Procédures modérées

60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nouveau-nées, une partie est exposée huit jours à une hypoxie sévère (10 % d'oxygène, équivalent à 4 500 mètres) pour reproduire la grande prématurité, reçoit une injection de 4-hydroxytamoxifène, puis à l'âge adulte une implantation d'électrodes cérébrales et une privation de sommeil paradoxal de 48 heures, avant mise à mort et analyse du cerveau. Le porteur indique que la chirurgie a un effet négatif modéré et peut provoquer des irritations autour de l'implant. Il affirme que l'analyse in vivo reste "incontournable" et que la souris est "nécessaire" faute de modèle reproductible in vitro.

Objectifs

La période postnatale correspond à la période critique au cours de laquelle l’environnement façonnent et affinent les neurones contrôlant nos comportements et notre cognition. Des perturbations induites durant cette période peuvent avoir des conséquences dramatiques et persistantes sur le fonctionnement du cerveau. Cette situation se retrouve chez les bébés en prématurité. Il est possible de reproduire la plupart des déficits observés chez les bébés grand-prématurés à travers un modèle rongeur classique dit d’hypoxie chronique. Des études récentes suggèrent une perturbation des réseaux de neurones dans ce modèle animal, qui sont profondes et persistantes. Il est probable que ces perturbations soient responsables de déficits cognitifs variés, incluant des troubles du sommeil. Dans ce contexte, notre projet vise à évaluer la perturbation du sommeil dans un modèle souris d’hypoxie chronique, et de caractériser les perturbations du développement et de l’activité des réseaux neuronaux sous-jacents

Bénéfices attendus

La prématurité touche entre 50 000 et 60 000 naissances par an et est en hausse sur ces dernières années. Comprendre ses effets à long terme c’est permettre de mieux le traiter à terme. Ainsi à travers notre projet nous pourrons évaluer : - l’effet de l’hypoxie sur l’activité neuronale global chez le nouveau-né -l’évolution de cette activité chez l’adulte à partir de l’enregistrement de l’activité cérébrale de l’animal -Cela nous permettra également de savoir à terme comment le sommeil paradoxal est impacté par ce phénomène.

Procédures

L’animal sera soumis à différents protocoles : Protocole 1 (classe modérée) : Après leur naissance, nous exposerons la moitié des animaux à une période d’hypoxie de 8 jours (réduction de la concentration d’oxygène à 10% correspondant à une altitude d’environ 4500 mètres). Les animaux seront ensuite immédiatement marqués après la période hypoxique par injection d’hydroxytamoxifen (4-OHT), marquant définitivement l’activation neuronale chez ces petits puis seront exposés à la suite des protocoles à l’âge adulte. Protocole 2 (classe modérée) : Les animaux seront implantés d’électrodes, permettant d’enregistrer l’activité cérébrale, sous anesthésie à l'âge de 12 à 16 semaines. Cette procédure est utilisée depuis de nombreuses années dans notre laboratoire et optimisée pour limiter son impact sur le bien-être animal. Après une période de récupération d'une semaine, les animaux seront enregistrées afin d’identifier leur activité cérébrale. Des mesures d’enrichissements seront mises en place pour permettre à l’animal d’exprimer un maximum de comportements naturels et compenser son isolement social durant les expérimentations. Protocole 3 (classe modérée) : Ensuite, nous exposerons les animaux, âgées de 12-16 semaines, à une privation spécifique de sommeil paradoxal (SP) pendant 48h. Cette privation conduit, une fois terminée, à une accumulation du SP dans un court lapse de temps (1h30) permettant d’observer son activation neuronale durant une période restreinte (~2h). Cette procédure a été initialement élaborée afin de limiter l’impact de l’expérimentation sur le bien-être animal.

Impact sur les animaux

L’ensemble des procédures utilisées dans ce projet ont été élaborées et sont maîtrisés depuis plusieurs années au sein de notre laboratoire. Aucun signe indicatif de douleur n’a été remarqué pour ces procédures. Cependant, un suivi journalier des souriceaux sera effectué durant l’ensemble des protocoles. Certains effets indésirables minimes peuvent apparaitre : Protocole 1 : Outre les critères d'appréciations de l'état des mères (stress, léthargie…) et des petits (estomac vide, abandon de la mère…) durant la phase d'hypoxie il est possible d’observer une activité de la mère réduite lors de la mise en place de l’hypoxie (réduction du taux d’oxygène). Afin de limiter cet impact il est possible de réduire le taux d’oxygène par paliers afin de passer de 20.9% à 10%. De plus l’injection de 4-OHT peut induire une légère gêne des membres postérieurs de l’animal réduisant légèrement sa mobilité. Cet effet s’estompe généralement dans la demi-heure après injection. Protocole 2 : Les étapes de chirurgies induiront un effet négatif modéré sur le confort des animaux adultes. Outre les critères d’appréciations de l’état des souris post-chirurgie (réduction poids, posture, pelage …) il est possible d’observer chez l’animal des petites lésions/irritations induites par le toilettage de cette zone ou un grattage excessif autour de l’implant. L’application d’une pommade ou de Bétadine sur la zone lésée est alors recommandée. Protocole 3 : Aucun signe indicatif de douleur ni d’effet indésirable n’a été remarqué pour ce protocole.

Devenir

Afin d'évaluer l'impact de l'hypoxie dans la mise en place du sommeil paradoxal chez les nouveaux nés et sur ses réseaux à long terme, tous les animaux seront euthanasiés afin de récupérer les tissus et effectuer une analyse histologique poussée (marquage immunohistochimique, densité de population neuronale ...)

Remplacement

L’analyse in vivo reste incontournable pour ce projet de Recherche. En effet, les séquelles neurologiques posthypoxiques dépendent de mécanismes complexes impossibles à reproduire in vitro d’où la nécessité d’un modèle animal pour étudier la pathologie. De plus l’étude du SP ne peut être conduite sur des animaux de niveau phylogénétique inférieur (mouche, poisson rouge…). Par ailleurs, notre projet permet d’établir l’évolution d’une activité cérébrale et plus particulièrement du sommeil paradoxal au cours du développement chez les nouveaux nés et à l’âge adulte, nécessitant alors le modèle transgénique décrit précédemment et, par définition d’un modèle transgénique stable, des souris.

Réduction

La petite taille des lots de souris a été calculée au plus juste à partir de nos études antérieures utilisant les mêmes protocoles dans le but de générer des données reproductibles dont la significativité sera validée par les tests statistiques adaptés (Par exemple, si paramétrique, un test de variance Anova à deux dimensions, et si non paramétrique, à une seule dimension, Kruskal-Wallis avec comparaison multiple de Dunn). Elle tient donc compte des ‘’erreurs et échecs’’ qui peuvent survenir à chaque étape de la procédure expérimentale. Pour finir, nous avons mis en place dans l’équipe depuis plusieurs années un système de préservation de toutes les séries de coupes non utilisées. Cette banque de tissu, accessible à l’ensemble de l’équipe est mise à jour systématiquement lorsque de nouveaux tissus ont été produit à la suite d’une coupe de cerveau. Le nombre d’échantillon/puits de coupes disponibles y est indiqué et peut être utilisé à d’autres fins ou futurs projet si ces derniers ont déjà été exploités sur leur projet d’origine. Ainsi, elle permet d’optimiser sur le long terme l’utilisation du tissu tout en réduisant le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

De nombreuses actions de raffinement seront mises en place lors des procédures décrites dans ce projet. Toute procédure de chirurgie (implantation d’électrode…) est étudié pour durer le minimum de temps possible (environs 45min) et sera accompagnée systématiquement d’utilisation d’anesthésiques et d’analgésiques, et d’un suivi journalier des animaux afin de détecter et traiter immédiatement tout signe d’inconfort des animaux. Pour la procédure d’hypoxie, les femelles seront échangées tous les 2 jours entre les cages normoxiques et hypoxiques, afin de préserver la quantité et la qualité du lait qu’elles produisent pour nourrir leurs souriceaux, et de minimiser au maximum le stress conséquent à la procédure sur les animaux. Afin de prévenir le stress engendré par la manipulation de l’animal avant chirurgie par exemple, plusieurs handling seront effectuées les jours précédant le protocole et l’animal sera habitué au préalable à chaque condition (habituation au câble d’enregistrement, aux injections en IP…). Des critères d’interruption des expérimentations et d’exclusion (souffrance physique et psychique, perte de poids…) seront estimés avec une grille d’évaluation quotidienne, leur impact étant délétère sur le sommeil.

Choix des espèces

Notre projet nécessite l’utilisation d’animaux transgéniques afin d’évaluer l’influence de l’hypoxie au cours du temps sur l’activité cérébrale de l’animal et en particulier de l’activité du sommeil paradoxal. Les séquelles neurologiques post-hypoxiques dépendent de mécanismes complexes qu’il est impossible de reproduire in vitro. Un modèle animal est donc nécessaire pour étudier les conséquences à court et long terme de l’hypoxie sur l’activité du sommeil paradoxal. Or, la souris est un des modèles animaux les plus adaptées dans la mise en place d’un génome modifié. De plus l’ensemble des données précédentes recueillis par les différentes équipes sur l’impact de l’hypoxie et sur l’activité du sommeil paradoxal ont été effectuée chez la souris. Ainsi à travers notre protocole une partie des souriceaux seront soumis à une hypoxie de P3 à P11 (8 jours) lorsque les autres seront en condition normoxique. Ensuite l’ensemble des souris retourneront en condition d’hébergement standard jusqu’à l’âge de 12-16 semaines environs, période où l’implantation des électrodes sera effectué pour l’enregistrement de sommeil paradoxal à l’âge adulte une semaine plus tard.

112 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Issues d'un élevage de souris modifiées pour la maladie d'Alzheimer, elles reçoivent un peptide par voie intranasale tous les deux jours pendant six mois, puis passent trois tests de mémoire, un test de mémoire de travail spatiale, un test associant un contexte à une émotion et un test de reconnaissance d'objet, avant mise à mort et prélèvement du cerveau. Le porteur indique que l'administration intranasale peut provoquer un stress et une détresse respiratoire. Il affirme que l'usage de ces animaux est "indispensable", les effets sur la mémoire ne pouvant s'étudier qu'in vivo.

Objectifs

La maladie d'Alzheimer est la forme la plus courante de démence chez les personnes âgées. Elle se caractérise par un déclin progressif de la mémoire et des capacités cognitives, qui est initié par l'accumulation de protéines anormales dans le cerveau. Ces protéines anormales provoquent une altération des cellules nerveuses qui est responsable du déficit de mémoire. Le défi est donc d'augmenter la résistance des cellules nerveuses à cette toxicité. Cependant, les traitements actuels de la maladie d'Alzheimer améliorent les symptômes comportementaux sans modifier l'évolution de la maladie. Une approche prometteuse consiste à contrer l'accumulation de ces protéines anormales à un stade précoce de la maladie et nous avons concu pour cela de nouveaux composés moléculaires. Nous avons caractérisé l'efficacité de ces composés à bloquer la formation, l'accumulation et la toxicité de ces protéines anormales dans des modèles in vitro de la maladie. L'ensemble de ces résultats ouvrent la voie à l’utilisation de ces composés pour lutter contre les altérations cognitives précoces dans la maladie d'Alzheimer. Dans ce projet, ces composés seront utilisés in vivo dans un modèle murin préclinique de la maladie d'Alzheimer, afin d'étudier leur impact sur différents types de mémoire et sur les cellules nerveuses. Les conséquences de cette stratégie expérimentale seront également analysées sur la charge du cerveau en protéines anormales.

Bénéfices attendus

L’ensemble de ces expériences a pour but de déterminer si cette stratégie peut limiter la toxicité due aux protéines anormales et améliorer de manière durable les capacités de mémorisation chez des souris, modèle de la maladie d’Alzheimer. L’objectif est d’étudier l’impact de ces composés sur les déficits de mémoire, les altérations des cellules nerveuses et la charge en protéines anormales dans le modèle murin de la maladie d'Alzheimer. L’utilisation de ces animaux est donc indispensable à une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques de la maladie d’Alzheimer et à l’estimation d’un effet bénéfique potentiel du traitement sur les déficits cognitifs. Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires de la maladie pour envisager dans le futur de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Les 3 procédures envisagées s’appuient sur la production de souris, puis l’administration non invasive de composés d’intérêt par voie intranasale chez la souris vigile pour faciliter leur transport jusqu’au cerveau. Ces traitements d’infusion d’une durée de 10 minutes seront initiés à la 8ème semaine et répétés tous les 2 jours sur une période de 6 mois. Dans la procédure 1 d’élevage, 112 souris transgéniques mâles et femelles APP/PS1 seront obtenues par croisement de souris hétérozygotes à phénotype non-dommageables. Dans la procédure n°2, l’effet de ces traitements sera étudié sur 64 souris (16 souris par groupe) par des tests comportementaux pour évaluer leurs capacités à fixer une information en mémoire. Pour chaque animal, 3 tests comportementaux seront réalisés au 8ème mois. Tout d’abord, un test destiné à évaluer la mémoire de travail spatiale sera réalisé 1 fois sur 5 jours, sur une durée de 8 minutes chaque jour. Après une semaine de délai, un test évaluant la capacité d’associer un contexte à une émotion sera effectué 1 fois sur 2 jours sur une durée de 4 minutes chaque jour. Enfin, après une autre semaine de délai, un test de reconnaissance d’objet sera entrepris sur 3 jours, sur une durée de 20 minutes le premier jour et 10 minutes les 2 jours suivants. Après cette étude comportementale, les souris seront anesthésiées profondément puis mises à mort pour prélever leur cerveau et réaliser une étude biochimique complémentaire. Cette étude permettra d’analyser l’impact des traitements sur la charge en protéines anormales dans ces souris modèle de la maladie d'Alzheimer. Dans la procédure n°3, 48 souris (12 souris par groupe) seront anesthésiées profondément et analgésiées après la fin des traitements, puis perfusées en intracardiaque en état de mort cérébrale pour fixer leur cerveau et réaliser une étude immunohistochimique. L’effet de ces traitements sur les cellules nerveuses sera étudié par un marquage spécifique sur coupes de cerveau.

Impact sur les animaux

L'application intranasale de composés peut induire un certain stress chez la souris. Pour limiter ce stress au maximum, les souris auront une période d'habiuation au protocole de 2 semaines avec un renforcement positif appliqué à chaque étape clé. Des aléas expérimentaux peuvent se produire après l'administration intranasale de composés comme l'induction d'une détresse respiratoire. Pour réduire ce risque, le protocole respecte une attente de 2 minutes entre chaque administration intranasale. Enfin, la possibilité qu'une hypersensibilité aux composés administrés apparaissent chez de rares souris sera envisagée. Dans ce cas, l'animal sera sorti immédiatement de l'étude et mis à mort après induction d'une anesthésie profonde.

Devenir

A l’issue de la procédure 1, les 112 souris seront utilisées dans la procédure expérimentale 2, pour 64 d’entre elles, et dans la procédure 3 pour les 48 souris restantes. A l’issue de la procédure n°2, les 64 souris seront anesthésiées profondément et mises à mort pour prélever leur cerveau et réaliser une étude biochimique en complément de l’étude comportementale. A l’issue de la procédure n°3, les 48 souris seront analgésiées puis anesthésiées profondément et perfusées en état de mort cérébrale pour fixer leur cerveau et réaliser une étude immunohistochimique. Ces 3 procédures permettront de déterminer si l’administration des composés d'intérêt permet de limiter la toxicité due aux protéines anormales, chez la souris modèle de la maladie, et d’améliorer de manière durable les capacités de mémorisation de ces souris, en conservant l'intégrité de leurs cellules nerveuses.

Remplacement

Des études sur ces composés ont été réalisées sur des modèles cellulaires et en éprouvette pour limiter l’utilisation d’animaux au strict nécessaire, c’est à dire à l’évaluation des performances cognitives. Les effets du traitement sur la mémoire ne peuvent en effet s’étudier que dans les conditions in vivo chez l’animal.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés dans ce projet est réduit au maximum sans compromettre les objectifs du projet et avoir des résultats statistiquement exploitables. Le nombre de souris a été réduit à n=112 en référence aux études comparables de la littérature. Ce nombre d’animaux est nécessaire car plusieurs traitements seront délivrés par voie intranasale en administrant les composés actifs ou les molécules contrôles chez des souris de génotypes différents. Les performances cognitives de ces souris seront évaluées après traitement grâce à trois apprentissages comportementaux. Comme ces apprentissages successifs peuvent réorganiser les circuits nerveux, il sera nécessaire d'utiliser d'autres souris (procédure 3) pour étudier l’impact des traitements sur la densité et la morphologie des cellules nerveuses. Dans la procédure 2, un même cerveau sera utilisé pour 2 approches différentes (i.e. approche comportementale sur l’animal vivant, puis approche moléculaire avec l’analyse biochimique de la charge en protéines anormales du cerveau). Une compilation d’études de la littérature indique qu’il est nécessaire d’avoir 15 animaux par groupe (4 groupes) pour atteindre la significativité statistique avec un test statistique adapté. Cette limite justifie le nombre de souris fixé à 16 souris par groupe, soit 1 animal supplémentaire à la limite de la significativité, afin de prévoir les possibles aléas (problème survenant lors des 6 mois de l'étude et/ou mort de l’animal).

Raffinement

Avant d’initier le protocole d’administration intranasale, les souris de 6 semaines seront habituées à la manipulation pendant une période de deux semaines. Elles seront habituées à être soulevées, placées en position inclinées vers l’arrière, et à recevoir une microgoutte (2,5 ul) de saline en contact avec la narine pour qu’elle soit aspirée au moment de l’inspiration. Cette habituation sera réalisée de manière à limiter le stress de l’animal lors de l’administration intranasale des composés, et se base sur une technique de renforcement positif avec une récompense sous forme de lait concentré sucré. Les souris seront suivies quotidiennement suite à l’infusion intranasale des traitements. Leur état sera noté selon des critères établis qui prennent en compte divers facteurs (poids, état du pelage, comportement dans la cage et lors de la manipulation de l’animal, fabrication d’un nid). Ceci nous permettra de nous assurer du bien-être des animaux. Tout animal présentant des signes de douleur ou de mal être avec atteinte de point limite sera aussitôt sorti du protocole, anesthésié profondement et mis à mort.

Choix des espèces

Les souris génétiquement modifiées sont couramment utilisées en neurosciences pour l'étude de traitements visant à améliorer les performances de mémoire dans la maladie d’Alzheimer ou pour mieux connaître les mécanismes moléculaires mis en jeu. Ces souris génétiquement modifiées présentent l'avantage unique de mimer les formes dites familiales de la maladie qui sont observées chez certains patients. Des souris âgées de 6 semaines à 8 mois seront utilisées dans ce projet car l’accumulation de protéines anormales dans leur cerveau débute à 8 semaines, et les déficits de mémoire se produisent au 8ème mois chez les mâles ou les femelles.

4 450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit dans le genou des injections de collagénase ou de sang pour induire une arthrose, avec incisions sous anesthésie, une autre partie une implantation de biomatériau suturée sous la peau du dos, pour tester des thérapies cellulaires et d'ingénierie tissulaire. Le porteur indique que les injections de collagénase provoquent une laxité de l'articulation et une douleur modérée. Il annonce des "retombées énormes" à moyen terme pour les patients tout en reconnaissant que ces cellules ne sont encore qu'"en cours d'évaluation" en clinique.

Objectifs

L'arthrose est une maladie articulaire dégénérative caractérisée par une perte progressive de cartilage au niveau des articulations. Plus de 50% des adultes de plus de 65 ans sont touchés par la maladie. Chez les plus jeunes, une arthrose post-traumatique peut se développer suite à des traumatismes accidentels. Enfin, une incidence croissante d’arthrose hémophilique est observée chez les patients hémophiles jeunes suite à des saignements répétés dans les articulations. Dans tous ces cas d’arthrose, aucun traitement curatif n’est disponible, seuls des anti-douleurs et des traitements de viscosupplémentation locale sont proposés. Le traitement ultime est la pose de prothèses. Cette intervention chirurgicale présente un certain nombre de limitations et n'est pas recommandée chez les patients jeunes. Chez ces patients, la réparation du cartilage et de l’os par thérapie cellulaire ou ingénierie tissulaire pourrait représenter une thérapie alternative. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer l’intérêt de la thérapie cellulaire et de l’ingénierie tissulaire pour diminuer les signes d’arthrose dans deux modèles expérimentaux murins ou favoriser la formation d’un nouveau tissu de réparation du cartilage.

Bénéfices attendus

Les deux approches de thérapie cellulaire et d’ingénierie tissulaire ont une portée translationnelle pour une utilisation en clinique chez des patients souffrant d’arthrose. Ces cellules médicament sont déjà en cours d’évaluation en clinique et nous espérons valider des cellules plus efficaces que les cellules en cours d’évaluation. En outre, ces cellules pourraient être encapsulées au sein d’un matériau et implantées au sein d’une lésion de cartilage chez les patients afin de remplacer le tissu détruit par la pathologie. Cette double approche permettrait à la fois de protéger et réparer les articulations des dégradations associées à l’arthrose. En terme de santé publique, l’impact attendu est majeur puisqu’il n’existe pas de traitement de l’arthrose. Améliorer les stratégies actuelles de thérapie cellulaire ou d’ingénierie tissulaire aura des retombées énormes à moyen terme sur la prise en charge des patients.

Procédures

Une partie des animaux sera soumise à des injections dans l’articulation d’un genou de patte arrière. Selon la procédure, ils recevront 5µL de collagenase (2 fois) ou de sang (injections tous les 2 jours pendant 3 à 6 semaines) suivi par l’injection de cellules ou de vésicules extracellulaires (1 fois) ou bien 5µL de gel contenant ou pas des cellules (1 fois). Une incision d’environ 2 mm est réalisée au niveau de la peau qui recouvre le genou. Toutes les injections se font sous anesthésie générale gazeuse (maximum 5 min/animal) et locale (application de lidocaïne en pommade) au moment de l’intervention. Une autre partie des animaux recevra une implantation d’un matériau contenant des cellules médicament en sous-cutanée. Une incision d’environ 5mm est réalisée au niveau de la peau du dos et le scaffold sera inséré sous la peau. Une suture sera réalisée après l’implantation. L’impantation se fera sous anesthésie générale gazeuse (maximum 8 min/animal) et locale (application de lidocaïne en pommade).

Impact sur les animaux

Nuisance et effets indésirables : faibles à modérés. Les incisions au niveau cutanée pour les injections intra-articulaires et sous-cutanée sont réalisées sous anesthésie (

Devenir

L’ensemble des animaux sera euthanasié à l’issue des procédures pour permettre l’analyse du modèle expérimental et des traitements réalisés (histologie).

Remplacement

Avant de proposer une thérapie cellulaire ou une approche d’ingénierie tissulaire chez l’homme, il est important de démontrer l’efficacité thérapeutique des traitements proposés dans un modèle pré-clinique pertinent. Des modèles in vitro sont utilisés en amont mais ne suffisent pas seuls à évaluer l’efficacité de ces traitements dans un contexte complexe d’inflammation et d’altérations tissulaires rencontrés in vivo.

Réduction

Nous nous sommes basés sur les expériences réalisées précédemment au laboratoire et une analyse statistique afin de réduire le nombre d’animaux à utiliser pour chaque expérience. Nous utiliserons donc 15 souris par groupe expérimental afin d’utiliser le nombre minimal d’animaux.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en portoirs statiques avec couvercles filtrants. L’enrichissement du milieu consiste en l’apport de copeaux dans les litières et carrés de cellulose. Des igloos sont également installés dans les cages. Les animaux font l’objet d’un contrôle visuel quotidien en se basant sur une grille d’évaluation des signes potentiels de souffrance. Surveillance liée aux procédures : Les souris sont examinées pour vérifier la cicatrisation et l’absence d’infection au niveau des incisions dans les jours qui suivent les gestes opératoires.

Choix des espèces

Le modèle murin d’arthrose induite à la collagénase (CIOA) a été choisi parce qu’il présente l’avantage de reproduire assez fidèlement les caractéristiques cliniques observées chez l’homme et est considéré comme une référence de l’arthrose inflammatoire. Les animaux sont utilisés à semaine 10, âge recommandé pour ces modèles d’arthrose ou en ingénierie tissulaire

116 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent un régime gras de douze semaines pour induire obésité et diabète, une chirurgie de constriction de l'aorte par thoracotomie que le porteur associe à une mortalité de 10 %, une injection de virus AAV, puis des mesures cardiaques, pour tester l'effet protecteur d'une protéine, la myotubularine MTM1. Les bénéfices sont annoncés au conditionnel, comme une "nouvelle perspective thérapeutique". Le porteur conclut qu'il n'existe pas de modèle in vitro permettant de "s'affranchir" du modèle animal.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'évaluer les effets de la surexpression de la myotubularine MTM1 dans la progression de l'insuffisance cardiaque chez la souris, notamment dans un contexte lié à l'obésité. Nos résultats in vitro sur des cellules cardiaques en culture montrent que la surexpression de MTM1 réduit le stress oxydant et préserve les fonctions mitochondriales au cours d'un stress. Ces résultats suggèrent un effet protecteur de MTM1 et ouvrent la voie à des essais in vivo.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en évidence les effets protecteurs de la surexpression de MTM1 dans l'insuffisance cardiaque liée à l'obésité, d'étudier les mécanismes moléculaires impliqués et de proposer la myotubularine MTM1 comme nouvelle perspective thérapeutique.

Procédures

Les animaux seront soumis à 5 interventions différentes: 1/ un régime riche en graisse (60%kcal) pendant 12 semaines afin d'induire un phénotype obèse et diabétique de type 2; 2/ une procédure chirurgicale visant à réaliser une constriction de l'aorte afin d'induire un stress cardiaque, pendant 4 semaines; 3/ une injection iv par la veine caudale de virus associés aux adénovirus (AAV) permettant de surexprimer la myotubularine MTM1; 4/ une échocardiographie transoesophagienne afin de mesurer la fonction cardiaque des animaux; 5/ une mesure de la composition corporelle (echoMRI).

Impact sur les animaux

Le régime HFD 60% induit un phénotype obèse et peut entrainer des difficultés de déplacement des animaux, l'apparition d'un diabète, le graissage du pelage des animaux, une polyurie/polydipsie. Par conséquent, les animaux soumis à un régime HFD auront un suivi plus précis avec des remplissages des biberons d'eau et changes de litières plus fréquents si nécessaire. La chirurgie TAC étant une procédure chirurgicale invasive impliquant une thoracotomie, elle peut entrainer une mortalité post-opératoire (précédemment observée à 10% de l'effectif). Les AAV sont utilisés en thérapie génique et vaccinologie. Plus spécifiquement, les AAV-MTM1 sont actuellement en essais cliniques pour des thérapies géniques sur le chien (labrador) et chez l'homme atteints par la myopathie myotubulaire liée à l'X (pathologie consécutive à une mutation de MTM1). L’échocardiographie transoesophagienne est réalisée sous anesthésie gazeuse (isoflurane 2%) et n’entraîne pas de nuisances pour l’animal. La mesure de la composition corporelle est réalisée sur animal vigile et acclimaté.

Devenir

Tout les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Quand cela est possible, le modèle animal sera remplacé par des techniques in vitro. Cependant, il n’existe à l’heure actuelle pas de modèle in vitro permettant de s’affranchir du modèle animal.

Réduction

Le critère principal de jugement sera la mesure de la fraction d'éjection (EF) et de raccourcissement (FS) du ventricule gauche. Des données de la littérature nous permettent de prévoir que nos groupes expérimentaux doivent comporter 12 individus afin d’avoir une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Les doublons expérimentaux seront évités, et des mesures strictes seront appliquées afin de réduire la douleur pendant les procédures expérimentales: anesthésie, tapis chauffant, monitoring global de l'animal. Un suivi journalier est mis en place par un zootechnicien qualifié afin de détecter le plus précocement possible la souffrance éventuelle de l’animal. Les signes de douleur spécifiques de la souris seront surveillés, comme la prostration, perte de poids, absence de toilettage.

Choix des espèces

Ce projet vise à caractériser les effets de la surexpression de MTM1 sur la progression de l'insuffisance cardiaque. Ces aspects complexes et interconnectés ne peuvent être reproduits qu'in vivo sur des modèles expérimentaux. Seul l'animal vivant peut permettre d'évaluer ces paramèters et il n'existe pas à l'heure actuelle de moyens alternatifs. Les animaux utilisées seront âgées de 2 mois (jeune adulte). Les souris de 2 mois sont les plus réceptives à la chirurgie TAC et les plus sensibles à l'induction par AAV (des souris plus âgées ont été décrites comme pouvant être résistante à l'induction).

128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, après dissection de la peau, elles reçoivent dans la trachée une injection d'une molécule provoquant une fibrose pulmonaire, puis une greffe de cellules précurseurs de cellules graisseuses, avant mise à mort et prélèvement des poumons au 21e jour. Le porteur indique que l'induction de la fibrose peut entraîner des difficultés respiratoires et une perte de poids. Il présente le projet comme une étude de faisabilité et affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative pour modéliser la réponse d'un "organe entier".

Objectifs

La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) est une maladie rare, chronique et progressive de cause inconnue. Elle est très sévère, avec une survie inférieure à 30% à 5 ans après le diagnostic. Cette maladie se caractérise par des dommages pulmonaires liés à une cicatrisation anormale et chronique, avec l'accumulation de tissu fibreux (fibrose) menant à la destruction des alvéoles pulmonaires. Ces alvéoles sont de minces sacs creux qui prolongent les voies respiratoires, où se déroulent les échanges gazeux avec le sang; elles sont essentielles à la respiration. L'accumulation de tissu fibreux dans le poumon est en grande partie due à l'accumulation de fibroblastes et à leur activité de sécrétion de différents facteurs. Ces fibroblastes sont des cellules d'aspects fusiformes, normalement présentes dans le tissu; ils sont parfois appelés "cellules de soutien". Dans la FPI, les processus menant à la fibrose sont encore mal connus. Or, des travaux récents ont mis en évidence la présence de cellulles graisseuses dans les poumons de patients atteint de FPI. De plus, des données ont montré que ces cellules graisseuses diminuaient in vitro l'activité des fibroblastes de fibrose. Dans d'autres organes, le tissu graisseux a une influence démontrée sur la fibrose (foie, rein, coeur). Nous souhaitons donc étudier son rôle potentiel dans la fibrose pulmonaire. Cependant, des travaux préliminaires n'ont pas permis de mettre en évidence de cellules graisseuses chez la souris dans les modèles de fibrose pulmonaire. Dans le cadre de ce protocole (étude de faisabilité d’une durée de 1 an), la greffe de cellules donnant naissance à des cellules graisseuses dans le poumon sera testée dans un modèle de fibrose pulmonaire chez la souris.

Bénéfices attendus

Ces expériences préliminaires de transplantation de précurseurs de cellules graisseuses permettront de démontrer la faisabilité de cette approche pour étudier le rôle des cellules graisseuses dans la fibrose pulmonaire. Il s'agit d'une première étape importante afin d’identifier le tissu graisseux pulmonaire associé à la fibrose pulmonaire comme potentielle cible thérapeutique dans cette maladie mortelle.

Procédures

En début de procédure (jour 1), les souris recevront, sous anesthésie générale, une injection unique d'une molécule induisant la fibrose pulmonaire. Cette molécule sera injectée directement au niveau de la trachée chez les souris endormies, après dissection de la peau et des tissus sous cutanés : la visualisation directe de la trachée permet une meilleure chance de succès de la procédure. Après injection, la lésion sera suturée par un ou deux points de suture : la souris recevra un antalgique au cours de la procédure, et qui pourra être répété. Cette intervention dure 5 à 10 minutes pour chaque souris. Cinq jours plus tard, les souris recevront une injection unique de cellules capables de donner naissance à des cellules graisseuses (cellules précurseurs), soit au travers de la paroi thoracique, sous anesthésie gazeuse brève (5 minutes), soit via la trachée, après intubation, sous anesthésie générale, (10 minutes) avec des suites post-opératoires similaires à l’injection du produit fibrosant. A l'issue de la procédure (jour 21), les souris seront euthanasiées après anesthésie profonde, après quoi plusieurs prélèvements seront effectués. Un prélèvement de sang sera réalisé ainsi que le prélèvement des poumons.

Impact sur les animaux

L'induction de la fibrose pulmonaire chez les animaux peut déclencher des difficultés respiratoires et une possible altération de l'état général avec perte de poids. Une surveillance quotidienne des animaux est effectuée par l'expérimentateur (exploration de l'aspect physique et de la motricité), ainsi que par le personnel de l'animalerie. Une surveillance au moins 3 fois par semaine minimum des animaux est effectuée par l'expérimentateur selon la grille d'évaluation des points limites (mesure de poids, exploration de l'aspect physique et de la motricité, etc.). La fréquence de surveillance des animaux pourra être augmentée selon leur état général et leur poids.

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasiés en fin de procédure en suivant une méthode réglementaire. Les prélèvements seront effectués après euthanasie de l'animal. Les animaux ne subiront qu'un seul protocole complet au cours de leur vie.

Remplacement

Le modèle murin est pertinent de par son système respiratoire très similaire à celui de l’Homme. A ce jour, il n’existe pas de méthodes alternatives pour modéliser la réponse d’un organe entier dans le cas du développement de la fibrose pulmonaire.

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique, tout en tenant compte du risque de mortalité si les points limites sont atteints. De plus, les prélèvements obtenus grâce à une seule souris permettent de mener de multiples mesures.

Raffinement

Nous veillerons à ce qu'il n'y ait pas d'animaux isolés dans les cages durant les expériences afin de préserver les groupes sociaux. Les animaux seront anesthésiés lors des procédures et recevront des antalgiques systématiquement concomitament de l'anesthésie. L'enrichissement consistera en la mise en place de coton dans les cages, et d'une nourriture facile à ingérer en cours de protocole. Les souris auront un accès permanent à de la nourriture et de la boisson. Une surveillance visuelle quotidienne des animaux est effectuée par l'expérimentateur (exploration de l'aspect physique et motricité), ainsi que par le personnel de l'animalerie. Une surveillance clinique au moins 3 fois par semaine des animaux est effectuée par l'expérimentateur selon une grille d'évaluation (mesure de poids, exploration de l'aspect physique et motricité, douleur, etc.): en cas d'atteinte d'un ou plusieurs point limite, les animaux seront sortis de la procédure et euthanasiés. La fréquence de surveillance des animaux pourra être augmentée selon l'état général des animaux et leur poids. En post-opératoire, la douleur et la cicatrice seront suivies de manière rapprochée. La douleur sera prise en charge par l'administration d'antalgiques. En cas de douleur et d'atteinte d'un point limite, les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

Le modèle souris est pertinent car son système respiratoire est proche de celui de l’Homme. Les modèles de fibroses pulmonaires chez la souris sont largement décrits dans la littérature. Les souris offrent la possibilité de travailler sur des organismes génétiquement modifiés et de cibler le rôle d’une molécule en particulier dans le poumon. Des animaux adultes d'au moins 8 semaines seront utilisés car la fibrose pulmonaire est une pathologie du sujet adulte.

153 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation reproduisant une maladie auto-inflammatoire rare, elles développent une vasculopathie et un déficit immunitaire avec une survie réduite, subissent l'ablation d'une phalange pour le génotypage puis un prélèvement sanguin sous anesthésie sans réveil. Elles sont tuées pour prélever les organes immunitaires, tout animal atteignant un score de souffrance donné étant mis à mort. Le porteur affirme que ces analyses exigent un modèle mammifère in vivo, la souris étant selon lui appropriée.

Objectifs

Le SAVI (STING-associated vasculopathy with infancy-onset) est une maladie auto-inflammatoire rare. Elle se caractérise par une inflammation systémique dès l’enfance (fièvre et syndrome inflammatoire), induisant notamment une vasculopathie cutanée sévère (engelures et ulcérations aux joues et aux extrémités comme nez, doigts, orteils), et une pneumopathie interstitielle. Le SAVI est dû à une mutation de gain-de-fonction (= suractivation) de STING, un facteur clé de la réponse immunitaire. Nous avons créé un modèle murin portant la mutation majeure (STING V154M) et reproduisant les signes de la maladie humaine. Les souris présentent un déficit immunitaire avec baisse des lymphocytes, et une survie diminuée à 6 mois. STIM1 est un interacteur connu de STING, et il a été démontré que cette interaction est cruciale pour la régulation de l’activité de STING. Le but du projet est de valider l’hypothèse scientifique selon laquelle une modulation de STIM1 pourrait réduire la suractivation de STING et ainsi améliorer le phénotype des souris SAVI.

Bénéfices attendus

Le projet vise à fournir la preuve de concept que la modulation de STIM1 peut améliorer l’auto-inflammation des souris STING V154M. Ceci pourrait conduire au développement d'approches thérapeutique pour les patients atteints de SAVI.

Procédures

A 10 jours : prélèvement d’un échantillon de phalange (acte de 10 secondes) pour extraction d’ADN et génotypage (= vérification de la présence/absence des mutations STING et STIM1). A 2-3 mois : anesthésie pour prélèvement de sang (acte de 5 minutes), puis mise à mort pour prélèvement des organes du système immunitaire.

Impact sur les animaux

Les souris STING V154M présentent un phénotype dommageable avec notamment un déficit immunitaire. Bien qu’une amélioration de ce phénotype soit attendue suite à la modulation de STIM1, il est possible qu’il n’y ait pas d’effet bénéfique. Nous proposons donc une surveillance hebdomadaire avec une procédure de suivi utilisant une grille de score tenant compte de plusieurs critères sur l’aspect général et le comportement des souris. Par ailleurs, les souris seront soumises à une phalagectomie (génotypage), ainsi qu'une prise de sang (sous anesthésie et sans réveil).

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort pour prélèvement des organes du système immunitaire.

Remplacement

Notre projet vise à étudier les réponses immunitaires dans un système complexe qui met en jeu des coopérations des organes lymphoïdes tels que la rate et les ganglions. Ces analyses nécessitent un modèle in vivo de mammifère, et nous ne pouvons avoir recours à des modèles in vitro. Par ailleurs, les connaissances du système immunitaire sont très développées chez la souris, qui représente de ce fait un modèle approprié pour étudier la physiopathologie de SAVI et établir des approches thérapeutiques qui pourraient être transférées aux patients dans l’avenir.

Réduction

Un nombre de 15 souris maximum/groupe (8 groupes au total) sera utilisé pour s’assurer que l’étude soit statistiquement et scientifiquement valable. Le test d’Agostino-Pearson sera réalisé afin de vérifier que les données suivent une loi Normale. Si la loi Normale est respectée, le test d'ANOVA sera appliqué. Si toutefois les données expérimentales ne respectent pas la loi Normale, un test non paramétrique (Kruskal-Wallis) sera appliqué. Plusieurs procédures expérimentales seront réalisées chez les mêmes souris, réduisant ainsi le nombre d'animaux nécessaires. Par ailleurs, nous allons utiliser des souris mâles et femelles afin de réduire d’avantage le nombre de souris utilisées pour les procédures expérimentales.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupes sociaux, dans des cages enrichies (barreau à ronger, matériel de nidification). Une grille de suivi permettra d’appliquer un point limite prédictif et adapté. Afin d'évaluer les points limites, cette grille prend en compte les points des catégories suivants : 1) L'aspect général de l'animal (hérissement des poils, yeux clos, flancs creusés...) : 2) Le comportement de l'animal (mobilité́, prostration, dos vouté́, isolement par rapport aux autres animaux). Ce suivi sera réalisé de manière hebdomadaire sur toute souris portant la mutation STING V154M à partir du sevrage et jusqu’à la mise à mort pour expérimentation. Chaque animal ayant une somme totale de scores ≥ 3 doit être mis à mort. Si un animal atteint le score de 2 dans une seule catégorie, celui-ci doit être également mis à mort.

Choix des espèces

La souris est un modèle pertinent et courant en immunologie. Son système immunitaire est bien étudié, de nombreux réactifs (notamment les anticorps) sont disponibles, et de nombreuses techniques d’analyse sont établies afin de mener à bien les analyses. L’expérimentation se fera à partir d’un âge adulte (2-3 mois) afin de pouvoir analyser les organes lymphoïdes matures (après mise à mort).

560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines sont irradiées pour une greffe de moelle osseuse, toutes suivent un régime gras de douze semaines avec prélèvements sanguins répétés, pour étudier l'inflammation des artères dans les maladies cardio-métaboliques. Elles sont tuées par dislocation cervicale, surdosage d'anesthésique ou CO2 selon les expérimentateurs. Le porteur affirme que ces pathologies complexes rendent l'approche in vivo "indispensable" et que le dépôt de cholestérol ne peut s'étudier in vitro.

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires représentent la première cause de décès dans le monde. Récemment, l'inflammation (réponse de l'organisme à une agression) est apparue comme une composante centrale dans l'apparition de ces maladies mais les mécanismes restent encore inconnus. Le dérèglement des cellules du système immunitaire est souvent associé à l'inflammation et à la progression des maladies cardiovasculaires dites cardio-métaboliques, dans lesquelles un dysfonctionnement du métabolisme cellulaire (utilisation des matières nutritives pour fabriquer de l'énergie) aboutit au développement de ces maladies. Plus précisément, au sein des vaisseaux sanguins, un type particulier de cellules immunitaires, appelé les macrophages, joue un rôle important dans l'élimination des déchets pour éviter l'encrassement des vaisseaux qui provoque une inflammation et le développement de plaques d'athérome (plaques de gras bouchant les artères). Cependant, une surcharge en déchets et en cholestérol sanguin dérégule le métabolisme des macrophages qui ne sont plus capables d'exercer leur rôle d'"éboueurs" des vaisseaux. Le métabolisme cellulaire dépend d'une organelle qu'on appelle la mitochondrie qui permet de transformer les nutriments en énergie. De récentes publications ont montré l'importance de la dérégulation des mitochondries dans le développement de l'inflammation. En particulier, une modification de la structure des membranes des mitochondries entraine des perturbations quantitatives et qualitatives de ces organelles. Les membranes mitochondriales ont une structure spécifique qui dépend de lipides spécifiques appelés phospholipies mais leurs rôles dans la fonction mitochondriale des cellules immunitaores restent inconnus. Néanmoins, leur quantité dans le sang est souvent associé aux maladies cardio-métaboliques. Ce projet vise donc à identifier le rôle de la synthèse des phospholipides dans les macrophages. Pour cela, des approches génétiques d'invalidation de gène seront réalisées. Cela permettra de mieux comprendre l'origine de l'inflammation dans les maladies cardio-métaboliques afin de développer de nouvelles approches diagnostiques et thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Cette étude pourrait ouvrir de nouvelles perspectives de traitement visant à mieux contrôler la fonction des cellules immunitaires et ceci dans les maladies cardio-métaboliques. L’ensemble des procédures proposées dans ce projet sont connues comme non remplaçables par des procédures ne faisant pas intervenir directement l’animal.

Procédures

Groupe 1 (Procédure1) : Prélèvements de sang à la joue sur animaux vigiles (toutes les 2-3 semaines) à partir de l'âge de 6 semaines. 12 semaines de régime riche en graisse. 48h en cage métabolique pour étudier les variations métaboliques (1 souris par cage) puis injection de glucose par voie intra-péritonéale (une injection) puis détermination de la glycémie (taux de sucre sanguin) par prélèvement de sang au niveau de la veine de la queue (1 goutte). Groupe 2 (Procédure 1) : Injection de Tamoxifen en intra-péritonéal sur souris vigiles à l’âge de 6 semaines tous les deux jours pendant une semaine (soit 3 injections). Pour ce groupe de souris, le Tamoxifen est nécessaire pour invalider, indirectement, le gène cible. Prélèvements de sang à la joue sur animaux vigiles (toutes les 2-3 semaines) à partir de l'âge de 6 semaines. 12 semaines de régime riche en graisse. 48h en cage métabolique pour étudier les variations métaboliques (1 souris par cage) puis injection de glucose par voie intra-péritonéale (une injection) puis détermination de la glycémie (taux de sucre sanguin) par prélèvement de sang au niveau de la veine de la queue (1 goutte). Dans le cadre de la Procédure 2 (greffe de moelle osseuse), les souris receveuses, âgées de 10 semaines, seront irradiées (pour éliminer les cellules de la moelle osseuse) dans un irradiateur prévu à cet effet pendant 6min30sec. Ces souris recevront une solution contenant des cellules de moelle osseuse par voie intra-veineuse au niveau de la veine de la queue. Ces souris seront ensuite soumises aux interventions citées ci-dessus selon leur groupe. Par ailleurs, une grille de score a été établie afin de limiter la douleur, et déterminer les mesures à prendre si besoin (antalgique (anti-douleur), désinfection ou mise à mort).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont une douleur légère lors du prélèvement à la joue et lors des injections intra-péritonéales et intra-veineuses. Lors du changement de cage, les animaux peuvent être légèrement stressés mais ce stress diminue au bout des 24h d'acclimatation à la cage métabolique. Il peut également survenir une perte de poids et une prostration suivant l’irradiation, ainsi que, très rarement, une respiration perturbée et une mobilité réduite avec le régime riche en graisses.

Devenir

A la fin des expériences, toutes les souris seront mises à mort par dislocation cervicale, surdosage d’anesthésiant ou asphyxie au CO2 (selon les expérimentateurs).

Remplacement

Les maladies cardio-métaboliques sont des pathologies complexes dans lesquelles de multiples voies métaboliques et physiologiques interviennent. De ce fait, une approche in vivo reproduisant ces interactions nous est indispensable pour répondre à notre problématique. De plus, l'étude du dépôt de cholestérol dans les artères ne peut être réalisé in vitro. Des modèles murins capable de développer de l'athérosclérose ont donc été développés et validés par la communauté scientifique comme outils d’études précliniques.

Réduction

Notre approche statistique garantit l’obtention de résultats exploitables avec le plus petit nombre d’animaux possible. Dans le cadre de cette étude, et pour chaque groupe, nous utiliserons des souris mâles et femelles. Ceci permettra d’utiliser l’ensemble des animaux générés dans les élevages. De plus, les résultats pourront ainsi être appliqués à la fois aux hommes et aux femmes. Ce projet prévoit l’utilisation de 560 souris sur 5 ans.

Raffinement

La mise en place de points limites précoces, prédictifs, adaptés à chaque procédure et basés sur une observation détaillée des animaux au cours de chaque procédure, permettra de limiter la sévérité de celles-ci. Les souris seront hébergées selon les mesures réglementaires pour le raffinement : en groupe (6 souris par cage, ou 5 souris par cage si une des souris fait 30g ou plus) dans des cages enrichies (igloos, ouate, baguettes de bois à ronger).

Choix des espèces

1) Nous avons choisi le modèle murin car c’est un modèle standard bien reconnu dans le domaine scientifique pour l’investigation de manipulations génétiques liées aux maladies cardio-métaboliques. 2) Nous avons également des souris déficientes pour le gène ApoE ou LDLR connues pour leurs différents facteurs de risque liés au développement de l’athérosclérose et donc à l’apparition des maladies cardio-métaboliques après un régime riche en graisse. 3) Des souris déficientes pour la protéine Cardiolipin synthase 1 spécifiquement au niveau des macrophages nous permettront de déterminer l’importance de cette enzyme sur la dynamique mitochondriale et le métabolisme des macrophages. 4) De plus, le modèle murin présente plusieurs avantages par rapport à d’autres espèces : cycle de vie court, natalité importante. A partir de l’âge de 6 semaines (âge à partir duquel les souris sont considérées comme suffisamment matures), les souris nécessitant une induction au Tamoxifen seront injectées. La greffe de moelle osseuse est réalisée sur des souris plus âgées (10 semaines). A l’âge de 8 ou 17 semaines toutes les souris seront soumises à un régime riche en graisse durant une période de 12 semaines afin de permettre la formation des plaques d’athérome. Pendant cette période, les expériences de calorimétrie et de tolérance au glucose seront réalisées afin d’étudier les variations des voies métaboliques. A la fin des expériences, les souris seront mises à mort par dislocation cervicale, par surdosage d’anesthésiant ou par asphyxie au CO2 (selon les expérimentateurs) à 29 semaines ou moins selon les procédures.