Procédures modérées

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une chirurgie implante une sonde de microdialyse, parfois couplée à une fibre optique, dans leur cervelet, les animaux étant tués dans les 24 heures pour vérification anatomique, afin d'étudier le rôle des cellules gliales dans la neurotransmission. Le porteur qualifie cette chirurgie intracérébrale de gêne légère et de mineure au motif que le cerveau serait dépourvu de fibres de la douleur. Il réduit les bénéfices attendus à la mise en évidence d'un rôle de ces cellules, sans application décrite.

Objectifs

Notre projet vise à édudier le role des cellules de Bergmann (les cellules gliales du cervelet) dans les neurotransmissions monoaminergiques (Sérotonine, Noradrénaline, Dopamine) dans le cervelet de souris.

Bénéfices attendus

La mise en évidence de l'implication des cellules gliales dans la neurotransmission monoaminergique

Procédures

Chirurgie : implantation stéréotaxique de sonde de microdialyse couplées ou non avec une fibre optique dans le cervelet. Ceci concerne l'ensemble des animaux la durée totale entre l'implantaion et le sacrifice des animaux est de 24 heures.

Impact sur les animaux

Techniquement les expériences menées impliquent la microdialyse mise en oeuvre seule ou avec l'optogénétique. Ces implantations intracérébrales constituent une gène légère pour l'animal. Le cerveau est dépourvu de fibres sensibles à la douleur, à titre d'exemple des chirurgies similaires ontvréalisée chez l'humains sous simple anesthésie locale.

Devenir

Euthanasie des animaux à l'issue de chaque procédure, pour vérification anatomique des implantations intracérébellaires

Remplacement

L'utilisation de souris est indispensable pour ce projet. L'évaluation de processus complexes comme les interactions neurones-glies sur une structure cérébrale en fonctionnement dans des conditions physiologiques, n'est à ce jour pas modélisable.

Réduction

Le calcul de puissance est effectuée pour les expériences de microdialyse a été réalisé avec le logicile biostatGV. Un écart type de 20 % (issue des données de la littérature et de notre propre expérience) et la possibilité de discriminer un effet de 25% a été envisagé. Une puissance de 0,9 et un alpha de 0,05 ont été choisis. Ceci indique 14 animaux par groupe nombre qui est augmenté à 15 pour pallier aux aléas expérimentaux. Une approche statistique sera envisagée

Raffinement

Un anesthésique est utilisé pour effectuer l'implantation des sondes de microdialyse. Le cerveau est un organe dépourvu de fibres nerveuses libres dédiées à la nociception, bien qu'invasive cette chirurgie se révèle mineure pour les animaux

Choix des espèces

L'utilisation de souris est nécessaire pour ce projet. Les souches modifiées génétiquement ne sont disponibles que pour cette espèce. Les animaux entreront dans le protocole expérimental lorsqu'ils seront agés de 8 à 10 semaines ainsi la chirurgie sera menées sur les animaux agés de 14 à 16 semaines.

960 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès le septième jour de vie, une chirurgie lèse leur hippocampe pour induire un modèle de schizophrénie, puis ils sont exposés jeunes à l'alcool et à des cannabinoïdes avant une seconde chirurgie d'implantation de canules, pour étudier l'impact de ces drogues sur la consommation d'alcool. Le porteur signale des douleurs postopératoires après chaque chirurgie. Il présente ce modèle par lésion comme le plus utilisé et le plus complet pour cette comorbidité.

Objectifs

L'objectif principal de ce projet est d'étudier l'impact d'expositions précoces aux drogues sur les troubles de la consommation d'alcool à l'âge adulte dans un modèle animal de schizophrénie. En effet il existe une prévalence élevée de patients atteints de schizophrénie qui présentent un trouble de la consommation d'alcool. Les consommations d'acool et de cannabis sont fréquentes à l'adolescence aussi bien dans la population générale que chez les sujets qui risquent de présenter la maladie. Nous chercherons donc à étudier le rôle de ces expositions précoces d'alcool et d'agents cannabinoides sur les comportements des animaux modèles de schizophrénie mais également sur la neurotransmission. En effet la dérégulation des systèmes de neurotransmission est directement impliquée aussi bien dans les troubles de la consommation d'alcool que dans ceux associés à la schizophrénie.

Bénéfices attendus

Il n'existe à l'heure actuelle aucune étude visant à étudier l'impact de la co-exposition précoce à l'alcool est aux cannabis ni chez l'Homme, ni chez l'animal alors que la consommation de ces drogues est relativement fréquentes chez les adolescents et jeunes adultes. Grâce aux expériences proposées dans ce projet nous pourrons obtenir des données importantes concernant les mécanismes neurobiologiques qui sous-tendent les troubles de la consommation d'alcool dans un modèle pertinent pour l'étude de la schizophrénie. L'aspect neurobiologique de ce projet aidera la communauté scientifique à mieux comprendre l'impact d'une exposition précoce à des drogues couramment utilisées sur les systèmes dopaminergiques. Nous ajouterons à cette étude neurobiologique un aspect purement comportemental qui nous permettra d'évaluer l'impact de cette exposition précoce aux drogues sur les comportements associés à la consommation d'alcool et à ceux associés à la schizophrénie.

Procédures

Tous les animaux subiront une chirurgie à l'âge de 7 jours. Chacune de ces opérations ne durera jamais plus de 20 minutes. Par la suite à l'âge adulte 320 rats subiront une seconde chirurgie qui ne durera pas plus de 30 minutes. Lors de ces chirurgies les animaux subiront une anesthésie gazeuse et recevront une injection d'analgésiques adaptés. En soins post-opératoires, les animaux (au 7ème jour de vie et à l'âge adulte) recevront pendant au moins 2 jours post-opératoires au moins 2 injections quotidiennes d'analgésique adapté.

Impact sur les animaux

- Douleurs post-opératoires de palier 1 à 2 à J7 suite à la lésion de l'hippocampe ventral par chirurgie stéréotaxique. Durée attendue : 2-3 jours. - Douleurs post-opératoires de palier 1 à 2 à l'âge adulte suite à l'implantation des canules par chirurgie stéréotaxiques. Durée attendue : 3-4 jours.

Devenir

Procédures 1, 2, 3: Ces procédures ne sont que des étapes qui nous permettent de générer nos animaux modèles de comorbidité. Tous les animaux issus de ces procédures seront répartis soit dans la procédure 4 (640 rats) soit dans la procédure 5 (320 rats). Procédure 4 : A la fin des analyses comportementales les cerveaux de ces animaux devront être récupérés pour des analyses post-mortem en vue d’étudier l’expression de marqueurs biologiques importants dans ces pathologies et iront donc en procédure 6. Procédure 5: Tous les animaux seront euthanasiés pour vérifications histologiques des sites d'implantation des électrodes d'enregistrement et de stimulation. Procédure 6: Tous les animaux seront euthanasiés au cours de cette procédure.

Remplacement

Les études de mécanismes complexes de maladies psychiatriques comme la schizophrénie ou l'addiction ne sont pour le moment pas remplaçables par des méthodes in vitro ou in sillico. Les mécanismes impliqués sont trop complexes pour pouvoir être simplifiés à ce jour. Le modèle que nous avons choisi fait partie des modèles les plus utilisés et les plus complets avec une validité de ressemblance, une validité de construction et une validité de prédiction très bien décrites dans la littérature.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire à chacune des expériences a été estimé sur la base de nos précédentes expériences utilisant le même modèle en prennant en compte la variabilité interindividuelle observée aussi bien dans les modèles animaux que dans les différents paradigmes comportementaux utilisés. Nous utiliserons au maximum les mêmes animaux entre les différentes procédures pour limiter le nombre total d'animaux utilisés dans ce projet.

Raffinement

Pour chacune des procédures nous avons mis en place un série de points limites ainsi qu'une grille de scoring du bien-être animal. Une action thérapeutique adaptée sera déclenchée dès q'un point limite sera atteint. « En ce qui concerne les conditions d'hébergement, les animaux seront stabulés en groupe tout au long du projet sauf pendant les périodes d'évaluation de la consommation d'alcool. Ces périodes seront limitées au strict minimum nécessaire et l'isolement sera contrebalancé par une manipulation accrue par les expérimentateurs (enrichissement inter-espèce).

Choix des espèces

Le modèle de lésion choisi pour induire des symptômes de schizophrénie est le plus utilisé en recherche sur la comorbidité addictive car ce modèle est sans doute celui qui représente le mieux l'évolution de la maladie. Les animaux seront utilisés tout au long de leur vie. Ce modèle nécessite une lésion du cerveau au 7ème jour de vie. Tous les petits seront ensuite soumis à la procédure d'exposition aux drogues pendant la période d'adolescence (entre les jours 28 et 50). Les rats seront conservés jusqu'à l'âge adulte pour évaluer les effets d'une telle pré-exposition précoce sur les comportements et la neurobiologie à l'âge adulte.

1 040 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules de cancer du pancréas leur sont injectées sous la peau, dans le pancréas ou dans le sang, provoquant tumeurs, ascite ou métastases pulmonaires, puis elles reçoivent des traitements, pour comparer la réponse selon la localisation de la tumeur. Le porteur décrit une possible altération de l'état général liée au cancer induit et aux effets des chimiothérapies. Il conclut que l'évaluation de traitements anticancéreux doit se faire sur un organisme vivant.

Objectifs

Le but du projet est d’évaluer l’efficacité antitumorale d’une association immunothérapie (anti-PD-1) et chimiothérapies utilisées en clinique dans des modèles de cancers du pancréas avec différentes localisations (sites d’injections différents) chez la souris. Nous étudierons également les infiltrats immunitaires dans les tumeurs. Ainsi nous pourront 1) évaluer l’efficacité des traitements selon la localisation et 2) déterminer si certaines cellules immunitaires voient leur nombre et leur activité modifiée en fonction du traitement et de la localisation du cancer. Cette étude nous permettra également de comprendre les mécanismes de résistance aux traitements actuellement utilisés en clinique.

Bénéfices attendus

En France, en 2018, le cancer du pancréas était le 9e cancer le plus fréquent chez l’homme et le 7e cancer le plus fréquent chez la femme. Le pronostic de ce cancer, souvent diagnostiqué tardivement, reste sombre, expliquant que la mortalité ne baisse pas. A tel point que l’adénocarcinome pancréatique pourrait devenir la seconde cause de mortalité par cancer dans les années 2030-2040. L’un des critères d’agressivité de ce cancer est sa capacité à former des métastases dans d’autres organes, comme le foie ou le poumon. Actuellement, le traitement de ce cancer repose sur l’utilisation de chimiothérapies qui sont malheureusement peu efficaces, car souvent administrées tardivement, notamment lorsque le cancer a métastasé. L’immunothérapie a été associée à la chimiothérapie afin d’augmenter son efficacité dans de nombreux cancers. Cependant cette association n’est pas efficace pour le cancer du pancréas. Il apparait donc important d’étudier les mécanismes responsables de cette résistance. Le but du projet est d’évaluer l’efficacité anti-tumorale d’une association immunothérapie et chimiothérapies utilisées en clinique dans différents modèles de cancers du pancréas. L’intérêt de ce travail est donc de mieux comprendre les mécanismes immunologiques associés aux traitements par chimiothérapie et de rechercher des moyens de potentialiser l’immunothérapie, jusqu’alors inefficace dans le cancer du pancréas.

Procédures

- Injection par voie sous-cutanée de cellules de cancer du pancréas murines : - 288 souris C57BL/6 et 144 souris BalbC/nude. - Injection orthotopique de cellules de cancer du pancréas murines dans le pancréas : - 160 souris C57BL/6 et 144 souris BalbC/nude. - Injection par voie intra-veineuse de cellules de cancer du pancréas murines : - 160 souris C57BL/6 et 144 souris BalbC/nude. - Traitements par voie intrapéritonéale : - 576 souris C57BL/6 et 432 souris BalbC/nude.

Impact sur les animaux

- Injection de cellules tumorales dans différentes localisations : - Sous-cutanée : masse tumorale au niveau du flanc droit pouvant gêner la liberté de mouvement de l’animal. - Orthotopique : croissance d’une masse tumorale intra-abdominale monitorée par palpation abdominale. Possible dissémination de la maladie au niveau du péritoine avec apparition d’ascite. - Métastatique : croissance de métastases intra-pulmonaires, pas d’effet masse attendu. - Dans tous les cas : possible altération de l’état général du fait de la pathologie cancéreuse induite. -Éventuels effets secondaires des traitements anti-cancéreux : les chimiothérapies utilisées ont déjà fait l’objet de recherche clinique sur l’animal, il n’est pas attendu d’effet secondaire important. -Concernant le modèle orthotopique, possible complications au niveau du site opératoire et de la cicatrice : infection, lâchage de suture, douleur.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure. Certains seront autopsiés (modèles orthotopique et intra-veineux).

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, pour être prédictifs, l’évaluation de l’efficacité ou de l’échec de nouvelles combinaisons thérapeutiques en oncologie doit être réalisée sur les organismes vivants. Nous réalisons à ces fins des études translationnelles sur des modèles d‘animaux greffés avec des cellules tumorales.

Réduction

- Les expériences seront réalisées sur des petits effectifs ce qui permet donc de réduire le nombre d’animaux de l’étude. De plus une étape de faisabilité pour évaluer la pertinence des modèles sera réalisée en début de projet. Si l’un des modèles ne donne pas les résultats escomptés sur la localisation des tumeurs ou s’il s’avère que les points limites sont atteints prématurément, celui-ci sera abandonné à l’étape de faisabilité (partie I). Si aucun effet bénéfique des composés seuls ou en association sur la réponse anti-tumorale (croissance et infiltrats immunitaires) n’est observé, l’étude sera arrêtée à l’étape II. En choisissant de transposer uniquement le ou les modèles ayant le mieux répondu aux combinaisons de traitements en partie II, dans les souris Balb/nude, nous réduirons également le nombre de souris utilisées pour cette lignée. Enfin pour les modèles orthotopiques et intra-veineux les expériences visant à étudier la taille des tumeurs et les infiltrats immunitaires seront réalisées sur les mêmes souris.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions qui répondent à leurs besoins (groupes, environnement enrichi) et seront habitués aux techniques de préhension. Les animaux sont suivis au minimum 3 fois par semaine par des techniciens responsables d’études. Une anesthésie générale gazeuse (isoflurane 3% + oxygène 1.5L/min) sera réalisée avant chaque greffe. Elle sera entretenue pour la greffe orthotopique, avec contrôle de l’absence de réflexe de la patte et surveillance de la fréquence respiratoire et protection de la cornée avec un collyre ophtalmique. Pour l’analgésie, des anti-inflammatoires (Ketoprofen 4mg/kg) seront administrés en sous-cutanée en pré-opératoire à distance du site opératoire et prolongé pendant 48h après l’opération, ainsi que des anesthésiques locaux (lidocaïne 4mg/kg + bupivacaine 2mg/kg) au niveau du site opératoire. La surveillance post-interventionnelle sera réalisée 2 fois par jour durant les 3 premiers jours, puis quotidienne pendant 2 jours et enfin espacée à 3 fois par semaine. Points limites : - perte de poids dépassant 20% par rapport au poids maximum enregistré à arrêt des traitements à si persistance au-delà de 24h, sacrifice de l’animal ; - posture ou autre expression de la douleur à arrêt des traitements à si persistance au-delà de 24h, sacrifice de l’animal ; - absence de toilettage à arrêt des traitements et surveillance de l’apparition d’autres points limites ; - léthargie, immobilité à si persistance au-delà de 24h, sacrifice de l’animal ; - une mauvaise cicatrisation ou une ouverture des sutures à sacrifice de l’animal. - Points limites spécifiques à la présence de tumeurs et dont l’atteinte entrainera l’euthanasie des animaux : - volume tumoral supérieur à 2000 mm3 ; - tumeurs gênant les fonctions vitales et motrices ; - ulcération ou nécroses de la tumeur sous-cutanée supérieure à 20% de la surface totale de la tumeur ; - palpation d’une masse abdominale localisée dans la zone du pancréas et entrainant une gêne ou une douleur ; - envahissement du péritoine de la souris conduisant à un une carcinose péritonéale ou la formation d’ascite et ainsi un gonflement de l’abdomen ; - difficultés respiratoires. Le projet se déroule en 3 parties. L’absence de faisabilité ou de résultats, conduira à l’arrêt de certains modèles.

Choix des espèces

Les souris présentent des caractéristiques physiologiques qui permettent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Diverses souches de souris immunocompétentes sont disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques, indispensables à la recherche préclinique en immuno-oncologie. Des souris génétiquement modifiées seront également utilisées afin de montrer l’importance du système immunitaire. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature et un poids corporel > 20g.

40 pélobates bruns, une espèce d'amphibien menacée, vont être capturés dans la nature, opérés pour l'implantation d'un émetteur, puis relâchés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La chirurgie sous anesthésie dure moins de vingt minutes et vise à suivre leurs déplacements terrestres pour améliorer la conservation de l'espèce. Le porteur indique un risque de mortalité d'environ 2 %, observé sur un protocole comparable en 2021. Il justifie l'étude sur des individus sauvages par son objet même, la conservation de ce pélobate.

Objectifs

Les amphibiens possèdent un cycle de vie complexe, composé d’une phase aquatique (reproduction et stade larvaire) mais aussi d’une importante phase terrestre. Si la première est très étudiée, les connaissances sur la phase terrestre sont en revanche souvent bien limitées. Cela est notamment dû à la difficulté de suivre des individus en déplacement en milieu terrestre comparé à l’écoute et à l’observation dans / près des mares. Néanmoins, la phase terrestre joue un rôle important dans la vie d’un amphibien et constitue la plus grande partie de son cycle de vie (zones de chasse, d’estivage, d’hivernage). Il est d’autant plus essentiel de connaître la totalité de l’habitat dans le cas d’espèces protégées. Il est aujourd’hui possible de suivre très finement les déplacements d’individus en phase terrestre sur le long terme grâce à la radiotélémétrie. Cette méthode permet, à l’aide d’une antenne et d’un récepteur, de suivre sur de longues distances les déplacements d’individus équipés d’un émetteur radio avec une précision telle qu’il est possible de les retrouver individuellement afin de pointer leur position par un GPS manuel. Ces techniques ont déjà été utilisées et validées pour étudier le déplacement en phase terrestre chez certains amphibiens. L’habitat terrestre n’a été que très peu étudié chez le Pélobate brun (Pelobates fuscus), espèce menacée en France (statut en « En danger (EN) » de l’UICN). Cette étude vise à caractériser les déplacements fins en phase terrestre du Pélobate brun.

Bénéfices attendus

Cette étude devrait nous permettre de mieux connaître les micro et macrohabitats utilisés par le Pélobate brun ainsi que ses patterns de déplacements, encore peu connus, permettant ainsi une meilleure gestion de son habitat et donc des mesures de conservation plus efficaces.

Procédures

En dehors du stress lié à la capture et à la manipulation, la nuisance prévue est l’implantation des émetteurs (chirurgie), cette nuisance est cependant réduite au maximum par l’anésthésie et l’emploi complémentaire d’analgésique. L’opération en elle-même dure moins de 20min, et le réveil se fait dans l’heure.

Impact sur les animaux

La probabilité d’apparition d’effets indésirables voire de mortalité des individus à la suite d’un stress dû à la capture, au déplacement, à l’opération et au maintien en captivité ne peut être réduite à zéro. Notamment, il y a eu 2% de mortalité (1 individu/46) pour le même protocole réalisé sur une autre espèce d’amphibien, en 2021. Les nuisances potentielles liées à la chirurgie concernent d’une part les risques inhérents à l’anesthésie et les risques possibles liés à la chirurgie en elle-même (problème de cicatrisation etc). Cependant ces risques restent bas : l’espèce cicatrise bien et la bonne formation des opérateurs mène à un risque quasi-nul de problème lors de l’opération.

Devenir

L’objectif est de suivre le déplacement des individus dans leur habitat naturel, il est donc obligatoire de les relacher.

Remplacement

Cette étude a pour objectif d’améliorer la conservation du Pélobate brun et concerne donc spécifiquement cette espèce, ainsi elle ne peut pas être réalisée via une autre approche qu’en étudiant le comportement des individus sauvages de cette espèce.

Réduction

Un nombre réduit d’individus sera utilisé lors de l’expérimentation. Cela nous permet d’avoir une puissance statistique suffisante tout en limitant le nombre d’individus manipulés. Réduire d’avantage cet effectif serait statistiquement risqué car nous ne pouvons écarter une mortalité induite par la capture, les manipulations, le transport et la chirurgie (2% de mortalité pour le même protocole réalisé sur une autre espèce d’amphibien, en 2021), ou une mortalité naturelle pendant l’expérimentation (prédation, maladie).

Raffinement

« Pendant la période de captivité les individus seront placés dans des vivariums à température ambiante (~20°C), dans un milieu maintenu humide, au calme et dans l’obscurité, enrichi de cachettes faites de pots en terre. Les individus seront nourris ad libitum avec des grillons vivants (Acheta domestica ; 1cm). La procédure chirurgicale est réalisée sous anesthésie générale et avec l’application d’un analgésique local. Pendant cette phase de captivité temporaire (48h à 72h) et de récupération post-chirurgicale, différentes évaluations sont mises en place pour déterminer quotidiennement les points limites, afin de limiter la douleur des animaux et permettre le relâcher dans de bonnes conditions.

Choix des espèces

Le but est d’étudier l’utilisation de l’habitat terrestre par le Pélobate brun dans le cadre de son étude et de sa conservation, ainsi le remplacer par une autre espèce n’est pas envisageable. D’autre part uniquement des adultes seront utilisés. Nous nous intéressons au déplacement en milieu terrestre des pélobates, éliminant ainsi de l’étude le stade larvaire qui est aquatique. Ainsi seuls des individus adultes et de poids suffisants (plus de 19 g) seront utilisés.

50 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Deux interventions chirurgicales créent un défaut osseux dans leur crâne puis y implantent un biomatériau, pour évaluer une méthode de régénération osseuse. Le porteur présente ce test in vivo comme la validation de résultats obtenus in vitro, avant un passage vers un modèle plus proche de l'humain. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet d'étudier la réparation osseuse dans ce contexte.

Objectifs

L’objectif principal du projet est d’évaluer l’efficacité sur la régénération osseuse chez le rat d’une méthode originale d’ingénierie tissulaire osseuse utilisant un assemblage tridimensionnel couche par couche de cellules souches mésenchymateuses autologues et d’un biomatériau imprimé en 3D.

Bénéfices attendus

On attend de ce projet qu’il vienne valider les résultats expérimentaux préliminaires obtenus in vitro. On a pu montrer que le matériau utilisé était biocompatible, non cytotoxique et qu’il permettait de guider la néoformation osseuse. Sa dégradation est également compatible avec une utilisation in vivo. Les bénéfices attendus sont donc de valider cette procédure de régénération osseuse dans un modèle de petit animal, avant de pouvoir passer sur un modèle plus proche de la clinique humaine.

Procédures

Selon les recommandations de l’annexe VIII de la directive 2010/63/UE du 22/09/2010, la procédure chirurgicale est considérée comme modérée en termes de souffrance (chirurgie sous anesthésie générale et analgésie appropriée). Les opérations seront réalisées sous anesthésie générale. La réduction de la douleur sera assurée par une analgésie pré-opératoire avec injection sous cutané de 0.05 mg/kg de Buprénorphine et l’injection sous cutané de 1 mg/kg de Meloxicam en post-opératoire. Les animaux seront suivis quotidiennement par le personnel de l’animalerie. Le poids des animaux sera relevé en continu. La cicatrisation des plaies sera suivie : en cas de problème, les animaux seront anesthésiés pour effectuer des soins nécessaires : selon la gravité, la plaie sera nettoyée et un traitement antibiotique sera délivré. L’estimation de la souffrance sera réalisée en suivant des critères spécifiques. Au-delà du score limite de 14, l’animal sera euthanasié. Les critères permettant cette évaluation sont l’apparence de l’animal, la prise d’eau et de nourriture, les signes cliniques et les comportements naturels et provoqués (les points limites sont décrits dans la partie 4.2) Toute souffrance plus modérée sera traitée par l’administration de Meloxicam pendant 3 jours. La persistance de douleurs malgré ce traitement entraînera la mise à mort de l’animal. Les rongeurs seront maintenus en fratrie (4 à 5 par cage selon la taille des animaux) en respectant la composition du groupe pré-opératoire. Chaque cage sera composée d’un milieu d’enrichissement adapté favorable au bien-être de l’animal. Afin d’avoir un nombre suffisant d’échantillons à la fin de l’étude, en prenant en compte le risque de perte d’animaux, nous ferons des groupes de 10 animaux pour chaque condition. Pour l’analyse statistique, nous comparerons les résultats pour les échantillons appariés à l’aide du test de Wilcoxon, le test t de Student, et pour les échantillons non appariés avec le test U de Mann-Whitney. La durée de le pemière procédure (prélèvément de tissu adipeux) est de 10 minutes (anesthésie, chirurgie et réveil) La durée de la seconde procédure (défaut osseux de calvaria et implantation) est de 15 minutes (anesthésie, chirurgie et réveil).

Impact sur les animaux

Les nuisances pour les animaux sont principalement en rapport avec la douleur associée aux deux interventions chirurgicales prévues dans le déroulé de l’expérimentation. Comme décrit plus bas, ces douleurs sont de classe modérée et seront prises en charge avec un protocole antalgique déjà validé dans ce modèle chirurgical. Par ailleurs, les activités des animaux ne seront pas modifiées par la procédure.

Devenir

Tous les animaux seront sacrifiés en fin d'expérimentation car nous devrons prélever les tissus d"intérêt (os de la calvaria et tissus attenants)

Remplacement

Il n’existe pas de modèle in vitro permettant d’étudier la réparation osseuse dans ce contexte.

Réduction

Ces expériences sont conçues pour limiter le nombre d’animaux à 10 par temps et pour chacune des conditions expérimentales, en utilisant des tailles de groupes basées sur des travaux antérieurs et permettant des comparaisons statistiques. Du fait des expérimentations prévues, nous envisageons d'utiliser 50 rats.

Raffinement

Une méthode d’analgésie des animaux en pré- et post-opératoire sera réalisée par injection d’analgésique 30 minutes avant l’opération et une injection d’un AINS en post-opératoire. Après l’intervention, les animaux seront replacés en fratrie avec des conditions d’hébergement et un milieu d’enrichissement adaptés, favorables au bien-être de l’animal (litière avec copeaux de peuplier, tuyaux pour jouer).

Choix des espèces

Un test in vivo en site osseux chez le petit animal est indispensable, et constitue la première étape de la démarche scientifique du projet. Le défaut de calvaria chez le rat est un modèle largement utilisé au laboratoire BIOTIS, validé dans la littérature. C'est un modèle de choix pour étudier l’influence des cellules et biomatériaux sur la régénération osseuse. De plus, les cellules souches mésenchymateuses issus de tissu adipeux de rat sont bien décrites dans la littérature. Des modèles autologues ont déjà été utilisés et leur capacité à aider la réparation osseuse également. La souris n’est pas adaptée à la taille des matériaux et à la taille de défaut envisagé. Le lapin n’est pas envisagé pour des raisons de coût et à cause de sa fragilité. Nous avons choisi une souche de rat robuste et adaptée à nos besoins : les rats WISTAR. Nous utiliserons des animaux adultes (10 à 12 semaines). Cela permettra d’éviter que la croissance osseuse des animaux vienne interférer avec les processus de régénération.

385 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont affaiblies par quatre jours de Busulfan qui peut entraîner infections et perte de poids, reçoivent une greffe de cellules souches par injection derrière l'œil, puis passent des tests de mémoire nommés (piscine de Morris, labyrinthe en croix surélevé, open field). Le porteur évalue une thérapie cellulaire contre la maladie d'Alzheimer, dont il présente le bénéfice pour l'humain au conditionnel. Il justifie le modèle murin par l'absence de modèle in vitro reproduisant la perte de mémoire.

Objectifs

Notre objectif est de développer une nouvelle approche thérapeutique dans la maladie d'alzheimer (MA) visant à surexprimer deux protéines du métabolisme du cholesterol, en utilisant comme véhicule des cellules souches hématopoïétiques (CSH) de souris. Ces cellules peuvent en effet être génétiquement modifiées ex vivo par un vecteur lentiviral pour exprimer un gène thérapeutique. Elles peuvent être ensuite réinjectées chez l’animal (modèle de la MA), après un traitement qui détruit les CSH de la moelle. Les cellules ainsi injectées reconstitueront le système hématopoïétique des animaux hôtes et après passage de la barrière hématoencéphalique, pourront se différencier localement pour exprimer nos protéines d'intêrets. Ce projet a pour but d’évaluer le potentiel thérapeutique de cette approche dans le but de diminuer la pathologie liée à l’accumulation de l’amyloïde Beta.

Bénéfices attendus

Le projet permettrait de mieux caractériser les rôles des protéines d'intérêts dans la maladie d’Alzheimer. Si cette étude apporte des résultats encourageants, les bénéfices seraient de développer une approche thérapeutique potentielle permettant de traiter la MA chez l'humain. Cette approche permettrait une administration par voie intraveineuse de macrophages/monocytes purifiés et génétiquement modifiés obtenus à partir des CSH des patients eux-mêmes au lieu d'une greffe de CSH (qui est une technique invasive). Ces cellules élimineraient les protéines toxiques qui causent les symptômes de la maladie.

Procédures

Les animaux seront immunodéprimés par injection de Busulfan pendant 4 jours (l'injection dure 10 secondes par souris) puis recevront une greffe de cellules souches génétiquement modifiées par injection rétro-orbitale le jour d'après la dernière injection de Busulfan (l'injection dure moins de 2 min par souris, réalisée sous anesthésie gazeuse). Deux semaine après la greffe, une partie des animaux seront nourris avec de la nourriture spéciale (appelée PLX5622) permettant de dépleter la microglie du système nerveux central pendant 28 jours. Des prélèvements sanguins seront réalisés (1 fois par mois maximum avec un volume prélevé de 150 uL maximum et seulement si les souris pèsent plus de 20g, le prélèvement dure 2 min maximum par souris) sous anesthésie gazeuse pour vérifier la bonne prise de la greffe. Le premier prélèvement sera réalisé 2 mois après la greffe. Des tests comportementaux seront réalisés sur un des modèles murins de la maladie d'Alzheimer. Les tests commenceront 1 semaine après le prélèvement sanguin et s'étaleront sur 2 semaines. Pour la piscine de Morris, chaque essai dure maximum 1 min et chaque animal a 3 essai par jour pendant 5 jours. Le labyrinthe en croix surélevé et l'openfield durent 10 min chacun par souris et un seul essai est réalisé. L'euthanasie sera réalisée après les tests comportements, entre 6 et 7 mois d'âge.

Impact sur les animaux

Le conditionnement pré-greffe par injection de Busulfan 4 jours de suite affaibli les souris (perte de poids) et peut entrainer des infections. L’injection IV se fait dans le sinus rétro-orbitale se trouvant à l’arrière de l’œil. L’aiguille est donc insérée à côté de l’œil et l’œil n’a aucun dommage après l’injection (une lésion oculaire est possible mais rare). L’injection dure moins d’une minute. Nous avons préféré réaliser des injections rétro orbitale au lieu d’injection dans la veine caudale car cette dernière méthode est plus stressante que l’injection rétro orbitale (placement sous une lampe chauffante pour dilater la veine, contention mécanique). Les croquettes spécifiques n’entrainent aucun effet indésirable. Lors des prélèvements sanguins, les souris peuvent perdre beaucoup de sang. Les tests comportementaux peuvent être stressants et angoissants pour les animaux.

Devenir

A l'issue de nos deux procédures, les animaux sont euthanasiés pour récuperer les tissus post mortem pour réaliser des analyses histologiques et biochimiques.

Remplacement

Nous souhaitons utiliser un modèle animal (souris) car aucun modèle in vitro ou de culture cellulaire ne permet aujourd’hui d’étudier les symptômes de perte de mémoire typiques de cette maladie ainsi que la complexité des mécanismes neuronaux. De plus, la souris est un modèle d'alzheimer bien caractérisé tant d’un point de vue comportemental que biologique (marqueurs histologiques ou moléculaires) pour évaluer le bénéfice thérapeutique associé à notre approche. Pour ce faire, nous utiliserons au maximum 4 modèles de d'alzheimer déjà décrits.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est optimisé pour obtenir des résultats statistiques fiables. En effet, des travaux précédents ont permis de montrer que l’étude de groupes de 15 animaux par groupe permettait d’obtenir des résultats statistiquement significatifs en comportement, ainsi que dans les analyses biochimiques et de biologie moléculaire, réalisées sur de petits échantillons (1 hippocampe / souris). De plus, ce nombre d’animaux prend en compte la mortalité spontanée, ayant cours du fait du phénotype, particulièrement chez les APP/PS1 De9 (perte d’environ 10% dans un groupe APP/PS1 De9 non traité), et de l’âge des souris. Ainsi, dans ce projet, nous prévoyons un total de 385 souris. Des tests statistiques seront ensuite réalisés sur les résultats obtenus pour avoir une interprétation fiable de ces résultats.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation (annexe III de la directive 2010/63/EU), les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (avec mise au point de points limites) et des soins adaptés si besoin. Les animaux sont hébergés en groupe avec un coton pour faire un nid dans chaque cage. Les animaux sont hébergés en groupe de 5 dans des cages ventilées. Les animaux sont examinés quotidiennement par les expérimentateurs et par le personnel de l'animalerie. Si nécessaire et en cas d'agressivité des mâles, les animaux seront séparés. Tous signes d’inconfort ou de détresse, tels que l'apparence (poil ébouriffé, dos courbé, perte excessive de poils) et un comportement anormal (agressivité soudaine, inactivité, vocalisation et mutilation, isolement, diminution de l’appétit), feront l’objet d’une surveillance accrue et d’un isolement en cas de besoin. Les critères absolus (état de choc, léthargie, inconscience, immobilité, forte hypothermie, difficultés respiratoires) entraîneront l’euthanasie. Toutefois, les critères absolus ne devraient pas être mis en évidence aux vues des procédures utilisées. Pour les chirurgies, les animaux bénéficieront d’une anesthésie générale et en prévention de la douleur un antidouleur sera administrer. Une nouvelle injection sera administrée à l’animal le lendemain matin. Un gel ophtalmologique est appliqué sur les yeux des animaux pour éviter l’assèchement de la cornée durant l'anesthésie. Les animaux ayant subi une chirurgie seront observés quotidiennement la semaine suivant la chirurgie avec une attention particulière.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l'espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son anatomie, sa physiologie et la génétique sont bien connues et sont relativement proches de celles de l’Homme. De plus, les méthodes pour la manipulation génétique de ces animaux sont les plus développées. La nécessité d'utiliser des souris transgéniques est liée à l'absence de tout mutant spontané dans une espèce de mammifères qui correspond à la maladie humaine. Nous avons prévu d’utiliser au maximum 4 modèles animaux de la MA ayant tous des avantages à leur utilisation afin de valider notre approche thérapeutique dans ces modèles. Pour les souris APP/PS1 : jeunes adultes de 2 mois pour réaliser la greffe avant l’apparition du phénotype (plaques Ab). Pour les souris THY-Tau22 : jeunes adultes de 2 mois pour réaliser la greffe avant l’apparition du phénotype (protéines Tau). Pour les souris APP23 : jeunes adultes de 2 mois pour réaliser la greffe avant l’apparition des symptômes cognitifs.

1 680 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une chirurgie inocule un peptide amyloïde dans leur cerveau pour provoquer une perte de mémoire, puis elles reçoivent un traitement combiné et passent des tests comportementaux, dont un test d'évitement où elles subissent un choc électrique. Le porteur vise une combinaison de molécules contre la maladie d'Alzheimer, à tester ensuite chez l'humain. Il présente le modèle murin comme "indispensable", seul recours in vivo reproduisant les symptômes.

Objectifs

Trouver un traitement contre la maladie d’Alzheimer (MA) est aujourd’hui une priorité. Cependant la MA étant une maladie multi-cible les chercheurs s’accordent à dire qu’un seul traitement ciblant une des nombreuses cibles de la MA ne sera pas suffisant et qu’une combinaison de plusieurs molécules serait plus efficace afin d’obtenir un effet thérapeutique. La combinaison de la mémantine ainsi que du Donepezil reste aujourd’hui un des traitements utilisés chez les patients atteints de la MA et ce malgré une efficacité remise en doute depuis plusieurs années par la communauté scientifique. Il est donc primordial de tester d’autres molécules de manière combinée sur un modèle de la MA afin de pouvoir un jour procéder au développement clinique d’un traitement combinatoire.

Bénéfices attendus

Le projet a pour but de mettre en avant un effet combinatoire de diverses molécules afin de contrer les symptômes de la maladie d'Alzheimer. Les combinaisons efficaces testées sur le modèle murin auront pour but finale d'être testé en clinique chez l'homme.

Procédures

Les animaux auront au cours de leur vie une chirurgie permettant l'inoculation du peptide amyloide 25-35 dans le ventricule cérébral droit. Cette intervention est d'une durée de 7 minutes maximun entre le début de l'anesthésie à l'isoflurane et la fin de l'innoculation du peptide amyloide. Ensuite durant 7 jours les animaux recevront une injection intrapéritonéale du traitement combinatoire mis en place. Suite à ce traitement les performances mnésiques des animaux seront testées, avec des tests comportementaux.

Impact sur les animaux

Un certain stress lié à la procédure chirurgicale et aux injections pourra être engendré. Une perte mnésique voulu, et dû à la diffusion du peptide amyloide dans le cerveau sera également observé. Durant le test comportemental d'évitement passif, les animaux recevront un choc électrique léger, (0.3 mA pendant 3 sec) afin d'évaluer leur performance mnésique.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de récupérer le cerveau et procéder à des tests biochimiques post- mortem.

Remplacement

L’utilisation de modèles murins de la MA pour ce projet est indispensable car ces modèles sont le seul recours « in vivo » autre que l’humain à présenter les symptômes pathologiques de la MA dans une fenêtre de temps relativement courte.

Réduction

Les analyses statistiques adaptées aux données générées permettront de limiter le nombre d'animaux par groupe (12 souris/groupe). Une veille bibliographique sera également prise en compte durant les 5 années du projet. Plusieurs structures du cerveau seront prélevées dans cette étude afin de concentrer un maximum d’échantillons et éviter ainsi de relancer des expérimentations.

Raffinement

Nous procéderons à l’enrichissement du milieu avec un accès à des maisons en cartons et des carés de cotons afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. L’état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière en suivant la courbe de poids des animaux. Dans le cas où le traitement pharmacologique serait à l’origine de douleur visible ou de détresse le traitement serait interrompu et si nécessaire la mise à mort de l’animal serait anticipée. Ce sera le cas lorsque l'animal perdra 20% de son poids de départ ou lorsque celui-ci présentera des lésions cutanées signe d’un stress ou d'une agressivité vis à vis de ses congénères. Les animaux seront aussi manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien que peut représenter la présence de l'expérimentateur

Choix des espèces

Afin de mimer rapidement les symptômes de la maladie d'Alzheimer en vue d'un traitement curatif, la souris reste à ce jours le modèle se rapprochant au plus près de l'homme. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte soit à partir de 6 semaines.

564 souris, dont des souris génétiquement modifiées, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des analyses post-mortem, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales leur sont greffées sous la peau du flanc sans anesthésie, puis elles reçoivent sous anesthésie de moins de cinq minutes une à trois injections d'un agent que le porteur dit "non douloureux". Selon les groupes, leurs macrophages sont éliminés, ce qui peut provoquer diarrhées, déshydratation et perte de poids pendant six jours dans l'un des protocoles, et une nécrose peut apparaître sur la tumeur en fin d'expérience. Le porteur écrit avoir "besoin impérativement" d'expériences in vivo, et prévoit que certaines n'auront lieu que si les premières donnent des "résultats intéressants", ce qui fait de l'effectif de 564 un plafond.

Objectifs

Au cours de la tumorigénèse, la matrice extracellulaire, qui constitue l’architecture de tout tissu, est profondément modifiée, contribuant à la progression tumorale en limitant l’accès des cellules immunitaires à l’intérieur de la tumeur, et en favorisant les métastases. Les macrophages sont des cellules immunitaires qui peuvent avoir des effets pro- ou anti-tumoraux, et sont capables de modifier la matrice extracellulaire. Notre projet étudie dans un premier temps le rôle des macrophages dans la modification de la matrice tumorale, pour évaluer, à terme, leurs effets sur la réponse immunitaire naturelle et sous immunothérapie. En particulier, notre projet vise à comprendre comment les propriétés physiques de la matrice influencent l’infiltration des cellules immunitaires, et le rôle que jouent les macrophages dans ce processus.

Bénéfices attendus

Ce projet va contribuer à une meilleure compréhension du dialogue entre cellules tumorales, cellules immunitaires et matrice extracellulaire, 3 acteurs centraux de la tumorigénèse. Les modèles expérimentaux choisis permettront d’obtenir des connaissances fondamentales sur les tumeurs solides et la réponse immunitaire contre celles-ci. Ce projet pourrait permettre à terme d’améliorer les stratégies d’immunothérapies par anticorps ou cellules CAR-T.

Procédures

1-Greffe de cellules tumorales en sous cutanée : 1 seule fois par animal, sur animal vigile, puis injections d’un agent non douloureux par voie intra-péritonéale sous anesthésie. 3 injections par animal (durée de l'anesthésie inférieure à 5 min) 2- Greffe de cellules tumorales en sous cutanée : 1 seule fois par animal, sur animal vigile, puis injection d’un agent non douloureux par voie intraveineuse sur animal anesthésié. 1 injection par animal (durée de l’anesthésie inférieure à 5 minutes)

Impact sur les animaux

Nous injectons au niveau du flanc des souris des tumeurs sous-cutanées plus ou moins résistantes aux immunothérapies, puis déplétons ou non les macrophages. L’expérience dure entre 9 et 15 jours. Nos observations se font à des temps précoces de la tumorigénèse, la taille de la tumeur reste modérée et ne gêne pas les déplacements de l’animal. Une nécrose peut apparaitre sur la tumeur en fin d’expérience. Le traitement pour la déplétion des macrophages peut provoquer des diarrhées et une déshydratation, pouvant entrainer une perte de poids pendant la durée de la déplétion dans un des modèles (6 jours)

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem

Remplacement

Des études in vitro ont montré l’importance de la matrice extracellulaire dans la tumorigénèse. Afin d’évaluer l’effet des macrophages et de la matrice extracellulaire sur la réponse immunitaire, nous avons besoin impérativement de réaliser des expériences in vivo pour avoir une tumeur, un stroma et un système immunitaire complets.

Réduction

Chaque tumeur sera coupée en 2 échantillons afin de réaliser plusieurs analyses sur la même tumeur pour permettre de réduire le nombre d’animaux utilisés. Cela permet également de corréler les résultats des différentes analyses pour chaque tumeur et de pouvoir mieux analyser les raisons potentielles d’hétérogénéité inter-souris. Par ailleurs, certaines expériences ne seront réalisées que si les expériences précédentes donnent des résultats intéressants (différences de matrice extracellulaire et / ou d’infiltrat immunitaire).

Raffinement

En accord avec les recommandations internationales dans le domaine de la cancérologie, les animaux sont suivis attentivement (mesure de la tumeur, poids, aspect et comportement) afin de détecter tout signe de souffrance ou d’angoisse, et d’assurer leur bien-être, et les expérimentations sont arrêtées avant la souffrance des animaux. Les animaux seront sacrifiés en cas d’atteinte des points limites. Du gel nutritif et hydratant sera donné en complément de l’alimentation habituelle afin de faciliter la prise alimentaire, et limiter la perte de poids et la déshydratation qui peuvent être causés par les traitements pour la déplétion des macrophages. En cas de déshydratation, une réhydratation parentérale sera réalisée. En cas d’inflammation cutanée ou de nécrose superficielle des tumeurs, de la crème hydratante et cicatrisante sera appliquée.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en immunologie et recherche en thérapeutique anti-cancéreuse. La forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins en font un modèle idéal. Par ailleurs, nous utilisons des modèles murins génétiquement modifiés déjà développés et bien caractérisés qui sont les plus adaptés à ce projet. Les souris seront utilisées entre 8 et 16 semaines, afin d’avoir un système immunitaire adulte.

15 920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'anomalies squelettiques qui se dégradent avec l'âge au point de gêner leur alimentation, elles reçoivent des injections et jusqu'à six prélèvements sanguins avant l'analyse de leurs organes, pour évaluer une biothérapie contre un groupe de maladies rares des os. Le porteur qualifie lui-même le bénéfice pour les patients d'"éventuel à long terme". Il conclut que le recours au modèle murin est "inévitable".

Objectifs

L’objectif de ce projet est de développer un nouveau traitement pour une famille de maladie des os. En effet, il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement curatif pour ce groupe de maladie. Les seules approches thérapeutiques actuellement utilisées sont des approches palliatives et seulement pour certains symptômes de la maladie.

Bénéfices attendus

Ce projet va nous permettre d'évaluer un traitement pour cette famille de maladie. Il s’agit d’un groupe de maladies rares sévère pour laquelle à l’heure actuelle il n’existe aucune approche thérapeutique. Dans le cas où cette approche fonctionnerait cela nous permettrait de continuer le développement dans le but d’apporter un jour un traitement efficace pour les patients. Il s’agit donc d’un bénéfice éventuel à long terme pour ces patients.

Procédures

Les animaux sont soumis à des injections de traitement (30 secondes), ainsi que des prélevements de sangs (5 minutes). Les prélèvements de sang sont sur animal anesthésié et un animal aura maximum de 6 prélèvements dans sa vie. Les animaux auront également une biopsie d'oreille pour déterminer s'ils sont porteurs de la maladie (20 secondes).

Impact sur les animaux

Le modèle de souris utilisé dans ce projet présente des anomalies squelettiques qui se dégradent avec le temps et les empêchent de s’alimenter normalement lorsque les animaux sont âgés (environ 12 mois). Ces altérations sont caractéristiques de la maladie.

Devenir

​Tous les animaux seront euthanasiés. En effet, le projet nécessite d'étudier la structure des organes afin de vérifier l'efficacité du traitement testé et cela ne peut se faire que sur animal euthanasiés.

Remplacement

​Globalement, la construction des traitements et l’optimisation de ces derniers se sont faites et continuent à se faire en se basant sur des publications scientifiques, et sur un certain nombre de tests in vitro réalisés. Les différents vecteurs viraux produits sont précédemment testés in vitro afin de valider leur efficacité. Une importante recherche bibliographique a été effectuée afin d’identifier les cellules atteintes lors de la pathologie et ainsi développer un traitement le plus ciblé possible. Cependant l’utilisation du modèle murin de la maladie est inévitable afin de déterminer le bénéfice thérapeutique ainsi que d’évaluer les potentiels effets toxiques du traitement.

Réduction

​Le juste nombre d’animaux a été calculé de manière à réduire le nombre minimum d’animaux par lot, tout en produisant des résultats statistiquement significatifs et robustes. De manière à répondre aux exigences de réduction, nous allons utiliser des groupes contrôles en commun chaque fois que cela est possible. Globalement, un ensemble de 10-12 animaux par groupe sera suffisant pour valider l’efficacité d’un traitement. Ce modèle étant un nouveau modèle de souris, il est possible que ce nombre soit amené à changer au cours des études et des différents résultats obtenus.

Raffinement

​Les animaux sont hébergés en groupe à maximum 5 par cage. Chaque cage contient une tige en papier, un igloo et une buchette de peuplier afin de satisfaire l’instinct naturel des souris à ronger et éviter les malocclusions des incisives. Le suivi quotidien (weekends et jours fériés inclus) des animaux par le personnel de l’établissement utilisateur et les visites régulières des expérimentateurs (à minima trois fois par semaine) nous permettront de déceler précocement tout signe de souffrance ou d’angoisse et nous appliquerons strictement les points limites définis. En cas d'altération de l'état de l'animal, la surveillance sera rapprochée et les animaux seront soignés en fonction de la sévérité de la douleur observée. Les procédures mises en place dans ce projet ne nécessitent aucune analgésie particulière. En cas d'apparition d'une souffrance ou toxicité inattendue, les animaux seront exclus de l'étude et mis à mort dans les 24 heures avec l’accord du directeur d’étude et/ou d’un vétérinaire.

Choix des espèces

Ce projet ne peut pas se faire sans modèle animal car avant de pouvoir envisager un traitement, et de commencer une étude clinique sur les patients souffrant d’Aggrecanopathies, il est nécessaire de démontrer que les molécules choisies ont l'effet attendu au niveau du modèle animal de la maladie, et qu'elles ne présentent pas d'effets toxiques majeurs. Ce modèle de souris est pertinent car il est connu pour mimer les principales caractéristiques de la pathologie. Les animaux seront utilisés de la naissance jusqu’à environ 52 semaines maximum afin de pouvoir caractériser chacune des étapes du développement de la pathologie.