Procédures modérées

577 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales, une injection de cellules souches et deux irradiations sur animal non anesthésié maintenu en boîte, ainsi que des prélèvements sanguins rétro-orbitaires répétés, pour étudier la production de cellules immunitaires infiltrant les tumeurs. Le porteur indique que les souris développent des tumeurs mammaires. Il affirme que ni la modélisation ni les systèmes in vitro ne remplacent la souris, présentée comme "indispensable".

Objectifs

Les cellules dendritiques sont des cellules phagocytaires qui jouent un rôle clef dans l’initiation des défenses immunitaires contre les tumeurs. En effet, les cellules dendritiques des tissus capturent les cellules tumorales et présentent les antigenes tumoraux aux lymphocytes T pour déclencher la réponse immunitaire. Les monocytes quant à eux sont les précurseurs directs d’une autre population de cellules phagocytaires appelée macrophages et qui, au contraire des cellules dendritiques, peuvent inhiber la réponse immunitaire anti-tumorale. Un enjeu primordial de la recherche contre le cancer est de mieux comprendre les interactions moléculaires et cellulaires entre la tumeur et les cellules phagocytaires qui l’infiltrent. En particulier, dans le cadre des thérapies anti-cancéreuses, nous souhaitons 1) augmenter la quantité des cellules dendritiques favorables aux réponses immunitaires dirigées contre le cancer ; et 2) diminuer la production des macrophages qui favorisent la croissance tumorale. Cela est possible en étudiant les mécanismes de production de ces cellules qui ont lieu dans la moelle osseuse à partir des cellules souches dites hématopoétiques (HSC). Dans ce projet, nous étudierons les mécanismes moléculaires et cellulaires qui permettent aux HSC de la moelle osseuse de produire des cellules dendritiques et des macrophages lors du développement tumoral.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes de production des cellules dendritiques et des macrophages et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques permettant d’inhiber la production des macrophages et d’augmenter la production de cellules dendritiques. En parallèle, nous nous interresserons aussi aux mécanismes par lesquels les macrophages inhibent les réponses immunitaires dans la tumeur. Nous développerons des stratégies pour bloquer l’effet inhibiteur des macrophages. En conclusion, ce projet nous permettra de mettre en lumière les mécanismes tumoraux qui activent la production des macrophages. Cela nous permettra de mieux les cibler dans le cadre d’interventions thérapeutiques visant à augmenter les réponses immunitaires contre les cancers.

Procédures

1- Injection de cellules tumorales par voie sous-cutanée : La contention de l’animal et l’injection durent maximum 30 secondes. Cette intervention aura lieu 1 fois au début de la procédure 2- Injection de cellules souches hématopoïétiques par voie intraveineuse rétro-orbitale La contention de l’animal et l’injection durent maximum 30 secondes. Cette intervention aura lieu 1 fois au début de la procédure 3- Irradiation L’irradiation dure au maximum 5 minutes durant lesquelles les animaux (non anesthésié) sont disposés dans une boite en plexiglass prévu à cet effet. Cette intervention aura lieu 2 fois au début de la procédure 4- Prélèvement sanguin par voie rétro-orbitale La contention de l’animal et le prélèvement durent maximum 30 secondes. Cette intervention aura lieu : 1 fois à 8 semaines au cours de la procédure 3 5 fois au cours de la procédure 4 (à 2 semaines, 4 semaines, 8 semaines, 12 semaines, 16 semaines)

Impact sur les animaux

Les souris développeront des tumeurs mammaires.

Devenir

Mise à mort

Remplacement

La production des cellules dendritiques et des monocytes/macrophages a été étudiée chez la souris in vitro et in vivo dans des situations non-pathologiques ou d’infection par des pathogènes. Cependant les mécanismes de production des cellules dendritiques et des monocytes/macrophages lors du développement tumoral restent mal connus. Ni les modélisations mathématiques, ni les systèmes in vitro ne permettent d’étudier la production et la circulation des cellules phagocytaires (cellules dendritiques et monocytes/macrophages) dans le sang et les mécanismes de leur entrée et leur différenciation dans les tumeurs. La souris reste donc un modèle indispensable pour le projet et permettra de tester de nouvelles thérapies anti-cancéreuses ciblant les cellules phagocytaires.

Réduction

les résultats attendus à l’issue de ce projet n’ont pas été publiés à ce jour dans la littérature scientifique. Le nombre d’animaux utilisés pour mener à bien ce projet a été réduit au minimum pour chaque modèle tout en assurant des résultats statisquement interprétables.

Raffinement

La lignée de souris utilisée développe des tumeurs mammaires très progressivement sur 5 mois. Les animaux seront suivis régulièrement afin d’assurer leur bien-être et pour suivre les éventuels signes de souffrance ou de stress. Des soins supports tels les aliments gélifiés et la ré-hydratation seront introduits dans les cages en cas de souffrance. Les expérimentations seront arrêtées avant l’atteinte des points limites définis.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les expériences menées pour la recherche en onco-immunologie et en therapeutique du cancer car la connaissance complète du génome murin permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés, dont les souris génétiquement modifiées pour des protéines spécifiques d’intérêt ainsi qu’un grand nombre de modèles de tumeurs transplantées. De plus, la grande homologie avec l’Homme permet d’envisager de transposer les résultats obtenus chez la souris vers des applications cliniques Les souris seront utilisées à l'âge adulte afin qu’elles aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux. De plus, cet âge est adapté pour générer des modèles de tumeurs par la greffe de lignées de cellules tumorales. Enfin, l'âge adulte permet d'étudier un système immunitaire mature.

576 souris nude vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de mélanome uvéal humain, puis des injections d'inhibiteurs trois fois par semaine jusqu'à soixante-dix jours, pour tester des molécules contre ce cancer de l'œil. Le porteur indique que la croissance tumorale peut provoquer poils hérissés, dos voûté, perte de poids et nécroses cutanées. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ne reproduit des interactions physiologiques aussi complexes.

Objectifs

Le mélanome uvéal (MU), est le cancer intra-oculaire primaire le plus fréquent chez l’adulte. Malgré un traitement réussi des tumeurs primaires, les métastases se développent chez 50% des patients principalement au foie. Les MU métastatiques sont hautement réfractaires aux traitements existants. 80% des patients meurent en moins d’un an. Il y a donc un besoin urgent de comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la pathogénie du MU et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et traitements efficaces pour améliorer la survie des patients. Dans ce but, par le biais d’une méthode innovante, l’équipe a identifié plusieurs candidats intéressants dont l’inhibition diminue la prolifération et la survie des cellules de MU. L’objectif du projet est maintenant d’évaluer in vivo chez la souris, l’efficacité des molécules ciblant les gènes candidats identifiés qui ont montré leur efficacité in vitro sur l’inhibition de la prolifération et la migration des cellules de MU.

Bénéfices attendus

Ce projet va nous permettre de tester in vivo l’effet des deux inhibiteurs ciblant nos deux gènes d’intérêt ainsi que les molécules pharmacologiques ciblant les effecteurs de nos gènes candidats. Ces molécules seront définies ultérieurement en fonction des cibles identifiées suites à des analyses approfondies qui sont en cours de réalisation, sur la croissance tumorale sous cutanée du mélanome uvéal. Ces validations sont indispensables pour envisager un développement clinique de nos agents en association avec les thérapies ciblées ou les immuno-thérapies.

Procédures

Une injection de cellules en sous cutanée au niveau du flanc gauche sur souris vigile, une fois la tumeur formé (100mm3), les souris seront injectées en intra-péritonéale par les différents composés (inhibiteurs) 3 fois par semaine jusqu’à 70 jours maximum après début du traitement.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous serons très attentifs. Ces effets indésirables pourront être causés soit par la croissance de la tumeur, soit par l’injection des drogues thérapeutiques. La croissance de la tumeur pourra entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance (poils hérissés, dos voûté, perte de poids, mobilité réduite, prostration), ainsi que des altérations visibles de la peau (nécrose, rougeur, infection). L’injection des drogues pourra également entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance et des altérations local au site d’injection (rougeur, infection, nécrose).

Devenir

Tous les animaux seront sacrifiés.

Remplacement

En termes de remplacement, il n'est pas possible de s'affranchir de l'utilisation de souris car il n'existe pas de méthodes alternatives in vitro qui permettent de reproduire des interactions physiologiques aussi complexes. Des études in vitro ont été réalisées pour nos deux gènes d’intérêt et seront réalisées dans un premier temps pour définir l’efficacité des 2 autres molécules dans l’induction de la mort ou l’arrêt de la prolifération des cellules de mélanome uvéal. Ainsi, in vitro, nous avons défini la concentration des molécules à utiliser ainsi que leurs effets et nous ferons de même pour les autres cibles. De plus, pour les expériences in vivo nous nous baserons aussi sur les concentrations rapportées pour ces drogues dans la littérature.

Réduction

En termes de réduction, le nombre d'animaux nécessaire à cette étude a été déterminé à l'aide d'un test de puissance statistique dans le cas où la différence de moyenne de chaque groupe est supérieure au moins d’un quart à notre écart type et une puissance de 0.9 et un risque de 0.01. Pour la réalisation de ce projet, il faudra 576 souris. L'utilisation de ces animaux sera optimisée en prélevant les tumeurs/métastases et organes (tels que le foie, la rate, les poumons) pour des analyses histologiques et biochimiques.

Raffinement

En termes de raffinement, les souris évoluent dans un milieu enrichi et sont hébergées en portoirs ventilés à plusieurs par cage et seront observées trois fois par semaine selon la procédure par les demandeurs du projet afin de prendre en charge tout signe de douleur, de stress ou d’inconfort. Les manipulateurs sont en possession du niveau opérateur ou concepteur qui permet d’avoir une bonne vision et une excellente capacité à détecter les problèmes de santé, stress ou malaise. Le suivi est fait par des méthodes non invasives (mesure des tumeurs sous-cutanée au pied à coulisse, pesée des animaux régulières). Des points limites précis sont définis dans chaque procédure. Le nombre d’animaux sera réduit au maximum grâce à un suivi longitudinal précis et quantifiable par imagerie.

Choix des espèces

La souris est un mammifère ayant de similitudes génétiques avec l’homme. De plus, elle a un cycle de vie court, un cycle de reproduction bien connu, une faible taille ce qui permet d’avoir des conditions d’hébergement plus faciles. Nous utiliserons un modèle de souris Nude. Grâce à un système immunitaire très faible, la souris nude pourra recevoir des cellules humaines sans risque de rejet. D’autre part, ce modèle de souris est commercialisé et bien établi, d’importantes études ont déjà été réalisées à partir de ce modèle. Les souris sont utilisées au stade adulte (7 semaines) et sont des femelles. Elles sont commandées à 6 semaines, puis l’expérience commence après une semaine d’acclimatation. La croissance tumorale est optimale à cet âge-là pour la souris nude, et ceci est scientifiquement cohérent avec les expériences déjà faites dans l’équipe et les données de la littérature.

48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès l'âge de quinze jours, elles reçoivent une injection d'un agent génotoxique qui provoque un cancer du foie, puis à douze mois des traitements pharmacologiques, pour évaluer leur effet sur un carcinome hépatocellulaire avancé. Le porteur indique qu'à ce stade toutes les souris présentent des tumeurs hépatiques. Il affirme qu'aucune méthode ne permet de remplacer l'étude de la progression tumorale in vivo.

Objectifs

Ce projet vise à évaluer le potentiel thérapeutique de molécules pharmacologiques dans le carcinome hépatocellulaire. Pour cela, nous utiliserons un modèle murin de cancer du foie qui sera induit par administration d'un produit chimique, le N-nitrosodiéthylamine (DEN), à des souris âgées de 15 jours. Dans ce modèle, les souris développent des tumeurs hépatiques à partir de 9-10 mois. Nous étudierons l'effet de molécules pharmacologiques, un inhibiteur du stress du réticulum endoplasmique (InhRE) et/ou un inhibiteur multikinase (Sorafenib), sur la progression du carcinome hépatocellulaire à 12 mois. L'inhibiteur du stress du réticulum endoplasmique (InhRE) a donné des résultats prometteurs dans un modèle murin précliniqiue de cancer du sein triplement négatif (Logue SE, et al. Nat Commun. 2018 Aug 15;9(1):3267). Il sera administré seul ou en combinaison avec le Sorafenib qui est un inhibiteur multikinase et qui est administré chez les patients en seconde ligne de traitement.

Bénéfices attendus

Les études proposées dans ce projet permettront de déterminer l'efficacité anti-tumorale de l'inhibiteur du stress du réticulum endoplasmique (InhRE) administré seul ou en combinaison avec le Sorafénib sur la progression du cancer du foie à un stade avancé pour après pouvoir les utiliser chez l'homme.

Procédures

Les souris seront soumises à une injection unique de dihétylnitrosamine (DEN) ou son diluant (NaCl) en ip 15 jours après la naissance ; deux injections par semaine d'inhibiteur du stress du réticulum endoplasmique ou son diluant (Kolliphor) à 12 mois pour une durée de 4 semaines ; une administration de Sorafénib 5 fois par semaine à 12 mois pour une durée de 4 semaines.

Impact sur les animaux

L'administration de N-nitrosodiéthylamine (DEN) favorise le développement de tumeurs hépatiques. A 12 mois, les souris présentent une hépatomégalie liée au développement tumoral. L'administration d'InhRE n'est pas associé à un effet secondaire connu.

Devenir

Les animaix seront euthanasiés à la fin des procédures afin de faire un prélèvement de sang et du foie pour étudier les effets de l'inhibiteur du stress du réticulum endoplasmique seul ou en combinaison avec le Sorafénib sur la progression du cancer du foie.

Remplacement

Nous avons recours à des animaux car il n’y a pas de méthodes alternatives. En effet, il n’existe aucun moyen de remplacer une telle étude dans laquelle nous étudions la progression tumorale.

Réduction

Le nombre de souris a été réduit à celui requis pour obtenir une validation statistique des résultats.

Raffinement

Nous effectuerons un suivi quotidien des souris tout au long du protocole en observant leur comportement et les indices pouvant suggérer une douleur. Si nous observons une douleur chez un animal, cela entraînerait son euthanasie anticipée. Par ailleurs, les animaux sont hébergés en présence de papier kraft et de carrées de coton pour faire le nid, ainsi que des maisonnettes et des dômes en cellulose.

Choix des espèces

La souris est l’espèce couramment utilisée dans ce protocole de carcinogenèse hépatique et pour étudier l'effet de molécules avec un potentiel anti-cancéreux. Pour le modèle d'induction d'un carcinome hépatocellulaire, le protocole consiste en une injection unique de N-nitrosodiéthylamine (DEN), un agent génotoxique, à 25 mg/kg ou son diluant (NaCl) à des souriceaux mâles âgés de 15 jours. En effet, la forte prolifération des hépatocytes à ce stade permet d'induire des mutations dans des cellules en prolifération ce qui permettra le développement de tumeurs hépatiques. Les effets de l'inhibiteur du stress du réticulum endoplasmique (InhRE 30 ug/g) administré seul ou en combinaison avec le Sorafénib (30 ug/g) sur la progression du cancer du foie seront étudiés chez les souris agées de 12 mois car le carcinome hépatocellulaire est diagnostiqué chez l'homme à un stade avancé. A ce stade, 100 % des animaux présentent des tumeurs hépatiques à un stade avancé qui est le stade auquel le cancer du foie est majoritairement diagnostiqué. De plus, à ce stade, la survie des animaux est proche de 100%.

18 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont inoculés avec le parasite Trypanosoma lewisi puis subissent des prélèvements sanguins quotidiens pendant six semaines et un prélèvement terminal, pour produire des parasites et des sérums de référence destinés à un test de dépistage. Le porteur indique que ce parasite, commensal du rat, présente une faible virulence. Il affirme que le recours au rat est "incontournable" pour produire les parasites en quantité.

Objectifs

Trypanosoma lewisi (T.lewisi), parasite hébergé par le rat, est transmis par une puce qui, via ses fécès, peut infecter le rat ou l’homme, surtout les enfants (par grattage au point de piqûre ou par ingestion de boisson contaminée). Souvent sans autre symptôme que la fièvre, cette infection peut être bénigne, nécessiter un traitement, ou être mortelle. A ce jour, l’Inde est le pays où le plus grand nombre d’infections à T. lewisi a été observé et confirmé, le dernier datant de décembre 2021. Les conditions sanitaires dans des pays à très fortes démographies facilitent le contact rat/homme dans les habitations précaires. Cette pathologie est très peu connue et sa prévalence de fait certainement sous-estimée. Compte-tenu du très grand nombre d’individus exposés, il est indispensable de disposer d’un test de dépistage sensible, spécifique et surtout utilisable sur le terrain. Sachant qu’un individu infecté par T. lewisi va produire des anticorps circulants dirigés contre le parasite, la présence de ces anticorps peut être détectée dans le sang ou le sérum humain par un test d’agglutination sur carte avec des trypanosomes préalablement colorés. Ce type de test, appelé CATT (Card Agglutination Trypanosomiasis Test), a fait ses preuves pour le dépistage sérologique de terrain de la maladie du sommeil ou Trypanosomiase humaine africaine. Le test CATT est facile d’utilisation et le résultat est obtenu en 5 minutes. Ce nouveau test CATT/T. lewisi consistera en un dépôt sur une carte d’une goutte de sang ou de plasma/sérum dilué, à laquelle sera mélangée une goutte d’antigènes de T. lewisi (trypanosomes colorés). S'il y a présence d'anticorps chez l’hôte, ces derniers agglutineront les parasites, ce qui sera visible à l’œil nu. En cas de résultat positif, la détection directe des parasites dans le sang de l’hôte, qui nécessite d’autres types de tests beaucoup plus lourds et longs à réaliser, sera effectuée comme diagnostic de confirmation. L’objectif in fine du présent projet est le développement d’un test CATT/T. lewisi qui nécessite 1/ la production d’antigènes du parasite T. lewisi pour la détection des anticorps ; cette étape consiste en la production de trypanosomes en quantité sur rongeurs de laboratoire, 2/ la production de sérums de référence positifs et négatifs pour l’étape de validation du test CATT/T. lewisi ; ces sérums seront obtenus à partir de rats infectés et non infectés.

Bénéfices attendus

La mise à disposition d’un test de dépistage sérologique rapide et utilisable sur le terrain va faciliter le travail des équipes médicales, compte-tenu du grand nombre de personnes à tester (exemple de l’Inde). Seules les personnes séropositives feront par la suite l’objet de tests supplémentaires pour mettre en évidence la présence du parasite T. lewisi. Après son évaluation ce test sera mis à disposition de toutes les équipes médicales des pays concernés par les infections humaines à T. lewisi (en Afrique ou en Asie). Cela permettra d’évaluer, pour la première fois, l’importance réelle de cette infection que de nombreux scientifiques pensent sous-estimée, et très certainement de sauver des vies, en particulier chez les catégories d’individus jeunes et/ou immunodéprimés, souvent atteints d’autres pathologies.

Procédures

Prélèvement (durée: 1 minute) sous anesthésie de 1ml de sang à T0 puis 1 fois par semaine durant 3 semaines sur 18 rats. Inoculation (durée: 30 secondes) sous anesthésie de parasites T. lewisi sur 18 rats puis collecte (durée: 30 secondes) sous anesthésie d’1 goutte de sang à la queue quotidiennement durant 6 semaines maximum et un prélèvement sanguin terminal (durée: 2 minutes) sous anesthésie profonde sera ensuite réalisée. Prélèvement (durée: 1 minute) sous anesthésie de 1ml de sang 1 fois par semaine durant 6 semaines maximum sur 9 rats.

Impact sur les animaux

L’infection à Trypanosoma lewisi chez le rat peut induire des effets indésirables (augmentation ou perte de poids, une légère perte de mobilité, le poil hérissé) qui ne sont pas systématiques. Néanmoins cette souche de parasite ne présente pas une virulence élevée, puisque T. lewisi est considéré comme un commensal du rat (portage sain).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure pour récolter leur sang qui contient les parasites en vue de leur purification, et de la collecte des sérums de référence.

Remplacement

Pour produire un très grand nombre de trypanosomes et obtenir des sérums de référence positifs et négatifs, le recours au rat est incontournable. En cas de succès de la mise au point de ce test CATT/T. lewisi et dans le cadre d’une production de ces parasites à plus grande échelle, nous envisageons une adaptation de ces parasites à la culture in vitro.

Réduction

Le nombre de rats est limité à 6 par essai de mise au point car nous avons calculé que les quantités de parasites et de sérums négatifs et positifs récoltés seront suffisants pour la mise au point du test. Ces mêmes 6 rats permettront de produire les sérums de référence négatifs avant l’inoculation des parasites, puis les parasites et les sérums de référence positifs ce qui permet de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Une fois infectés, les animaux feront l’objet d’une observation quotidienne afin d’évaluer un changement de comportement anormal. Si les animaux présentent un changement d’apparence physique tel que le poil hérissé pendant plus de 3 jours, avec un aspect général moribond, un état de prostration, ou s’ils ne s’alimentent plus ou si la perte de poids excède 15%., seront euthanasiés sans délai. Le poids de l’animal est relevé à chaque estimation de la parasitémie. Enfin, les animaux seront maintenus en groupe de 2 ou 3 et des mesures d’enrichissement du milieu destinées à améliorer les conditions de vie et à réduire le stress des rongeurs seront mises en place : utilisation de tunnels et/ou carrés de cellulose. Un tapis chauffant est utilisé lors des anesthésies afin de compenser la chute de température interne des animaux.

Choix des espèces

Les rats étant très susceptibles à l’infection par T. lewisi (parasite commensal), ils permettent d’obtenir de fortes parasitémies sous un volume sanguin important. Leur utilisation permet d’obtenir des trypanosomes en quantité suffisante pour la fabrication du test CATT/ T. lewisi. Les rats sont utilisés au stade adulte (300g) afin de permettre de collecter de plus grands volumes de sang pour constitution des sérums de référence et au prélèvement sanguin terminal.

12 singes verts vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous gardés en vie à l'issue de ce projet. Ils reçoivent deux injections d'un candidat vaccin contre le virus Nipah et des prélèvements sanguins réguliers, puis une chirurgie abdominale d'une heure pour poser un implant de télémétrie et cathétériser l'artère fémorale. Le porteur agit comme fournisseur d'animaux et prépare ces primates pour une épreuve infectieuse ultérieure menée sur un autre site en laboratoire de haute sécurité. Il affirme que le recours à une espèce de primate sur "organisme entier" ne peut être remplacé.

Objectifs

Le projet consiste en deux phases : - Immunisation des animaux avec un candidat-vaccin contre le virus Nipah en vu d’un challenge infectieux quelques semaines plus tard pour mesurer l’efficacité de ce candidat-vaccin; - La pose d’implant de télémétrie. Elle pour but d’assurer une meilleure surveillance des animaux lors du challenge vaccinal dans un but de raffinement de la sévérité de la procédure finale. La pose d’implant de télémétrie permet le suivi en temps réel et en continu des paramètres vitaux des animaux (température corporelle, fréquence respiratoire, fréquence cardiaque, pression artérielle, activité). Cela permet d’obtenir des données physiologiques continues sans stresser les animaux (pas de contention); de plus, cela permet des mesures en temps réel à distance, afin d’être le plus prédictif possible d’un changement d’état physiologique de l’animal et une intervention rapide du personnel (atteinte de point-limite….)

Bénéfices attendus

- La phase d’immunisation a pour but de tester l’efficacité d’un nouveau candidat-vaccin contre le virus Nipah. Le virus Nipah est un virus zoonotique émergent ; il est classé comme maladie prioritaire par l’Organisation Mondiale de la Santé, n’ayant à ce jour pas de traitement ni de vaccin agréé. Le candidat vaccin que nous proposons se base sur la technologie du ciblage des cellules présentatrices d’antigènes (cellules dendritiques) à l’aide d’anticorps monoclonaux associés aux antigènes vaccinaux. Il a été démontré dans des modèles animaux (souris humanisées, singes) que cette approche permet d’induire une réponse immunitaire forte et protectrice contre différentes maladies infectieuses, notamment contre le VIH-1 (virus du SIDA) ou le SARS-COv2 (virus de la COVID-19). Des candidats vaccins pour le SARS-Cov2 et le VIH ont pu être produits avec des premiers essais cliniques débuté en 2021. Une approche identique mais appliquée au virus Nipah a été développée. Les premières données obtenues sur souris, en lien avec nos observations précédentes chez le primate dans d’autres pathologies, laissent présager une bonne capacité des animaux immunisés avec ce vaccin à pouvoir se protéger contre l’infection Nipah, et de pouvoir ensuite développer ce vaccin pour l'Homme. - La pose d’implant de télémétrie permet le suivi en temps réel et en continu des paramètres vitaux des animaux (température corporelle, fréquence respiratoire, fréquence cardiaque, pression artérielle, activité). En phase d'essai vaccinal, il est important de pouvoir suivre les animaux en continu car le virus Nipah peut être responsable de formes sévères/suraiguës. De plus cette phase se déroule dans un laboratoire biosécurité niveau 4 en raison de l’infectiosité du virus, les conditions d’accès en sont très restreintes. Cela permet de raffiner la procédure avec l’obtention de données physiologiques continues sans stresser les animaux, et en étant plus prédictif « en direct » sur toute modification de l’état de l’animal pour une intervention plus rapide en cas d’atteinte de points-limites plus précoces (monitoring avec système d’alerte possible).

Procédures

Le projet se développe en deux phases : - La phase d’immunisation consiste en l’administration d’un candidat-vaccin ou d’un placebo selon les groupes d’études (2 injections par voie sous-cutanée à 4 semaines d’intervalle) associée à un suivi de la réaction immunitaire par des prélèvements sanguins réalisés environ toutes les 2 semaines au cours de l’étude. Les manipulations pour cette phase prennent environ 15 minutes pour chaque manipulation par animal (capture, contention et injection et/ou prélèvement sanguin) - La phase de télémétrie consiste en la réalisation, sous anesthésie générale et analgésie, d’une chirurgie abdominale pour la pose d’un implant intra-abdominal et une cathérisation vasculaire de l’artère fémorale sur les animaux de l’étude ; la chirurgie dure environ une heure par animal, et la convalescence complète 5 à 7 jours.

Impact sur les animaux

Phase d’immunisation : Le protocole d’immunisation est constitué de 2 injections à 1 mois d’intervalle par voie sous-cutanée et constitue donc juste la nuisance de l’introduction d’une aiguille et l’injection d’un faible volume (1mL) de solution. Les études précédentes n’ont pas montré d’effets indésirables sur les animaux, hormis des réactions locales mineures. L’essai clinique de Phase I en cours du vaccin DC/VIH n’a montré aucune réaction adverse à ce jour. Comme pour tout élément d’essai, des effets secondaires peuvent survenir. Les risques les plus probables sont : réaction locale (douleur, inflammation transitoire) au point d’injection, baisse transitoire de l’état général, hyperthermie/syndrome fébrile transitoire. Des soins vétérinaires appropriés seront apportés aux animaux si besoin ; Cette phase inclut également des prélèvements sanguins réguliers. L’acte de prélèvement sanguin entraine une légère douleur chez l’animal (introduction d’une aiguille), et peut potentiellement entrainer des hématomes post-prélèvements. Tous les prélèvements sont effectués par du personnel expérimenté au geste technique. La majorité des prélèvements sont faits sous anesthésie générale pour réduire l’inconfort et le stress des animaux pendant l’acte, et des soins adaptés sont mis en place en cas de petit saignement ou hématome post-prélèvement. Phase de télémétrie : Les animaux devant subir une chirurgie, les effets probables sur les animaux seront ceux inhérents à une telle intervention : - de la douleur per et post-opératoires. Cela peut entrainer secondairement une baisse de l’activité et une diminution de l’appétit transitoire pendant quelques jours après la chirurgie. La douleur sera gérée par une anesthésie et une analgésie per et post-opératoires adaptées. De plus, inhérent à toute intervention de ce type, les risques possibles sont : - risque anesthésique, - risque d’infection, - risque hémorragique per-opératoire, - risque vasculaire sur le membre postérieur cathétérisé. Tout est mis en oeuvre pour que ces risques soient limités au maximum. Une prise en charge vétérinaire rapide sera mise en place si besoin.

Devenir

L’ensemble des animaux de l’étude participe à la phase immunisation et à la phase télémétrie de l’étude. Tous les animaux sont gardés en vie en fin d’étude, le projet s’inscrivant comme phase de préparation des animaux en vue d’une étude de challenge vaccinal sur un autre site.

Remplacement

Ce projet a pour objectif de fournir des animaux immunisés et « équipés » en télémétrie pour la réalisation d’une étude ultérieure. Ce projet est un service réalisé dans le cadre de notre activité de fourniture d’animaux. La nécessité scientifique de l’utilisation d’animaux est faite en amont par les utilisateurs des animaux ; Leur projet de recherche est déclaré et agréé par les autorités compétentes selon la règlementation en vigueur. Ce projet doit se faire sur un organisme entier et sur une espèce Primate, et ne peut pas être remplacé par d’autres modèles in silico, in vitro ou in vivo sur autres espèces pour des résultats scientifiques équivalents.

Réduction

Le nombre d’animaux a été étudié par l’utilisateur final pour réduire au maximum le nombre d’animaux en garantissant que son étude de challenge vaccinal permette une analyse statistique pertinente de l’efficacité de son candidat-vaccin.Les douze animaux seront divisés en 2 groupes. Le groupe non-immunisé a été réduit ad minima (3 animaux) car les données collectées dans ce groupe seront associées à celles déjà acquises lors d’études précédentes (n=5) ; cela permet de réduire le nombre d’animaux total pour le projet. Afin de respecter une représentativité en male/femelle et de pouvoir avoir une comparaison statistiquement correcte, 9 animaux seront vaccinés.

Raffinement

Phase immunisation : La phase d’immunisation se déroule dans notre établissement. Cela permet de garder les animaux plus longtemps dans des conditions d’hébergements optimisées et moins contraignantes que dans l’Etablissement Utilisateur final où aura lieu le challenge vaccinal, et où les conditions d’hébergement sont plus contraintes pour des raisons de biosécurité. L’immunisation, bien que se limitant à l’introduction d’une aiguille et à l’injection d’un faible volume, est réalisée sous anesthésie générale légère pour limiter le stress et l’inconfort de l’animal au moment de l’injection. Raffinement des procédures de prélèvements sanguins : les volumes et les procédures de laboratoire ont été optimisées pour réduire au maximum les volumes prélevés sur les animaux pendant l’étude. Tous les gestes de prélèvements sanguins sont réalisés par des personnes formées et expérimentées sur ce geste. La majorité des prélèvements sanguins sont réalisés sous anesthésie générale légère pour limiter l’inconfort des animaux lié ce geste. Phase télémétrie : La réalisation de ce projet s’inscrit pleinement dans un objectif de raffinement puisque cela permet une meilleure surveillance des animaux per-étude lors du challenge vaccinal : acquisition de mesures physiologiques sans intervention sur les animaux ; cela a pour but de pouvoir intervenir le plus tôt possible en anticipant les points-limites de l’étude concernée (système d’alerte lors d’atteinte de paramètres limites) dans un contexte d’une étude en infectiologie avec modification rapide possible de l’état physiologique des animaux (formes suraigüe de la maladie). Dans un but de raffinement de la technique elle-même pour ce projet, la chirurgie sera réalisée par un.e chirurgien.ne expérimenté.e dans cette technique d’implantation afin d’optimiser la réussite du projet et encadrée par une équipe vétérinaire formée à l’anesthésie.

Choix des espèces

La pertinence de l’utilisation du singe vert pour le projet de recherche a été établie par l’utilisateur final. Le Singe vert est une espèce phylogéniquement proche de l’homme et particulièrement sensible au virus Nipah considéré dans le projet. Le modèle d’infection par le virus Nipah du Singe vert est un modèle complexe qui a été parfaitement établi par d’autres équipes de recherche françaises, avec notamment un descriptif complet de la physiopathologie, de la réplication virale de la survie, selon le mode et la dose d’infection. Le choix du stade physiologique et du sexe des animaux est décidé dans le cadre de l’étude finale. Le contexte actuel d’approvisionnement en primates permet d’avoir essentiellement des juvéniles, on veillera que les animaux soient assez gros pour la réalisation technique de la chirurgie. Le modèle d’infection du Singe vert par Nipah ne montre pas de différences notables entre les mâles et les femelles. Les animaux des deux sexes seront donc utilisés (6 mâles et 6 femelles).

1600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie de deux heures induisant une ischémie-reperfusion du foie, puis plusieurs injections, pour tester une molécule contre les lésions hépatiques après chirurgie ou transplantation. Le porteur qualifie de modérées les douleurs abdominales dues au clamp vasculaire et affirme que l'animal vit normalement. Il conclut qu'il est impossible de reproduire in vitro la complexité de l'ischémie-reperfusion hépatique.

Objectifs

L’hépatite ischémique est une lésion du foie induite par un apport insuffisant de sang ou d’oxygène, induisant la mort des cellules hépatiques. Il a été démontré que la neutralisation d’une protéine libérée par les cellules et les organes et qui est impliquée dans un réflexe primitif de la faim induisait l'activation du flux autophagique dans des modèles de toxicité chronique du foie. Sur la base de ces observations, l’objectif de ce projet est de déterminer si l'inhibition de cette protéine peut prévenir ou traiter l’hépatite ischémique chez des modèles murins appropriés.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de valider dans un modèle préclinique une nouvelle stratégie thérapeutique pour palier à l'ischémie-reperfusion hépatique, qui survient après une chirurgie ou une transplantation du foie et qui influence considérablement le pronostic de la fonction hépatique.

Procédures

Tous les animaux du projet seront soumis une seule fois à une chirurgie induisant l'ischémie-reperfusion hépatique (durée environ 2h/souris). L’acte chirurgical sera réalisé sous anesthésie et analgésie. Les animaux recevront 2, 4, 6 ou 8 injections sous-cutanées (animal vigile). Tous les traitements seront administrés par voie intra-péritonéale, les animaux recevront 2, 4, ou 5 injections (animaux vigiles). La durée des injections sous-cutanées et intra-péritonéales est de quelques secondes.

Impact sur les animaux

Tous les animaux du projet seront soumis à une chirurgie induisant l'ischémie-reperfusion hépatique. Aucun autre effet indésirable n’est attendu en dehors de ceux connus et causés par cette induction. Les douleurs abdominales dues au clamp vasculaire seront modérées car les procédures n’excéderont pas 72h. L’animal vit normalement (ses mouvements et sa respiration ne sont pas impactées). Les injections intra-péritonéales et sous-cutanées (animal vigile) ne provoquent pas de symptômes majeurs autre que la douleur de piqure de l’aiguille.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants est indispensable car il est actuellement impossible à reproduire, in vitro ou ex vivo, les conséquences et les effets sur l’organisme de l'ischémie-reperfusion hépatique vu sa complexité.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 1600 souris. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si la procédure initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés. Les tests statistiques utilisés seront des tests « LogRank » pour la survie, et des tests « Anova » pour comparer les divers groupes de traitements.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum ; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, anesthésie/analgésie des animaux, utilisation de lampes chauffantes...). Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques et éthiques : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est le modèle animal le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Selon les procédures, les animaux seront utilisés entre 7 et 8 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé. Selon les procédures, les animaux seront utilisés entre 7 et 8 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.

465 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des instillations intranasales d'un produit bactérien sous anesthésie, un transfert de cellules lymphoïdes et des injections d'une neurotoxine pour dénerver le poumon, avant prélèvement pulmonaire, pour étudier la formation de structures lymphoïdes tertiaires. Le porteur indique que les instillations peuvent provoquer une gêne respiratoire et fixe la mise à mort à une perte de poids de 20 pour cent. Il affirme qu'aucune approche in vitro ne permet de provoquer ces structures.

Objectifs

Le projet vise à élucider les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à la formation des structures lymphoïdes tertiaires en conditions inflammatoires. La présence de ces structures a en effet été corrélée à un bon pronostic dans de nombreux types de tumeurs solides, et notamment dans les cancers du poumon non à petites cellules. Nous souhaitons étudier le rôle de cellules lymphoïdes innées dans la néogenèse de ces structures. L'étude des voies de signalisation à l'origine de l'induction de ces structures dans les poumons pourrait permettre à l'avenir leur manipulation à des fins thérapeutiques, avec l'identification de molécules candidates jouant un rôle dans leur néogenèse. L'expérimentation sera réalisée en utilisant un modèle inflammatoire visant à induire ces structures pulmonaires. Les objectifs principaux de ce projet sont : 1 – d'étudier la population de cellules lymphoïdes innées au cours de l'inflammation induite par un produit bactérien, par l'analyse cinétique des différents compartiments cellulaires des poumons de ces souris ; 2 - d'étudier la néogenèse des structures lymphoïdes tertiaires et la présence des cellules lymphoïdes innées pulmonaires au cours de l'inflammation, en présence ou absence de fibres nerveuses ; 3 - de transférer des cellules lymphoïdes innées pulmonaires chez des souris naïves ou ayant reçu un traitement avec une faible dose du produit bactérien, afin d'étudier la capacité des cellules transférées à induire ces structures en conditions non ou faiblement inflammatoires.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but d'élucider les mécanismes sous-jacents à la formation des structures lymphoïdes tertiaires, et plus particulièrement d'évaluer le rôle des cellules ILC3 dans ces processus. Pour cela, l'utilisation de souris rapportrices RORgt-EGFP dans lesquelles nos cellules d'intérêt expriment l'EGFP, représente un outil pour étudier cette population mais aussi pour les purifier en vue de réaliser des tests fonctionnels. Ce projet vise donc à mieux comprendre le processus de formation des TLS, et étudier la cible thérapeutique que pourraient représenter des ILC3 pulmonaires dans différentes maladies. Induire des TLS chez les patients cancéreux ouvrirait la voie à de nouvelles possibilités thérapeutiques tous stades de la tumeur confondus, et pourrait ainsi contribuer à allonger la survie de ces patients, même lorsqu'ils sont inopérables.

Procédures

- Instillations intranasales : 5 instillations par voie intranasale (lent dépôt de 14 µL/narine de chaque souris maintenue verticalement ; durée totale environ 2-3 minutes/souris en fonction du rythme respiratoire) de NaCl 0,9% ou de LPS à des animaux préalablement anesthésiés. - Transfert adoptif d'ILC3 pulmonaires par voie intraveineuse : injection dans la veine de la queue de 100 µL de suspension cellulaire (1000 cellules en PBS 1X stérile) sur souris vigile, sous lampe chauffante et placée brièvement dans un dispositif de contention lors de l'injection (durée totale environ 1 minute, chauffage préalable environ 5-10 min). Cette intervention n'est réalisée qu'une fois par animal. - Injections de 6-OHDA par voie intrapéritonéale : Sur animal vigile, injection de 200 µL de NaCl 0,9% ou de 6-OHDA resuspendue en NaCl (100mg/kg puis une deuxième injection à 250 mg/kg 48h plus tard). Durée totale < 30 secondes. - Prélèvements : Tous les prélèvements (poumons, plasma) sont réalisés sur animaux euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Les animaux ne subiront aucune manipulation plus douloureuse qu'une injection ponctuelle par voie intra-péritonéale ou intraveineuse (cellules), ou une instillation intranasale (LPS) sous anesthésie générale. Les injections pourront provoquer l'apparition d'un stress chez les animaux, mais toutes sont rapides (pas plus de quelques secondes) et les animaux sont maintenus immobiles le temps de l'injection (voie i.p. ou i.v.) afin de limiter au maximum l'éventuelle douleur provoquée. Dans le cas des instillations intranasales, une gêne respiratoire pourra dans certains cas être observée au moment des instillations dans la narine.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les poumons des animaux seront prélevés dans le but d'analyser les TLS pulmonaires ainsi que les ILC3. Les animaux devront donc être euthanasiés suite à l'inflammation induite par le LPS afin de prélever leurs poumons pour procéder aux analyses ex vivo décrites dans les procédures (suivi de la densité de TLS et de la population d'ILC3, purification d'ILC3 fonctionnelles pour leur utilisation in vitro et in vivo). Du sang sera également prélevé post mortem sur les animaux afin de procéder à des dosages plasmatiques de catécholamines, afin de s'assurer notamment de la dénervation du système nerveux sympathique.

Remplacement

Il n'existe pas actuellement d'approches alternatives in vitro pour provoquer la formation des structures lymphoïdes tertiaires dans les situations inflammatoires et permettant d’évaluer le rôle des différentes sous-populations cellulaires pulmonaires dans l’induction de ces structures.

Réduction

Nous utiliserons au maximum un total de 465 souris sur trois années dans les approches expérimentales envisagées. Ce nombre a été calculé au plus juste, afin de permettre des analyses statistiques fiables pour chaque expérience. Ces expériences ne répèteront pas d’expériences publiées antérieurement.

Raffinement

Transport depuis le lieu du fournisseur agréé et période d’acclimatation d’au moins une semaine, conditions d’hébergement des souris soigneusement contrôlées : les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés en groupe (5 par cage au maximum). Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, maisons en carton, tunnel en carton ou carré de coton compacté). Locaux d’expérimentation agréés. Les instillations intranasales pouvant engendrer une gêne et un stress intenses seront réalisées sur les animaux sous anesthésie générale (par injection par voie i.p. d'un mélange xylazine-kétamine) afin de limiter ces perturbations. Les animaux seront maintenus immobiles pour les injections afin de limiter la douleur et le stress pouvant éventuellement être provoqués par leur mouvement. Expériences arrêtées dès les premiers symptômes comportementaux et physiologiques d’une santé altérée apparaissant chez les souris : l'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent responsables du bien-être des animaux. Les points limites tout au long des procédures sont déterminés comme suit. 1. Tout dérèglement physiologique aboutissant à une incapacité prolongée ou irréversible à se nourrir ou à boire 2. Modification du comportement caractéristique d'une douleur intense, d'une détresse ou d'une souffrance (absence de locomotion, pelage hérissé et/ou terne, prostration, dos voûté, difficultés respiratoires) 3. Anomalies pouvant entrainer une douleur intense, une détresse ou une souffrance : perte de poids supérieure ou égale à 20% du poids initial de l'animal (pesées entre 1 et 3 fois par semaines selon les procédures : J0-J4-J6-J10-J15 et J20 pour la procédure 1 ; J0-J2-J4-puis 1x/semaine jusqu'à J30-J32-J34-J37 et J40 pour la procédure 2 ; J0-J4-J7-J10 et J14 pour la procédure 3), plaies et ulcères, tumeurs, fractures... Les éventuels risques anesthésiques seront également pris en compte, avec une surveillance de la détresse respiratoire des animaux lors des instillations intranasales (avec arrêt et/ou modulation du rythme des instillations si observation de difficultés respiratoires), et surveillance des animaux après les instillations et avant leur réveil.

Choix des espèces

La souris est l’animal permettant d’explorer le plus facilement la formation des TLS ainsi que les interactions entre cellules du système immunitaire et fibres nerveuses grâce à l’accessibilité d’un grand nombre de réactifs (ex. anticorps, cellules de lignée cellulaire tumorale transfectées avec l’ADNc codant la luciférase). Par ailleurs, les cellules immunitaires ont été exhaustivement caractérisées chez la souris : les marqueurs des cellules d’intérêt de cette étude sont connus et de nombreux anticorps spécifiques sont disponibles. Enfin, différents protocoles développés chez la souris sont décrits de façon détaillée dans la littérature et sont donc applicables sans nécessité de mises au point longues et consommatrices d’animaux. Les animaux seront reçus à l'âge de 12 semaines, puis mis en stabulation pendant une semaine minimum avant de débuter l'expérimentation (8 semaines pour la procédure 2). Cet âge a été choisi car à ce stade de développement, les souris sont sevrées, ont atteint une taille adulte et disposent d'un système immunitaire et nerveux mature. Les expériences durent entre 10 à 40 jours soit un âge maximum de 17,5 semaines (ou avant si les souris présentent des signes de souffrance, une perte de poids>20% de leur poids initial ou détresse respiratoire) à la fin de l'expérience.

3000 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tués à l'issue, environ 200 réutilisés et 20 placés en adoption. Les animaux, souvent porteurs de tumeurs greffées et issus d'un projet précédent, servent à entraîner le personnel aux gestes techniques, jusqu'à quinze journées et deux gestes par jour, dont les administrations, les prélèvements, la chirurgie et l'euthanasie. Le porteur indique que la mise à mort peut être elle-même le geste appris. Il justifie l'usage d'animaux vivants par l'échec d'un rat synthétique jugé insuffisamment réaliste.

Objectifs

Ce projet, dédié à la formation et au maintien des compétences du personnel interne, répond aux exigences réglementaires (arrêté du 1er février 2013 relatif à l’acquisition et à la validation des compétences des personnels des établissements utilisateurs, éleveurs et fournisseurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques) et éthiques. Il permet de répondre aux besoins d’acquisition de compétences sous tutorat ou de perfectionnement de gestes techniques nécessaires à l’activité de recherche spécifique. Les gestes qui pourront être travaillés sur souris ou rats sont les suivants : 1)Identification des animaux 2)Techniques d’administrations 3)Procédures non invasives réalisées sous anesthésie gazeuse (ex. imagerie) 4)Prélèvements sanguins 5)Techniques de chirurgie sous analgésie et anesthésie 6)Techniques d’euthanasie 7)Autopsies : apprentissage de l’anatomie avec reconnaissance et prélèvements d’organes en post-mortem. Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet sont essentiellement issus d’un premier projet autorisé. Du fait du design des études en oncologie nécessitant de greffer des animaux qui ne sont ensuite pas tous inclus dans les études de pharmacologie, une grande proportion d’animaux formation sera porteur de tumeur greffée en sous cutanée dont le volume sera de petite taille et contrôlé (de type « petit nodule »). Cette réutilisation des animaux permet de valoriser les animaux non inclus dans les études et contribue à la règle des 3R par la réduction du nombre d’animaux. A défaut de disponibilités compatibles avec les besoins en formation, les animaux nécessaires seront commandés spécifiquement auprès des fournisseurs.

Bénéfices attendus

L’entrainement et la compétence du personnel, au-delà de l’aspect réglementaire, contribuent à la bonne réalisation des études, à la fiabilité des résultats, ainsi qu’au respect du bien-être animal par la réalisation de gestes maitrisés. A l’inverse, un geste technique mal réalisé au cours d’une étude peut avoir pour conséquence : - Un stress de l’animal - Une souffrance de l’animal allant jusqu’à la mort en cas de fausse route lors d’un gavage par exemple. - Une plus forte variabilité des résultats de l’étude ou des résultats ininterprétables amenant à devoir reproduire l’étude en utilisant plus d’animaux.

Procédures

Pour les gestes techniques, une limite de 15 journées d’utilisation (consécutives ou non) est fixée par animal à raison d’un nombre maximal de 2 gestes par jour. En fonction du type de technique à acquérir et de l’objectif de formation visés, différentes combinaisons de techniques d’administration et/ou de prélèvements peuvent être réalisées sur un même animal. Les gestes qui pourront être réalisés sont : - identification, administrations et prélèvements sur animaux vigiles (quelques secondes) ou anesthésiés (

Impact sur les animaux

Un maximum de 15 journées d’utilisation seront possibles avec un nombre maximal de 2 gestes techniques simples réalisés par jour. Un seul geste chirurgical sera possible. Aucun animal présentant des signes de douleur ou de souffrance suite à un geste technique ou une chirurgie ne sera gardé en vie.

Devenir

La plupart des animaux seront porteurs de tumeurs, ils devront donc être euthanasiés à la suite de la formation. La mise à mort peut être elle-même la technique pour laquelle la personne sera formée. Dans de rares cas, des animaux qui ne proviennent pas d’une utilisation précédente et en bonne santé pourront être ré-utilisés pour de la mise au point de modèle chirurgical dans le cadre d'un autre projet. L’utilisation de ces animaux se fera uniquement dans le cadre d'un projet autorisé et de gravité de sévérité prospective modéré. Enfin, des cas ponctuels d’adoptions pourraient être organisés sur des animaux immunocompétents, ne présentant pas de phénotype dommageable, en bonne santé, n’ayant jamais été porteurs de tumeurs et dans un contexte où il n’y a pas de besoin de formations à l’euthanasie. L’avis vétérinaire et l’autorisation des autorités compétentes seraient un préalable à ces adoptions.

Remplacement

Par le passé, des sessions d’entrainement sur la contention et l’administration de composés ont été effectuées sur des rats synthétiques (rat Koken) mais n’ont malheureusement pas été concluantes suite au manque de tonicité et de mouvement de l’animal et à la mauvaise reproduction de l’enveloppe corporelle et du système veineux. De plus, certains gestes techniques, comme les prélèvements sanguins à la veine saphène, par exemple, ne pouvaient pas être effectués sur ce moyen de substitution. Il n’y a donc pas d’autres choix, actuellement, que d’exercer ces entrainements sur des rongeurs anesthésiés ou vigiles avant de les mettre en pratique dans des expériences d’un projet de recherche.

Réduction

Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet sont essentiellement issus d’un premier projet autorisé. Cette réutilisation des animaux permet de valoriser les animaux non inclus dans les études et contribue à la règle des 3R par la réduction in fine du nombre d’animaux. A défaut de disponibilités compatibles avec les besoins en formation les animaux nécessaires seront commandés spécifiquement auprès des fournisseurs. Un même animal pourra faire l’objet de plusieurs gestes techniques à raison d’un maximum de 2 gestes par jour. En effet, nous pourrons associer un geste dédié à l’administration avec un geste dédié aux prélèvements sanguins. Par exemple, on pourra cumuler des administrations Intra-veineuses avec des prélèvements de sang à la veine jugulaire sous anesthésie gazeuse. Ainsi, en combinant ces 2 types d’entrainement sur un maximum de 15 journées sur 6 mois (30 gestes maximum) on valorisera au maximum les animaux.

Raffinement

Une attention particulière sera portée sur les volumes des prélèvements sanguins et volumes d’administration, qui seront basés sur des guidelines reconnues. Si un animal présente un signe clinique altérant son bien-être ou nécessitant un soin il sera euthanasié. Pour les animaux porteurs de tumeur, le point limite lié au volume tumoral est inferieur aux normes habituelles afin de s’assurer que l’impact lié à la précédente utilisation de l’animal reste léger. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux tout au long des entrainements, dans des cages enrichies leur permettant de fouiller. Des éléments de nidification sont apportés ainsi que des éléments d’enrichissement en polypropylène permettant une complexification de l’environnement. L’observation de l’utilisation de l’enrichissement sera un paramètre complémentaire permettant de s’assurer du bien-être des animaux.

Choix des espèces

Les projets de l’équipe in vivo se faisant avec des modèles souris ou rat, il convient de s’entrainer sur ces espèces en adéquation avec les activités. Des animaux sevrés seront utilisés majoritairement (jeunes adultes et adultes). Cependant, pour des besoins spécifiques de formation, des animaux non-sevrés pourront être également utilisés.

45 rats nude vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une greffe de cellules tumorales cérébrales humaines lors d'une chirurgie d'une heure, puis des injections intraveineuses de nanoparticules et des séances d'imagerie par scanner et IRM, pour optimiser la dose visualisant un glioblastome. Le porteur estime la douleur légère au motif que le cerveau n'est pas innervé, la gêne provenant de l'incision du crâne. Il affirme que la distribution des nanoparticules in vivo est "indispensable" et qu'aucune méthode alternative n'est possible.

Objectifs

Les tumeurs cérébrales appelée glioblastomes sont les cancers du cerveau les plus fréquents et sont généralement agressifs. En clinique, actuellement le protocole de traitement de ces tumeurs cérébrales commence par une ablation chirurgicale, suivie de séances de radiothérapie et de chimiothérapie. En effet, dans la plupart des cas, l’ablation chirurgicale ne permet que de retirer partiellement la masse tumorale. Les cellules cancéreuses restantes après chirurgie sont ensuite traitées par radiothérapie et chimiothérapie. Ce projet se place dans le contexte clinique de traitement des tumeurs cérébrales, et plus particulièrement sur l’amélioration de l’efficacité du traitement par radiothérapie guidée par l'image grâce à l’utilisation de nanoparticules. Une nanoparticule radiosensibilisante (en cours de développement clinique) a été développée pour permettre une imagerie bimodale par résonance magnétique (IRM) et tomodensitométrie (TDM). L’objectif principal de ce projet consiste à optimiser la dose de nanoparticule à injecter chez le rat pour visualiser la tumeur en IRM et en TDM. Nous avons préalablement évalué in vitro (sur cellules tumorales humaines) l’intérêt s de ces nanoparticules pour les 2 modalités d’imagerie, la toxicité des nanoparticules ainsi que l’efficacité thérapeutique en association avec la radiothérapie et avons ainsi pu démontrer leur pouvoir « radiosensibilisant » et leur intérêt pour de l’imagerie bimodalité. Nous souhaitons confirmer ces résultats très prometteurs sur un modèle de tumeur cérébrales chez le rat et optimiser les conditions d’imagerie.

Bénéfices attendus

Les nanoparticules que nous avons développées présentent de multiples intérêts. (1) elles permettront de décupler les effets toxiques du traitement de radiothérapie au sein de la tumeur (2) elles permettront un meilleur suivi par imagerie de la progression/régression tumorale au cours du traitement des patients L’objectif du projet étant ainsi d'optimiser les modalités de traitement des tumeurs cérébrales.

Procédures

Chirurgie 1h sous anesthésie gazeuse. 1 fois Imagerie par bioluminescence : injection intra-péritonéale sur animal vigil (quelques secondes) puis15 min d'imagerie sous anesthésie gazeuse. 1 fois Injection de nanoparticule par voie intraveineuse dans la veine de la queue ( quelques secondes) : 2 fois à 3 jours d'intervalle. Imagerie par tomodensitométrie sous anesthésie gazeuse : 30 min; 2 fois Imagerie IRM sous anesthésie gazeuse : 20 min; 2fois

Impact sur les animaux

Chirurgie opératoire classée modérée car la procédure est parfaitement maitrisée au sein de notre laboratoire . Malgré une opération invasive due à l’incision de la peau du crâne et à l’injection de cellules intracérébrale, la douleur engendrée par l’acte chirurgical est estimée modérée, car dès le lendemain le rat se laisse manipuler aisément, ne montre aucun signe de peur (cris, prostration, agressivité) lors du nettoyage de la plaie. Le cerveau n’étant pas innervé, la douleur principale engendrée par l’opération provient de l’incision de la peau du crâne que nous estimons légère. Utilisation d'analgésiques pour limiter la souffrance des animaux. Imageries non invasives réalisées sous anesthésie volatile.

Devenir

Animaux mis a mort à la fin de la procédure ou si un point limite est atteint. Les animaux seront mis à mort et le cerveau ainsi que les organes seront prélevés pour analyse macroscopique et histologique.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est dans ce contexte clairement pas possible puisque le développement de tumeurs cérébrales dépend de phénomènes biologiques complexes. De plus la distribution des nanoparticules in vivo est indispensable pour évaluer leur intérêt en imagerie. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous pourrons suivre dans le temps sur chaque animal la croissance tumorale ainsi que la prise de contraste par les nanoparticules. Nous obtiendrons ces données sans avoir besoin de mettre à mort les animaux à différents temps. Cette procédure offre donc l’opportunité d’utiliser un nombre plus restreint d’animaux car la prise d’image peut être réitérée au cours du temps

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux après l'implantation de la tumeur (pesée quotidienne, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, désinfection et vérification de la bonne cicatrisation de la plaie) . L'atteinte d'un point limite décrit dans le descriptif de la procédure conduira à la mise à mort de l'animal. Une attention toute particulière sera également portée lors du transport des animaux depuis le site d’hébergement et de chirurgie vers les sites d’imagerie, notamment par le maintien d'une température optimale (par l'intermédiaire de bouillottes chauffantes placées sous les cages). Ce transport se fera toujours sous conditions éveillées : l’anesthésie gazeuse étant rapidement réversible. Les animaux bénéficieront en permanence d'un enrichissement sous forme de feuilles de sopalins et de bâtonnets en bois à ronger. Une prise en charge analgésique sera réalisée en pré-opératoire et post-opératoire par injection sous-cutanée de Meloxicam avec possibilité de réitération les 2 jours suivants la chirurgie.

Choix des espèces

Dans les études menées en oncologie, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles murins (souris et rats). Les rats constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibilité et de leur facilité de manipulation. En outre, le choix de cette espèce se justifie par les limitations de résolution offertes par l’imagerie. Les rats nude (dépourvus d’une partie du sytème immunitaire) sont classiquement utilisées dans le cas de greffes de cellules tumorales humaines car il n'y a ainsi pas de rejet du greffon tumoral implanté. Nous privilégions des rats mâles, sexe utilisé jusqu’à présent dans nos études antérieurs afin de pouvoir confronter nos résultats. Des rats âgés de 8 semaines sont utilisés, à un stade où leur conformation crâniale correspond à celle de l’atlas sur lequel nous nous basons pour injecter les cellules tumorales dans un endroit précis du cerveau.

220 rats femelles vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, seize gardés en vie pour des formations internes et le reste tué pour des prélèvements terminaux de peau, muscle et os. Les animaux sont épilés puis exposés à des rayonnements ionisants sur la patte arrière sous anesthésie, ce qui provoque une radiodermite douloureuse et une possible perte de poids. Le porteur décrit un modèle destiné à tester des vasoconstricteurs contre les brûlures des radiothérapies. Il affirme qu'un modèle in vivo est "nécessaire" pour évaluer la réponse à l'échelle de l'organisme.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont de mettre en place un modèle d’irradiation localisée de la patte chez le rat afin de mimer les brulures pouvant survenir des radiothérapies ou des actes de radiologie interventionnelle. Une fois le modèle mis en place, les objectifs seront de tester différents produits et d’évaluer leurs efficacités sur la prévention et/ou la limitation du développement des lésions.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à démontrer l’efficacité de vasoconstricteurs (substance permettant de rétrécir le diamètre des vaisseaux sanguins) en application cutanée préventive pour prévenir et/ou limiter l’apparition de lésions cutanées suite à une exposition aux rayonnements ionisants (radiothérapie et radiologie interventionnelle).

Procédures

Les animaux seront épilés (crème dépilatoire) et exposés aux rayonnements ionisants sous anesthésie gazeuse. Des pesées et un scoring des lésions seront réalisés sur animaux vigiles. Une fois par semaine le flux sanguin au niveau des pattes sera mesuré au laser doppler sous anesthésie gazeuse. Des prélèvements terminaux (prélèvement de sang, de la peau, des muscles et des os) seront réalisés sur tous les animaux.

Impact sur les animaux

L’objectif de ce projet étant de développer un nouveau modèle de radio dermite radio-induite chez le rat, les animaux exposés aux rayonnements ionisants vont développer des dermatites radiques localisées au niveau de la patte arrière gauche plus au moins sévères en fonction de la dose d’exposition. Cette dermatite radique va conduire à une douleur locale au niveau de la patte. Une perte de poids n’est pas à exclure lorsque le pic de la lésion sera atteint ainsi qu’une utilisation réduite de cette patte. La durée et la sévérité de ces effets va dépendre de la dose d’exposition.

Devenir

Les animaux devront être euthanasiés à la fin de l’expérience afin de réaliser les différents prélèvements prévus. Une partie des rats sera gardée en vie et pourront être utilisés dans des sessions de formation interne.

Remplacement

Dans le but de caractériser un nouveau modèle de radiodermite chez le rat et d’évaluer l’efficacité thérapeutique de vasoconstricteurs pour le traitement ou la prévention des radiodermites radio-induites il est nécessaire d’avoir recours à un modèle « in vivo ». Ce modèle nous permettra d’évaluer l’impact de l’irradiation à différentes énergies et la réponse thérapeutique à différents vasoconstricteurs sur le développement d’une pathologie à l’échelle de l’organisme.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation de 220 rats sur 5 ans. Le nombre d’animaux utilisé correspond au minimum nécessaire pour obtenir un résultat scientifique robuste et statistique.

Raffinement

Les conditions de soins et d’hébergement des animaux seront adaptées aux procédures réalisées afin de limiter le plus possible le stress et la souffrance de l’animal. Les rats seront hébergés en groupe et dans un environnement enrichi. Lors des irradiations, des anesthésiques seront utilisés et une surveillance des animaux sera mise en place après les irradiations. Le bienêtre animal sera également évalué en réalisant des pesées, des photos des lésions et un scoring lésionnel ainsi que la mise en place de points limites adaptés.

Choix des espèces

Pour les besoins de ce projet nous avons choisi d’utiliser l’espèce animale rat car des équipes ont déjà travaillé sur la même thématique avec ce modèle. Nous pourrons ainsi comparer l’efficacité du traitement appliqué à ces études. Nous utiliserons des animaux adultes (10 – 12 semaines) afin d’éviter une potentielle hétérogénéité liée à l’âge. Pour ce projet nous utiliserons uniquement des rats femelles. L’objectif n’étant pas d’étudier le dimorphisme sexuel, les femelles, moins agressives, ont été choisies, ce qui permettra de garder les animaux en groupes sociaux stables.

100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit trois injections intramusculaires dans les pattes arrière sur animal vigile maintenu par contention, puis deux prélèvements sanguins au sinus rétro-orbitaire sous anesthésie, pour comparer des candidats vaccins anticytokines en développement. Le porteur indique que les prélèvements oculaires peuvent provoquer douleurs, blépharospasme et écoulements. Il conclut que l'absence de méthode in vitro rend le recours à la souris "incontournable", préférant une lignée transgénique produisant des protéines humaines.

Objectifs

Les cytokines sont des protéines naturelles qui assurent la communication intercellulaire et orchestrent les réponses immunitaires, inflammatoires ou allergiques. Leur surexpression ou dérégulation conduit à l’apparition ou au développement de pathologies auto-immunes, inflammatoires ou cancéreuses. Ces pathologies sont aujourd’hui de véritables enjeux de santé publique. C’est pourquoi, une nouvelle stratégie d’immunothérapie active a été développée, reposant sur la production d’anticorps anti-cytokine, par le système immunitaire du patient, après administration d’un candidat vaccin. Ce dernier est composé d’une protéine porteuse couplée à une cytokine. Un test d’activité chez la souris permet de sélectionner les meilleurs candidats vaccin lors de la phase de développement. Il n’existe à ce jour pas de méthodes in vitro permettant d’évaluer la réponse immunologique à ce vaccin. Cette limitation rend incontournable le recours à l’expérimentation animale, pour tester l’efficacité de nouveaux candidats vaccins. Cette étude sert à valider la conformité des lots de vaccins produits pour les études précliniques, ainsi qu’à valider les évolutions du procédé inhérentes au développement jusqu’aux études cliniques. A terme ce test chez la souris sera standardisé pour être utilisé comme test de contrôle qualité pour la libération des lots de vaccins.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à valider que les modifications apportées au cours du développement du procédé de fabrication du vaccin n’affectent pas l’activité in vivo de ce dernier qui à terme sera administré chez l’homme au cours d’un programme d’évaluation clinique.

Procédures

Chaque animal recevra trois injections de vaccin par voie intramusculaire aux sites d’injections des pattes arrière (100 µl au total, 50 µl par patte). Les injections sont réalisées sur animaux vigiles maintenus par contention pendant 30 secondes. Ensuite, chaque animal sera prélevé 2 fois au sinus retro orbitaire sous anesthésie générale par inhalation d’isoflurane (anesthésie sur une durée de 5min). Le prélèvement de sang est réalisé en moins de 30 secondes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables généralement observés sont principalement dus à l’injection ou au prélèvement au sinus retro orbitaire. Les effets secondaires liées au candidat vaccin ne sont pas attendus. Le principe du vaccin étant de provoquer une réponse immune, des effets indésirables de type inflammatoire peuvent se produire principalement au site d’injection et se manifester par des œdèmes et érythèmes pouvant durer quelques heures à quelques jours. L’injection se faisant par voie intramusculaire dans le muscle de la patte arrière une douleur musculaire localisée pourra entre autres être détectée si l'animal a tendance à se mordre au niveau de la zone douloureuse. Les prélèvements sanguins se faisant au niveau du sinus rétro-orbitaire, des effets indésirables sur l’œil peuvent se produire. La survenue de contractions répétées et involontaires des muscles des paupières (blépharospasme), la sécrétion lacrymale éventuellement accompagnée de photophobie, les écoulements, la survenue d'œil rouge ou opaque seront examinés, puisqu'ils traduisent des douleurs oculaires et l'état des yeux.

Devenir

Le système immunitaire des souris utilisées ayant été stimulé par les candidats vaccin, ce dernier conservera une « mémoire » des vaccinations précédentes. Nous ne serons donc plus dans la possibilité d’obtenir chez ces souris, une réponse immunitaire comparable à des animaux nouvellement-vaccinés. De surcroit les souris ont une durée de vie assez courte et l’utilisation d’animaux âgés n’est pas recommandé pour l’obtention d’une bonne réponse immunitaire. Après le deuxième prélèvement, soit à jour 56 après la première injection, les animaux sont mis à mort par dislocation cervicale.

Remplacement

La stimulation du système immunitaire par vaccination ne peut s’effectuer que sur animaux vivants. Il n’existe pas à ce jour de méthode in vitro permettant de remplacer le recours à l’expérimentation animale.

Réduction

Ce protocole suit la condition pour lequel un nombre de 10 animaux par groupe procure une puissance statistique suffisante (tests statistiques classiques, i.e. Wilcoxon). Les groupes de souris sont divisés en sous-groupes de 10 selon leur sexe.

Raffinement

Les animaux disposent d'une période d'acclimatation conséquente (minimum 7 jours) avant l'initiation de tout protocole, afin de limiter l'angoisse subie. Ils subissent ensuite des contraintes très modérées. Les injections réalisées en intramusculaires et les prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse, ont lieu de façon ponctuelle et n’induisent pas de modification de leur bien-être. Enfin, des points-limites généraux avec l’établissement d’une grille d’évaluation regroupant les critères relatifs au bien-être tout le long de l’étude ont été établis. De plus, des antalgiques sont prévus si l’animal présenté un signe de souffrance (Buprénorphine à 0,05 mg/kg par voie sous-cutanée). Si un animal présente l'un des points limite à un seuil critique, il est mis à mort afin d'abréger sa souffrance. Une attention particulière sera portée aux conditions d’hébergement des animaux. Le bruit dans les zones d’hébergement ainsi que dans la zone d’expérimentation sera réduit au maximum. Les souris seront hébergées par groupe de 5 souris maximum par cage. Ce milieu sera enrichi (igloo + copeaux) et la nourriture et l’eau seront fournis ad libitum afin de s’assurer du bien-être de l’animal.

Choix des espèces

Il n’existe à ce jour pas de méthodes in vitro permettant d’évaluer la réponse immune à un vaccin. Cette limitation rend incontournable le recours à l’expérimentation animale, préférentiellement la souris, pour tester l’efficacité de nouveaux candidats vaccins. La réponse immunitaire chez la souris est assez proche de celle de l’Homme. Dans le cas des tests de nos vaccins candidats pour l’Homme, il est nécessaire d’utiliser une lignée de souris transgénique. Ces souris sont capables de produire des protéines d’intérêt ayant une séquence humaine. Ces conditions sont ainsi proches des réponses immunes attendues chez l’Homme lors de l’administration de nos vaccins et sont donc plus pertinentes pour en évaluer l’efficacité.