Procédures modérées

Pour mettre au point des implants d'optogénétique sans fil, 70 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Une chirurgie de deux heures place un dispositif dans leur cerveau, suivie de séances de stimulation lumineuse à distance. Le projet met en avant un meilleur confort des animaux, grâce à la suppression des câbles. Les 70 rats sont malgré tout tués à la fin pour des analyses du cerveau.

Objectifs

Le cerveau fonctionne grâce à des milliards de neurones qui communiquent entre eux. Comprendre comment ces cellules contrôlent nos comportements (comme apprendre ou prendre des décisions) est essentiel pour mieux comprendre certaines maladies, notamment les troubles psychiatriques et neurologiques. L’optogénétique est une technique récente qui permet d’agir directement sur l’activité de certains neurones à l’aide de la lumière. Concrètement, des cellules du cerveau sont rendues sensibles à la lumière, ce qui permet de les activer ou de les désactiver de manière très précise. Les chercheurs peuvent ainsi observer comment ces modifications influencent le comportement de l’animal. Cette approche permet de mieux comprendre les liens de cause à effet entre l’activité du cerveau et les comportements. Pour réaliser ce type d’étude, il est nécessaire de travailler sur des animaux vivants, afin d’observer le comportement suite à la manipulation de l’activité des neurones. Cela implique généralement l’implantation d’un dispositif très fin dans le cerveau, permettant d’envoyer de la lumière dans une zone ciblée. Dans ce projet, nous utilisons un nouvel équipement innovant qui fonctionne sans fil. Il s’agit de très petits implants, légers et sans batterie, qui peuvent être activés à distance. Cette technologie présente un avantage important : elle évite l’utilisation de câbles, ce qui simplifie les expériences et améliore le confort des animaux. L’objectif de ce projet est de mettre en place la technique chirurgicale permettant d’installer ces implants et de vérifier que le système fonctionne correctement chez l’animal. À terme, cet outil permettra d’étudier plus précisément le rôle de certaines zones du cerveau dans des comportements complexes, notamment ceux liés à des troubles psychiatriques.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à valider un nouvel outil permettant de stimuler le cerveau sans fil, afin de faciliter les expériences et d’améliorer la liberté de mouvement des animaux. En supprimant les câbles, les animaux peuvent se déplacer plus librement, ce qui permet d’observer des comportements plus naturels et de réduire les contraintes techniques. Ce dispositif offrira de nouvelles possibilités pour mieux comprendre le rôle de certaines zones du cerveau, notamment dans les comportements liés à la récompense et à l’addiction. Enfin, cette technologie contribue à améliorer le bien-être des animaux en limitant le stress et les contraintes physiques, tout en permettant d’obtenir des données scientifiques de meilleure qualité.

Procédures

Sur animaux anesthésiés : - chirurgie d’implantation de dispositif d'activation cérébrale (durée : 2 heures par animal). Sur animaux vigiles : - 2 sessions de locomotion (1 session / jour, 1 heure par session,). - 7 sessions de stimulation cérébrale dans les cages de type 1 (1 session / jour, 1 heure par session). - 7 sessions de stimulation cérébrale dans les cages de type 2 (1 session / jour, 1 heure par session).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues pour cette procédure sont : -Chirurgies : inconfort transitoire au réveil - implantation d'un dispositif à demeure : risques d’infection ou démangeaisons - Les injections peuvent engendrer une légère douleur au niveau du site d’injection

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérience afin de procéder à des analyses moléculaires sur le cerveau

Remplacement

L’utilisation d’animaux est indispensable pour ce projet, car il s’agit d’étudier la relation causale entre l’activité de circuits neuronaux spécifiques et des comportements (locomotion, comportement opérant) dans un organisme intact. Ces phénomènes ne peuvent être reproduits de manière fiable avec des modèles in vitro ou informatiques. Le projet permettra de valider le fonctionnement du dispositif optogénétique sans fil et son déclenchement contingent aux comportements, ce qui nécessite l’observation directe du comportement des animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux est limité au strict nécessaire. Chaque animal est étudié dans plusieurs conditions afin de maximiser les données obtenues, ce qui permet de réduire le nombre total d’animaux utilisés. Les effectifs sont calculés et optimisés de manière à utiliser un minimum d’animaux tout en conservant une grande puissance statistique. Ainsi, nous utiliserons un maximum de 70 animaux sur 5 ans pour répondre à nos objectifs.

Raffinement

Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape grâce à une surveillance régulière, basée sur une grille de suivi dédiée. Celle-ci permet d’évaluer des points limites gradés et de définir des critères d’intervention ou d’arrêt, notamment à partir d’indicateurs tels que la perte de poids, l’apparence générale et le comportement. Un animal atteignant un des points limites définis nécessitant une intervention est pris en charge sans délai. Le bien- être des animaux est pris en compte à chaque étape avec une évaluation basée sur la grille de suivi. Dès leur arrivée à l’animalerie et pour toute la durée du projet, les animaux seront hébergés à deux par cage en conditions normales (température et humidité contrôlées, cages ventilées) et en cycle inversé avec un enrichissement dans la cage fourni par l’animalerie (stick ou pièce de bois à ronger pour assouvir leur besoin naturel de ronger ; tunnel pour se cacher). Les procédures débuteront après une période d’acclimatation de 10 jours minimum, pendant laquelle les animaux seront manipulé par l’expérimentateur principal 3 fois par semaine.

Choix des espèces

Le rat est l’espèce la plus adaptée pour l’étude expérimentale des circuits neuronaux impliqués dans la motivation, la récompense et l’addiction. Les rats présentent des réponses comportementales et neuronales aux drogues et récompenses naturelles comparables à celles de l’Homme et peuvent apprendre à s’auto-administrer de manière fiable différentes substances, ainsi qu’à effectuer des réponses opérantes complexes. Leur taille et leur neuroanatomie permettent l’implantation d’équipements optogénétiques miniaturisés et la réalisation de chirurgies stéréotaxiques précises. Nous utiliserons des rats présentant une faible consanguinité. Cette variabilité génétique interindividuelle importante reflète mieux celle observée chez l’Homme, ce qui renforce la pertinence translational de nos résultats. Cette espèce permet donc de combiner de manière optimale les exigences de manipulations optogénétiques précises et l’évaluation de comportements complexes, dans un modèle pertinent pour l’étude des circuits neuronaux impliqués dans des troubles psychiatriques. Dans cette étude, nous utiliserons des rats « jeunes adultes » de 7-8 semaines au début du projet, ce qui correspond au stade de développement utilisé dans la vaste majorité de nos projets.

Dépourvues de système immunitaire, 24 souris nude vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Une tumeur colorectale humaine est greffée sous leur peau, puis exposée et retirée sous anesthésie pour tester un dispositif d'imagerie par fluorescence. Toutes sont tuées après la chirurgie pour des analyses des tissus. L'aide annoncée aux chirurgiens et la réduction d'opérations inutiles chez les patients restent à distance de cette étape sur l'animal.

Objectifs

Le cancer colorectal est l’un des cancers les plus fréquents et mortels chez les hommes et les femmes avec un taux de survie de 63 % à 5 ans malgré la mise en place d’un programme de dépistage. Des cancers colorectaux (CCR), 30 % sont localisées dans le rectum (cancer rectal CR). Le CR nécessite un diagnostic et un traitement spécifiques. La résection chirurgicale est le traitement de référence, mais elle induit une morbidité importante et une qualité de vie réduite. Les chirurgiens doivent se reposer sur leurs sens de la vision et du toucher afin de distinguer les tissus malades devant être retirés des tissus sains à préserver. Cette absence de guidage est critique ; une identification inadéquate des zones de résection peut être responsable du développement de métastases, d’une récidive locale et de la diminution de la survie. Pour répondre à cette problématique, l’imagerie est devenue un domaine de recherche majeur, notamment autour de l’imagerie de fluorescence. Cette technique non-irradiante est adaptée aux contraintes d’un bloc chirurgical. Elle nécessite l’usage d’un fluorophore sensible et spécifique au tissu malade ciblé. La stratégie « Watch and Wait » (observer et attendre) est une approche permettant de préserver les organes. Un suivi précis de ces patients est crucial pour identifier toute (re)croissance tumorale locale ou dans des organes avoisinants. C'est pourquoi de nouvelles technologies de surveillance ont été développées afin de permettre un suivi plus précis et plus objectif et de minimiser le risque de récidive et d’améliorer les résultats cliniques et la qualité de vie des patients. Dans ce contexte, ce projet aura comme objectif l’évaluation d’un nouveau système d’imagerie avec un fluorophore cible comparé à différents systèmes. Pour ce faire, un modèle murin de xénogreffe de cancers colorectaux permettant de reproduire les conditions du cancer colorectal humain sera utilisé. Ce nouveau dispositif d’imagerie, s’il est validé, pourrait être utilisé au cours d’une chirurgie colorectale ou d’une coloscopie afin d’aider les chirurgiens dans leur prise de décision.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait contribuer à optimiser les thérapies chirurgicales des cancers colorectaux en réduisant le nombre d'opérations inutiles après une réponse clinique complète et d'assurer un meilleur suivi des patients. En effet, le traitement à visée curative du cancer colorectal consiste en une chimioradiothérapie néoadjuvante suivie d'une résection chirurgicale. Cette technique a permis de diminuer la récidive avec de meilleurs résultats à long terme. Toutefois, il est difficile pour les chirurgiens de distinguer les tissus cancéreux des tissus sains. Ainsi, de nouveaux outils d'imagerie diagnostique pourraient améliorer le contraste entre les tissus cancéreux et les tissus sains adjacents pendant la chirurgie. L'imagerie moléculaire ciblée sur la tumeur est une technologie émergente qui pourrait répondre au besoin d'évaluation nécessaire aux chirurgiens. Cette technique innovante peut permettre une visualisation peropératoire en temps réel de la tumeur en mettant en évidence de manière sélective les cellules cancéreuses. Ainsi, cette étude pourrait permettre la mise en place d’essais cliniques chez l’homme et fournir de meilleurs outils d'orientation aux chirurgiens traitant des patients atteints de cancers colorectaux.

Procédures

Les animaux seront soumis à : - une injection sous-cutanée de cellules tumorales (1 minute) – une injection intraveineuse de marqueur fluorescent une heure avant imagerie (10 minutes) - 1 chirurgie sous anesthésie générale pour exposer la tumeur et imagerie sous anesthésie générale (environ 1 heure) - 1 résection de tumeur complète sous anesthésie générale (5 minutes)

Impact sur les animaux

Les effets indésirables qui pourraient être observés sur notre modèle de souris de cancers colorectaux sont : - Inflammation ou nécrose de la tumeur, - Perte de poids Les procédures prévues dans le cadre de ce projet sont limitées à des interventions standardisées et couramment utilisées en expérimentation animale, incluant l’injection de cellules tumorales, l’administration de traceurs, une anesthésie et une séance d’imagerie non invasive. Les nuisances attendues sont principalement liées aux manipulations et à l’anesthésie d’une durée moyenne à longue (un tapis chauffant sera utilisé pour maintenir la température corporelle), susceptibles d’entraîner un stress transitoire chez les animaux. L’implantation tumorale peut conduire à une gêne progressive liée à la croissance de la masse tumorale sous-cutanée ; toutefois, cette évolution est bien maîtrisée et strictement surveillée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure afin de prélever les tissus pour des études et validations post-mortem.

Remplacement

Après un début de développement du dispositif d’imagerie grâce à des approches « in silico » (numériques) et « in vitro » (substrats de synthèse, tissus, organes isolés), le recours à l’animal s’avère essentiel pour avancer dans la validation de cette nouvelle technologie. Il s’agit de démontrer l’efficacité du dispositif d’imagerie en temps réel au cours d’une chirurgie, en validant des paramètres spécifiques dans différentes procédures expérimentales réalisées sur un modèle de cancers colorectaux. L’objectif principal est de démontrer que le nouveau dispositif d’imagerie permet de distinguer les tissus sains des tissus cancéreux pour guider le chirurgien lors de son opération. Cette étape sur l’animal est indispensable afin de pouvoir envisager, par la suite, la mise en place d’essais cliniques chez l’homme.

Réduction

Le nombre de mesures réalisées par animal a été optimisé (plusieurs systèmes d’imagerie seront utilisés sur un même animal) afin de réduire le nombre d’animaux au strict minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Les animaux seront acclimatés à leur hébergement quelques jours avant de démarrer les procédures expérimentales ; la mesure de leurs tumeurs et leur poids sera réalisée 3 fois par semaine. Les chirurgies et les examens d’imagerie seront réalisés sous anesthésie générale. L’usage d’analgésie avant et pendant les opérations permettra une meilleure gestion de la douleur. Les animaux seront euthanasiés sans réveil après la chirurgie. La surveillance et les soins des animaux avant l’intervention seront assurés par une équipe qualifiée de zootechniciens, vétérinaires, techniciens et chirurgiens. La structure en charge du bien-être animal accompagnera le projet dans sa mise en œuvre, avec les conseils du vétérinaire qui prendra les dispositions nécessaires au maintien du bien-être des animaux.

Choix des espèces

La souris représente l’espèce la plus utilisée en expérimentation en oncologie. Il est ainsi possible d’obtenir un modèle standardisé optimal de tumeurs colorectales, modèles plus difficiles à réaliser chez d’autres espèces. La raison la plus importante du choix de la souris pour notre étude est sa similitude avec les organismes humains en ce qui concerne l’anatomie, la physiologie et la génétique. Sa petite taille, sa prolificité, les facilités zootechniques, les risques sanitaires moindres et une littérature abondante sont autant d’arguments complémentaires en faveur du choix de cette espèce. Nous utiliserons des souris nude. Ce modèle de souris permettra l’implantation de lignées cancéreuses humaines et le développement des tumeurs. Ces souris sont connues pour être de bons modèles pour le développement de tumeurs sous-cutanées. Les animaux seront livrés à partir de l'âge de 5 semaines. A cet âge, nous pourrons réaliser les analyses prévues sur les tumeurs. L’utilisation de souris nude, sans poils, fera en sorte que la couleur de la peau et les poils n'interfèrent pas avec les différentes technologies d'imagerie utilisées.

Pour comprendre comment le cerveau arbitre entre faim et soif, 520 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Leur accès à l'eau et à la nourriture est limité à huit heures par jour, et ils reçoivent des implants d'électrodes et de fibres optiques dans le cerveau, ce qui impose ensuite un isolement pour éviter que les congénères ne rongent le matériel. Tous sont tués pour vérifier la position des implants. Le porteur retient le rat parce que c'est l'espèce la mieux étudiée pour ce comportement.

Objectifs

Pour rester en vie et en bonne santé, un animal doit répondre à des besoins vitaux : manger, boire, se reproduire ou fuir un danger. Mais dans la nature, il ne peut pas tout faire en même temps. Il doit donc classer ses priorités en permanence. Si certains circuits du cerveau responsables de la faim ou de la soif sont déjà connus, on ignore encore comment le cerveau arbitre entre ces besoins. Par exemple : si un animal a faim ET soif en même temps, quel circuit neuronal permet de guider son choix ? L'objectif est d'étudier les circuits cérébraux qui reçoivent les signaux du corps (faim, soif) et les transforme en une décision d'agir. Pour comprendre ce mécanisme, nous allons observer des rats placés face à un choix : manger ou boire. Nous réaliserons deux approches : (1) des enregistrements électrophysiologiques qui permettent d’observer l'activité électrique des neurones en temps réel pendant que le rat choisit et (2) des manipulations optogénétiques qui permettent d’activer ou d’inactiver précisément certains neurones afin de voir si cela modifie la décision du rat.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera des bénéfices scientifiques majeurs en éclairant les mécanismes cérébraux qui permettent aux animaux de hiérarchiser leurs besoins vitaux. Au cours des dernières décennies, la recherche a considérablement progressé dans la compréhension des processus permettant de sélectionner les actions les plus à même de maximiser la probabilité de satisfaire un besoin spécifique. Il a ainsi été mis en évidence que le striatum dorsal joue un rôle majeur dans la décision de l’action à réaliser. Cependant, très peu de travaux de neurosciences ont cherché à comprendre comment le cerveau choisit parmi différents besoins primaires. Ces travaux permettront de déterminer si le striatum ventral et ses connections participent à la sélection des besoins à l’image du rôle du striatum dorsal dans la sélection des actions.

Procédures

Chacun des animaux de ce projet sera soumis à une ou plusieurs sédation à l'aide d'un anesthésique gazeux afin de procéder à des injections intra-péritonéales et sous-cutanées, ainsi qu'à un acte chirurgical, réalisé sous anesthésie générale. Ces interventions permettront une injection intracérébrale ainsi que l'implantation de fibres optiques et d'électrodes.

Impact sur les animaux

En condition normale, les animaux mangent et boivent pendant la période nocturne de 12h. L’accès limité à 8h par jour dans la journée, pour l’eau et la nourriture, peut entraîner une perte de poids transitoire de quelques jours avant que le cycle des animaux ne se recale sur le nouveau rythme. Une seconde nuisance possible correspond aux conséquences à court terme des interventions chirurgicales. Durant les jours suivant l’opération, les animaux peuvent perdre un peu de poids, présenter une activité réduite. Dans le cas de l’implantation de fibres optiques, de même que celle des électrodes, les animaux peuvent ressentir une gêne due au poids du chapeau protecteur fait en ciment dentaire. Plus rarement, les animaux peuvent présenter un saignement au niveau des cicatrices. Une dernière nuisance concerne l’isolement des animaux après avoir été implantés avec des électrodes/fibres optiques qui est indispensable car en groupe, les animaux rongent le matériel implanté sur la tête de leurs congénères.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort afin de vérifier que les injections virales, implantations de fibres optiques et d’électrodes d’enregistrement aient été correctement localisées. Cela est nécessaire afin de confirmer que les effets observés sur les comportements des rats soient liés aux structures cérébrales ciblées.

Remplacement

Les méthodes in vitro ne peuvent pas reproduire le fonctionnement d’un organe aussi complexe que le cerveau en raison de l’isolement des cellules du contexte physiologique.

Réduction

En maintenant notre animalerie dans le respect des bonnes pratiques, nous nous efforçons de minimiser la variabilité induite par le stress ou par la présence de pathogènes. Afin de limiter le nombre d’animaux au strict nécessaire, ne connaissant pas la taille de l’effet et la variabilité des mesures au préalable, nous ne pouvons pas utiliser un calcul de puissance pour déterminer l’effectif. L’expertise acquise dans l’équipe sur ce type d’expérience nous a permis de fixer a priori le nombre d’animaux nécessaires. Par expérience nous avons déterminé pour les expériences d’electrophysiologie que des effectifs comprenant 20 animaux (mâles et femelles) nous permettent de mettre en évidence des différences significatives entre les groupes expérimentaux et d’anticiper de possibles mauvais placements des fibres, électrodes et de sites d’injection. Ceci prend donc en compte les problèmes susceptibles de survenir aux différentes étapes de l’expérimentation et qui peuvent amener à écarter des animaux. Les analyses statistiques appropriées seront réalisées. Enfin, pour utiliser tous les animaux produits, l’étude porte sur les mâles et les femelles.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation à l’animalerie ainsi qu’au contact des expérimentateurs avant le début des procédures expérimentales, afin de limiter autant que possible le stress lié à la manipulation. Leur environnement sera enrichi et cet enrichissement sera renouvelé régulièrement afin de diversifier les stimulations et de favoriser l’expression des comportements naturels. Lors des chirurgies, un anesthésique volatil sera utilisé en raison de sa rapidité d’induction et de réveil, ainsi que de la meilleure stabilité du niveau d’anesthésie qu’il procure par rapport aux anesthésiques injectables. Cette approche permet une récupération post-opératoire plus rapide et réduit la mortalité. La surveillance post-opératoire sera renforcée afin de s’assurer de la bonne récupération des animaux et de permettre une intervention rapide en cas de complication. L’évaluation de la douleur reposera sur une grille prenant en compte l’aspect général (pelage, posture, ouverture des yeux), le poids corporel, le comportement spontané et le comportement induit. Tout animal présentant des signes de douleur (pelage terne, poils hérissés, dos voussé, yeux mi-clos, apathie) recevra un traitement antalgique toutes les 24 heures et sera observé deux fois par jour. Si aucune amélioration n’est constatée, une nouvelle injection d’analgésique sera effectuée. En l’absence d’amélioration supplémentaire, l’animal sera euthanasié afin de prévenir toute souffrance prolongée.

Choix des espèces

L’utilisation du rat est justifiée par la richesse de données collectées par la communauté scientifique chez cette espèce, tant au niveau anatomique que comportemental. Au niveau anatomique, les afférences au noyau accumbens ont été mieux détaillées chez le rat que chez n’importe quelle autre espèce. Au niveau du comportement de prise alimentaire, le rat a également été l’espèce la mieux étudiée. Enfin, le récent développement de vecteurs viraux permet désormais de manipuler sélectivement des populations neuronales spécifiques chez cette espèce. Afin d'améliorer la précision de nos chirurgies, et donc de réduire le nombre d'animaux utilisés, nous réaliserons nos expériences chez des rats adultes (>7-8 semaines), un stade du développement cérébral en adéquation avec notre question scientifique.

Gardés en vie et réutilisés à la fin, 7 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une crème inflammatoire est appliquée sur leur dos une à deux fois par jour pendant quinze jours, avec quatre biopsies de peau sous anesthésie et cinq prises de sang, pour valider un modèle de psoriasis. Le modèle avait été testé sur quatre animaux, aux réponses inconstantes. Trois macaques sont ajoutés pour tenter d'obtenir l'effet recherché.

Objectifs

L’objectif du projet est de valider un modème d’inflammation cutanée chez le primate non humain afin de reproduire une réponse inflammatoire cutanée comparable à celle observée chez l’homme dans le cadre d’un psoriasis. Le psoriasis touche 2 à 3 % de la population, ce qui en fait une maladie chronique fréquente et un véritable enjeu de santé publique. Son caractère inflammatoire systémique justifient une recherche active pour mieux comprendre ses mécanismes. Enfin, son fort impact sur la qualité de vie rend indispensable le développement de traitements plus efficaces et mieux tolérés. De plus, le psoriasis partage des mécanismes inflammatoires avec d’autres maladies auto-immunes extrêmement invalidante, comme l’arthrite rhumatoïde. Les modèles expérimentaux de psoriasis sont donc aussi utilisés comme des portes d’entrées sur d’autres maladies inflammatoires pour lesquelles il n’y a pas de modèles satisfaisants. Mieux caractériser ce modèle au niveau des mécanismes inflammatoires impliqués permettra de l’utiliser pour tester des candidats médicaments dédiés à d’autres indications thérapeutique et accélérera leur développement. Dans le cadre de cette validation, des prélèvements cutanés et sanguins seront réalisés, cette approche permettra de caractériser les profils d’expression génique associés à la réponse inflammatoire et de confirmer la pertinence biologique du modèle. Un modèle similaire a été décrit chez la souris puis chez le primate non humain mais une revalidation est nécessaire : • les données existantes concernent une autre espèce de primate non humain, susceptible de présenter des différences immunologiques. De plus, les données méthodologiques sont lacunaires et ne permettent de pleinement juger de la pertinence du modèle ou de le reproduire. • il faut spécifiquement vérifier l’activation de certaines voies de signalisation inflammatoires dans les lésions induites, étape indispensable pour le développement de candidats thérapeutiques ciblant certaines populations immunitaires. La validation du modèle dans cette espèce vise ainsi à confirmer sa pertinence biologique, sa reproductibilité et son adéquation aux besoins du programme de recherche, en vue de son utilisation ultérieure pour l’évaluation de nouvelles approches thérapeutiques destinées aux maladies inflammatoires cutanées.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ces projets sont à terme, la validation d’un modèle préclinique qui induit une réponse inflammatoire cutanée similaire au psoriasis humain, tant sur le plan clinique qu’immunologique, d’étudier les mécanismes immunitaires induits par cette crème chez le primate, plus proche de l’homme que les rongeurs, pour mieux caractériser les voies impliquées et enfin d’avoir un modèle validé pour évaluer l’efficacité et la tolérance de nouvelles approches thérapeutiques.

Procédures

Au cours de ce projet, les animaux vigiles auront une application de crème sur le dos quotidiennement pendant 15 jours pour 4 animaux et bi quotidiennement pour 3 animaux. L’application de la crème et la contention durera environ 10 à 15 minutes. Cette contention pour l’application de la crème permettra également de faire une observation dermatologique rapprochée quotidienne du site d’application. Les animaux auront également 5 prélèvements de sang de 2,5ml, pour un volume total prélevé de 12,5 ml sur 2 semaines. Les animaux seront vigiles lors des prélèvements de sang uniquement les jours sans biopsie de peau. Les jours de biopsie, les animaux seront anesthésiés, les prélèvements de sang se feront donc à ce moment-là. Chaque prélèvement dure entre 3 à 15 minutes (contention et prélèvement compris). Quatre prélèvements de peau par animal seront réalisés chez tous les animaux et sous anesthésie générale et analgésie (après une mise à jeun inférieur à 16h). Pendant cette anesthésie, des mesures spécifiques dermatologiques tel que l'hydratation ou le pH de la peau seront prisent de manière non invasive avec des appareils de mesure spécialisé pour 4 animaux uniquement. Le prélèvement durera environ 30 minutes (anesthésie et mesures comprises) et environ 20 min sans les mesures pour les 3 autres animaux. Le suivi des poids tout au long du projet nécessitera une contention d’environ 5 minutes. Pour le confort des animaux, certains prélèvements et suivis pourront être réalisés simultanément (ce qui diminuera le nombre de manipulations et de contentions). Des points limites précoces ont été déterminés afin de prendre en charge toute forme de douleur ou de souffrance. En cas d’atteinte d’un de ces points, l’animal concerné sera pris en charge selon les recommandations du vétérinaire.

Impact sur les animaux

Sur la base du mode d’action de la crème utilisé et de sa cible cutanée des lésions au niveau de la peau pourront être observées. La réalisation de prélèvements sanguins peut également provoquer un stress, une douleur légère et/ou l’apparition de réactions locales (du type hématome ou oedème léger par exemple) au niveau de la zone de ponction. Les prélèvements de peau sous anesthésie pourront provoquer des douleurs au niveau de la zone de prélèvement ainsi qu’un hématome et dans de très rare cas une déhiscence de plaie ou infection de la zone de prélèvement. L'anesthésie des animaux pourra également engendrer un stress ou une sensation d'inconfort lié à la mise à jeun (maximum 16h), à la procédure d'induction (contention, administration, perte de conscience...) ou lié au réveil de l'animal (risque de vomissements, perte d'équilibre...).

Devenir

À la fin du projet, tous les animaux seront gardés en vie après examen et avis du vétérinaire de l’établissement utilisateur.

Remplacement

Le modèle d’inflammation cutanée présenté vise à reproduire une réponse inflammatoire cutanée complexe, impliquant des interactions immunitaires proches de celles observées chez l’homme. Ces caractéristiques sont essentielles pour garantir la pertinence des résultats et la prédictivité des réponses thérapeutiques. Bien que des modèles de peau in vitro permettent d’étudier certains mécanismes cellulaires, ils restent limités dans la reproduction de la complexité immunologique, vasculaire et systémique observée in vivo. À ce jour, aucune méthode alternative in vitro ou in silico ne permet de capturer de manière fiable cette dynamique intégrée. L’utilisation des animaux demeure donc indispensable pour valider le modèle et assurer la transposabilité des données vers la clinique dans le cadre du développement de nouvelles thérapies.

Réduction

Le nombre estimé d'animaux utilisés dans ce projet a été défini à 4 primates. Il a été réduit au minimum afin de tout de même obtenir des résultats fiables interprétables. Le but étant aussi de faire des analyses génétiques, il était important d'avoit au moins 4 animaux pour avoir une diversité de profils et de variations potentielles. AJOUT : Lors de la première procédure, quatre animaux ont été utilisés et ont montré des réponses différentes : certains ont bien réagi, d’autres moins. Ces résultats indiquent que le modèle fonctionne, mais que l’effet recherché n’a pas été obtenu de manière constante. L’ajout de trois animaux supplémentaires est donc proposé afin de mieux comprendre cette variabilité et d’augmenter les chances d’observer l’effet attendu.

Raffinement

Afin d'optimiser leur bien-être et de leur permettre d'exprimer leurs besoins comportementaux, les animaux sont hébergés en groupes sociaux de même sexe. De l'eau fraîche ad libitum est mise à leur disposition et un aliment adapté à l'espèce et au poids de chaque individu est distribué quotidiennement. Les paramètres environnementaux de l'animalerie sont également suivis et contrôlés afin de répondre aux exigences physiologiques de l’espèce. En parallèle, un programme d'enrichissement complet est mis en place au sein de l'animalerie. Ce dernier comprend : - Des enrichissements structuraux permettant aux primates d'évoluer dans un environnement tridimensionnel ; - De la litière pour leur permettre de fourrager ; - Des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine pour éviter que les animaux ne se lassent ; - Des friandises et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement (cachés dans la litière ou dans des jouets distributeurs) ; - De la musique d'ambiance est diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Une période d'acclimatation sera mise en place avant le début de l’étude. Un programme d'habituation à l'Homme et de conditionnement aux actes techniques associés à du renforcement positif permettra de réduire le stress des animaux lié aux manipulations (prise de sang, application de la crème). Les animaux seront suivis individuellement et bi-quotidiennement tout au long de l'étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur. De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal afin de diminuer le stress qui pourrait être engendré par les manipulations. Les temps de repos accordés aux animaux entre les prélèvements et les volumes prélevés respecteront les recommandations éthiques en vigueur. Des mesures préventives et correctives de diminution de la douleur et du stress ont été déterminées au préalable sans compromettre les objectifs scientifiques de l’étude. Enfin, des points limites précoces ont été déterminés afin de prendre en charge toute forme de douleur ou de souffrance. En cas d’atteinte d’un de ces points, l’animal concerné sera pris en charge selon les recommandations du vétérinaire.

Choix des espèces

L’utilisation du primate non humain pour le modèle d’inflammation cutané induit par l’application d'une crème sur la peau est justifiée par sa similarité immunologique avec l’humain. Les primates ont un système immunitaire proche de celui de l’humain. Ce modèle induit une inflammation de la peau et une activation immunitaire locale. Chez le primate, l'activation immunitaire est exprimé de manière comparable à l’humain, ce qui garantit une réponse pertinente pour l’évaluation des thérapies. Le développement de ce model permettra d’avoir des résultats transposables et prédictifs pour l’homme. Des animaux juvéniles seront utilisés dans ce projet (jeunes adultes). Dans la littérature, certaines études montrent que les animaux matures (>4ans) sont statistiquement plus sujet aux anomalies liées au vieillissement pouvant affecter la qualité des échantillons prélevés et notamment les analyses histologiques. Sachant que des prélèvements de peau pendant l’étude seront réalisés en fin d’étude dans ce projet, il est préférable d’écarter au maximum ce biais lié à l’âge des animaux.

Opérées puis soumises à cent minutes de tests d'activité locomotrice, 88 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Une puce mesure leur température pour suivre le passage d'anticorps vers le cerveau. Le projet s'intitule mise en place d'une méthode alternative pour réduire l'utilisation de souris, et annonce jusqu'à 80 % d'animaux en moins que les méthodes classiques. Il tue malgré tout 88 souris, dont les ovaires et le cerveau sont prélevés, et sert de base à un projet plus large.

Objectifs

Dans cette étude pilote, nous voulons savoir si les anticorps que nous développons peuvent atteindre leur cible dans le cerveau chez la souris. L’objectif est de mettre en place une méthode alternative qui permet de suivre en temps réel le passage de ces anticorps grâce à une puce mesurant la température sur plusieurs heures, sans devoir sacrifier des animaux à chaque mesure. Cette étude permettra de tester si la technique fonctionne, quel anticorps est le plus efficace, quelle dose utiliser et quelle voie d’administration est la meilleure.

Bénéfices attendus

Le bénéfice de cette étude pilote est de mettre en place une nouvelle méthode qui réduit le nombre d’animaux utilisés tout en permettant de mesurer plus efficacement si les anticorps atteignent le cerveau. Cette étude servira de base pour un projet plus large visant à montrer les effets bénéfiques de ces anticorps sur les troubles du spectre autistique et la maladie d’Alzheimer.

Procédures

Les souris seront soumises à une procédure chirurgicale (une fois, 15 minutes par animal) et effectueront des tests de comportement (100 minutes par animal) pour mesurer leur activité locomotrice. Une administration (1 min) sera réalisée. Les animaux recevront une dose d’antalgiques et d’anesthésiques (1 min) avant leur mise à mort.

Impact sur les animaux

La contention, l’injection des anticorps et le test de comportement peuvent entraîner un léger stress pour l’animal. Les souris seront soumises à des procédures chirurgicales pouvant entraîner une diminution transitoire de leur bien-être et, très rarement, des infections.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés et les organes prélevés pour l’étude directement (ovaires) mais aussi pour des études ultérieures (cerveau).

Remplacement

Les anticorps sont d’abord développés et testés sur des cellules en laboratoire. Seuls les 5 plus prometteurs seront évalués dans cette étude pilote chez la souris. Il n’existe pas de méthode alternative pour mettre en place cette technique, car elle nécessite un organisme vivant entier, depuis l’injection des anticorps jusqu’à l’observation de leurs effets sur la température, afin de démontrer leur passage dans le cerveau.

Réduction

Cette étude pilote consiste justement à mettre en place une méthode alternative pour réduire le nombre d’animaux utilisés (jusqu’à 80 %) par rapport aux méthodes classiques. Nous avons optimisé le nombre d’animaux pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement valides.

Raffinement

L’environnement des souris est enrichi et renouvelé régulièrement pour optimiser le maintien de leur chaleur corporelle et de leur bien-être. Les injections et les tests de comportement seront réalisés dans une pièce calme et faiblement éclairée, et seront les plus brefs possibles afin de minimiser l’inconfort et l’anxiété des animaux. De plus, les animaux seront habitués à cette pièce et au contact des expérimentateurs, notamment afin de vérifier leur état de santé. Les souris soumises aux procédures chirurgicales seront traitées avec des antidouleurs jusqu’à leur rétablissement pour limiter leur douleur et, comme pour tout changement chez un animal, feront l’objet d’une surveillance renforcée. Des points limites adaptés à chaque procédure ont été mis en place et seront appliqués.

Choix des espèces

Les souris sont de petits animaux sociaux, et dont les comportements sont proches de ceux de l’homme. Notre but est d’étudier les effets bénéfiques des anticorps dans les modèles de souris des troubles autistiques et la maladie d’Alzheimer, qui impactent fortement la qualité de vie chez l’homme. À l’heure actuelle, les quantités d’anticorps produites dans notre laboratoire sont compatibles avec une utilisation chez la souris adulte âgée de 2 mois, ayant un cerveau mature.

Jusqu'à deux chirurgies cérébrales de quatre heures et des séances répétées d'IRM et de TEP sous anesthésie générale sur un an: 60 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Des protéines pathologiques humaines sont injectées dans leur cerveau pour y reproduire une maladie de Parkinson ou d'Alzheimer et suivre l'apparition de troubles moteurs et cognitifs. Le porteur juge le primate "indispensable" au motif que les rongeurs ne reproduisent pas les symptômes cognitifs. Tous les cerveaux sont prélevés après la mise à mort pour analyse.

Objectifs

Les maladies neurodégénératives comme la maladie de Parkinson, la maladie d’Alzheimer ou la paralysie supranucléaire progressive se caractérisent par l’accumulation progressive d’agrégats protéiques spécifiques dans le cerveau. Avec l’évolution de la maladie et le vieillissement cellulaire, ces agrégats deviennent toxiques, entraînant la mort des neurones et l’apparition de symptômes moteurs et cognitifs. Il est donc essentiel de comprendre le rôle de ces agrégats dans le développement des déficits, d’évaluer leur impact fonctionnel et d’explorer des stratégies thérapeutiques visant à favoriser leur élimination, telles que les immunothérapies. Les modèles animaux classiques, notamment les rongeurs, permettent de reproduire certaines lésions mais ne reflètent pas pleinement les symptômes, en particulier cognitifs. Cette limite pourrait s’expliquer par les différences anatomiques entre le cerveau humain et celui des rongeurs. Ainsi, l’utilisation d’un modèle animal phylogénétiquement proche de l’Homme apparaît indispensable pour étudier les conséquences fonctionnelles de l’accumulation de protéines pathologiques. Des travaux récents montrant le caractère « infectieux » de certaines protéines ont ouvert la voie au développement de modèles chez le primate non humain. Ces modèles animaux permettent de reproduire les mécanismes d’agrégation protéique et d’induire des troubles moteurs et cognitifs similaires à ceux observés chez les patients même à des stades précoces de la maladie. Ils offrent également la possibilité d’un suivi longitudinal (au cours du temps) des lésions et du comportement grâce à des techniques d’imagerie non invasives directement applicables à l’Homme telles que l’IRM, les examens ophtalmologiques et la tomographie par émission de positons (TEP). L’objectif du projet est double: développer des modèles de maladies neurodégénératives chez le primate non humain par différentes approches (surexpression de protéines pathologiques humaines ou de protéines de synthèse), et suivre in vivo l’évolution des agrégats protéiques en lien avec l’apparition et la progression des déficits moteurs et cognitifs.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de développer de nouveaux modèles animaux plus robustes et pertinents d’un point de vue biologique des principales maladies neurodégénératives, telles que la maladie de Parkinson, la maladie d’Alzheimer ou la Paralysie Supranucléaire Progressive. L’utilisation de méthodes non-invasives similaires à celles utilisées dans les hôpitaux va permettre une meilleure application à l’Homme. Sur le long terme, ces nouveaux modèles animaux permettront de valider des thérapies innovantes ou des biomarqueurs diagnostiques ciblant ces maladies neurodégénératives.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés pour inoculer des protéines mutées synthétisées in silico ou isolées et amplifiées à partir de cerveaux de patient. . Un maximum de deux chirurgies de 4h maximum espacées de 6 mois sont prévues. Les animaux seront ensuite réévalués à 6 mois et 12 mois post injection. Les animaux seront évalues de la façon suivante à 3 temps espacés de 6 mois : - Comportement moteur spontané sans restriction alimentaire ou hydrique (1h/j/4j à 4 temps différents maximum). - Comportement cognitif sur écran tactile avec renforcement positif et sans restriction alimentaire ou hydrique (1h/j/4j à 4 temps différents maximum). - Imagerie IRM sous anesthésie générale pendant 1 à 3 heures maximum par session avec un minimum de 1 session et un maximum de 3 sessions espacées d’au moins une semaine par temps et un maximum de 4 temps. - Imagerie TEP sous anesthésie générale durant 2 à 4 heures maximum par session avec un maximum de 3 sessions espacées d’une ou deux semaines (voir renouvelée une fois à 6 mois) en fonction de la nécessité de réaliser des prélèvements sanguins (tous les traceurs TEP ne demande pas des prélèvements de sang pour l’interprétation des résultats). Un maximum de 3 temps 12 mois. - Imagerie ophtalmique sous anesthésie générale durant 1 à 3 heures maximum par session avec un maximum de 3 sessions espacées d’au moins une semaine et un maximum de 3 temps sur 12 mois. - Un prélèvement sanguin et de LCR sous anesthésie (15min).. Ces prélèvements sont couplés à l’un des examens d’imagerie pour réduire le nombre total d’anesthésies.

Impact sur les animaux

L’administration de vecteurs viraux ou des protéines entraine une douleur locale, de courte durée et légère. La délivrance de ces composés dans le cerveau entraine une douleur locale due à l’ouverture de la peau et la rétraction du muscle. Les anesthésies, qu’elles soient de courte durée ou plus longues, génèrent un risque d’hypothermie (stress thermique) si la température n’est pas contrôlée. De plus, la mise à jeun la nuit qui précède l’anesthésie et la manipulation des primates avant anesthésie pourraient induire un stress jusqu’à leur réveil, nourrissage et remise en groupe social. Les anesthésies de longue durée nécessitent la pose d’un cathéter veineux pour maintenir une anesthésie en continue et une intubation ce qui entraine une douleur locale, légère, et de courte durée. Pour les chirurgies et les examens d’imagerie, la nécessité d’immobilisation peut entrainer une nuisance locale transitoire au niveau du canal auditif jusqu’au retrait du cadre. Le maintien de l’œil ouvert lors des examens ophtalmologiques peut entrainer une douleur locale transitoire. Les anesthésies répétées peuvent induire une perte de poids, raison pour laquelle un suivi du poids sera réalisé tous les mois pendant toute la durée de l’expérience.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés à la fin du projet afin de pouvoir prélever leurs cerveaux. Des analyses histopathologiques et biochimiques seront réalisées afin de caractériser l'expression des protéines aberrantes dans les différentes régions du cerveau, ainsi que l’inflammation, afin de valider les résultats obtenus in vivo.

Remplacement

Pour ce projet, le recours à l’animal est nécessaire, car aucun milieu de culture, organoïdes ou système synthétique, ne permet aujourd’hui de reproduire la complexité architecturale et fonctionnelle du système nerveux au point de prédire la cinétique d'accumulation des protéines anormales et leur impact fonctionnel. Par ailleurs, la réaction du système immunitaire suite à la surexpression d’une protéine doit aussi être évaluée dans un modèle animal proche de l’Homme pour augmenter sa valeur prédictive en termes de sureté et absence d’effets adverses.

Réduction

Une veille de la littérature est faite pour éviter de refaire des expériences déjà publiées. Le nombre d’animaux prévu dans ce projet a été réduit au minimum afin de pouvoir exploiter correctement les résultats. Un calcul statistique de puissance a été réalisé afin de dimensionner les groupes expérimentaux. De plus, le suivi longitudinal chez le même individu par des méthodes d’évaluation fonctionnelle non-invasives (imagerie et comportement) permet de réduire le nombre d’animaux en évitant l’euthanasie pour une confirmation histologique à différents temps, et sans compromettre la possibilité d’observer un effet pathologique significatif.

Raffinement

Afin de minimiser le stress et l’angoisse des animaux d’élevage importés pour des utilisations scientifiques, les primates seront acclimatés pendant au moins un mois en dehors de la quarantaine et avant la date de début du protocole. Le protocole d’anesthésie pour la réalisation des études comporte des analgésiques pour minimiser l’inconfort. La surveillance rapprochée suite aux anesthésies et plus particulièrement après les chirurgies à l’aide d’une grille d’évaluation péri-opératoire, l’évaluation du comportement moteur tous les 6 mois à l’aide d’une grille adaptée au modèle , le suivi régulier du poids, l’interaction avec la Structure chargée du Bien Être des Animaux (SBEA) et la mise en place de points limites clairs permettent de limiter les nuisances liées aux interventions. De plus, le nombre d’interventions ainsi que leur durée sont réduits au maximum. L’interaction positive au quotidien avec les personnels impliqués dans l’étude constitue aussi une forme d’enrichissement.

Choix des espèces

Le macaque adulte est retenu comme modèle d'étude sur les critères suivants : - il n'est pas possible de reproduire tous les signes pathologiques des maladies neurodégénératives dans les modèles cellulaires/organoïdes ou les modèles rongeurs, et par conséquent, il est difficile de prédire l'effet d'une thérapie chez l'Homme. - il permet d'intégrer des méthodes d'évaluation fonctionnelle, telles que l'imagerie, le comportement et les signes cliniques, qui peuvent être directement extrapolés à l'Homme dans une démarche translationnelle et utilisant des équipements d’imagerie et de tests comportementaux identiques ou similaires à ceux utilisés en clinique. - sa ressemblance anatomique et fonctionnelle du cerveau par rapport à l’Homme. La taille et la structure du cerveau permettent des analyses anatomiques et fonctionnelles strictement comparables à celles réalisées dans les mêmes conditions que chez les patients. Les animaux seront adultes (6 ans ou plus) pour mieux mimer le stade auquel les maladies neurodégénératives donnent lieu à des signes cliniques et pour éviter toute plasticité cérébrale présente chez les jeunes individus.

Pour savoir si un gène répare les micro-lésions du muscle adulte, 96 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le gène est éteint par un vecteur viral injecté sous anesthésie, puis les souris sont poussées à courir sur un tapis incliné jusqu'à soixante minutes d'effort intense provoquant des lésions musculaires, avec des stimulations pour les relancer si elles s'arrêtent. Chez chaque souris, une patte part en histologie et l'autre en biochimie, et toutes sont tuées pour prélever les muscles. Les applications annoncées, mieux soigner les blessures sportives ou la faiblesse liée à l'âge, sont repoussées au long terme.

Objectifs

Les muscles squelettiques nous permettent de bouger, respirer et maintenir notre posture. Ils contiennent des unités contractiles appelées sarcomères, qui génèrent la force nécessaire au mouvement. Lors d’activités normales ou d’exercice, ces sarcomères peuvent être endommagés. En général, le muscle répare rapidement ces micro-lésions pour maintenir sa force. Si ce processus de réparation échoue, cela peut entraîner une faiblesse musculaire, une mobilité réduite et un risque accru de blessures. Nous avons précédemment identifié un gène d’intérêt comme un régulateur potentiel de ce mécanisme de réparation. Les souris dépourvues de ce gène dès la naissance présentent des muscles plus faibles et davantage de dommages après l’exercice, mais nous ne savons pas si cela est dû à des effets développementaux ou à un rôle direct dans la réparation du muscle adulte. Pour répondre à cette question, nous allons supprimer ce gène spécifiquement dans les myofibres adultes en utilisant un vecteur viral inoffensif. Nous évaluerons ensuite la capacité de ces muscles à se réparer après un exercice contrôlé. Cela nous permettra de déterminer si notre gène d’intérêt joue un rôle direct dans la réparation des dommages aux sarcomères.

Bénéfices attendus

Cette étude fournira des informations importantes sur la manière dont les muscles squelettiques adultes maintiennent leur structure et leur fonction sous stress mécanique. En clarifiant le rôle de notre gène d’intérêt dans la réparation des sarcomères, nous visons à identifier les mécanismes moléculaires qui soutiennent l’entretien normal du muscle. À long terme, ces connaissances pourraient informer des stratégies pour améliorer la réparation musculaire chez les personnes souffrant de blessures sportives, de maladies musculaires ou de faiblesse musculaire liée à l’âge. Améliorer la capacité de réparation des muscles pourrait contribuer à une meilleure mobilité, une récupération plus rapide et une qualité de vie améliorée.

Procédures

Injection d’analgésique, d’anesthésique et d'antidote à l'anesthésique: ces injections sont très rapides, elles ne durent que quelques secondes chacune. Injection d’un vecteur viral chez des souris âgées d’au moins 10 semaines : Les injections seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie afin de minimiser l’inconfort. L’injection est rapide, elle ne dure pas plus de 30 secondes. Protocole d’exercice excentrique: Le programme d’exercice réalisé par les animaux est un modèle d’activité physique intense. Il s’agit d’une procédure qui induit des lésions musculaires pouvant provoquer un niveau d’inconfort musculaire important passager. Cet exercice est réalisé une seule fois, il comprend 3 jours de 15 à 20 min de course d’habituation sur tapis roulant légèrement incliné suivi d’un jour de course de 60 min maximum comparable à un exercice physique intense. L’animal reçoit des stimulations légères et brèves pour le motiver à courir s’il s’arrête. Si l’animal ne court pas pendant plus de 5 secondes le test est arrêté.

Impact sur les animaux

Les souris déficientes pour le gène d'interêt dans les muscles (mutant injecté avec le vecteur viral) devraient être en bonne santé et ne devraient pas présenter de phénotype visuellement apparent. Toutefois, d’après nos études précédentes, elles peuvent présenter une légère faiblesse musculaire et une susceptibilité accrue aux dommages induits par l’exercice. Néanmoins, ces effets n’entraînent pas de détresse significative ni d’altération des fonctions de base. Les injections intramusculaires de vecteurs viraux seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie afin de minimiser l’inconfort et un antidote à l'anesthésique sera administré pour accélerer et améliorer le reveil. Cette procédure peut provoquer une douleur locale légère et transitoire au site d’injection. Le protocole d’exercice excentrique induit des dommages modérés aux sarcomères physiologiques, pouvant entraîner une gêne musculaire temporaire, sans provoquer de détresse durable.

Devenir

Pour parvenir à des conclusions scientifiques solides avec le nombre minimal d'animaux utilisés, nous collecterons les biopsies musculaires de tous les animaux à la fin de chaque procédure. Par conséquent, nous ne réutiliserons pas, ne remplaçons pas et ne ferons pas adopter les animaux.

Remplacement

Les mécanismes de dommage et de réparation des sarcomères impliquent des forces mécaniques complexes ainsi que des réponses coordonnées des myofibres pleinement développées. Ces processus ne peuvent pas être reproduits in vitro à l’aide de cellules musculaires en culture, qui ne possèdent pas une organisation sarcomérique mature, ni modélisés de manière fiable in silico. Par conséquent, des études in vivo chez la souris adulte sont indispensables pour atteindre les objectifs de recherche de ce projet.

Réduction

L’injection intramusculaire de vecteur viral permet d’induire la délétion génique chez les souris adultes, évitant ainsi la nécessité de croiser des lignées mutantes supplémentaires et réduisant considérablement le nombre total d’animaux utilisés. Les deux membres d’une même souris seront utilisés pour différentes analyses (un muscle pour l’histologie et le controlatéral pour un test biochimique) afin de maximiser les données obtenues à partir de chaque animal. Nous utiliserons des groupes composés de 8 femelles et 8 mâles, ce nombre d’animaux (n = 8) est fondé sur des expériences antérieures ayant démontré une puissance statistique suffisante pour détecter des différences physiologiques dans les processus de lésion et de réparation musculaires. Nous utiliserons 6 groupes de 16 individus (8 mâles et 8 femelles) par groupe soit un total de 96 souris comprenant les animaux contrôles et les expérimentaux (traités avec un vecteur viral vide ou traités avec le vecteur expérimental), 2 points temporelles après exercice ainsi que des animaux sans exercice. Les resultats seront analysés en utilisant les statistiques appropriées.

Raffinement

Les souris sont hébergées dans des conditions réglementaires, conformes à la réglementation en vigueur relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques. Les injections intramusculaires seront effectuées sous anesthésie générale et analgésie. La profondeur de l’anesthésie sera contrôlée par l’absence du réflexe en pinçant des orteils. Les souris seront placées sur un tapis chauffant pendant la phase de réveil, et leurs yeux seront protégés à l’aide d’un gel ophtalmique. Un antidote à l'anesthésie sera administré pour accéler et améliorer le reveil. Une surveillance post-injection sera effectuée quotidiennement pendant les 3 premiers jours, puis 2 à 3 fois par semaine par la suite. La surveillance comprend l’observation de l’état de santé général (motricité, apathie, aspect du pelage, aspect physique, vigilance, interaction sociale, toilettage). Le niveau de douleur sera évalué grâce à la fiche d'évaluation de la douleur fournie en annexe. Les manipulations seront réalisées à l’aide de tunnels afin de réduire le stress, et du matériel de nidification sera fourni pour l’enrichissement environnemental. L’exercice excentrique devrait provoquer uniquement un inconfort léger et transitoire. Les souris seront étroitement surveillées après la séance d’exercice pour détecter toute démarche anormale, boiterie ou réduction de l’activité. En cas de douleur de niveau 1 (légère boiterie), d'un anti-inflammatoire sera administré une fois par jour. Pour une douleur de niveau 2 (altération marquée de la mobilité), la dose d'anti-infammatoire sera augmentée. En cas de douleur de niveau 3 ou de détresse sévère, les animaux recevront une injection combinée d'anti-inflammatoire et d'analgésique et si leur état dne s'améliore pas sous 48h, alors ils seront immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Les souris constituent le modèle le plus approprié pour ce projet. Nos études précédentes sur notre gène d'interêt ont été réalisées chez la souris, fournissant une base de référence bien définie pour l’interprétation des phénotypes. Les outils génétiques utilisés dans cette étude, notamment la lignée mutante d'interêt et les vecteurs viraux utilisés, sont déjà établis et optimisés chez cette espèce. De plus, la physiologie du muscle squelettique de la souris est bien caractérisée et présente de fortes similitudes structurelles et fonctionnelles avec celle du muscle humain, ce qui en fait un modèle largement reconnu pour l’étude de la réparation des sarcomères et de la biologie musculaire. L’utilisation de la souris permet de combiner une manipulation génétique précise avec des analyses physiologiques et éthiquement maîtrisable. Toutes les injections seront effectuées sur des souris mutantes âgées de 10 à 12 semaines, correspondant à l’âge adulte. À ce stade, les muscles squelettiques sont pleinement développés et physiologiquement stables, ce qui permet d’étudier la réparation des sarcomères dans un contexte mature, plutôt que pendant la croissance développementale. L’utilisation d’animaux adultes garantit également une anesthésie sûre et efficace et réduit la variabilité de l’efficacité de la transduction virale, puisque des titres de vecteurs viraux plus faibles sont suffisants à cet âge. De plus, cette tranche d’âge est cohérente avec les études précédentes, permettant une comparaison directe des résultats avec les données de référence existantes.

100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune subissant deux chirurgies de la moelle épinière à un mois d'intervalle, des injections modulant l'activité neuronale, puis des tests moteurs et une mesure de conduction nerveuse sous anesthésie, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le modèle reproduit une sclérose en plaques pour observer si stimuler les neurones aide à réparer la myéline. Les prélèvements de cerveau et de moelle épinière imposent la mise à mort de tous les animaux. Les retombées annoncées pour les patients, limiter la progression du handicap, restent renvoyées au conditionnel et au long terme.

Objectifs

La sclérose en plaques est une maladie inflammatoire, dégénérative du système nerveux central (cerveau et moelle épinière) et la première cause d’handicap neurologique non traumatique chez les jeunes adultes. Dans cette maladie, on observe des phases de démyélinisation (il s’agit d’une perte de la myéline, substance permettant de favoriser les influx nerveux et la protection des neurones) dans lesquelles l’organisation des neurones est altérée, conduisant à des déficits fonctionnels chez les patients. Un mécanisme de réparation existe, mais il est incomplet et très variable selon les patients. Les cellules immunitaires du cerveau et de la moelle épinière (microglie) sont activées précocement lors de la démyélinisation et participent à la réparation de la gaine de myéline. La microglie contacte par ailleurs les neurones et cette interaction peut influencer positivement la réparation post-démyélinisation. Nous avons mis en place une technique permettant de moduler l’activité neuronale lors de la phase de rémission dans un modèle murin de sclérose en plaques pour étudier l’impact de cette modulation sur les interactions entre les cellules immunitaires du cerveau et les neurones, afin de favoriser la réparation tissulaire et la récupération fonctionnelle. Le présent projet vise à mesurer par des tests comportementaux et des mesures de conduction nerveuse chez la souris si la modulation de l’activité neuronale facilite la récupération fonctionnelle dans nos modèles et si cela dépend de l’interaction neurone-microglie.

Bénéfices attendus

La sclérose en plaques touche plus de 100 000 personnes en France et se déclenche majoritairement chez le jeune adulte. La réparation de la myéline (remyélinisation) est essentielle dans cette pathologie, mais reste partielle, d’où une perte neuronale à long terme et des déficits irréversibles chez les patients. L’activité neuronale a été montrée comme favorisant la remyélinisation. Ce projet permettra de mieux comprendre l’impact biologique obtenu de l’activité neuronale sur les interactions neurones-cellules immunitaires et leur rôle dans un modèle murin de sclérose en plaques. A plus long terme, la mise en évidence d’effets bénéfiques de l'activité neuronale sur la réparation via une modulation directe du dialogue neurones-cellules immunitaires pourrait permettre d'envisager des stratégies thérapeutiques visant à limiter la progression du handicap chez les patients.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à deux procédures chirurgicales sous anesthésie générale avec une prise en charge analgésique adaptée, afin de réaliser une injection au niveau de la moelle épinière (chirurgies séparées d’un mois, durée 15 minutes chacune). Tous les animaux recevront à l’état vigile deux injections (moins d’une minute) séparées de 3h pour moduler ou non l’activité neuronale. Tous les animaux participeront à des tests comportementaux visant à mesurer leurs compétences motrices (sessions de 2h30 incluant des pauses entre les tests). Des mesures de la vitesse de conduction nerveuse seront effectuées sous anesthésie générale avec traitement analgésique en fin d’étude (maximum 45 minutes), avant euthanasie par une méthode réglementaire pour réaliser différents prélèvements tissulaires.

Impact sur les animaux

Les chirurgies engendreront un inconfort temporaire lors du réveil après anesthésie (environ 30 min d’inconfort au réveil) et un risque de douleurs post-opératoires. Il existe un risque rare de complications liées à la chirurgie : infections, hémorragie. L’anesthésie générale sera associée à des risques d’hypothermie, de sécheresse oculaire et de défaillance cardiorespiratoire. Les injections seront associées à un risque de légère et brève douleurs et d’inconfort de courte durée. Le traitement modulateur d’activité neuronale peut occasionner un trouble locomoteur et une gêne dans les 3 heures maximum suivant l’injection. Les tests comportementaux peuvent induire un stress léger.

Devenir

Des prélèvements tissulaires (cerveau et moelle épinière) sont réalisés post mortem, ce qui implique l’euthanasie de l’ensemble des animaux pour répondre à nos objectifs scientifiques. L’euthanasie est réalisée par une méthode réglementaire.

Remplacement

Dans un objectif de remplacement, nous travaillons en première approche avec des modèles in vitro et ex vivo, qui nous ont permis d’établir le rôle positif de l’activité neuronale dans le dialogue neurone-microglie pour limiter l’aspect pro-inflammatoire de ces cellules après démyélinisation. Les modèles murins in vivo sont ultimement nécessaires pour l’étude fondamentale de la Sclérose en plaques, car ils permettent d'étudier la démyélinisation et la remyélinisation dans un contexte intégré, impliquant des interactions entre tissus nerveux, effecteurs de l’immunité circulante et apports métaboliques par le réseau sanguin, qui sont des composantes importantes de la sclérose en plaques. Le présent projet nous permettra d’avoir une lecture fine de l’impact de l’activité neuronale sur la réparation et la part de cet effet dûe au dialogue neurone-microglie dans nos modèles démyélinisants in vivo.

Réduction

Des approches statistiques permettront d’optimiser le nombre d’animaux utilisés après l’utilisation des premiers lots d’animaux afin de réduire au strict minimum le nombre d’animaux nécessaires : ce nombre sera calculé pour chaque groupe d’expériences à l’aide d’un calcul statistique après utilisation initiale de 5 à 6 animaux par condition. Au maximum nous utiliserons 100 animaux pour ce projet. Des tests statistiques seront utilisés pour l’analyse des résultats obtenus, adaptées à chaque expérience et réalisées en partenariat avec des biostatisticiens.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une semaine à leur arrivée avant leur entrée en procédure. L’eau et la nourriture sont fournies à volonté. Un environnement enrichi est fourni aux animaux, comprenant nidification (carré de coton, kraft) et bâton à ronger. Les animaux sont manipulés uniquement par un personnel qualifié et sensibilisé au bien-être animal. Ils seront observés quotidiennement, toute anomalie sera gérée en collaboration entre notre équipe, la structure chargée du bien-être animal et nos vétérinaires afin d’assurer une prise en charge adaptée pour chaque animal. Des points-limites sont définis, ainsi qu’un suivi par l’équipe de recherche pour éviter la souffrance de l’animal. Les animaux soumis aux procédures chirurgicales sont placés sous anesthésie générale (durée maximale de 30 minutes), avec une prise en charge analgésique adaptée. Nous nous assurerons du maintien de la température des animaux durant toute la durée de l’anesthésie. Un gel de protection oculaire sera appliqué sur leurs yeux. En post-chirurgie, les animaux auront un accès facilité à la nourriture et à l’eau pour faciliter leur récupération. Nous mettrons également en place une surveillance renforcée post-chirurgie. Avant les tests comportementaux, les animaux auront un temps d’acclimatation. La mesure de la conduction nerveuse sera réalisée sur un animal anesthésié. L’animal ne sera pas réveillé ensuite et euthanasié au cours de son anesthésie générale.

Choix des espèces

La souris est l'espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son anatomie, sa physiologie et sa génétique sont bien connues et sont relativement proches de l'Homme. L’âge adulte est requis pour pouvoir faire les actes chirurgicaux et les mesures d’activité neuronale envisagées dans ce projet.