bloquent la prolifération des cellules cancéreuses. Après avoir validé in vitro leurs efficacités, nous souhaitons maintenant tester leurs efficacités sur nos modèles murins in vivo lors d’études précliniques. Les bénéfices attendus du projet concernent donc la découverte de nouvelles drogues et stratégies thérapeutiques dans le traitement des Leucémies Aiguës Lymphoblastiques (LAL).

Procédures

Les animaux seront soumis à des transplantations de cellules leucémiques par des injections intra-veineuses (I.V.) (une seule injection est prévue par souris, durée de 20 minutes). Après la transplantation, des injections intra-veineuses (I.V.) d’une molécule chimique ou d’un anticorps agoniste ou d’immunoliposomes (3 injections par souris sont prévues, à J+15, J+20, J+25 , durée par injection de 20 minutes). Un prélèvement de sang à partir de la veine de la queue (un seul prélèvement par souris, durée de 15-20 minutes) sera réalisé à J+35 jours après la transplantation.

Impact sur les animaux

Les animaux vont développer des cancers (leucémies), avec une multiplication proliférative des cellules leucémiques lymphoblastiques dans la moelle osseuse, le sang et la rate des animaux. Un point limite est fixé, il correspond à un état de fatigue de l’animal qui ne s’alimente plus et qui présente une couleur pâle de la peau au niveau des oreilles et aux extrémités des pattes avants et arrières. Quand l’animal présente des signes de souffrance, n’explore plus son environnement, ne s’alimente plus, est replié sur lui-même, montre des signes d’aplasie, et couleur pâle de la peau au niveau du museau et des oreilles, cela veut dire qu’il y a une aplasie trop importante consécutive au développement de la leucémie qui a alors atteint un stade trop avancé. Dès que ce point limite est observé, l’animal sera euthanasié.

Devenir

Dès que les souris développent les symptômes de la leucémie (point limite identifié), elles seront anesthésiées avec l’Isofluran, suivi d’une mort par dislocation cervicale.

Remplacement

Pour remplacer des modèles animaux, il est parfois possible de travailler sur des cellules ou des tissus (in vitro). Le recours aux modèles in vitro doit être l’objectif du chercheur si son expérimentation le permet. La molécule chimique, l’agoniste et les immunoliposomes que nous allons tester dans ce projet préclinique ont d’ores et déjà été testé in vitro sur des méthodes alternatives ; sur des cellules primaires isolées de patients, ainsi que sur des lignées cellulaires. Ceci nous permet de limiter le nombre des animaux utilisés dans ce projet.

Réduction

Dans ce projet, nous allons diminuer le nombre d’animaux utilisés à des fins de recherche par : la limitation aux seules expériences considérées comme absolument indispensables. S’il est essentiel d’utiliser le plus petit nombre d’animaux possibles, il faut néanmoins éviter que cet effort de réduction nuise à la fiabilité des résultats. Une réflexion biostatistique a alors été intégrée à la construction de ce projet. Pour les courbes de survie, nous utiliserons des groupes de 7 souris afin d’effectuer des tests statistiques, pour les tests sur la viabilité cellulaire, nous utiliserons des groupes de 5 souris afin de réaliser des tests statistiques.

Raffinement

Afin de réduire, supprimer ou soulager la douleur ou la détresse des animaux, et ainsi d’améliorer leur bien-être, en amont des expériences, nous allons planifier les protocoles pour éviter le stress, nous allons aussi planifier et établir les points limites (ou critère d’arrêt anticipé) de la procédure. Ces informations seront par ailleurs transmises au personnel de l’animalerie. Nous avons donc prévu la réduction de la durée de nos études précliniques dès que ce point limite est observé.

Choix des espèces

Pour qu’un nouveau traitement puisse être commercialisé, il est nécessaire de mener des études précliniques et cliniques, afin de prouver son efficacité, d'optimiser les dosages mais aussi d'identifier ses effets indésirables possibles. Les études précliniques nécessitent d’avoir recours à des animaux. Nous disposons d’échantillons de cellules leucémiques provenant de patients que l’on peut transplanter à des souris immunodéficientes. Quelques semaines après l’injection, les cellules leucémiques humaines sont présentes dans la moelle osseuse et la rate des souris qui constituent un modèle d’étude reproduisant la physiopathologie de cette maladie. Ces études ne peuvent se réaliser que dans le modèle murin ; Souris (Mus musculus) L’hématopoïèse et la leucémogénèse des souris (mus musculus) est celle qui se rapproche le plus de l’homme. Les animaux âgés entre 2 et 5 mois seront utilisés, ceci correspond à un âge optimal pour la greffe des cellules hématopoïétiques saines et leucémiques.

2400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules leucémiques de patients leur sont injectées, puis elles subissent des prélèvements de sang et de moelle osseuse répétés, jusqu'à dix-huit fois sur un an, pour étudier l'hétérogénéité des leucémies aiguës myéloïdes. Le porteur affirme que l'envahissement de la moelle ne provoque pas de douleur, en se référant à l'absence d'antalgique chez les patients, et fixe un point limite à 70 % de cellules leucémiques dans le sang. Il conclut que la réponse aux traitements ne peut être validée qu'à l'échelle de l'organisme entier.

Objectifs

Les leucémies aigues myéloïdes (LAM) sont hétérogènes aussi bien sur le plan cellulaire et clinique que sur le plan de leurs réponses aux traitements. Actuellement, seules les anomalies au niveau des chromosomiques ou de l’ADN sont utilisées pour établir le pronostique et le traitement, mais il persiste une forte hétérogénéité intra-groupe. L’implication des cellules souches leucémiques (CSL), provenant de la transformation maligne de cellules souches sanguines, est de plus en plus mise en avant dans l’échappement aux traitements et dans les rechutes, du fait de leurs capacités à la fois d’autorenouvèlement et de dormance cellulaire. Toutefois, ces cellules restent difficiles à identifier du fait de l'hétérogénéité des marqueurs exprimés à leur surface. Le premier axe de notre projet, se focalise sur le rôle de cette hétérogénéité dans la mise en place de la maladie. Des modèles de LAM, réalisés par injection de cellules leucémiques de patients à des souris immunodéprimées, nous permettront de comparer les cellules cancéreuses du patient avec les cellules qui auront ainsi greffées chez la souris. Cette comparaison nous permettra d’identifier et de hiérarchiser, sur la base de leur capacité à recréer une leucémie chez l’animal, les marqueurs membranaires caractérisant les différentes sous populations leucémiques. Le second axe de ce projet porte sur l’étude de la résistance aux traitements anti leucémiques. Pour mieux évaluer celle-ci et comprendre l’implication des sous-populations cellulaires présentes au diagnostic chez le patient, nous traiterons nos modèles murins de LAM issus de cellules de patients et nous comparerons les cellules obtenues à la rémission et à la rechute des souris aux analyses et au suivi de la maladie chez le patient. Les traitements à tester seront choisi en concertation avec les services clinique et biologique de l’hôpital en fonction des risques de rechute et des anomalies génétiques présentes au diagnostic chez le patient. Enfin, en fonctions des marqueurs membranaires identifiés dans le premier axe du projet nous testeront également de nouvelles molécules afin de développer de potentiels nouveaux traitements dans les LAM.

Bénéfices attendus

Notre projet a pour but d’identifier de nouveaux marqueurs présents à la surface des cellules souches leucémiques nous permettant de mieux identifier ce pool de cellules capables d’échapper au traitement et de persister chez le patient lors de la rémission, et pouvant conduire à une rechute. En effet, jusqu’à maintenant seules les anomalies chromosomiques ou de l’ADN sont utilisées pour établir le pronostique et le traitement des patients dans les LAM malgré la persistance d’une la forte hétérogénéité intragroupe. Par cette étude, nous voulons mettre en évidence que les marqueurs protéiques présents à la surface des cellules souches leucémiques (CSL) pourraient également être discriminants et apporter une meilleure stratification pronostique des patients. Il est essentiel de mieux connaitre les caractéristiques des CSL afin d’optimiser les approches thérapeutiques. C’est pourquoi, une fois ces cellules mieux identifiées nous pourront cibler leurs marqueurs membranaires pour mettre au point de nouvelles thérapies ciblées de façon à avoir une toxicité minimale sur les cellules saines du patient. Les bénéfices attendus de cette étude sont donc une meilleure stratification pronostique des patients, permettant une orientation thérapeutique optimale, ainsi qu’une meilleure connaissance des mécaniques impliqués dans la résistance aux traitements conduisant à une amélioration des traitements actuels.

Procédures

Procédure 1 : - 600 souris : injection IV des cellules sur souris vigiles en boite de contention (1-2min), puis prélèvement de sang sous anesthésie à l'isoflurane (1-2min) toutes les 3 semaines pendant 1 an (soit 18 prélèvements maximun) - 600 souris : injection IV des cellules sur souris vigiles en boite de contention (1-2min), puis prélèvement de moelle osseuse sous anesthésie à l'isoflurane (5-10min) (3 prélèvements maximun). Procédure 2 : 620 souris : injection IV des cellules sur souris vigiles en boite de contention (1-2min), puis prélèvement de sang sous anesthésie à l'isoflurane (1-2min) toutes les 3 semaines pendant 1 an (soit 18 prélèvements maximun). Procédure 3 : 417 souris : injection IV des cellules sur souris vigiles en boite de contention (1-2min), puis injection de luciférine en IP (

Impact sur les animaux

L'envahissement tumorale de la moelle osseuse induit par une LAM ne produit généralement pas de douleur. C’est pourquoi chez les patients humains aucun analgésique n’est prescrit sur cette base seule. De ce fait, nous ne prévoyons pas que les animaux utilisés dans ce projet subissent de douleur lié à cet état. Durant tout le suivit de la maladie, des prélèvements de sang ou de moelle seront réalisés sur les animaux pour évaluer le pourcentage de cellules leucémiques dans ces organes. Ces prélèvements seront réalisés sous anesthésie générale et des antidouleurs seront adminitrés quand cela est nécessaire pour éviter une douleure ou un stress aux animaux. Les traitements utilisés seront issus de ce qui est réalisé chez l’Homme ou de données bibliographiques disponibles et sont bien tolérés chez l’animal. Pour les traitements pour lesquels aucunes données ne sont disponibles, des tests préliminaires sur des petits groupes d’animaux seront réalisés afin de connaitre la dose optimale à utiliser sans nuisance sur l’animal. Toutefois, afin d’éviter toute souffrance éventuelle, nous observerons les points suivants pouvant conduire à l’euthanasie de l’animal : comportement, apparence physique, perte de poids supérieure à 20%, envahissement sanguin de plus de 70% de blastes humains.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’étude (avant que les points limites des procédures ne soient atteints) afin de récupérer dans les organes les cellules leucémiques huamines sur lesquelles des tests génétiques et fonctionnels seront réalisés.

Remplacement

Des tests in vitro ont été réalisés au laboratoire sur des cellules de patients atteints de LAM et sur des modèles cellulaires modifiés de LAM. Ces expériences nous ont permis d'obtenir des données sur la résistance ex vivo des cellules de patients au traitement antileucémique, par exemple et nous ont permis également d'orienter nos recherches sur certains marqueurs membranaires en particulier. Cependant le développement d’une LAM implique des mécanismes cellulaires mettant en jeu le microenvironnement de la moelle osseuse. De même la réponse au traitement et l'évaluation son efficacité ne peuvent être correctement validé qu'à l'échelle d'un organisme entier. De ce fait, l’hétérogénéité de la maladie ainsi que la réponse aux traitements ne peut être étudié sans l’apport des modèles animaux.

Réduction

Les modèles de LAM humaines à partir de cellules de patients étant déjà en place au laboratoire, le nombre d’animaux dédié aux mises au point sera considérablement réduit et concernera principalement les nouvelles molécules à tester pour lesquelles aucune données bibliographiques ne sont disponibles. Notre expérience nous permet également de savoir que les modèles murins de LAM crées à partir de lignées cellulaires donnent rarement chez l'animal des LAM dont les blastes circulent dans le sang. De ce fait, nous avons modifié nos modèles cellulaires en leur faisant exprimer un marqueur luminescent afin de suivre l’évolution de la leucémie par imagerie du vivant sans avoir à mettre à mort nos animaux ou à effectuer de prélèvements invasifs. Cela nous permettra également de mieux évaluer quand débuter les traitements afin de limiter le nombre d'animaux utilisé.

Raffinement

Après l’injection des cellules leucémiques les souris ne présentent aucuns signes de souffrance, d’angoisse ou de douleur, toutefois elles seront surveillées dans les heures qui suivent pour s’en assurer. Sur la base de ce qui est observé chez les patients humains, nous ne prévoyons pas que les animaux subissent de douleur lié au développement de la LAM. Toutefois, afin d’éviter les signes cliniques liés à un état trop avancé de la maladie (anémie, fatigue, paralysie des membres inférieurs) nous avons fixé comme point limite à l’expérimentation un envahissement en cellules leucémiques de 70% dans le sang. En nous basant sur nos précédents travaux nous savons qu’en dessous de ce pourcentage les animaux ne subissent habituellement pas de dommages physiques liés à la maladie. Cependant, pour éviter toute souffrance de l’animal nous observerons très régulièrement les points suivants : comportement, apparence physique, perte de poids supérieure à 20%, paralysie, tumeur localisée, pouvant conduire à son euthanasie éthique. Tous les prélèvements nécessaires au suivit de la maladie se feront sur des animaux préalablement anesthésiés et une analgésie sera donné en supplément pour les prélèvements de moelle osseuse. Après chaque actes (injection ou prélèvement) les animaux seront surveillés pour vérifier qu’ils n’aient pas de souffrance lié à l’acte réalisé. Enfin, pour la partie de notre projet utilisant des modèles murins créés à partir de lignées cellulaires, nous avons choisis de modifier génétiquement nos lignées afin de réaliser le suivit de la maladie par imagerie du vivant pour éviter de réaliser des prélèvements répétés sur les animaux.

Choix des espèces

Les souris immunodéficientes sont un excellent et unique modèle pour la prise de greffe de cellules souches humaines ainsi que le développement de leucémies comparables à celles observées chez les patients. De plus, nous utilisons déjà au laboratoire cette espèce pour notre modèle de LAM humaine et connaissons donc déjà la croissance tumorale, la dissémination et les effets secondaires associés à l’implantation d’une LAM dans cette espèce. Nous injecterons les cellules leucémiques à des animaux entre 4 et 8 semaines. Après 8 semaines, l’immunité résiduelle de ces souris commence à se développer et la greffe est de mauvaise qualité.

72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles courent sur un tapis roulant, motivées par de faibles décharges électriques délivrées par une grille en bout de piste, ou sur une roue volontaire, puis reçoivent une injection de puromycine, pour étudier la production d'énergie et la synthèse des protéines dans le muscle sain ou atteint de la myopathie de Duchenne. Le porteur décrit des décharges réglées au minimum et un hébergement individuel pour la roue, qu'il reconnaît sources de stress. Il affirme que la fonction musculaire de la souris est proche de celle de l'humain et que l'étude ne peut se faire ni en culture cellulaire ni par modélisation.

Objectifs

Au sein du muscle squelettique,il existe des compartiments cellulaires qui contrôlent la production d’énergie. Ces centrales énergetiques cellulaires jouent également un rôle important dans les adaptations du muscle en réponse à l’activité physique. Cependant elles ne fonctionnent pas indépendamment au sein de la cellule musculaire et forment notamment des contacts privilégiés avec d’autres compartiments cellulaires contrôlant la synthèse des protéines. Ces contacts dynamiques permettent d’échanger des composés et de contrôler les fonctions de ces deux compartiments cellulaires. Des travaux récents, y compris les nôtres suggèrent l’étendue des contacts entre les centrales énergetiques cellulaires et le site de synthèse des proteines peut moduler la production d’énergie et la production des protéines et ainsi impacter la fonction du tissu musculaire. Dans ce projet, il s’agira d’étudier la relation entre l’étendue de ces contacts, la production d’énergie et la synthèse des protéines dans des muscles soumis à un exercice ou atteints de la myopathie de Duchenne.

Bénéfices attendus

Aucune étude approfondie n'a encore vérifié dans le muscle squelettique l'importance des interactions entre les centrales énergétiques cellulaires et le lieu de synthèse des protéines dans le maintien de la fonction musculaire. L'ambition de notre projet est de préciser ces interactions au repos et à l'exercice. Enfin, et à notre connaissance, nous testerons pour la première fois si l'exercice physique, en modifiant ces interactions, pourrait améliorer le dysfonctionnement de la production d'énergie identifié dans le modèle murin de la myopathie de Duchenne. Notre projet pourrait donc ouvrir la voie à de futures pistes thérapeutiques pour traiter ces pathologies importantes chez l’homme.

Procédures

Lors des séances d’habituation à la course sur tapis roulant, de faibles stimulations électriques seront administrées à l’aide d’une grille placée en bout de piste de course pour motiver les animaux à la course. L’intensité et la fréquence des décharges au niveau de la grille seront réglées au minimum (0,1mA et 1Hz). Pour le test d’exercice sur tapis roulant, en lieu et place des stimulations éléctriques, une réglette à lamelles sera placée au dessus des pistes pour motiver les animaux à la course. Il suffit d'effleurer le dos de l'animal avec une règlette en plastique pour qu'il se remette à courir. Aucune nuisance n'est attendue pour l’exercice volontaire sur roue. C’est un modèle d’entraînement qui permet un enrichissement du milieu et participe au bien être de la souris qui peut s’adonner de manière volontaire à la pratique physique. Enfin, pour la mesure de la synthèse proteique, les animaux recevront une injection intrapéritoneale unique de puromycine (non irritant aux doses utilisées).

Impact sur les animaux

Pour les séances d’habituation à la course sur tapis roulant, des décharges électriques seront administrées à l’aide d’une grille placée en bout de piste de course pour motiver les animaux à la course. L’intensité et la fréquence des stimulations électriques au niveau de la grille seront réglées au minimum (0,1mA et 1Hz). Pour la procédure de tests d'activité sur roue, les animaux (sur roues et sédentaires) seront hébergés individuellement et garderont le contact olfactif et visuel. Ces deux situations pourraient générer un état de stress chez les animaux.

Devenir

A l’issue de la procédure 1, les animaux seront euthanisiés pour effectuer les prélèvements. Les muscles prélevés nous permettront d’évaluer l’effet de l’exercice aigu et de la période de récupération sur la fonction mitochondriale et la synthèse protéique. A l’issue de la procédure 2, les animaux seront euthanisiés pour effectuer les prélèvements. Les muscles prélevés nous permettront d’évaluer l’effet de l’entrainement sur roue sur la fonction mitochondriale et la synthèse protéique. Ces résultats pourront être comparés à ceux de l’exercice sur tapis. Enfin, l’entrainement des souris mdx nous permettra d’évaluer le potentiel bénéfique de l’exercice sur le muscle myopathique en relation avec la fonction des mitochondries et la synthèse des protéines.

Remplacement

Ce projet se propose d’étudier les mécanismes moléculaires impliqués dans les modifications de la fonction et masse du tissu musculaire dans le contexte de l’exercice et de la myopathie de Duchenne. Il ne peut donc pas être réalisé sur des cultures cellulaires ou par modélisation informatique.

Réduction

Pour chacune des procédures, le nombre d’animaux par groupe a été estimé sur la base de résultats précédemment publiés par notre laboratoire et d’analyses statistiques. Outre les muscles, les autres tissus issus des animaux ayant participé à ces procédures seront congelés. Ces tissus pourront être par la suite utilisés dans les autres projets du laboratoire pour étudier l’influence de l’exercice sur les interactions entre le muscle et les autres organes.

Raffinement

Pour la procédure expérimentale d’exercice aigu sur tapis roulant, les animaux sont hébergés par 2 dès leur arrivée jusqu'à la fin de l’étude, avec enrichissements (tunnel de contention en plexi rouge et coton). Le change est fait une fois par semaine avec transfert d’une partie du nid et du tunnel pour conserver l’odeur des animaux dans la cage propre. Trois séances d’habituation sur tapis seront effectuées, afin de réduire au maximum le stress. Les séances et le test de course seront également supervisées par le même expérimentateur (habituation à l’expérimentateur). Ces séances d’habituation sont de faible intensité et de faible durée (maximum 10min et jusqu’à 10m/min). Pour motiver les animaux à la course, des stimulations électriques seront administrées à l’aide d’une grille placée en bout de piste de course. L’intensité et la fréquence des décharges électriques au niveau de la grille seront réglées au minimum (0,1mA et 1Hz). Lors du test, en lieu et place des stimulations éléctriques, une réglette à lamelles sera placée au dessus des pistes pour motiver les animaux à la course. Le test est arrêté lorsque l'animal reste sur la grille plus de 5 secondes malgré la règlette et aucun acharnement ne sera effectué pour pousser l'animal au delà de ce qu'il aura décidé. Pour la procédure expérimentale d’exercice volontaire sur roue, les animaux sont hébergés individuellement dès leur arrivée jusqu'à la fin de l’étude, avec enrichissements (roue/tunnel de contention en plexi rouge). Le change est fait une fois tous les 15 jours avec transfert du tunnel pour conserver l’odeur des animaux dans la cage propre. L’exercice volontaire sur roue est un modèle d’entraînement qui permet un enrichissement du milieu et participe au bien être de la souris qui peut s’adonner de manière volontaire à la pratique physique. En cas d’inconfort, on peut supposer que l’animal cessera de lui-même. Les animaux gardent le contact olfactif et visuel puisqu’il s’agit de cages ouvertes. Pour l’injection intrapéritonéale de solution de puromycine, nous respecterons les recommandations en terme de volume (

Choix des espèces

La fonction musculaire chez la souris est similaire à celle de l'homme et nous permettra de transposer facilement nos résultats. De plus, l'utilisation de la souris nous permet également d’avoir accès à des modèles génétiquements modifiés et d'utiliser un large panel de réactifs de biochimie et de biologie moléculaire. Dans cette étude nous utiliserons ainsi les souris mdx, un modèle d’étude de la myopathie de Duchenne. Nous prévoyons des animaux adultes âgés de 6 mois pour la course sur tapis. Pour la course volontaire sur roue les animaux démarreront la course à l’âge de 3 mois afin d’atteindre l’âge de 6 mois à la fin du protocole. Nous pourrons ainsi comparer les effets de différentes modalités d’exercice au même âge. Enfin, pour le contexte pathologique de la myopathie de Duchenne, les animaux seront âgés de 3 mois afin de présenter les signes de la maladie.

Les 100 souris de ce projet sont rendues porteuses de tumeurs cérébrales, par implantation de cellules cancéreuses dans le cerveau pour 50 d'entre elles et par injection dans une veine pour les 50 autres. Ces souris C57Bl/6 et BalbC adultes sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, puis irradiées en une seule séance sous anesthésie générale, ou laissées sans irradiation comme témoins. Transférées dans un autre établissement pour des IRM répétées à quatre jours d'intervalle au moins, elles peuvent présenter titubation, léthargie, tête penchée, tremblements et crises d'épilepsie, et sont toutes tuées à la fin du projet pour comparer les images à des coupes histologiques. Les souris porteuses de tumeurs sont étudiées jusqu'à ce qu'elles perdent 15 % de leur poids ou atteignent un autre point limite, et des signes de souffrance entraînent soit leur mise à mort, soit un analgésique.

Objectifs

Chaque année, environ 65 000 européens sont diagnostiqués avec une tumeur cérébrale primitive. La radiothérapie est une option thérapeutique établie en association avec une chimiothérapie ou une résection chirurgicale. Même si son efficacité a largement été prouvée, la radiothérapie peut cependant engendrer des phénomènes nécrotiques et inflammatoires intenses, appelés radio-nécrose, 6 mois à 2 ans chez près de 25% des patients. Cette radio-nécrose est un effet secondaire de la radiothérapie et limite la précision de l'évaluation de la réponse tumorale à la thérapie. En effet, ces lésions dues aux radiations peuvent être confondues avec la progression tumorale, d'où le terme parfois utilisé « pseudoprogression ». A ce jour, seule l’analyse d’échantillons extraits par biopsie s’avère être totalement fiable pour différencier ces deux phénomènes. Mais la biopsie reste une intervention chirurgicale pouvant présenter certains risques pour le patient et le résultat peut s’avérer peu informatif étant donnée la petite taille de l’échantillon vis-à-vis du volume et de l’hétérogénéité tumorale. Diagnostiquer précisément le plus tôt possible une radionécrose ou une récidive est essentielle afin d’adapter au mieux le traitement. En effet, la progression tumorale et la radio-nécrose ont des approches thérapeutiques et des pronostics différents : des sessions supplémentaires de radiothérapie peuvent être bénéfiques pour les patients présentant une récidive de la maladie, alors qu'elles sont contre-indiquées lors de présence de radionécrose. Par conséquent, des biomarqueurs spécifiques et sensibles sont nécessaires pour différencier le plus tôt possible les deux effets. Ce projet vise à développer des méthodes avancées d’Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) pour permettre l'évaluation in vivo non invasive de la réponse à la radiothérapie. Ainsi, l’objectif de cette demande est de développer un modèle de radionécrose chez la souris portant un gliome.

Bénéfices attendus

Ce modèle est représentatif de cas chez l’homme, donc la méthodologie IRM pourra être transférée rapidement - une seule session de radiothérapie permettra un stress amoindri des animaux que plusieurs sessions.

Procédures

Un premier groupe de 50 animaux sera soumis à une implantation de cellules cancéreuses dans le cerveau (en une seule fois) puis traités par radiothérapie (session unique) ou pas. Un deuxième groupe de 50 animaux sera soumis à une injection de cellules cancéreuses en intraveineux (en une seule fois) puis traités par radiothérapie (session unique) ou pas. Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Les modèles tumoraux pourraient induire des effets indésirables sur le comportement de l’animal (titubation, léthargie), sur son apparence (yeux mi-clos, dos vouté), une perte de poids, et des signes neurologiques tels que la tête penchée, tremblements, crises d’épilepsie. La radionécrose tumorale ne devrait pas induire de douleur. En revanche, si une radionécrose du tissu cérébral sain intervient, celle-ci pourrait devenir douloureuse et sera détectée par des modifications du comportement ou de l’apparence physique . De plus, le transport des animaux d’un établissement utilisateur à un autre pourrait induire un stress aux animaux.

Devenir

A l’issue de la radiothérapie (ou pas pour les contrôles), les animaux seront transférés à un autre établissement utilisateur pour les héberger à proximité d’une plateforme d’imagerie pour leur suivi par IRM. A la fin du projet, les animaux seront euthanasiés afin de confirmer les résultats IRM avec des coupes histologiques.

Remplacement

Notre projet est à visée translationnelle. En effet, nous souhaitons développer des séquences IRM permettant un diagnostic précoce et fiable de la radionécrose. L’imagerie du petit animal vivant est donc un maillon indispensable dans ce processus.

Réduction

Du fait de la non-invasivité de l’imagerie par IRM, les mêmes animaux seront imagés plusieurs fois avec un minimum de quatre jours entre chaque examen. Cette démarche permet de limiter le nombre d’animaux au strict nécessaire.

Raffinement

Pendant les chirurgies, l'utilisation d'anesthésies gazeuses par isoflurane, la présence d'un tapis chauffant permettant de maintenir la température interne des animaux et le contrôle visuel de la respiration permettent d'assurer un réveil rapide des animaux. Au cours du suivi post-opératoire, les souris portant des tumeurs ou métastases cérébrales seront étudiées jusqu’à ce que leurs poids aient diminué de 15% ou que les autres points limites soient atteints. Des points limites ont été instaurés pour surveiller la santé et le bien-être des animaux. Si des signes de souffrance apparaissent, les animaux seront soit euthanasiés soit pris en charge par un analgésique. Les animaux seront observés au réveil pour une recherche de signes cliniques de la douleur. Les animaux sont observés 2 fois par jour pendant les 3 jours suivant les chirurgies puis 1 fois par jour. La fréquence repassera à 2 fois par jours en cas de début de perte de poids (10%).

Choix des espèces

Les souris C57Bl/6 et BalbC seront utilisées car couramment utilisées dans la littérature, et permettant ainsi de comparer nos résultats avec des études précédentes. De plus, elles possèdent un système immunitaire fonctionnel permettant de mimer la pathologie humaine. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 8 semaines) car le développement des organes sera terminé.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales leur sont implantées dans le foie après incision de l'abdomen, sur des souriceaux âgés de neuf jours pour reproduire un cancer du très jeune enfant, puis elles reçoivent deux médicaments et un suivi de la tumeur par imagerie. Le porteur affirme que les effets indésirables sont "proches de zéro" grâce à l'anesthésie et à l'absence de toxicité observée chez la souris adulte, alors que le modèle reproduit une dissémination tumorale vers les poumons. Il indique qu'aucun système in vitro ne reconstitue la complexité tumorale et juge indispensable cette souche de souris immunodéprimée.

Objectifs

L’hépatoblastome est le cancer primaire du foie le plus fréquent chez l’enfant de moins de 5 ans. Le traitement de référence utilise une chimiothérapie à base de cisplatine, un médicament qui tue très efficacement les cellules tumorales mais reste très toxique pour les enfants. Un modèle juvénile de cancer du foie chez la souris a été mis au point récemment. Nous souhaitons maintenant tester l’efficacité d’une nouvelle thérapie de deux médicaments dans le traitement de ce cancer pédiatrique à l’aide de ce modèle.

Bénéfices attendus

Montrer que ces cellules d’hépatoblastome répondent à une chimiothérapie à base de deux composés et donc que le modèle est pertinent pour tester de futurs médicaments. Disposer d’un modèle juvénile pour étudier les mécanismes à l’origine de ce cancer pédiatrique.

Procédures

Implantation de cellules tumorales dans le foie après incision de la peau au niveau ventrale (durée : 10 min). Points de sutures au niveau ventrale (durée : 5 min). Administration de médicaments 2 fois par semaine (durée : 2 min par jour d’injection). Mesure de la tumeur par imagerie à bioluminescence 3 fois par semaine (durée : 15 min par mesure). Pesée des souris deux fois par semaine (durée : 1 min).

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales utilisées dans ce projet sont de classe modérée. Elles prévoient la greffe de cellules tumorales dans le foie. Les souris seront également manipulées afin de mesurer la croissance des tumeurs par bioimagerie. Toutes les manipulations des animaux sont réalisées sous anesthésie générale et les yeux des animaux sont protégés avec de la pommade vit A. Les effets indésirables sont donc proches de zéro. Il n’y a pas de risque particulier lié au développement de la tumeur qui se fera dans une partie localisée du foie. Le modèle reproduit la dissémination des cellules tumorales dans les poumons comme cela est observé chez les patients. Celles-ci sont 10 fois plus petites en taille que la tumeur hépatique d’origine. Des analyses précédentes dans un modèle de souris adulte montrent l’absence de toxicité de cette combinaison de drogues ou de chaque drogue utilisé seule.

Devenir

Les 80 souris de ce projet seront euthanasiées afin de procéder au prélèvement des tissus tumoraux et à leur analyse pas des approches moléculaires et histologiques.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative à la réalisation de ce projet, c’est-à-dire un système biologique qui reproduit partiellement ou entièrement les conditions cliniques, analytique et/ou moléculaire de notre objet d'étude, l’hépatoblastome. II est impossible d'obtenir les informations fournies dans cette étude sans l'utilisation de cette souche de souris (souris immunodéficience, NOD/LtSz-scid IL2R gamma, NSG). Les conclusions recherchées ne peuvent être obtenues par des modèles alternatifs d'étude in vitro, qui ne reconstituent pas de manière optimale la complexité, l’interactivité et la diversité des compartiments stromales et tumorales en action in vivo chez la souris.

Réduction

Le nombre d’animaux et l’analyse des résultats sont déterminés à l’aide de tests statistiques adaptés. Pour renforcer la puissance statistique de nos données, nous prévoyons de réaliser l’expérience deux fois. Si les résultats de nos analyses sont convaincants dès la première série d’expérience, celle-ci ne sera pas reconduite.

Raffinement

Concernant l’objectif de réduction de la souffrance, la douleur et l’angoisse infligées aux animaux. Les souris seront hébergées en animalerie A2, suivies quotidiennement pour détecter d’éventuels signes cliniques par du personnel qualifié. Ces animaux sont hébergés en cages de type 2L à raison de 5 souris par cage. Les conditions d’hébergements sont adaptées à la forte immunodépression de ces animaux : cages, nourritures et litières sont stérilisées. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu. En ce qui concerne les données de comportement et de physiologie, l’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Le score limite est de 12. Au-delà, l’animal est euthanasié sans attendre. En tenant compte de ces points limites adaptés et conformément au paragraphe 3 de l’annexe VIII de la directive 2010/63 CE, nous proposons comme classement pour l’ensemble de nos procédures le degré modéré. Les critères prépondérants ainsi que les mesures conservatoires en fonction du score de cette grille sont détaillés dans les procédures. Il n’existe pas de méthode alternative à celle de réaliser une incision de la peau ventrale et d’implanter les cellules tumorales directement dans le foie pour mettre en place ce modèle orthotopique de tumeur du foie chez le souriceau. Les animaux seront manipulés sous anesthésie gazeuse et après intervention chirurgicale, ils seront traités pas des antalgiques. Les expérimentateurs de l’Animalerie ont toutes les compétences et les formations requises pour réaliser les procédures chirurgicales et les manipulations des animaux prévues dans ce projet.

Choix des espèces

- La souche de souris NSG est appliquée dans la recherche sur le cancer en raison de sa capacité à développer la maladie étudiée. - Afin de mimer l’apparition du cancer du foie chez des enfants très jeunes, l’implantation des cellules tumorales se fera sur des souris âgées de 9 jours - La capacité d’extrapoler les résultats. - L’expérience d’utilisation des chercheurs demandeurs. - L’existence des équipements nécessaires à l’étude. - La pertinence des installations de l’Animalerie.

804 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par le parasite Giardia puis gavées quotidiennement pendant douze jours, une partie étant des souriceaux non sevrés séparés de leur mère à chaque manipulation, pour tester des probiotiques destinés d'abord à un usage vétérinaire chez le chien. Le porteur décrit un objectif de commercialisation par un partenaire industriel et une application humaine à plus long terme, et indique que l'infection reste asymptomatique et auto-résolutive chez la souris. Il affirme qu'il est "nécessaire" de vérifier in vivo l'efficacité observée in vitro, aucun modèle ne reproduisant selon lui les interactions hôte-parasite-microbiote.

Objectifs

Giardia est un parasite de l’intestin de nombreuses espèces de mammifères dont l’Homme. Il est à l’origine d’infections intestinales souvent chroniques se traduisant par des diarrhées et parfois des signes de malabsorption. Le nombre croissant de cas de giardiose liés à la contamination de l’eau potable, aux effets secondaires des traitements, ainsi qu'à l’émergence de souches résistantes aux médicaments, font de la giardiose un sujet d’actualité de plus en plus préoccupant qui nécessite le développement de traitements alternatifs. Nous avons établi que la microflore et certains probiotiques, comme les bactéries probiotiques Lactobacillus johnsonii, jouent un rôle important dans la protection contre cette parasitose. Des résultats obtenus, in vitro et in vivo, montrent que ces bactéries agissent en produisant des composés toxiques pour le parasite, permettant de réduire les signes de la maladie. Une souche de L. johnsonii a également fait l’objet d’un essai clinique chez le chiot où nous avons pu confirmer ses propriétés anti-Giardia. A partir de ces résultats très encourageants, nous avons obtenus au laboratoire 4 nouvelles souches de probiotiques présentant des propriétés anti-Giardia augmentées comparativement à la souche d’origine in vitro. Afin de déterminer quelle souche sera utilisée sur l’espèce hôte cible (le chien), mais aussi afin d’étudier in situ dans l’intestin les mécanismes à l’origine de ces effets, il est nécessaire de valider les résultats obtenus sur ces différentes souches in vitro, par des essais in vivo d’infection à Giardia sur des modèles rongeurs. Nos objectifs sont la commercialisation par notre partenaire industriel de ce nouveau probiotique chez le chien, d’ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans le traitement de la giardiose basées sur l'utilisation de probiotiques ou de molécules actives.

Bénéfices attendus

La majorité des traitements humains ou vétérinaires actuels font appel à l’emploi d’antibiotiques, qui non seulement provoquent d’importants effets secondaires, mais sont également de moins en moins efficaces dû à l’émergence de souches résistantes à ces médicaments. Ce contexte préoccupant nécessite le développement de traitements alternatifs novateurs, et nécessite également des avancées majeures dans la compréhension des interactions hôte/Giardia/microbiote qui seront à la base de nombreuses thérapies innovantes. Giardia est un parasite ayant une prévalence importante dans l’industrie de l’élevage en Europe et dans le monde. La diminution de l’utilisation des antibiotiques dans l’ensemble des traitements des animaux est un sujet de très haute importance étant donné l’apparition de nombreuses souches résistantes. Le développement de ce type de traitement alternatif est donc capital, en particulier dans ce type d’industrie. La réduction de souches résistantes aux antibiotiques ainsi que la diminution des traces d’antibiotiques dans l’alimentation humaine et vétérinaire est au cœur des enjeux sociétaux et environnementaux actuels et pour le futur. Ce projet permettra à court terme le développement et la mise sur le marché vétérinaire de probiotiques anti-Giardia, puis à plus long terme une application chez l’humain. Ceci pourrait permettre un développement de l’éventail thérapeutique, une amélioration de la prise en charge et du traitement de la maladie, pour in fine une amélioration de la qualité de vie des individus concernés. Il permettra également l’avancement des connaissances fondamentales dans l’application de souches probiotiques produisant des composants toxiques pour le parasite, en particulier dans leur action synergique avec le microbiote. Le microbiote est au centre de découvertes majeures dans l’application à la médecine vétérinaire et humaine depuis 20 ans. Ce projet vise à en comprendre les mécanismes clés, ce qui permettrait d’identifier de nouveaux axes de recherche fondamentaux ou appliqués.

Procédures

Au cours des études et pour l’ensemble des animaux rentrant en procédures, les interventions seront : - Prise de poids et gavage quotidiens pendant 12 jours maximum (5 min maximum par animal) - Deux gavages quotidiens espacés d’une demi-journée : 1 fois - Prélèvement sanguin : 1 fois juste avant la mise à mort - Mise à mort

Impact sur les animaux

L’infection à Giardia duodenalis est asymptomatique et auto-résolutive en une dizaine de jours chez la souris. Les potentiels effets indésirables seront les erreurs de gavage (fausse route avec passage de la sonde dans la trachée, détectable par présence de sang sur la sonde). Dans ce cas nous procéderons à l’euthanasie immédiate des animaux concernés. Chez les jeunes souriceaux, un stress est engendré lors des gavages et pesées journalières, mais il est également dû à la séparation de sa mère, qui a lieu durant ces différents gestes. Les souriceaux seront manipulés avec des gants imbibés de l’urine et fèces de la mère afin de réduire le risque de rejet et/ou cannibalisme de la mère.

Devenir

A l’issue de l’ensemble des procédures, les animaux seront euthanasiés afin de procéder au prélèvement des différents organes nécessaires à la quantification de la giardiose et aux traitements des données expérimentales.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est nécessaire pour confirmer les observations faites in vitro. En effet, le test in vitro ne permet d’apprécier que l’efficacité du surnageant de culture bactérienne sur Giardia. Il est donc nécessaire de vérifier l’efficacité de ces stratégies thérapeutiques dans des conditions physiologiques. De plus, il n’existe pas de modèle in vitro envisageable qui permet l’étude des interactions hôte/Giardia/microbiote. L’ensemble des souches de probiotiques qui seront administrées in vivo auront fait l’objet d’études préliminaires in vitro et seront le fruit d’une première sélection visant à ne garder que les souches ayant un réel intérêt anti-Giardia. Préalablement, l’activité transcriptionnelle, la quantité de protéine produite, ainsi que la capacité de ces protéines à hydrolyser les acides biliaires conjugués ont été étudiées afin de sélectionner uniquement des souches ayant un fort potentiel in vivo. Pour chaque formulation, des études de faisabilité, de stabilité de l’activité sont réalisées. Ainsi les formulations qui seront étudiées in vivo seront également issues d’un processus de sélection afin de limiter le nombre de groupes et donc le nombre d’animaux entrant dans cette étude.

Réduction

Pour la procédure sur souriceaux non sevrés, le nombre d’animaux sera réduit au maximum pour mesurer l’efficacité d’un traitement et comparer les traitements entre eux. Afin de déterminer le nombre d’animaux que nous utiliserons au cours de ces études, nous nous appuyons sur l’expérience de collègues ayant déjà utilisé ce modèle. De plus il a déjà été montré et validé par 2 publications que 12 animaux par groupe séparés en 2 lot de 6 animaux étaient suffisants. Pour le modèle de souris âgés de 3 semaines, une publication récente a démontré que 16 animaux par groupe séparés en 2 sous-groupes de 8 animaux étaient suffisants.

Raffinement

Un suivi journalier du bien-être des animaux sera effectué via un cahier de suivi rempli quotidiennement. Les gavages intragastriques des animaux seront pratiqués par des expérimentateurs formés et entrainés. La présence d’une procédure d’entrainement spécifique permettra un raffinement des autres procédures présentes dans le projet. Un enrichissement de milieu sera mis en place pour améliorer les conditions d’hébergement des souris : ajout de cellulose déchiquetée et bâton à ronger. Une attention particulière sera faite pour réduire au minimum les temps de séparation mère-souriceaux dus aux gavages ou aux autres manipulations. Les souriceaux seront manipulés avec des gants imbibés de l’urine et fèces de la mère afin de réduire le risque de rejet et/ou cannibalisme de la mère. L’établissement de points limites s’appuyant sur des paramètres objectifs facilement quantifiables (poids, mobilité) sera mis en place afin d’éviter efficacement tout état de souffrance aux animaux.

Choix des espèces

Deux espèces de Rongeurs sont utilisées pour les études expérimentales de la giardiose : la souris et la gerbille de Mongolie qui est beaucoup plus difficile à manipuler et très sensible au stress et qui n’est utilisée que lorsque le modèle souris ne peut pas être utilisé notamment pour étudier la giardiose chronique. Les modèles souris sont des modèles reproductibles. Ils correspondent aux modèles les plus utilisés pour tester des traitements contre la giardiose. L’infection par Giardia n’est possible que chez le souriceau avant sevrage et jusqu’à l’âge de 4 semaines. Après cet âge, l’infection est inconstante ou nécessite un traitement préalable des animaux (immunosuppression ou antibiothérapie pour détruire la flore digestive). La variabilité de l’infection est plus faible avant sevrage.