Procédures modérées
Robustesse des poissons: une composante clé de la vulnérabilité de leurs populations et de la durabilité en aquaculture
- Conservation des espèces
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
6 000 bars vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils subissent des biométries sous anesthésie, des jeûnes, des tests d'effort en tunnel de nage et une exposition volontaire à des canicules et à des épisodes d'hypoxie pendant quatorze jours, une partie subissant des prélèvements de sang et des biopsies de branchies. Les poissons sont ensuite tués pour peser leurs organes, l'analyse génétique de l'héritabilité exigeant selon le porteur un grand nombre d'individus. Le projet vise la sélection génomique de souches robustes pour l'aquaculture, et le porteur affirme qu'il n'est "pas possible de remplacer l'espèce".
Objectifs
Ce projet étudiera la robustesse individuelle des poissons en tant que déterminant de la vulnérabilité des populations et de la durabilité de l’aquaculture face aux changements climatiques en cours. La robustesse est mesurée comme la capacité d’un animal à grandir et à se reproduire dans les conditions environnementales de son habitat, ainsi que sa capacité à résister à des événements climatiques extrêmes. Ce projet est une étude de cas sur la robustesse d’une espèce de poisson importante pour la pêche et l’aquaculture, le bar européen Dicentrarchus labrax. L’espèce compte trois populations génétiquement distinctes, dans l’Atlantique, la Méditerranée occidentale et la Méditerranée orientale. La robustesse des individus issus de chaque population sera caractérisée pendant l’élevage sur plusieurs années sous trois régimes thermiques saisonniers qui reflètent les aires de répartition des trois populations. La robustesse sera évaluée en termes de croissance et des performances comportementales et physiologiques, saisies à des températures différentes pendant l’élevage. La résilience des individus et des populations face aux événements climatiques extrêmes estivaux, vague de chaleur et épisode d’hypoxie, sera aussi évaluée.
Bénéfices attendus
Les données seront intégrées avec des données de génomique pour révéler la composante héritable de la robustesse. L’ensemble de ces données seront ensuite utilisées pour développer des modèles pour prédire le destin des populations du bar Européen dans des climats futurs, pour mieux préserver les stocks de poissons. Les résultats soutiendront l'aquaculture durable, en permettant la mise en place de programmes de sélection de populations robustes.
Procédures
La totalité des n = 6000 poissons seront soumis à des biométries sous anesthésie et des intervalles de jeune alimentaire. Parmi ces 6000, n = 2756 vont aussi subir d’autres procédures. Un nombre de 774 individus vont subir des analyses de performance comportementale de sévérité légère ; n = 288 seront placés en groupes de 8 dans des aquariums pour 4 jours, n = 486 seront placés en groupes de 6 dans des aquariums pour quelques heures. Un nombre de 432 poissons seront testés pour leur performance physiologique, un protocole de sévérité modérée car il implique être confiné individuellement pour quelques heures dans un tunnel de nage, pour subir un test d’effort. Un nombre de 1550 individus seront placés dans des bassins en groupes de 45 individus pour plusieurs semaines, pour être exposés à des stress environnementaux (canicule ou hypoxie) sur une duree de 14 jours (ou servir de témoins). Basée sur les connaissances de la physiologie de l’espèce le protocole est de sévérité modérée, car les conditions sont calculées pour engendrer des réponses de stress sublétales en restant bien éloigné de tout risque pour la survie des animaux. Finalement, parmi les n = 1550 individus soumis à ces stress, n = 432 vont subir un échantillonnage de leur sang et une biopsie de leurs branchies, sous anesthésie. Un protocole non-létal mis a point sur les poissons et de sévérité modérée.
Impact sur les animaux
Les nuisances et les effets indésirables devraient être limités, toutes les procédures sont d'une sévérité légère ou modérée et sont maîtrisées sur cette espèce. Les conditions d'élevage en captivité, et d'experimentation comportementale et physiologique, ont été optimisées pour cette espèce. La perte d'accès à la nourriture, pendant les phases de jeûne, représente une nuisance mineure et transitoire, les poissons prédateurs sont adaptés à des alternances de festins et de famines. Les tests de performance impliquent un confinement mais sont de courte durée. Les expositions aux stress environnementaux représentent des nuisances transitoires d’une sévérité modérée, cette espèce étant souvent exposée à de telles conditions estivales dans leur environnement naturel (lagunes et estuaires). Le protocole d’échantillonnage du sang, et biopsie des branchies, a été mis à point pour les poissons et ne devrait pas représenter une nuisance majeure.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de leur procédure, pour pouvoir évaluer la taille de leurs organes. Pour les évaluations de la robustesse individuelle des poissons, l’approche génomique et l’analyse génétique de l’héritabilité et des corrélations génétiques nécessitent de travailler sur un nombre relativement important d’individus pour des questions de méthodologie statistique appliquée à ces disciplines.
Remplacement
Il n'est pas possible de remplacer l’espèce Dicentrarchus labrax pour ces recherches qui impliquent la mesure de la robustesse in-vivo des individus d’une espèce de poisson d’importance pour la pêche et la pisciculture.
Réduction
Pour les évaluations de la robustesse individuelle des poissons, l’approche génomique et l’analyse génétique de l’héritabilité et des corrélations génétiques nécessitent de travailler sur un nombre relativement important d’individus pour des questions de méthodologie statistique appliquée à ces disciplines. Typiquement, un nombre de 500 à 1000 poissons par population et par condition environnementale est recommandé pour avoir une précision suffisante des estimations d’héritabilité et de corrélations génétiques. Dans ce cas, il y a 3 populations et 3 conditions, soit un nombre recommandé compris entre 4500 et 9000, d’où le choix de 6000 poissons. Pour les évaluations de la robustesse des populations, en termes des performances comportementales et physiologiques, et de la résilience des populations face aux événements extrêmes, le nombre d’individus est le minimum nécessaire pour pouvoir établir des moyennes populationnelles des traits, et faire des comparaisons statistiquements valides de ces moyennes entre populations et régimes thermiques.
Raffinement
Tout sera mis en place dans le cadre des procédures pour limiter la souffrance et le stress des animaux. L’objectif majeur des protocoles est de limiter au maximum les nuisances ou effets indésirables pendant les procédures, pour obtenir des mesures valides et fiables de la robustesse des individus qui ne soient pas influencées par un état préalable de souffrance, stress ou agitation. Pendant le marquage et les biométries lors des mesures de croissance et de tolérance au jeûne, une procédure d'anesthésie sera appliqué qui est optimisée pour cette espèce. En dehors des mesures biométriques, les poissons seront conservés à des densités optimales, dans des bassins isolés des perturbations. De manière générale, l'alimentation sera conduite ‘ad-libitum’. Les phases de jeûne, avec une durée de 3 semaines, amènent à une perte de masse des poissons mais des expériences précédentes indiquent qu’ils ne posent aucun risque pour leur santé. Les acquisitions comportementales seront faites par vidéo dans des dispositifs utilisés au préalable chez cette espèce et en minimisant les perturbations. Les procédures en tunnel de nage sont bien établies chez les poissons. Pour limiter au maximum la souffrance et le stress des poissons pendant les manipulations, ils sont capturés et transférés dans les tunnels de nage sans exposition à l’air, puis une période de récupération et d'acclimatation d’une durée minimale de 4h est réalisée. Les poissons sont à l’abri de nuisances visuelles et sonores pendant la récupération et les expériences. Les expositions aux événements extrêmes (vague de chaleur ou hypoxie) auront lieu dans une salle dédiée et avec des effectifs d’animaux réduits, dans des bassins isolés des perturbations. Basée sur les connaissances de la physiologie de cette espèce, la gravité des événements extrêmes est calculée pour engendrer des réponses de stress sous-létales en restant bien éloigné de tout risque pour la survie des animaux. Le protocole d’échantillonnage du sang et biopsie des branchies, sous anesthésie, a été mis à point pour cette espèce.
Choix des espèces
Dicentrarchus labrax (bar en Atlantique, loup en Méditerranée) est une espèce de poisson marin côtier, importante pour la pêche et la pisciculture. Comprendre sa variation intraspécifique de robustesse, et les bases génomiques de cette variation, permettra de mieux prédire la capacité de l'espèce à persister face aux changements globaux en cours. Cette compréhension permettra aussi de mettre en place des programmes de sélection génomique de souches tolérantes pour la mariculture en cage dans les zones côtières. Les animaux seront étudiés d'un stade juvénile jusqu’à la maturation sexuelle. Un objectif principal du projet est d'étudier la robustesse de chaque individu, mesurée comme la capacité à grandir dans leurs conditions environnementales actuelles.
Evaluation de la propriété analgésique de la mycolactone dans un modèle incisionnel plantaire chez la souris
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent une incision plantaire sous anesthésie, puis une douleur post-opératoire volontairement laissée sans analgésique chez les groupes témoins, le porteur indiquant qu'un traitement "irait à l'encontre de l'étude". Des tests plantaires répétés jusqu'à sept fois évaluent la sensibilité, et les pattes sont prélevées à la mise à mort, 48 heures au plus après l'incision. Le projet teste la mycolactone, toxine bactérienne, comme analgésique local, et le porteur affirme ne pas pouvoir se passer d'animaux.
Objectifs
Notre équipe travaille sur les propriétés anti-douleurs de la mycolactone, toxine produite par la mycobactérie M. ulcerans. En effet, les personnes atteintes d’une infection à M. ulcerans présentent de vastes ulcérations cutanées qui ne sont pas douloureuses. Dans ce contexte, nous avons démontré grâce à des tests cellulaires que la mycolactone induisait une diminution de la sensibilité locale pendant plus de 24h après son inoculation. Cela nous a également permis de disséquer son mécanisme d’action. Jusqu’à maintenant, l’activité analgésique (anti-douleur) de la mycolactone n’avait été évaluée au laboratoire que chez des souris ne présentant pas de douleur. Cela a d’ores et déjà permis de démontrer que la mycolactone présente des propriétés anti-douleur supérieures à la morphine. Dans ce contexte, notre objectif est de déterminer si la mycolactone pourrait être utilisée comme analgésique local (en raison de sa faible diffusion après inoculation) dans des modèles de « douleur ». Compte tenu de son effet durable (entre 24 et 48 h après une injection unique en sous cutanée) et de sa faible diffusion dans l’organisme, la mycolactone pourrait présenter un intérêt pour traiter les douleurs post opératoires. Ainsi nous proposons d’évaluer l’effet analgésique de la mycolactone dans un modèle pertinent de douleur post-opératoire.
Bénéfices attendus
Nos résultats antérieurs ont montré que la mycolactone présentait des propriétés anti-douleur lorsqu’elle était administrée par injection en sous cutanée chez des souris naïves (chez lesquelles aucune douleur n’a été induite). Compte tenu de ces résultats, il nous semble judicieux d’évaluer les propriétés analgésiques de la mycolactone dans le traitement des douleurs post opératoires. Ce projet se justifie puisque l’arsenal thérapeutique contre les douleurs reste limité.
Procédures
Les animaux seront répartis en 4 groupes de 180 animaux chacun (soit 720 animaux au total) : - avec incision traité par la mycolactone - sans incision - avec incision non traité - avec incision traité par un anesthésique de référence (buprénorphine). Incision plantaire, réalisée une seule fois. Procédure réalisée sous anesthésie gazeuse. La durée de la procédure est d’environ 5 à 10 minutes. Les animaux concernés sont au nombre de 540. Les 180 animaux restants subiront toute la procédure (anesthésie, désinfection de la patte) mais sans l’incision. Traitement par instillation de la mycolactone sur la plaie avant la suture, réalisée une seule fois. Procédure réalisée sous anesthésie gazeuse pendant la procédure d’incision. L’instillation ne dure que quelques secondes avant de suturer la plaie. Les animaux concernés sont au nombre de 180. Traitement par injection de la buprénorphine en intrapéritonéale, réalisée une seule fois. Procédure réalisée sous anesthésie gazeuse juste après la procédure d’incision. L’injection en intrapéritonéale ne dure que quelques secondes. Les animaux concernés sont au nombre de 180. Acclimatation au test plantaire, 5 jours consécutifs pendant 15 minutes à chaque fois. Tous les animaux sont concernés par cette procédure soit 720 animaux. Tests plantaires à T-1 avant incision, puis après incision et traitement par mycolactone ou buprénorphine : 2h, 4h, 6h, 24h, 30h et 48h, soit au maximum 7 fois. Le test plantaire dure environ 20 minutes. Tous les animaux sont concernés par cette procédure soit 720 animaux. Chronogramme des procédures : J-5 : acclimatation au test plantaire 15 min J-4 : acclimatation au test plantaire 15 min J-3 : acclimatation au test plantaire 15 min J-2 : acclimatation au test plantaire 15 min J-1 : acclimatation au test plantaire 15 min T-1 : test plantaire pré-incision T0 : incision + instillation de la mycolactone sur la plaie avant suture ou injection de la buprénorphine (groupe test ou groupe témoin incisé traité) T2h : test plantaire T4h : test plantaire T6h : test plantaire T24h : test plantaire T30h : test plantaire T48h : test plantaire puis sacrifice et récupération des pattes
Impact sur les animaux
Suite à l’incision, il est attendu une douleur modérée, tout particulièrement chez les animaux non traités. Plusieurs indicateurs seront suivis : - L’induction d’une sensibilité accrue que nous détecterons lors des tests plantaires par un temps de réaction réduit par rapport aux souris non incisées. Les données des tests plantaires seront analysées au fur et à mesure et les tests seront arrêtés si, 2h suite à l’incision, aucun effet analgésique n’est observé de la part de la mycolactone. Si un effet analgésique apparait, les tests se poursuivront jusqu’à ce que l’effet disparaisse (lorsque le temps de réaction des souris ayant reçu la mycolactone sera de nouveau identique à celui des souris du groupe témoin incisé non traité). - Une perte de poids est attendue mais ne devra pas excéder 5% en 24h ou 10% sur la durée totale de l’expérience (48h), sinon, les souris concernées seront euthanasiées. - L’induction d’une modification de la démarche (telle qu’un boitement). Si un animal présente une absence totale d’utilisation de sa patte, il sera euthanasié. - Un changement du comportement les 24 premières heures. Il est à noter que les animaux seront mis à mort maximum 48h après l’incision. De plus, malgré nos précautions, une surinfection de l’incision n’est pas à exclure. A l’apparition des signes de surinfection, les animaux seront mis à mort. Le comportement sera analysé selon une grille d’évaluation des scores. Son utilisation nous fournira un score qui sera décisionnel : - Pas d’action nécessaire. - Douleur légère, l’animal sera surveillé plus régulièrement pour vérifier l’évolution de son état. - Douleur modérée, l’animal sera surveillé plus régulièrement pour vérifier l’évolution de son état et un enrichissement supplémentaire sera apporté. - Douleur sévère, le point limite sera considéré comme atteint et l’animal sera euthanasié. Les souris seront systématiquement euthanasiées si elles présentent une infection de la patte. La douleur sévère ne sera pas atteinte. Si des animaux atteignent ce stade, ils seront immédiatement mis à mort. Nous n’utiliserons pas d’analgésiques (en dehors de la mycolactone pour le groupe test et de la buprénorphine pour le groupe témoin) car ceux-ci iraient à l’encontre de l’étude. Le but étant de provoquer une douleur post opératoire et de vérifier l’efficacité de la mycolactone dans le traitement de cette douleur. Une observation biquotidienne des souris sera réalisée.
Devenir
A la suite du dernier test plantaire, tous les animaux seront sacrifiés et les pattes seront récupérées pour des études histologiques.
Remplacement
Le bien-être animal a été une des priorités dans la conception de cette étude mais nous ne pouvons à ce stade nous passer d'utiliser des animaux. En effet, la phase réalisée chez les animaux permettra de valider l’effet de la mycolactone dans le traitement de douleurs post opératoires dans un système biologique complexe où de nombreux facteurs peuvent intervenir (disponibilité du composé, dégradation, capacité du composé à atteindre sa cible...). De plus cette phase est obligatoire pour le développement d’analgésiques destinés à la santé humaine et animale.
Réduction
Le nombre d’animaux prévu pour cette étude est suffisant pour que les résultats soient statistiquement significatifs sans pour autant exagérer ce nombre. Afin de valider des différences statistiques, les groupes seront composés de 6 souris. Si l’analyse des résultats montre l’absence d’effet analgésique de la part de la dose/formulation de mycolactone utilisée, ou souligne des effets secondaires (non rapportés à ce jour dans nos travaux précédents), les expériences ne se poursuivront pas pour cette dose/formulation. Cependant, si les résultats montrent un effet analgésique sans effet indésirable, alors l’expérience sera répétée une seconde fois indépendamment pour accroître la qualité de nos résultats. Il est nécessaire de répéter les résultats (formulations/doses retenues) dans une deuxième expérience indépendante. Ce préalable est indispensable pour la poursuite de notre étude, qui vise à réaliser une étude dans un modèle animal plus complexe.
Raffinement
Afin de raffiner les conditions de vie des souris, un suivi adapté des animaux a été instauré afin de réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, mais aussi la détresse ou l'angoisse qu'elles pourraient éprouver. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux et bénéficient d’un enrichissement adapté. Un suivi régulier sera effectué sur l'ensemble des animaux et des indicateurs comportementaux et physiques sont prédéfinis et constituent les points limites. Pour éviter toute souffrance ou stress lors du protocole expérimental, un anesthésique gazeux (isoflurane) sera utilisé. La procédure d’incision sera d’abord pratiquée sur des cadavres pour s’entrainer à maitriser et calibrer l’incision avant de démarrer le protocole sur animaux vivants. Cet entrainement permettra de réaliser la procédure efficacement et rapidement pour éviter toute souffrance ou stress inutile aux animaux et diminuer le temps d’anesthésie générale. La dose de mycolactone appliqué sera plafonnée à une certaine dose, quelle que soit la formulation, car nos travaux précédents montrent qu’au-delà de cette dose il y a un risque de lésions tissulaires et d’inflammation. Lors de chaque expérience, les données des tests plantaires seront analysées au fur et à mesure et les tests seront arrêtés si à 2h aucun effet analgésique n’est observé de la part de la dose/formulation de mycolactone testée. Si un effet analgésique apparait, les tests se poursuivront jusqu’à ce que l’effet disparaisse, c’est-à-dire lorsque le temps de réaction au test plantaire des souris ayant reçu la mycolactone sera de nouveau identique à celui des souris du groupe témoin incisé non traité. De plus, pour le groupe de souris ayant reçu la buprénorphine, les tests de ce groupe seront arrêtés une fois que l’effet de la buprénorphine aura disparu (soit environ 6h selon la bibliographie). C’est-à-dire lorsque leur temps de réaction au test plantaire sera de nouveau identique à celui des souris du groupe témoin incisé non traité. Ce projet s’inscrit ainsi dans une gestion éthique de l’expérimentation animale et, est donc en accord avec les réglementations européennes et françaises de bonnes pratiques de laboratoire.
Choix des espèces
De nombreuses études visant à identifier de nouveaux analgésiques utilisent « l’espèce souris ». Dans notre contexte, cette espèce nous semble très pertinente puisque son utilisation nous a permis de disséquer la propriété anti-douleur de la mycolactone. De plus, de très nombreux outils pour cette espèce sont disponibles (pour analyser les propriétés analgésiques et les effets secondaires indésirables). Les animaux utilisés pour ce protocole devront, à l’initiation de l’expérimentation être âgés de 8 semaines (maturation immunitaire et maturation du système nerveux).
IRM fonctionnelle du cortex auditif ovins
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
34 moutons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisés et remis dans leur troupeau. Ils subissent jusqu'à quatre séances d'IRM sous anesthésie de deux heures et demie, et cinq agneaux sont castrés pour maintenir un groupe social mixte. Le projet cartographie le cortex auditif ovin et développe des techniques de neuro-imagerie présentées comme utiles au "bien-être" des animaux non-humains d'élevage. Le porteur mobilise un argument de consommation, citant un Eurobaromètre sur le prix que les Européens accepteraient de payer, et affirme que l'étude ne peut être menée que sur l'animal vivant.
Objectifs
Les objectifs généraux de ce projet sont : 1) Fournir des connaissances fonctionnelles et structurelles fondamentales sur le système sensoriel auditif du cerveau du mouton et en particulier sur son réseau de traitement de l'information sociale. 2) Initier l'utilisation de l'IRM fonctionnelle pour étudier les capacités perceptives et cognitives d’animaux de ferme. De plus, l'objectif du premier avenant (accepté) était d'inclure un groupe supplémentaire d'ovins afin de pouvoir les entraîner dès leur plus jeune âge à rester immobiles dans l’IRM afin de permettre la réalisation de courtes séances IRM à l’état éveillé sans la contrainte de l’anesthésie. D’autre part, nous nous demandons quels sont les effets de l’anesthésie au niveau de l’activité cérébrale. Pour cela, nous envisageons de réaliser des sessions IRM sous anesthésie avec les animaux de ce groupe supplémentaire, tout en appliquant la même procédure que celle qui fait l’objet de la saisine originale.
Bénéfices attendus
Cette étude va contribuer à l'enrichissement des connaissances scientifiques en ce qui concerne les capacités perceptuelles et cognitives des ovins ainsi que les mécanismes neuronaux sous-jacents. En effet, ce projet permettra le développement de techniques de neuroimagerie cognitive afin d'explorer l'état mental de ces animaux, ce qui permettra à long terme d'obtenir une image claire des besoins nécessaires au bien-être d'une espèce ou même d'un individu. En plus d'étudier le cerveau du mouton afin de comprendre les besoins nécessaires à son bien-être, ce modèle animal est également un modèle important du cerveau humain. Les données qui seront obtenues au cours de ce projet en ce qui concerne le système auditif du mouton pourront également être utiles pour les recherches sur les pathologies qui impliquent des modifications de la perception auditive. De plus, l'IRM est une technique de neuroimagerie non invasive et la plus adaptée pour étudier l’organisation anatomique et fonctionnelle des connexions cérébrales; cette méthode ne nécessitant pas l'euthanasie de l'animal contrairement à d'autres techniques plus invasives. Enfin, l’intérêt de cet avenant est d’intégrer des agneaux à l’étude et de les entraîner dès leur plus jeune âge à rester immobiles dans l’IRM afin de permettre la réalisation de courtes séances IRM à l’état éveillé sans la contrainte de l’anesthésie. Cela aura ainsi pour but de minimiser le stress des individus lié à la procédure d’anesthésie ainsi qu’au dispositif IRM et à la présence humaine. En effet, l'entraînement, qui est basé sur un renforcement positif (= récompense), permettra une optimisation de la relation de l’animal avec le soigneur ainsi qu’une habituation au matériel nécessaire pour réaliser les séances IRM. Ainsi, dans le cadre de ce projet, le développement de protocoles dans différentes conditions (anesthésié, éveillé) permettra de réaliser des neurosciences cognitives chez l’ovin.
Procédures
IRM sous anesthésie (4 sessions max, d'une durée de 2,5h chacune) Castration des 5 agneaux du groupe entraînement (durée entre 20 et 45 min par individu : variable selon le temps de réveil)
Impact sur les animaux
Des effets indésirables peuvent apparaître notamment lors de la procédure de l’anesthésie. On peut ainsi retrouver des modifications de la fréquence cardiaque et respiratoire en lien avec cette technique. L’animal peut également avoir des difficultés à se réveiller à la suite de l’anesthésie et présenter des vomissements. Il se pourrait que l’animal soit allergique à l’anesthésie. On peut également retrouver un stress lié au transport des animaux et / ou à leur capture. Les mâles pourront également présenter des signes cliniques (perte d'appétit, décubitus prolongé) à la suite de la castration. Pour limiter ces signes cliniques, un analgésique (butorphanol) leur sera administré.
Devenir
Les animaux retournent dans leur troupeau à l'UEPAO.
Remplacement
Ce projet vise à étudier les capacités de perception auditive des moutons et à développer les techniques de neurosciences cognitives capables d'étudier cet aspect et d'autres de la vie mentale des animaux. La recherche sur la vie mentale des animaux nécessite l'inclusion de l'animal dans l'expérience. Cette étude ne peut être conduite sur un autre modèle. Elle ne peut être menée que sur l’animal vivant et aucune méthode de remplacement comme une étude in vitro n’est envisageable.
Réduction
Le total de 24 individus prévus dans ce projet est le meilleur compromis entre la capacité à tester de manière fiable notre hypothèse et la minimisation du nombre d'animaux de recherche utilisés. Le choix d'utiliser l'IRMf réduit également le nombre d'animaux requis car chaque animal peut participer à plusieurs séances expérimentales (maximum 4) et sera maintenu en vie après cette étude. De plus, l'objet de cet avenant est d'inclure 10 agneaux de race Ile-de-France dans ce projet. Le choix de ces 10 animaux est un nombre nécessaire pour constituer un groupe social. Cela nous permettra ainsi d’étudier le comportement et la personnalité de chacun des individus du groupe lors de l'entraînement, et de sélectionner les ovins les plus réceptifs à ce protocole afin de pouvoir réaliser des séances IRM à l’état éveillé.
Raffinement
L’IRM est la méthode la moins invasive et la plus adaptée pour étudier l’organisation anatomique et fonctionnelle des connexions cérébrales. L'utilisation de l'IRM est un raffinement par rapport aux techniques alternatives de neurosciences plus invasives qui nécessitent l'euthanasie de l'animal. A la suite de cette étude, les animaux seront gardés en vie et seront remis dans leur troupeau. Toutes les mesures seront prises pour promouvoir le bien-être des animaux. En particulier, les moutons sont des animaux grégaires, et sont stressés lorsqu’ils sont isolés de leurs congénères. C’est pourquoi, les individus seront en permanence en compagnie d’au moins deux autres membres de leur groupe social. Cet avenant représente un raffinement supplémentaire puisqu'un protocole d’entrainement est mis en place afin d'éviter l’anesthésie des animaux lors des sessions IRM, ce qui implique l’absence des effets indésirables liés à cette technique. De plus, la castration permet de garder un groupe social mixte stable. En effet, nous avons déjà commencé le protocole d'entraînement, et des affinités entre les individus se sont créées. Cet acte chirurgical évitera ainsi la séparation des mâles et des femelles dès la puberté.
Choix des espèces
Les Européens se soucient du bien-être animal et lui accordent une importance toujours plus grande dans leurs choix de consommation - 59% sont prêts à payer un prix plus élevé pour les produits issus de systèmes de production respectueux du bien-être (Eurobaromètre 442). Il y a près de 100 millions de moutons d'élevage rien qu'en Europe. Ce projet fournira des informations sur leurs capacités cognitives et développera des techniques pour nous aider à comprendre leurs besoins en matière de bien-être, ainsi que ceux d'autres animaux d'élevage. Comme ce travail ne vise pas à mettre en évidence le développement du système auditif du mouton, les 24 individus seront tous d'âge adulte (1 à 3 ans). Cela minimise la variabilité possible de la structure et de la fonction cérébrale liée au développement et / ou au processus naturel de vieillissement. L'objet de cet avenant est d'inclure 10 ovins (5 agneaux + 5 agnelles) de race Ile-de-France qui seront âgés d'au moins 4 semaines lors de leur première session IRM sous anesthésie afin de pouvoir comparer l'activité cérébrale avec et sans anesthésie.
Equilibre excitation – inhibition et épilepsie dans le circuit hippocampique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la moitié dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une chirurgie cérébrale avec injection intracérébrale et implantation d'électrodes, puis le déclenchement de crises d'épilepsie par un agent convulsivant, avant une mise à mort par perfusion transcardiaque. Le porteur décrit des crises pouvant atteindre le stade 5 de l'échelle de Racine, convulsion généralisée entraînant l'euthanasie de l'animal. Il justifie les bénéfices par un "intérêt sociétal considérable" et affirme que l'étude des circuits neuronaux ne peut se faire que sur l'animal.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de comprendre le rôle d'un type neuronal spécifique (interneurones médiateurs de l'inhibition périsomatique), dans le contrôle inhibiteur du circuit hippocampique dans les conditions physiologiques et dans l'épilepsie. L'efficacité de cette inhibition dépend directement de la concentration intracellulaire en ions chlorures. Plusieurs travaux in vitro suggèrent qu'un épisode aigu de crise pourrait affecter à plus ou moins long terme les systèmes d'homéostasie des ions chlorures dans les neurones hippocampiques, ce qui pourrait causer un déficit d'inhibition favorisant l'épileptogenèse. De plus, le diurétique bumétanide, qui module aussi l'homéostasie des ions chlorures dans les neurones in vitro, a été proposé comme approche thérapeutique potentielle. Grace à des méthodes d'électrophysiologie et d'optogénétique chez la souris, nous allons tester directement ces hypothèses in vivo.
Bénéfices attendus
Les avantages escomptés sont une meilleure compréhension du fonctionnement cérébral et de ses pathologies (en particulier l'épilepsie), ce qui représente un intérêt sociétal considérable.
Procédures
Les animaux seront soumis à 5 types d'intervention, sur une durée totale de 2 à 4 mois : procédures chirurgicales (injection intracérébrale d'agents neuromodulateurs et implantation de miniatures pour enregistrement chez l'animal vigile), d'une durée de 1 à 6h suivie d'une période de récupération d'au moins une semaine et d'attente de l'expression des constructions virales de 2 à 4 semaines, procédure de déclenchement de crises d'épilepsie par injection intracérébrale d'agent convulsivant, d'une durée de 2 à 5h, procédure d'enregistrement sur l'animal vigile libre, d'une durée d'1 à 6h (cycle comportemental complet, incluant une période de sommeil jusqu'au réveil), ou en mode tête-fixée, par sessions quotidiennes de quelques minutes au départ (période d'acclimatation d'1 à 2 semaines) puis progressivement jusqu'à 2 ou 3h (période d'apprentissage et d'entrainement, sur 2 à 4 semaines), procédure d'enregistrement sur l'animal anesthésié, d'une durée de 3 à 6h, et enfin anesthésie terminale (perfusion transcardiaque), procédure d'une durée de 30 à 60 min, au cours de laquelle l'animal est mis à mort.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables suivants sont attendus : - la stabulation dans des conditions standardisées (et donc monotones) afin de permettre des résultats reproductibles et comparables à ceux d'autres laboratoires - l'expression de crises d'épilepsie, condition dommageable au bien être animal - des anesthésies (avec ou sans réveil) et interventions chirurgicales (craniotomie) afin d'insérer les électrodes d'enregistrement de l'activité cérébrale, avec le cas échant l'inconfort associé au réveil post-chirurgical et un risque infectieux - des mises à mort prématurées (euthanasie) en fin d'expérience
Devenir
Les animaux doivent être maintenus en vie jusqu'à la dernière procédure (terminale), de façon à ce que les données scientifiques soient recueillies, y compris les données histologiques post-mortem.
Remplacement
Les fonctions des réseaux neuronaux sont assurées par leurs caractéristiques intrinsèques (connectivité précise entre multiples types neuronaux) autant qu'extrinsèques (interactions avec les autres régions cérébrales), ce qui impose le recours à des techniques invasives d'exploration. L'étude des propriétés des circuits neuronaux impliqués dans la cognition nécessite l'observation et la manipulation de systèmes neuronaux intacts, et ne peut donc se faire que sur l'animal.
Réduction
Seules les expériences absolument indispensables ont été prévues, nous avons évité la répétition inutile d'études antérieures, et le protocole expérimental est soigneusement préparé. Une difficulté notable dans le calcul a priori du nombre d'animaux nécessaire est que les variables étudiées sont nouvelles, et leurs paramètres statistiques (moyenne et variance) par conséquent inconnus. D'après la littérature du domaine, un scénario plausible pour les variables que nous caractérisons est d'être en mesure de détecter une différence de 25% entre 2 échantillons de petite taille issus de distributions suivant une loi Normale dont l'écart type est d'environ 20% de la moyenne. l faut ainsi un échantillon de 10 animaux pour détecter avec une certitude de 95% (risque α de type I) et une puissance de 0.8 (risque β de type II) une différence de 25% entre 2 moyennes dont les distributions suivent une loi Normale (µ, σ=0.2µ). Le nombre d'animaux retenu dans notre protocole, nécessaire pour garantir un pouvoir statistique suffisant pour chacune de nos expériences réalisée avec un taux de succès de 50%, est donc de 20 par lot expérimental. Toutefois, les animaux sont préparés par petites séries de 4 ou 5 et les résultats analysés au fur et à mesure, ce qui permet d'ajuster le nombre final d'animaux utilisés, la procédure s'arrêtant dès que le nombre de 10 expériences réussies par groupe est atteint.
Raffinement
Les dommages en termes de souffrance animale sont minimisés par les conditions d'élevage (cages collectives et enrichies de carré de coton jusqu'à la chirurgie et autant que possible après), le suivi des règles de l'art pour les interventions chirurgicales (aseptie, anesthésie et antalgie), le suivi régulier (quotidien dans les periodes péri-opératoires et après le déclenchement des crises) des animaux par le chercheur responsable et par le personnel animalier (définition de points limites de bien être général qui déclenchent soins particuliers, voire euthanasie, selon leur gravité). Les animaux sont étroitement surveillés lors de l'induction de l'épisode épileptique aigu, et des points limites spécifiques ont été définis selon l'échelle de Racine. Si l'animal atteint le stade 5 d’intensité des crises (convulsion motrice généralisée), l'animal est immédiatement anesthésié (inhalation d'isoflurane) et un anti-convulsivant est administré (Diazepam, 5mg/kg, 0.5ml/kg, IP). Si le stade 5 persiste au réveil de l'animal, il est mis à mort sans délai par dislocation cervicale sous anesthésie isoflurane. L'état de récupération dans les jours qui suivent l'état de crise est étroitement surveillé (alimentation, récupération comportementale). Les animaux sont conservés le minimum de temps nécessaire au projet. Le phénotype n'est pas dommageable pendant la période de latence (absence de crise) qui suit l'état épileptique aigu et qui dure 2 à 6 semaines selon les individus. Les enregistrements les plus tardifs sont réalisés dès l'apparition des crises spontanées (stade chronique), dont l'expression est vérifiée chaque jour, afin de minimiser la durée du phénotype épileptique subi par l'animal. Enfin, des points limites spécifiques à chaque procédure sont décrits pour chaque étape du projet.
Choix des espèces
Nous avons opté pour l’utilisation de la souris car cette espèce présente des similitudes neuronales et cognitives suffisantes pour assurer la pertinence des investigations menées par rapport au cerveau humain. C'est également l'espèce de choix pour modéliser la pathologie cérébrale concernée par cette étude, représentant un bon équilibre entre les bénéfices (disponibilité d'outils de biologie moléculaire, de génétique et de pharmacologie, facilité d'élevage, pertinance par rapport aux pathologies chez l'homme) et les dommages escomptés (souffrance liées aux conditions d'élevage ou d'expérimentation). En outre, une quantité de données considérable dans le domaine des Neurosciences Cognitives a été obtenue avec cette espèce, ce qui nous permet une comparaison des résultats obtenus et une minimisation du nombre d'animaux utilisés en s'appuyant sur des données publiées par d'autres équipes et obtenues à l'aide de protocoles expérimentaux similaires. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes (4-8semaines), car c'est la tranche d'âge qui donne les meilleurs résultats pour les manipulations optogénétiques (meilleur taux de succès d'infection virale, meilleure récupération post-chirurgicale, enregistrements plus faciles sur cerveau jeune du fait des propriétés physiques de la dure mère et du tissu cérébral probablement moins myélinisé) tout en permettant une expérimentation sur un système nerveux qu'on considère mature, et en minimisant autant que possible la durée d'élevage en condition d'animalerie de laboratoire.
Modèles d’études in-vivo de la réponse à des traitements anti-tumoraux: implication de la réponse immune humaine ou murine
- Recherche appliquée
- Cancers
1 350 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie subit une splénectomie sous anesthésie, toutes reçoivent une greffe de cellules tumorales et des prélèvements sanguins hebdomadaires, avant traitement par des molécules anticancéreuses et imagerie sous anesthésie. Le projet teste l'efficacité de traitements anti-tumoraux sur des souris aux tumeurs humaines greffées, avec des bénéfices situés à long terme. Le porteur affirme que ce modèle demeure "indispensable" et juge la modélisation cellulaire ou informatique "trop imparfaite".
Objectifs
Obtenir une réponse objective pour de nouveaux traitements (petites molécules, anticorps monoclonaux...) anti-tumoraux dans le cadre d'un organisme complet, prenant ainsi en compte l'ensemble des acteurs biologiques qui pourraient y concourir.
Bénéfices attendus
Il s'agit pour nous d'évaluer l'efficacité de nouveaux traitements dirigés contre le cancer. Les molécules testées auront préalablement été selectionnées sur un ensemble d'expériences réalisées sur des cellules en laboratoire. Il s'agira donc de confirmer l'efficacité de ces traitements dans le cadre d'un être vivant complet (murin ou humanisé). Les benefices à long terme seront de pouvoir mettre sur le marché de nouveaux traitements et d'aider dans la lutte contre le cancer. L'analyse de l'importance de la réponse immunitaire fait que ces futurs traitements pourront s'intégrer dans des programmes adaptés à chaque patient.
Procédures
Les animaux inclus dans la procédure "SCID-Hu-PBL-Tumeur" subiront une splénectomie (1 fois: anesthésie profonde, retrait et ablation de la rate, suture et reveil). Cela représente donc 600 animaux. L'abaltion de la rate correspond au temps 0 de l'experimentation. L'opération dure 1 heure entre l'injection de la solution anesthésiante et le réveil suite à l'injection de l'antidote. Des prélèvements sanguins sont prévus sur animaux vigiles (1 prélèvement sanguin / semaine sur les 4-5 semaines expérimentales). Tous les animaux quelque soit la procédure seront suivis pour les paramètres sanguins soit les 1450 animaux. Les animaux seront traités avec des molcules anti-cancereuses (1 fois par semaine,pendant 4 semaines maximum, pour la moitié des animaux soit 725 sur les 5 années). Injection de cellules tumorales sous-cutannées: 1 fois (30 secondes) pour tous les animaux soit 1450. Injection en intra-péritonéale de cellules immunitaires: une seule fois, 30 sec, 600 annimaux. Anesthésie Gazeuse: 5 min maiximum par animal, 3 fois par semaine, pendant 4 /5 semaines experimentales, pour les 1450 animaux prévus sur les 5 années.
Impact sur les animaux
Splenectomie: douleur à la piqure, animal grogi au reveil; Prélèvement sanguin sur animal vigile: stress à la préhension, légère douleur à la piqure ; Injection de cellules: stress de la préhesion, douleur à la piqure; Injection de traitement : stress de la préhension, douleur à la piqure; Anesthésie gazeuse: stress au dépot des animaux dans la boite et jusqu'au moment de l'induction
Devenir
Nous sommes dans l'obligation éthique et scientifique de sacrifier les animaux à l'issue de chaque protocle car nous allons pratiquer des prélèvement d'organes vitaux pour l'analyse post-mortem.
Remplacement
L'ensemble du projet correspond à une phase finale d'études in-vitro préalable. Le modèle nous permettra ainsi de réaliser un suivi précis tant au niveau de l’évolution de la masse tumorale (par Imagerie du petit animal) que du système immunitaire. L’approche in-vivo nous apportera tous les éléments indispensables à la mise en place de futrus protocoles thérapeutiques sur des masses tumorales humaines (création d’une véritable « niche » et du microenvironnement tumoral) que l’on ne peut obtenir que par xeno/-greffe. L’ensemble des observations nous permettra alors de confirmer et d’approfondir les résultats obtenus in-vitro, et de proposer des traitements pour de futurs essais cliniques chez l’homme. Dans la mesure où la modélisation experimentale cellulaire ou informatisée est trop imparfaite, ce type de modèle demeure indispensable à l'évaluation de ces futurs traitements.
Réduction
Grâce à notre experience et aux conseils scientifiques des experts, nous n'avons pas besoin de mettre au point le protocole qui sont bien établis. L'ensemble des animaux ne servira uniquement que pour l'étude de l'effet des traitements. Néanmoins, dans un souci de conservation de la fiabilité des résultats et pour ainsi éviter d'avoir à refaire les experiences, nous réaliserons des groupes d'étude suffisament solides d'un pooint de vue statistique. AInsi, pour des modèles simples de regression tumorale sur animaux immunocompétants des groupes de 30 animaux pourraient etre envisagés, et sur les modèles humanisés des groupes de 25 souris seront suffisantes.
Raffinement
Nous avons cherché à optimiser l'expermientation en metant en place une méthodologie d'étude courte et efficace: suivi de tumeur sur un temps limité (4 semaines maximum), tout en minimisant les douleurs ou la detresse. Nous avons ainsi choisi des modèles de souris dont nous connaissons les comportement et la capacité de prise de greffe, qui sont élevées sur place (reduction du transport, condition d'élevage de haute qualité). Les animaux plus jeunes, seront manipulés regulierement et ainsi entrainés en vue d'une reduction du stress. Par ailleurs, l'ensemble des procédures seront strictement limités aux points limites experimentales (taille des tumeurs, poids des animaux, comportement locomoteur). En cours d'experimentation, nous avons choisi de faire les greffes tumorales uniquement sous-cutanées (au flanc arriere) de manière à ne gener en rien la vie de l'animal (locomotion, alimentation), le suivi sera ainsi facilité par mesure manuelle externe sur animal vigile (mesure au pied à coulisse), ou grâce à un systèmle d'imagerie par bioluminescence (l'animal sera alors sous anesthésie dans l'appareil à +37°C et aura préalablement reçu une injection de luciférase). Aucune mesure invasive ne sera ainsi faite.
Choix des espèces
Nous utilisons des souris SCID ou NSG (modèles immunodéprimés) pour permettre la xénogreffe humaine, s'agissant de créer une chimère à la fois tumorale et immunitaire humaine. Et des souris BalB/c ou C57/Bl6 pour les modèles de cancers murins. Les souris sont des petits rongeurs qui permettent de réaliser des groupes cohérents et limités pour l’étude efficace des effets des traitements thérapeutiques testées en faibles quantités. C’est le modèle de choix pour les études précliniques des médicaments anti-cancéreux. Par ailleurs le campus dispose d’outils de mesure performants spécialement adaptés à la souris (Imagerie du petit animal). Les souris entreront en phases experimenale à partir de 6 semaines. Elles sont sevrées et sexées. Elle sont suffisament robustes pour suporter les traitements, et suffisament grandes pour les injections et le developement des cellules tumorales.
Etude d’excretion de substances actives chez le rat ou la souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Rats : 280
80 souris et 280 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont isolés jusqu'à 168 heures dans des cages à métabolisme, sur grille et exposés à la lumière, ce que le porteur décrit lui-même comme un inconfort, après administration de candidats médicaments par diverses voies. Ces études d'excrétion s'inscrivent dans le cadre réglementaire obligatoire pour la mise sur le marché d'un médicament, et les animaux sont tués pour doser ce qui reste dans leur corps. Le porteur indique qu'il n'existe "aucun modèle in vitro" applicable à l'excrétion dans un organisme vivant.
Objectifs
Ce projet a pour but de décrire les études d’excrétion réalisées dans le cadre des études de pharmacocinétique réalisées chez les rat ou les souris. Chaque étude permet d’évaluer le devenir de molécules contenues dans un candidat médicament dans l'organisme. L’objectif est de récolter des données concernant la quantité des molécules excrétées par rapport aux quantités administrés ainsi que de déterminer la durée d’excrétion. Après l'administration, des recueils d’urines, fèces ou de bile pour mesure de la concentration de la molécule seront réalisés. L’objectif de ces tests n’est pas de démontrer une efficacité de la molécule ou de mettre en relief les effets secondaires possibles, mais de démontrer que le produit est bien excrété du corps après une période définie.
Bénéfices attendus
Ce type d'étude permet de comprendre comment et pendant combien de temps des molécules sont excrétées de l'organisme après leur administration et sont nécessaires pour évaluer la sécurité d'un médicament.
Procédures
Les animaux sont placés individuellement dans les cages pendant une certaine durée : Pour les études d’excrétion biliaire (procédure 1), 3 à 4 jours d’acclimatation des rats sur litière + 24h maximum dans les cages à métabolisme. Pour les animaux utilisés pour les études d’excrétion urine et fèces (procédure 2), la durée, seul dans les cages à métabolisme, est au maximum de 168h. Les administrations iv, vaginale, rectale, oculaire, intranasale, intra-auriculaire, topique sont réalisées une seule fois sous anesthésie en moins d'une minute Les administration PO sont réalisées une seule fois sur animaux vigile en moins d'une minute
Impact sur les animaux
Dans le cas des études pour récupérer l'urine et fèces, les animaux sont placés individuellement dans les cages à métabolisme. Les animaux sont seuls dans la cage, sur grille et plus exposé à la lumière que dans les cages classiques, ce qui provoque un inconfort chez l’animal et ne correspond pas à son environnement habituel.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de l'étude, afin d’analyser la quantité retrouvée dans le corps de l’animal et non excrétée.
Remplacement
Il n’existe à ce jour aucun modèle in vitro permettant d’étudier l’excrétion d’une molécule dans un organisme vivant. Un autre modèle n’est pas applicable dans la mesure où ces études rentrent dans un cadre réglementaire obligatoire pour la sécurité d'un médicament.
Réduction
Pour les études réglementaires le nombre minimum utilisé est défini par les guidances. Pour les études précoces dans le développement d’un médicament, un nombre d’animaux inférieur ou égal à celui recommandé par les guidances est utilisé. Dans la mesure du possible un maximum de données est collecté sur un même animal afin de ne pas avoir à reproduire l’expérimentation.
Raffinement
Une procédure de point limite est en place au laboratoire. Dans le cadre de l'utilisation des cages à métabolisme ou le placement seul dans une cage, les cages sont regroupées sur le même portoir afin que les animaux soient proches l’un de l’autre pour favoriser le lien et la communication entre animaux (instinct grégaire). Une plaque métallique finement perforée est ajoutée dans les cages afin de permettre à l’animal de se reposer. Des panneaux opaques sont placés sur un des quatre côtés de la cage pour éviter l’exposition directe à la lumière. Les animaux sont observés tous les jours et les points limites (voir annexe) basés sur l’apparence et le comportement de l’animal sont définis dans une grille afin de décider si l’animal doit être soulagé de son inconfort.
Choix des espèces
Les espèces rat ou souris seront utilisées conformément aux guidances techniques. Le choix de l’espèce pour chaque étude sera en cohérence avec les espèces utilisées pour toutes les études nécessaires pour le dossier d’autorisation de mise sur le marché (AMM) de la molécule. Les animaux utilisés sont âgés au minimum de 6 à 12 semaines conformément aux recommandations de la règlementation.
Acquisition de données de phénotypage grâce à l’outil d’alimentation de précision chez le porc en engraissement
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
1 800 porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis envoyés à l'abattoir commercial pour la consommation. Suivis pendant l'engraissement, ils subissent jusqu'à trois prises de sang, des prélèvements de fèces, des mesures d'épaisseur de lard et des prises de température sous contention. Le projet vise à valider un outil d'alimentation de précision et à recueillir des données de phénotypage pour optimiser l'élevage porcin. Le porteur classe ces manipulations en gravité modérée et affirme que les mesures ne peuvent se faire que sur un animal "entier et vivant".
Objectifs
Un outil d’aide à la décision été développé pour le porc en croissance pour traiter les données individuelles des animaux, déterminer en fonction des performances de chaque porc la composition de l’aliment à lui distribuer chaque jour, et piloter un distributeur d’aliment capable de distribuer un aliment spécifique pour chaque animal. Une salle expérimentale dédiée à l'alimentation de précision a été équipée d'automates permettant l'acquisition de données et l'application de ces outils. L’objectif ce projet est d'utiliser ce dispositif dans l'optique d'acquérir des données de phénotypage en conditions pratiques sur des porcs suivis durant toute la période de croissance-finition (le stade « croissance » correspond à la période d’élevage de 25-30 kg jusqu’à 65 kg de poids, le stade « finition » correspond à la période d’élevage de 65 kg à 110/115 kg de poids, soit jusqu’au départ à l’abattoir). Ces données de phénotypage serviront à la mise en relation des différens dimensions de la performance des porcs (zootechnique, santé, bien-être, comportement) dans un objectif d'optimisation multicrière de l'élevage porcin.
Bénéfices attendus
Le projet va permettre de disposer de données multicritères (zootechniques, bien-être animal, comportement, santé). Celles-ci sont bénéfiques pour la compréhension des relations entre les critères cités précédemment et pour établir des relations animal / environnement pour un meilleur pilotage de l'élevage porcin en termes d'efficacité alimentaire, d'impact environnemental, de conduite d'élevage et de bien-être animal.
Procédures
Les animaux pourront être soumis à : - des prises de sang (3 fois au maximum par animal, contention d'une durée maximale de 2 minutes), - des prélèvements de fèces (3 fois au maximum par animal, maintien en cage de 5 minutes maximum réalisé simultanément à la mesure d'épaisseur de lard dorsal et à la prise de température), - des mesures d'épaisseur de lard dorsal par échographe (3 fois au maximum par animal, maintien en cage de 5 minutes maximum réalisé simultanément aux prélèvements de fèces et à la prise de température), - une prise de température (3 fois au maximum par animal, maintien en cage de 5 minutes maximum réalisé simultanément à la mesure d'épaisseur de lard dorsal et aux prélèvements de fèces).
Impact sur les animaux
Les seules nuisances possibles sont celles associées aux contraintes liées à la contention nécessaire aux prélèvements (sang, fécès, température) ou mesure avec échographe (épaisseur de lard). Cependant, la contention est brève (inférieure à 5 minutes), limitée en nombre (au maximum 3 fois par animal) et assurée par du personnel compétent sur l'espèce porcine.
Devenir
Les animaux sont destinés à la consommation. Ils sont donc envoyés en abattoir commercial pour rejoindre la chaîne alimentaire.
Remplacement
Les mesures sur animaux sont requises car l’objectif de l’étude est de mesurer les réponses des porcs à leur alimentation. Ces travaux ne peuvent se faire autrement que sur un animal entier et vivant.
Réduction
Le nombre d’animaux dans chaque répétition (120) et le dispositif expérimental mis en place ont été déterminés sur la base d’essais antérieurs et permettent d’atteindre le niveau de précision souhaité pour évaluer avec précision les effets de l’alimentation malgré la forte variabilité interindividuelle généralement observée dans ce type d'étude.
Raffinement
Cette expérimentation est réalisée dans une salle avec des équipements (station d'alimentation automatique, système de pesée automatique, abreuvoirs connectés) permettant de mesurer les performances individuelles d'animaux élevés en un seul groupe en conditions proches de celles rencontrées pratiquement en élevage.
Choix des espèces
La cible de l'étude est le porc en croissance-finition (25 à 120 kg). Ce stade physiologique est celui pour lequel l'outil d'aide à la décision a été développé et il faut donc utiliser le type d'animaux cible dans l'expérimentation. Dans notre essai, nous allons donc utiliser des animaux des porcs en croissance-finition et croisés Pietrain x (Large-White x Landrace), un croisement très répandu dans les élevage commerciaux français.
Evaluation préclinique à l’aide d’un modèle murin d’une nouvelle thérapie ciblée dans les leucémies aiguës myéloïdes.
- Recherche appliquée
- Cancers
210 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit dans la veine de la queue, sans anesthésie, des cellules leucémiques humaines, issues de patients ou de la moelle de souris déjà greffées et traitées, puis jusqu'à neuf prises de sang hebdomadaires à la veine faciale et, pour une partie, jusqu'à quatre semaines de traitement mêlé aux croquettes. Le porteur écrit que ces gestes "engendrent du stress et de la douleur", puis qualifie les procédures de "peu douloureuses" pour se passer d'anesthésie. Alors que l'une des deux molécules est déjà autorisée hors de France et l'autre en essai clinique chez l'humain, il affirme qu'il n'est "pas possible de mettre en place des méthodes de substitution" pour ce projet.
Objectifs
Ce projet vise à l’évaluation préclinique d’un nouveau médicament pour le traitement des leucémies aiguës myéloïdes. Les leucémies aigües myéloïdes touchent environ 3 500 personnes chaque année – dont une centaine d’enfants – et constituent un défi majeur pour les médecins. Les taux de survie n’ont que modérément évolué ces vingt dernières années. La prise en charge des patients repose actuellement sur la chimiothérapie, en association avec la greffe de moelle osseuse mais le pronostic global reste mauvais en raison de la fréquence élevée des rechutes. Ces rechutes sont causées par la persistance des cellules souches leucémiques insensibles aux thérapeutiques actuelles. Le développement de nouvelles thérapies permettant de cibler ces cellules est donc un enjeu majeur pour la prise en charge de cette maladie . Ce projet scientifique consiste à évaluer l’efficacité in vivo (sur un modèle murin de la maladie) d’une thérapie ciblant spécifiquement ces cellules. Cette thérapie, basée sur l’administration de deux molécules, a été testée au préalable sur des modèles d’étude in vitro et a montré une très bonne efficacité. Le premier objectif de ce projet est de mettre en place le modèle de leucémie aiguë myéloïde, pour cela des cellules issues de patients atteints de leucémie aiguë myéloïde seront injectées à des souris (modèle murin de leucémie aiguë myéloïde). A l’issue de cette expérience, deux modèles seront sélectionnés. Le deuxième objectif est d’évaluer l’efficacité anti-leucémique, pour cela les deux molécules seront administrées aux deux modèles murins de leucémie aiguë myéloïde. Les deux molécules seront administrées seules ou en association pendant un maximum de 4 semaines contre placebo. Le troisième et dernier objectif est de tester l’efficacité des traitements sur le contingent de cellules souches leucémiques. Pour cela les cellules médullaires issues de souris greffées avec des cellules leucémiques de patients et traitées avec les nouvelles thérapies ou le placebo (4 bras de traitement) seront réinjectées à de nouvelles souris. Celles-ci ne seront pas traitées et la survenue ou non d’une rechute de la maladie sera monitorée.
Bénéfices attendus
La leucémie aiguë myéloïde est une maladie qui peut survenir à tout âge, mais seulement 25 % des cas sont diagnostiqués avant 25 ans. C'est surtout après 40 ans que la fréquence de la maladie augmente, l'âge moyen au moment du diagnostic étant de 65 ans. Le pronostic est particulièrement défavorable pour les personnes diagnostiquées plus tardivement. Plus âgées et pouvant présenter certains problèmes de santé, elles ne peuvent pas bénéficier d’un traitement intensif (chimiothérapie et greffe de moelle osseuse) qui leur serait défavorable car trop toxique. Le mauvais pronostic de la pathologie est également dû à la fréquence élevée des rechutes, ceci dans tous les groupes d’âge. Ces rechutes sont dues aux cellules souches leucémiques, un sous type de cellules cancéreuses qui est peu sensible à la chimiothérapie conventionnelle et peut donc persister dans l’organisme après traitement, permettant à la maladie de se développer à nouveau après une période de rémission. Le développement de thérapeutiques alternatives moins toxiques et ciblant plus efficacement les cellules souches leucémiques est donc nécessaire. Les deux molécules candidates pour ce projet sont des composés qui, pour le premier a déjà obtenu une autorisation de mise sur le marché dans le monde (hors France) et pour le second, est testé actuellement dans des essais cliniques (sur l’humain) dans différents cancers dont des cancers du sang. Si l’association montre son efficacité dans le modèle murin de leucémie aiguë myéloïde utilisé pour cette étude, ce projet pourra donc rapidement donner lieu à des essais cliniques chez l’humain. Nos expériences pourraient donc participer au développement de nouveaux médicaments pour traiter la leucémie aiguë myéloïde.
Procédures
Les animaux seront soumis à : - une injection pour chaque animal (animal vigile, contention simple) de cellules leucémiques humaines dans la veine de la queue. Cette intervention ne dure que quelques minutes au maximum en tenant compte du temps de dilatation des veines par la chaleur. - des prélèvements de sang : la prise de greffe sera évaluée sur des prélèvements de sang hebdomadaires qui seront effectués à partir de la huitième semaine post-greffe et ce au maximum jusqu’à 16 semaines, soit 9 prélèvements maximum. Cette intervention dure moins d’une minute. - un traitement par voie orale d’une durée maximale de 4 semaines, les molécules étant incorporées dans les croquettes
Impact sur les animaux
L’injection dans la veine de la queue de la souris et les prélèvements de sang au niveau de la veine faciale engendrent du stress et de la douleur chez la souris. Le développement de la leucémie chez l’animal peut entraîner l’apparition d’un affaiblissement et/ou une perte de poids chez l’animal. Les médicaments utilisés n’ont pas de toxicité attendue chez l’animal.
Devenir
A l’issue de chaque procédure les animaux seront euthanasiés, le développement de la leucémie ne permettant pas de les garder en vie. Ce développement n’est pas réversible et entrainerait la mort des animaux.
Remplacement
Le projet scientifique porte sur l’évaluation de l’efficacité d’une thérapie ciblée (association de deux molécules candidates) sur un modèle de souris mimant le développement de la leucémie aigüe myéloïde. Il s’agit du modèle in vivo classiquement utilisé pour les leucémies aiguës myéloïdes et plus largement pour les cancers de la moelle osseuse et du sang afin de valider l’étape préclinique. Un modèle in vitro ne peut pas remplacer le modèles in vivo car il ne reproduit pas la caractéristique systémique de cette maladie humaine (qui se traduit par une atteinte de tous les organes qui fabriquent les cellules sanguines). De plus, le maintien d’un modèle in vitro basé sur l’utilisation des cellules de patients se révèle impossible sur la durée, la survie de ces cellules étant limitée dans le temps car n’ayant pas le microenvironnement nécessaire pour leur maintien. Par ailleurs, l’effet de l’environnement des cellules souches leucémiques s’avère fondamental dans le développement des leucémies aiguës myéloïdes, dans l’apparition d’éventuelles résistances et dans l’effet de la leucémie aiguë myéloïde sur l’hématopoïèse normale (processus à l’origine de la production des cellules sanguines). Les effets de cet environnement ne peuvent être pris en compte dans leur globalité que dans un modèle in vivo. Les cellules souches leucémiques représentent une petite fraction des cellules leucémiques, elles sont définies par leur capacité à redonner naissance à la leucémie quand elles sont injectées à des souris, capacité que ne possède pas la majorité des cellules leucémiques. Les cellules souches leucémiques sont à l’origine des rechutes de la maladie observées chez les patients. L’évaluation de l’efficacité des candidats médicaments sur les cellules souches leucémiques n’est donc possible que dans un contexte de greffe secondaire après l’étape de traitement qui a lieu lors de la greffe primaire. Il n’est donc pas possible de mettre en place des méthodes de substitution qui évitent l’emploi de modèles animaux pour ce projet.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé à chaque étape (10 souris/condition) est nécessaire étant donné la variabilité de la prise de greffe d'une souris à l'autre, il est suffisant pour exploiter de façon rigoureuse et efficace les résultats de l’expérience et permet d’obtenir un nombre suffisant pour réaliser une analyse statistique fiable. Si la prise de greffe était plus homogène qu’attendu dans la première étape du projet, le nombre d’animaux nécessaire à la seconde étape serait réduit. Lors de la première étape 5 échantillons de cellules leucémiques, issus de 5 patients différents, seront testés soit un total de 50 souris, car toutes les cellules issues de patients ne se greffent pas dans les souris. Lors de la deuxième étape, l’efficacité des molécules candidates sera testée dans 2 des modèles établis à l’étape précédente, sur la base de groupes de 10 souris, cette étape nécessite 80 souris. A l’issue de cette étape, afin d’évaluer l’efficacité des molécules sur les cellules souches leucémiques, une greffe secondaire sera pratiquée, les cellules d’une souris traitée (molécule(s) ou placebo) devant être réinjectées à une autre souris, cette étape nécessite également 80 souris, soit un total de 210 souris pour le projet. Il est indispensable d’évaluer l’efficacité des molécules sur ces cellules souches leucémiques, car elles sont à l’origine des rechutes de la maladie après une période de rémission. Ces cellules souches leucémiques étant définies comme des cellules étant capables de redonner naissance à la maladie après greffe dans des souris, il est nécessaire pour évaluer l’efficacité sur ces cellules souches leucémiques de réaliser une deuxième greffe.
Raffinement
Les différentes procédures envisagées ne nécessitent qu'une simple contention de l'animal car elles sont peu douloureuses, elles ne nécessitent donc pas d'anesthésie locale ou générale. Des éléments d’enrichissement du milieu seront mis à la disposition des souris: coton, litière papier pour la confection de nids. Les traitements seront administrés per os avec les croquettes pour éviter la souffrance liée au gavage. En sus des points de surveillance habituels, dans le cadre de ce projet, seront surveillés une fois par semaine dès le début du projet: les points d'injection, les points de ponction, le bilan sanguin. Des points limites spécifiques à cette expérience ont été définis afin d’éviter toute souffrance chez les animaux.
Choix des espèces
La connaissance approfondie du modèle de souris fait de cette espèce, une espèce de choix dans la réalisation d’une étude préclinique et permet d’obtenir des données reflétant les interactions physiologiques de l’organisme vis à vis des molécules candidates testées dans ce projet. Ce projet a été initié dans le respect de l’éthique et de la sensibilité de l’animal. De nombreux modèles de souris immunodéprimées peuvent accepter les greffes de cellules humaines. Le modèle souris immunodéprimée que nous avons choisi représente le modèle le plus adapté aux transplantations de cellules leucémiques humaines car la greffe ne nécessite pas d'irradiation préalable de l'animal et elle représente le modèle le plus proche de la physiopathologie humaine. Ces animaux ne présenteront pas d’atteintes physiques et/ou comportementales sévères dans le cadre de ce projet car, et bien que ne présentant pas de système immunitaire fonctionnel, ils seront élevés en portoirs ventilés et changés sous hotte. Les animaux utilisés seront des souris adultes entre 6 et 10 semaines en conformité avec les données de la littérature pour ce type de modèle.
Thérapie génique ciblant la voie de nettoyage des cellules pour limiter les phénomènes neurodégénératifs dans les maladies causées par la protéine α-synucléine pathologique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 2400
11 520 rongeurs, 9 120 souris et 2 400 rats, vont subir chacun jusqu'à deux chirurgies de trente minutes, l'une pour induire la maladie étudiée, l'autre pour administrer une thérapie génique censée relancer la dégradation des agrégats d'α-synucléine dans les neurones. Tous sont tués à l'issue pour une étude histologique du cerveau, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, et passent un test locomoteur que le porteur qualifie de "non invasif et non contraignant" sans le nommer. Il affirme viser un traitement curatif, et écrit espérer "éviter la neurodégénérescence chez des modèles animaux de maladies neurodégénératives". Pour justifier un effectif de 11 520 rongeurs, il cite seulement des études pilotes et un nombre de rongeurs qu'il dit "minimum mais suffisant".
Objectifs
Les maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson (MP) ou l’atrophie multisystématisée (AMS) sont caractérisées par l’agrégation d'une protéine mutée dans différents types cellulaires. Ces agrégats, toxiques pour les cellules, provoquent après accumulation des symptômes moteurs tels qu’une rigidité musculaire, une difficulté/incapacité à initier le mouvement , mais aussi des symptômes non-moteurs comme un état dépressif ou des troubles digestifs. Actuellement, ces maladies neurodégénératives ne possèdent pas de traitement curatif, mais seulement des traitements symptomatiques ayant un effet limité, accompagné d’effets indésirables. Le but de ce projet est de développer un outil thérapeutique visant à restaurer la voie de nettoyage des neurones en permettant ainsi de dégrader les agrégats protéiques.
Bénéfices attendus
La maladie de Parkinson touche plus de 100.000 personnes en France, dont 80% sont âgées de plus de 65 ans. Au cours des années à venir nous allons observer une augmentation importante du nombre de cas en raison du vieillissement de la population et de l'amélioration de l'espérance de vie. De ce fait la découverte d’un traitement curatif (et non symptomatique) est un des grands axes de la recherche. Ce projet novateur ayant pour but de développer un traitement curatif a certains types de maladies neurodégénératives, grâce à des outils permettant de rétablir le fonctionnement des voies de dégradation de protéines agrégées de façon anormales par les neurones. Nous espérons, grâce à notre traitement rétablir l’activité de dégradation et de "nettoyage" dans les neurones et donc éviter la neurodégénérescence chez des modèles animaux de maladies neurodégénératives.
Procédures
Les animaux subissent deux intervention chirurgicales au maximum, avec une durée de 30 minutes, qui correspondent à la création des modèles et le traitement. Une étude de comportement simple locomoteur, non invasif et non contraignant sera réalisée pendant ce projet, afin d'avoir un suivi de l'évolution du modèle et de l'impact du traitement.
Impact sur les animaux
Les animaux subissent au maximum deux chirurgies d'une durée de 30 minutes maximum chacune, correspondant à l'induction du modèle et au traitement. Les effets indésirables sont directement liés à la chirurgie, mais sont bien encadrés par une analgésie et une anesthésie controlées et par un suivi des animaux postopératoire sur 3 jours minimum. De plus ces modèles neurodégénératifs n'entrainent pas de symptome marqué, en effet les désordres sont plutôt visibles à l'échelle moléculaire.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de réaliser une étude histologique détaillée du cerveau et ainsi de déterminer l'éfficacité du traitement.
Remplacement
Dans le respect du R de remplacer, dans l’état actuel des connaissances, nous ne pouvons pas nous passer d’animaux vivants, car il n’est pas possible de mimer le développement spatiotemporel des synucléinopathies dans des modèles in vitro. L’impact bénéfique potentiel sur l’accumulation d’α-synucléine et donc sur le fonctionnement cérébral et la survie neuronale ne peuvent être évalués que chez l’animal.
Réduction
Des études pilotes ont été effectuées au préalable pour confirmer l’activation des lysosomes après injection de plasmide TFEB, et pour confirmer l’absence de toxicité chez l'animal
Raffinement
Acclimatation : une période de deux semaines permet une bonne acclimatation des animaux à leur nouvel environnement. Hébergement : les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect de leur bien-être et avec un milieu enrichi afin de limiter leur stress. Les animaux sont suivis quotidiennement par les animaliers ou les expérimentateurs afin de détecter tout inconfort ou souffrance en observant l’aspect physique, l’état du poil, la vigueur, la nutrition, l’hydratation et le comportement social des animaux. Chirurgie : une attention particulière est apportée pour un maintien de l'asepsie pendant la période opératoire. Et les animaux reçoivent un couverture analgésique une demi-heure avant l’intervention et après l’intervention ainsi que le lendemain . Un suivi post-opératoire est dans tous les cas réalisé grâce à une fiche de scorage qui évalue la perte de poids, la mobilité, les interactions avec les congénères, aspect du poil (0 mauvais, 1 moyen, 2 bon). Les points limites adaptés sont pour les deux espèces : une mobilité réduite voir difficile suite à la chirurgie, une attitude de repli, une allure du poil terne et mal nettoyé, difficulté à récupérer le poids initial, dans les jours suivant la chirurgie. Les animaux sont pesés de manière hebdomadaire pendant toute la durée de l’étude. Si malgré les soins concernant la chirurgie (plaie), les scores restent mauvais durant deux jours consécutifs, si une lésion cutanée s’étend et s’infecte, une décision d’euthanasie est prise par l'expérimentateur en accord avec le personnel zootechnique. Si un constat de stéréotypie est fait, des éléments d’enrichissement comme des roues sont proposés à l’animal. Si cela n’améliore pas son état au bout de 48h, il sera mis à mort selon la règlementation en fonction de l'espèce. Formation : une grande maîtrise technique est demandée à nos expérimentateurs qui sont régulièrement formés au sein de l'institut pour le bien-être animal. Tests statistiques : toutes nos études sont réalisées avec un nombre d’animaux minimum mais suffisant pour pouvoir obtenir des résultats qui sont statistiquement représentatifs, et ainsi limiter la répétition des d’études.
Choix des espèces
La souris permet de travailler les modèles de type pathologies humaines, une fois ces modèles bien établis , ils sont transposables au rat, espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L’organisation du système nerveux central de cette espèce est assez proche de celle de l’homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l’espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes synaptiques à une échelle moléculaire. Cela rend les enseignements tirés de l'étude des tissus du rat largement transférables à l'homme. De plus, cette espèce permet d’utiliser des animaux modifiés génétiquement. Pour toutes les cohortes, les animaux seront utilisés à l'âge adulte (à partir de 6 semaines pour les rats et 8 semines pour les souris)
Etude des cellules dendritiques cutanées dans la sensibilisation allergique
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
559 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles sont anesthésiées pour une sensibilisation à un allergène sur l'oreille, répétée jusqu'à deux fois, et une partie reçoit des injections de toxine diphtérique destinées à éliminer une sous-population de cellules dendritiques cutanées. Le porteur affirme viser une meilleure compréhension de la réaction allergique transposable à l'humain et une éventuelle cible thérapeutique, retombées renvoyées au conditionnel. Sur le remplacement, il indique qu'il est "primordial" d'utiliser un "organisme entier" et juge impossible de travailler sur un système in vitro.
Objectifs
Les allergies (ou maladies atopiques), incluant la dermatite atopique (eczéma), l’asthme, la rhinite allergique et les allergies alimentaires sont des maladies inflammatoires complexes avec des caractéristiques communes,impliquant différents organes du corps. La dermatite atopique précède souvent le développement d’autres allergies, et sa sévérité aggrave le cours de l’allergie respiratoire. Il est donc important de comprendre les mécanismes et interactions des cellules immunitaires responsables de la réponse inflammatoire. Les cellules dendritiques (DC) sont des cellules présentes notamment dans le derme et l'épiderme. Elles sont activées lors de la reconnaissance d'un allergène. Ensuite, lelles activent à leur tour les lymphocytes T (LT) naïfs en différentes populations de LT auxiliaires, possédant chacun des fonctions uniques et participant à différentes réponses immunitaires, pro- ou anti-inflammatoires. Ce projet vise à éclairer l'axe cellules dendritiques (DC)/lymphocytes T (LT) dans la sensibilisation allergique. Nous nous baserons sur notre modèle expérimental de sensibilisation allergique. Celui-ci permet de mimer la rupture de la barrière cutanée observée dans l'atopie cutanée et d'induire une réponse immunitaire semblable à celle présente chez l'humain dans le mécanisme allergique. Nous cherchons à identifier et caractériser les sous-populations de cellules dendritiques cutanées, afin d'identifier celles qui sont responsables de l'induction de la réponse immunitaire inflammatoire exacerbée, caractéristique de l'allergie.
Bénéfices attendus
Notre projet nous permettra de comprendre les mécanismes immunitaires mis en jeu dans le cadre de la sensibilisation allergique chez la souris et de transposer ces connaissances chez l'homme. Ceci pourrait permettre d'identifier une nouvelle cible thérapeutique dans l'allergie chez l'homme et de limiter la réponse inflammatoire, en agissant en amont des traitements actuellement proposés en première intention contre l'allergie, à savoir les antihistaminiques entre autres. En plus de cela, la compréhension des signaux impliqués dans la génération des lymphocytes T anti-inflammatoires pourrait également permettre de réussir à augmenter leur fréquence et ainsi de réguler la réponse immunitaire inflammatoire rencontrée notamment dans l'allergie, mais également dans d'autres maladies inflammatoires humaines.
Procédures
Pour reproduire le phénotype de dermatite atopique observé chez l'homme, les 559 animaux seront anesthésiés au jour 0 pour la sensibilisation à un allergène au niveau de l'oreille (durée de la procédure = 20 minutes). Cette procédure est effectuée au maximum 2 fois, à 3 jours d'intervalle (à jour 0 et à jour 3). Parmi ces 559 animaux, 72 seront sensibilisés avec un allergène couplé à une molécule fluorescente afin de visualiser les cellules qui sont capables de capturer cet allergène. Parmi ces 559 animaux, 80 animaux seront également injectés avec de la toxine diphtérique (durée de l'injection : 10 secondes) pour éliminer une sous population de cellules dendritiques dans le but de déterminer leur rôle dans la dermatite atopique. 2 injections seront nécessaires en tout, 2 jours avant la première sensibilisation allergique, puis le jour de la sensibilisation. Enfin, 48 souris recevront 2 injections de toxine diphtérique ainsi que l'allergène couplé à la molécule fluorescente.
Impact sur les animaux
Notre procédure de sensibilisation induira une légère inflammation de type dermatite atopique au niveau des oreilles traitées. Ce procédé est régulièrement utilisé dans notre laboratoire et la lésion de l'épiderme, associée à l'application de l'allergène produit simplement une légère inflammation directement après la procédure, mais celle-ci n'affecte pas le comportement de l'animal. Nous avons déjà fait des injections de toxine diphtérique sur d'autres modèles par le passé, et n'avons observé aucun changement de comportement de la part des animaux traités, cependant une rougeur pourrait survenir au point d'injection.
Devenir
A l'issu de chacune des procédures, les animaux sont euthanasiés afin de prélever et d'analyser les organes impliqués dans la réponse immunitaire allergique, à savoir les oreilles, les ganglions lymphatiques cervicaux et le sang périphérique.
Remplacement
Etant donné que nous cherchons à étudier une réponse immunitaire impliquant différents organes (la peau et le ganglion lymphatique associé), il ne nous est pas possible de travailler sur un système in vitro. Il est primordial d'utiliser un organisme entier afin d'éclaircir la complexité de la réponse immunitaire allergique.
Réduction
Ce protocole sera appliqué à un maximum de 559 souris. Selon les expériences, les groupes comporterons 8 souris (modèle de sensibilisation allergique) ou 16 souris (expérience ex vivo), ce qui permettra d'avoir des résultats statistiquement interprétables pour les différents paramètres étudiés (à savoir, la fréquence de populations spécifiques de cellules dendritiques). De plus, nous proposons d'étudier en premier les lignées dans lesquelles les gènes sont inactivés dans tout l'organisme, puis, si des résultats intéressants sont produits, d'étudier ensuite les lignées dans lesquelles les gènes sont inactivés dans des types cellulaires donnés. Ces 2 stratégies expérimentales nous permettront de diminuer le nombre d'animaux nécessaires à notre étude.
Raffinement
Les animaux seront gardés en groupe dans leur cage pour préserver les interactions sociales. Nous avons pu observer auparavant que la lésion de la barrière épicutanée par génération de micropores est peu douloureuse et n'entraîne pas de souffrance pour les souris. L'application topique de l'allergène nécessite une anesthésie gazeuse légère et ainsi diminue le stress des animaux. Durant cette procédure et le réveil, les animaux sont placés sur plaque chauffante, puis lampe chauffante et surveillés attentivement. Tout au long du protocole, les animaux seront surveillés quotidiennement et nous utiliserons une grille d'évaluation de la souffrance et la douleur, adaptée à chaque procédure, afin de permettre une appréciation optimale du bien-être des souris. Si les animaux atteignent 3 points dans une catégorie ou 5 en additionnant les catégories, ils seront retirés de l'étude et pourront bénéficier de soins. Si le cas est plus grave, les animaux seront euthanasiés. Une attention particulière sera apportée à la zone de traitement, à savoir l'oreille. Nous serons attentifs aux éventuelles démangeaisons provoquées par notre protocole.
Choix des espèces
Dans ce projet, nous voulons utiliser des lignées génétiquement modifiées afin de nous permettre de caractériser les populations de cellules dendritiques impliquées dans la sensibilisation. Les mécanismes immunitaires mis en jeu chez la souris sont très proches de ceux observés chez l'homme. Nous pouvons ainsi étudier de la façon la plus pertinente possible, les acteurs cellulaires de la réponse allergique. Les souris sont utilisées dès lors qu'elles auront atteint l'âge de 8 semaines afin d'étudier le système immunitaire murin adulte.
Rôle des cellules épithéliales intestinale dans la défense contre les infections virales
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 180 d'entre elles, dont une lignée génétiquement modifiée privée de cellules tuft, sont infectées par voie gastrique avec trois virus digestifs puis autopsiées entre un et dix jours après, pour mesurer le rôle de ces cellules dans la défense antivirale de l'intestin. Le porteur qualifie la balance bénéfice-risque de "clairement favorable" et attend une perte de poids et des coliques comme principaux effets. Il affirme ne disposer d'aucune méthode alternative au modèle souris pour ces questions.
Objectifs
L’objectif de ce projet est simple, et consiste à évaluer la susceptibilité d’une lignée de souris génétiquement modifiées (dans lesquelles certaines cellules, nommées cellules tuft sont absentes) à des infections virales. Nos données, obtenues dans un modèle cellulaire, indiquent que l’absence des cellules tuft inhibe la synthèse de molécules antivirales sans lesquelles la réponse d’un hôte infecté est compromise. Ces données, inédites et encourageantes, méritent d’être approfondies le plus rapidement possible dans un modèle physiologique, afin de mesurer le réel impact de ce défaut. Notre stratégie expérimentale est simple, et consistera à infecter des souris de nos souches avec des virus digestifs. Les virus utilisés seront de 3 types, pour des expériences n’excédant pas 10 jours. Nous comparerons ainsi la progression de l’infection et de la réponse antivirale mise en place entre nos souris contrôle, et les souris sans cellules tuft. Cette stratégie nous permettra de répondre à des questions simples : (1) quelles sont les cellules impliquées dans la mise en place de la réponse immune suite à une infection virale et (2), l’absence de certains type cellulaire compromet-elle l’efficacité de la réponse de l’hôte suite à une infection ?
Bénéfices attendus
La balance bénéfice/risque associée à ce projet est clairement favorable. Nos données préliminaires indiquent en effet que les expériences associées à cette étude peuvent aboutir à la découverte de nouveaux mécanismes associés à l’immunité antivirale. Les retombées attendues en termes de connaissances fondamentales sont importantes, et pourraient avoir des répercussions en termes de santé publique, dans le contexte de pandémie que nous connaissons. Ce projet pourrait virtuellement d’expliquer les raisons pour lesquelles certains individus réagissent favorablement à une infection virale (réponse adéquate), alors que d’autres développent des formes graves (réponse inflammatoire prédominante). Notre stratégie expérimentale est simple, et devrait donner des résultats rapides et robustes.
Procédures
Les souris de nos 3 cohortes expérimentales se verront chacune être infectées par chacun des trois virus décrits, par voie gastrique (pour un total de 180 souris infectées et 60 souris contrôle non infectées). Suite aux traitements, les animaux seront progressivement analysés dans un laps de temps allant de 1 à 10 jours tout au plus, se focalisant sur les conséquences précoces de l’infection.
Impact sur les animaux
La source principale de stress pour tous les animaux impliqués dans ce projet sera l’étape d’inoculation des particules virales, et, selon nos prévisions, une potentielle perte de poids et des coliques.
Devenir
Les animaux devront être mis à mort, puisqu’autopsiés afin de récupérer les organes digestifs.
Remplacement
Ce projet a pour objet l’étude des interactions entre les cellules épithéliales intestinales, les cellules immunitaires et certains virus. Nous ne disposons pas de méthode alternative à ce jour pour traiter ces questions autre que les modèles de souris.
Réduction
Le nombre de souris engagées dans cette procédure a été défini selon les données de méthodologie classiquement retrouvées dans la littérature, nous conduisant à utiliser des cohortes de 40 individus par infection. Ce nombre, étant donnée l’effet drastique que nous attendons, nous permettra d’assurer des données robustes et exploitables. Nous réduirons le nombre d’animaux à produire en utilisant des individus des deux sexes. Finalement ; lorsque possible, nous compléterons nos données en utilisant des modèles de cultures cellulaires.
Raffinement
Les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie. Afin de réduire au maximum les hypothétiques risques de douleur et d’angoisse chez les individus du groupe mutant, un suivi individuel des individus sera réalisé selon les paramètres de masse corporelle et d’activité. Une perte de poids supérieure à 20% du poids initial, ou l’apparition de signe de prostration seront considérés comme des points limites. En cas de signes de détresse ou de douleur, d’atteinte d’un point limite, en accord avec le personnel qualifié, le protocole sera immédiatement stoppé pour ces animaux qui seront euthanasiés et autopsiés.
Choix des espèces
Le système digestif de la souris présente de nombreuses similitudes avec celui de l’homme. De plus, nous disposons du modèle idéal (souris KO Pou2f3, dans lesquelles les cellules tuft sont absentes) pour aborder notre question. Les individus seront utilisés à partir de 8 semaines d’âge, lorsque le système digestif est mature. Notre étude se focalise sur les individus adultes et la mise en place précoce de la réponse antivirale.
Etude de l’impact de la délétion du gène Card9 chez le neutrophile sur la dissémination de Candida albicans chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par le champignon Candida albicans injecté dans la veine de la queue, puis suivies pendant deux à sept jours avant une prise de sang et une mise à mort par dislocation cervicale, pour étudier le rôle du gène Card9 des neutrophiles dans la dissémination de l'infection. Le porteur qualifie la dose de subléthale et estime la souffrance modérée, l'infection pouvant entraîner une perte de poids jusqu'au point limite de 20 %. Il indique avoir mené des expériences préliminaires in vitro et s'être limité à un seul modèle d'infection pour réduire le nombre d'animaux non-humains.
Objectifs
La présence de champignons dans les différents microbiotes de nos muqueuses, et notamment de l’intestin, est associée à diverses pathologies. Parmi les champignons intestinaux, le plus connu est Candida albicans. C'est une espèce pathogène opportuniste, c'est-à-dire qu'elle est la plupart du temps inoffensive, mais qu’elle peut déclencher une infection dans certaines circonstances, comme après un traitement antibiotique, une chimiothérapie intense ou dans le cas des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) telles que la maladie de Crohn et la colite ulcéreuse. En effet, un échec des cellules immunitaires à contrôler les champignons intestinaux, et notamment C. albicans, peut mener à ce type d’inflammation sévère et chronique de l'intestin. Il est ainsi important de comprendre le rôle des gènes de susceptibilité aux MICI également impliqués dans la réponse aux champignons. Par exemple, une mutation ponctuelle (appelé polymorphisme) dans le gène Card9 est associé au développement de MICI, et les mutations plus importantes entraînant une perte de fonction de la protéine CARD9 sont quant-à-elles associées à des infections fongiques invasives, notamment à C. albicans. CARD9 est exprimé dans les cellules de l'immunité innée, mais les types cellulaires impliqués dans la pathologie et les mécanismes en jeu ne sont pas connus. Nous avons montré in vitro que les neutrophiles mutés pour le gène Card9 ont une capacité réduite à éliminer C. albicans. Cependant, le rôle des neutrophiles, cellules immunitaires innées en première ligne de défense contre les envahisseurs, reste très peu compris. Les patients dont les neutrophiles ne sont pas fonctionnels peuvent développer différentes formes d'inflammation intestinale et les neutrophiles des patients atteints de MICI présentent des défauts fonctionnels. Ainsi, l’utilisation d’un modèle d'infection systémique nous permettra de mieux comprendre le rôle des altérations génétiques liées aux MICI, et notamment de CARD9, dans la réponse contre les champignons. Nous étudierons aussi d’autres gènes en lien avec CARD9 impliqués dans la reconnaissance des champignons par les neutrophiles.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera des connaissances précieuses sur le rôle de Card9 et des neutrophiles dans le développement d'infections fongiques invasives, telles que celles causées par Candida albicans. Le modèle d'infection à Candida albicans par voie intraveineuse est un modèle très bien caractérisé, reproductible et qui permet de mimer les infections invasives humaines dues aux cathéters, notamment. Candida albicans est une levure naturellement présente dans l’organisme mais qui peut causer des infections graves chez des personnes immunodéprimées ou avec une mutation génétique dans CARD9 par exemple. En effet CARD9 est protecteur dans le sens où il permet de protéger l’organisme contre ces infections en éliminant le champignon. CARD9 est principalement exprimé sur les cellules de l’immunité innée, mais son rôle dans les différents types cellulaires (neutrophiles, macrophages, cellules dendritiques, monocytes…) reste inconnu. Ici, nous nous intéressons aux neutrophiles, d’où l’intérêt de la lignée mutée pour CARD9 dans les neutrophiles. Cependant il est important de comprendre comment CARD9 est activé, si cela passe par les récepteurs de surface aux champignons de type Dectin, ou pas ; et si les cellules de l’immunité adaptative ont effectivement aucun rôle dans le phénotype protecteur de CARD9, ou pas. Comprendre les mécanismes en jeu, et surtout les types cellulaires impliqués, permettra de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques et préventives aux patients souffrant de ce type d'infection chronique et invasive.
Procédures
L'infection à C. albicans sera réalisée par injection intraveineuse dans la veine caudale, en une dose subléthale et unique, sur animal vigile. Le poids corporel sera suivi quotidiennement le jour d'avant et après l'infection, soit pendant 2 ou 7 jours (quelques secondes sur la balance). Les fèces seront prélevées quotidiennement, pendant 2 ou 7 jours. Pour cela, les souris sont délicatement déposées dans des pots en plastique. Lorsqu'elles ont fait 1-3 crottes (au bout de quelques minutes), elles sont rentrées dans leur cage. Le jour de la fin de l'expérimentation, 2 ou 7 jours après l'infection, nous réaliserons le prélèvement sanguin juste avant l’euthanasie de l’animal (300ul, 30 secondes environ).
Impact sur les animaux
La douleur imposée aux animaux est d'origine infectieuse. Du fait de l'utilisation d'une dose subléthale, c'est-à-dire ne menant pas à la mort de l'animal, on peut estimer que son intensité sera modérée. La douleur de la piqure est une douleur seuil considérée comme légère en expérimentation animale. Les animaux seront également pesés quotidiennement pendant 2 ou 7 jours, et placés quelques minutes dans des pots en plastique afin de prélever leurs fèces. Un prélèvement sanguin juste avant l’euthanasie de l’animal sera également réalisé.
Devenir
La méthode de mise à mort prévue à l'issue de chaque procédure est la dislocation cervicale. Celle-ci est réalisée dans une pièce dédiée (pièce de manipulation post-mortem) par des personnes formées et autorisées.
Remplacement
Des expériences préliminaires in vitro, sur neutrophiles murins de la moelle osseuse, ont été réalisées afin de remplacer des expériences in vivo et de ne réaliser qu'un seul modèle infectieux chez la souris pour ce projet. Par exemple, un « endpoint dilution assay » (dilution au point limite, où l'on compte grâce à un microscope le nombre de colonies de C.albicans ayant résisté aux neutrophiles) a permis de mettre en évidence que les neutrophiles mutés pour Card9 sont moins capables d'éliminer C. albicans in vitro. Ces résultats obtenus par expérimentation in vitro auraient pu faire l'objet d'expérimentation in vivo, par exemple par des modèles complémentaires d’infection à C. albicans par voie orale chez la souris. Nous avons décidé de nous limiter à ce modèle in vivo par voie intra-veineuse, pour réduire l’expérimentation animale tout en assurant une compréhension optimale de la maladie.
Réduction
Le nombre d’animaux est basé sur le rapport de biostatisticiens. 20 souris par groupe sont nécessaires à l’obtention de différences statistiquement significatives pour l’étude de la résistance à l’infection et de la dissémination dans les organes à 2 ou 7 jours. Cela prend en compte un effet attendu de ±60% (hypothèse nulle moyenne de 1500 cfu C. albicans/organe dans le groupe contrôle, hypothèse nulle alternative de 2400 cfuC. albicans/organe dans le groupe expérimental), une P-value de 5%, puissance de 80%, déviation standard Sigma de 0,5, et test 2-sided. Nous utiliserons des groupes de mâles et de femelles afin d'optimiser l'utilisation des souris générées pour ce projet, tout en veillant à ce que les souris mutées et leurs contrôles soient du même sexe, afin de pouvoir conclure quant à l’importance de la mutation sur le contrôle de la dissémination du champignon.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans les conditions standard. Nous veillerons à enrichir le milieu de vie par l’ajout de feuille de cellulose dans les cages et d’un abri prévu à cet effet. Les souris seront au maximum 5 par cage. Les souris seront observées quotidiennement afin de surveiller leur état de santé et bien-être. Si un animal des signes liés à la perte de poids et à la déshydratation (sans atteindre une perte de 20% correspondant au point limite), du Diet Gel sera placé dans la cage afin de faciliter l’accès pour l’animal à une source d’hydratation. Si la perte de poids atteints 20% du poids initial, l’animal sera mis à mort par limiter sa souffrance.
Choix des espèces
La souris est un modèle largement utilisé dans le cadre de l'étude de pathologies intestinales humaines. Le modèle d'infection à C. albicans par voie intraveineuse est un modèle très bien caractérisé, reproductible et qui permet de mimer les infections invasives humaines dues aux cathéters notamment, dans le contexte nosocomial. Les lignées utilisées sont déjà en élevage. Aucun de ces génotypes n'est dommageable. Nous utiliserons des souris de fond génétique C57BL/6, âgées au début de chaque expérimentation de 7 à 11 semaines, mâles ou femelles, afin d'optimiser l'utilisation des animaux. A chaque fois, les souris mutées et leurs contrôles seront du même sexe. Les souirs utlisées seront âgées d'au minimum 7 semaines, soit à partir du moment où le système immunitaire est mature. L'utilisation de l'espèce Mus musculus pour l'étude des infections fongiques invasives à Candida albicans est cruciale pour mieux en comprendre le mécanisme infectieux dans un organisme complexe. Cela permettra de développer des solutions préventives et thérapeutiques innovantes pour les patients souffrant d'un affaiblissement immunitaire, soit causé par une mutation génétique, soit par un contexte fragilisant comme les séjours prolongés à l'hôpital.