Procédures modérées

320 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue par exsanguination sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont immunisés puis subissent des prélèvements sanguins répétés pendant 11 à 24 mois, pour produire des anticorps destinés à la transplantation et à la cancérologie. Le porteur, une société privée, décrit une plateforme de production commerciale de sérum. Il justifie le choix du porc par le volume de sang collecté, un animal remplaçant selon lui plus de cent petits animaux comme le lapin.

Objectifs

L'objectif de ce programme est de produire des anticorps polyclonaux glyco-humanisés porcins anti-cellules tumorales, pour des applications de développement clinique en transplantation et en cancérologie.

Bénéfices attendus

Contrairement à d’autres espèces animales, l’être humain et certains primates non humains n’expriment pas les enzymes alpha-1,3-galactosyl-transférase (GGTA1) et cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase (CMAH), responsables respectivement de la synthèse de motifs alpha 1,3-galactose (Gal) et acide N-glycolyl-neuraminique (Neu5Gc) à la surface cellulaire. Il existe naturellement chez l’homme des anticorps dirigés contre ces xéno-antigènes Gal et Neu5Gc. Ainsi l’administration d’anticorps d’origine animale entraine habituellement l’apparition d’effets délétères (maladie sérique et allergie) du fait de la présence de ces xéno-antigènes. Nous avons développé une plate-forme de sérothérapie passive originale permettant la production d’anticorps polyclonaux glyco-humanisés (GH-pAb), issus d’animaux modifiés génétiquement, knock-out pour GGTA1 et CMAH. Nos anticorps polyclonaux glyco-humanisés présentent un certain nombre d’avantages : 1- une absence d’effets xénogéniques délétères (allergies et maladie sérique), 2- une efficacité lytique accrue vis-à-vis des cellules ciblées, 3- une activité anti-inflammatoire dûe à l’absence d’interaction entre le fragment Fc des IgG porcines et les RFc humains (CD16, CD32, CD64). 4- une spécificité démontrée par une série d’analyses histologiques sur tissus humains.

Procédures

Prélèvements de sang sous analgésie (animaux à moins de 120 kg de poids vif) sur 25% des animaux (catégorie des porcs entre 70- 120 kg de poids vif). La procédure de prélèvement sous analgésie a une durée de : - 5 minutes pour l’administration injectable en i.m. ; - 5 minutes pour le temps d’attente de l’effet de l’analgésie et - 5 minutes de prélèvements avec les préparations, soit un total de 15 minutes / porc. Prélèvements de sang sur des animaux sous analgésie et anesthésie gazeuse. Immunisations des animaux sous analgésie et anesthésie gazeuse sur 75% des animaux (catégorie des porcs entre 120 - 200 kg de poids vif). La procédure de prélèvement sous analgésie avec une anesthésie gazeuse a une durée de : - 5 minutes pour l’administration injectable en i.m. ; - 5 minutes pour le temps d’attente de l’effet de l’analgésie ; - 10 minutes pour l’administration injectable en i.m. de l’anesthésique et le branchement de masque pour l’anesthésie gazeuse - 5 minutes de prélèvements avec les préparations, - 10 minutes de réveil soit un total de 35 minutes / porc. *Il est à noter que plusieurs animaux peuvent être manipulés en même temps (5 porcs par équipe de 3 techniciens). Les temps pris par les procédures vont s’intercaler ce qui permet aux opérateurs de réduire le temps global des procédures.

Impact sur les animaux

Les nuisances provoquées par les prélèvements ou les vaccinations sont inclues dans la catégorie modérée selon la référence : Arrêté du 1er février 2013 relatif à l’évaluation éthique et à l’autorisation des projets impliquant l’utilisation d’animaux dans des procédures expérimentales - Exemples de différents types de procédures expérimentales définies selon chaque classe de gravité sur la base de facteurs liés au type de procédure expérimentale : a) Application fréquente de substances d’essai produisant des effets cliniques modérés et prélèvements d’échantillons sanguins (> 10 % du volume sanguin) chez un animal conscient pendant quelques jours, sans reconstitution du volume sanguin ;

Devenir

A la fin du programme d’immunisation, une exsanguination finale (euthanasie) sera effectuée sous anesthésie profonde afin de collecter le maximum de sérum hyper-immun qui sera ensuite utilisé pour la production de substance médicamenteuse. L'euthanasie des animaux sera effectuée à la fin du programme ou en cas de développement d’une non-réponse aux vaccinations par surdose d'anesthésie ou T 61.

Remplacement

Plusieurs laboratoires ont cherché à remplacer la production d’anticorps polyclonaux (pAbs) à partir d’animaux donneurs par une production in vitro, recréée en bioréacteur à partir de l’information génétique extraite des donneurs et triée par phage-display. Cependant, malgré plus d’une décennie de R&D, les systèmes de production de pAbs in vitro n’ont pas permis d’atteindre les rendements requis pour la production de lots cliniques. En outre, ce type d’anticorps n’est pas disponible actuellement en Europe et ne pourrait pas couvrir les besoins des patients européens, sans préjuger du prix de ce type de produit. De plus, le remplacement des pAbs rendant actuellement des services thérapeutiques essentiels (existant principalement dans les domaines de l’envenimation, de la transplantation et de l’anémie aplastique sévère) par des produits obtenus in vitro nécessiterait un développement complet, passant par une nouvelle recherche pré-clinique (chez l’animal) et clinique, chez des patients qui pourraient être aussi privés du traitement incluant de nouvelles phases 1, 2 et 3. Il s’agit typiquement d’un travail prenant plusieurs années (de quelques années à 10 ans).

Réduction

Le choix du porc comme espèce pour l’immunisation nous permet de réduire le nombre d’animaux vaccinés par rapport à d’autres espèces habituellement utilisées (comme le lapin), du fait du volume important de sérum pouvant être collecté sur un animal dans le respect des règles éthique. Un porc peut ainsi produire autant de sérum que plus de 100 petits animaux. Dans le cadre du projet en cours de Xenothera dans la COVID-19, un animal fournissait suffisamment d’IgG pour traiter 1000 patients. Aucun test statistique ne soutient cette comparaison qui est évidente eu égard à la différence de taille bien connue entre ces espèces (un porc pesant en moyenne 110 Kg). En outre, le porc est maintenu en vie pendant une période de 11 à 24 mois, alors que les protocoles de prélèvement de sérum sur petit animal comprennent en général une à 2 prises de sang. Ces 2 facteurs justifient les différences importantes dans le nombre d'animaux nécessaires pour collecter une quantité identique de sérum, lorsque des porcs sont choisis et non des petits animaux (tels que des lapins).

Raffinement

Les conditions d’hébergement, l’enrichissement, les procédures de renforcement positif (jus de pomme) et le suivi des animaux par les animaliers et le vétérinaire, ainsi que les procédures analgésiques sont mises en place pour prévenir la douleur, et respecter le bien-être animal. Les animaux vont profiter de plusieurs éléments de matériaux manipulables pour pouvoir manifester leur comportement naturel de fouissement, de recherche de nourriture et environnemental. Les animaux dans le bâtiment spécialisé porc doté d’une climatisation et chauffage spécifique pour chaque catégorie, vont bénéficier de l’accès à la paille dans des nourrisseurs spécifiques pour compléter l’apport des fibres nécessaires en plus de la nourriture et avoir la possibilité de manifester leur capacité de fouissement. Plusieurs jouets vont être rajoutés dans les cases de chaque catégorie : brosses pour les reproducteurs, chaines avec des balles, tasseaux de bois attachés des parois, objets en caoutchouc mâchonnables spécifiques pour le porc. Un arbuste dans un pot va compléter l’environnement de chaque salle des animaux en procédure. Au cours de la semaine de la mise-bas, les truies et les cochettes vont recevoir des matériaux de nidification en quantité suffisante (sacs de jute, journaux, sciure de bois) pour le calme des animaux et l’amélioration des mises bas. Les truies et les cochettes vont mettre bas dans des cages spécifiques « liberté » qui permettent de bloquer les truies pendant les 72 h autour de la mise bas pour éviter l’écrasement des porcelets. Ensuite les animaux vont être libérés et avoir la possibilité de bouger dans toute la case de 6.5 m² pour pouvoir s’occuper des leurs porcelets jusqu’au sevrage.

Choix des espèces

Le porc, de par son poids important, permettra de récolter un volume optimisé de sérum sur un nombre plus réduit d’animaux. Ainsi, un animal vacciné à l’âge de 5 mois, avec une vaccination itérative maintenue pour une période de 11 mois consécutifs, peut produire suffisamment d’IgG pour soigner de 100 à 1000 patients (en fonction de la dose administrée dans les indication de Transplantation ou d’oncologie). Les porcelets sont élevés puis immunisés à partir d’un minimum de 5 mois d’âge (> 70Kg). Les sérums hyper-immuns seront prélevés sur des porcs par prises de sang répétées 35 jours après la première vaccination dans le respect des normes éthiques de volume et de fréquence de prélèvement : Arrêté du 1er février 2013 relatif à l’évaluation éthique et à l’autorisation des projets impliquant l’utilisation d’animaux dans des procédures expérimentales - Exemples de différents types de procédures expérimentales définies selon chaque classe de gravité sur la base de facteurs liés au type de procédure expérimentale : a) Application fréquente de substances d’essai produisant des effets cliniques modérés et prélèvements d’échantillons sanguins (> 10 % du volume sanguin) chez un animal conscient pendant quelques jours, sans reconstitution du volume sanguin ;

1 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont anesthésiées trois fois par semaine pendant quatre semaines et leur cavité buccale est colonisée par la levure Candida albicans, pour mettre au point un modèle d'infection oropharyngée. Le porteur, une société de biotechnologie, présente ce modèle comme un service destiné à ses clients pour tester des composés. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la réponse immunitaire de l'hôte.

Objectifs

La forme la plus fréquente de candidose est une infection superficielle de la bouche, du vagin ou de la peau, qui provoque l’apparition de plaques blanches ou rouges, et un prurit (démangeaisons), une irritation, ou les deux. Les patients immunodéprimés peuvent présenter de très graves atteintes au niveau de l’œsophage ou d’autres organes. Le projet consiste à développer un modèle pré-clinique prédictif afin de tester de nouvelles drogues en développement contre les infections oropharyngées à Candida albicans.

Bénéfices attendus

Notre société de biotechnologie possède une plateforme scientifique dédiée à la validation de nouveaux composés et thérapies pour ses programmes de R&D et ses clients. Le développement de ce nouveau modèle pré-clinique permettra de répondre aux attentes de différents clients et contribuera au développement de thérapies anti-infectieuses innovantes.

Procédures

S'il est prévu d'analyser les animaux après nécropsie uniquement, des prélèvements uniques de sang pourront être réalisés sous anesthésie

Impact sur les animaux

-anesthésie 3 fois par semaine pendant 4 semaines. -écouvillonnage de la cavité buccale et de la langue avec un écouvillon enduit de levure C. albicans -établissement d'une colonisation de la cavité buccale par la levure -traitements par différentes voies d'administration (per os, ip, iv, in).

Devenir

A la fin de la procédure tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever et analyser les organes d'intérêt.

Remplacement

Le recours à l’animal de laboratoire se justifie dans le sens où l’efficacité in vivo d’un composé sur une infection résulte non seulement de l’effet de ce dernier sur les micro-organismes mais également de la réponse du système immunitaire de l’hôte sur ces agents pathogènes. Il n’existe aucun modèle in vitro mimant de façon précise ces interactions complexes.

Réduction

Une attention toute particulière est portée sur le nombre d’animaux utilisés dans le projet. Nous travaillons avec une compagnie spécialisée dans les biostatistiques. Cette collaboration nous permet d’utiliser le nombre strictement nécessaire pour chaque expérience et de l’optimiser durant toute la durée du projet.

Raffinement

L'accent sera mis sur les conditions d’hébergement (soins, enrichissement du milieu) des animaux dans le but d’augmenter autant que possible leur bien-être. Planification du protocole de façon à éviter les perturbations susceptibles d'affecter le bien etre des animaux. Recourir à l’anesthésie. Utilisation de procédures d’euthanasie appropriées.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est la souris (Mus musculus). Les modèles souris sont largement utilisés par les équipes de Recherche publique et privée dans le traitement des maladies infectieuses: Souris agées de 49-55 jours, afin de reproduire un modèle déjà décrit dans la littérature.

30 souris déficientes en Tafazzine vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des échocardiographies sous anesthésie, des tests d'effort sur tapis roulant puis un prélèvement terminal du cœur, pour caractériser un modèle du syndrome de Barth. Le porteur reconnaît que ce projet ne teste aucun traitement et prépare seulement une future demande. Il justifie le recours à la souris par l'incapacité des modèles cellulaires à reproduire un "organisme tout entier".

Objectifs

Dans cette Demande d'Autorisation de Projet, nous voulons caractériser finement le modèle souris du Syndrome de Barth en terme de suivi de poids, d'endurance, et de fonctionnement mitochondrial et cardiaque. Cette caractérisation permettra de mettre en avant des défauts du modèle souris qui serviront dans une future demande d'Autorisation de Projet où nous testerons la capacicté de candidats médicaments à supprmier ces défauts (dans l'optique de proposer un médicaments à des patients atteints du syndrome de Barth). Ce projet est conçu pour permettre le déroulement des procédures expérimentales de tests de composés médicaments, à suivre, dans les conditions les plus respectueuses de l’animal et de l’environnement.

Bénéfices attendus

Avant de tester des candidats médicaments, il est nécessaire de caractériser la lignée murine, modèle du syndrome de Barth, dans nos animaleries afin de vérifier les meilleurs paramètres pour les futurs tests médicamenteux. Cela n'a jamais été fait auparavant de manière détaillée. La caractérisation du modèle souris au niveau du poids, du comportement, de la force musculaire ainsi que les analyses sur échantillons d'urine, de sang et d'organes seront réalisées dans une Demande d'Autorisation de Projet en cours. La présente demande d'Autorisation de Projet permet d'aller plus loin dans la caracterisation du modèle souris en réalisant échocardiogrammes et tests d'effort et d'endurance sur des appareillages uniquement présents dans une autre animalerie que celle où sont produits les animaux.

Procédures

pas de procédures chirurgicales sur animaux vivants. - échocardiographies - tests d'endurance sur tapis roulant - prélèvements terminaux du coeur sur animaux sacrifiés

Impact sur les animaux

Les caractéristiques du phénotype dommageable décrites par nos collaborateurs sont les suivantes : poids inférieur de 20 à 25% dès la naissance, défaut au niveau des ventricules cardiaques (plus fins : fonctions diastolique et systolique réduites), défaut au niveau de la morphologie des mitochondries (augmentation de la taille, baisse dans la densité des crêtes). Les nuisances/effets indésirables causés par les expérimentations (manipulations/gestes expérimentaux sur l'animal) sont classées de sévérité modéré. L'analyse échographique nécesite une analyse sous anesthésie. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données échographiques. Le suivi des performances sur tapis de course teste les capacités motrices de l'animal vigile. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données de la course.

Devenir

Euthanasie de tous les animaux en fin de cinétique pour prélèvements terminaux du coeur. Afin d'utiliser au maximum tous les animaux, des prélèvements de coeurs seront effectués pour des analyses qui permettent d'évaluer l'état et le fonctionnement des mitochondries de coeurs. Si des défauts sont mis en avant chez la souris modèle du syndrome de Barth par rapport à la souris sauvage, nous pourrons par la suite, dans une prochaine demande d'Autorisation de Projet, tester la capacité des candidats médicaments à supprimer ces défauts.

Remplacement

Nous utilisons des modèles cellulaires eucaryotes pour répondre à certaines questions, cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que les mécanismes impliqués dans le syndrome de Barth, puisqu'elles ne tiennent pas compte de l’ensemble des interactions existantes au sein d’un organisme tout entier. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro mais également pour procéder aux essais cliniques chez l'homme.

Réduction

Seules les expériences indispensables seront réalisées. Il n'y aura pas de répétition inutile d'expérience. Le nombre d'animaux nécessaire a été réduit au minimum, tout en permettant de garantir l’analyse statistique des résultats. Les mêmes animaux seront utilisés dans toutes les expérimentations de la procédure . Des travaux antérieurs ont montré des écarts types importants pour les différents paramètres analysés. Cette variabilité impose de travailler avec des effectifs minimum de 12 animaux par groupe. Afin de palier une éventuelle mort prématurée des animaux (suite à une blessure par exemple), nous prévoyons 25% d’animaux en plus, soit 15 souris par groupe. Une analyse statistique adaptée des résultats sera réalisée.

Raffinement

Les animaux seront surveillés quotidiennement par le personnel compétent grâce à la grille de score des points limites. Le poids sera suivi 2 fois par semaine. Si un animal montre un problème de comportement, de locomotion ou autre (hors point limite), des mesures conservatoires seront prises: nourriture mouillée dans la cage, biberon à longue tétine, isolement si nécessaire jusqu'à ce qu'une amélioration soit observée. Si au bout de 48h aucune amélioration n'est constatée alors l'animal sera mis à mort. Points limites attendus: - poids des mutants est inférieur de 20 à 30% dès la naissance : si on dépasse les 25% d'écart l'animal sera euthanasié - défauts ventriculaires: si on observe une tachycardie, une bradycardie, une arythmie ou une fréquence respiratoire anormale, l'animal sera euthanasié par la dislocation cervicale pour ne pas attendre et laisser souffrir l’animal. - points limites spécifiques à chaque geste développés dans chaque procédure.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : - animal de petite taille, facile à héberger et à contentionner - modèle idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours), - 6 à 15 souriceaux par portée - modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99% d'homologies entre son génome et le génome humain - modèle très bien maitrisé en terme de manipulation génétique. Les animaux seront élevés jusqu'au sevrage dans l'animalerie de production puis envoyés à l'animalerie où se feront les expérimentations de la présente DAP juste après le sevrage et utilisés durant 6 semaines. En effet le déficit de poids se voit normalement dès la naissance, il est donc intéréssant de corréler ce déficit avec d'autres phénotypes délétères (fonctions cardiaques et test à l'effort/endurance). Avant d'utiliser les animaux nous attendons qu'ils soeint sevrés.

20 000 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des molécules à tester en administration unique ou répétée jusqu'à quinze jours, puis sont tués dans les quatre heures pour prélever des structures cérébrales et en mesurer les neuromédiateurs. Le porteur indique que les composés peuvent provoquer prostration, hyperlocomotion, perte de poids, stéréotypies, agressivité voire convulsions, auquel cas les animaux sont écartés et tués. Il justifie le recours au rongeur par la "nécessité" d'un système nerveux "intègre" pour évaluer les molécules.

Objectifs

La communication entre les différentes cellules du système nerveux central s’effectue via la libération de molécules, des neuromédiateurs, se liant à des récepteurs localisés sur les cellules cibles. Les nouveaux composés à tester, agissent sur ce système de transmission entre cellules nerveuses en activant ou inhibant la libération de neurotransmetteurs, en activant ou bloquant les récepteurs cibles. Afin de connaitre l’action de nos nouveaux composés sur l’activité de ces systèmes neurochimiques nous avons besoin d’évaluer les contenus en neuromédiateurs (dopamine, noradrénaline, acétylcholine, histamine…) et leurs métabolites (molécules résultant de leur dégradation) dans le cerveau ou des zones particulières du cerveau (hippocampe, hypothalamus, striatum, cortex…) de rongeurs. Pour ce faire nous avons besoin d’administrer nos composés à des rongeurs afin d’observer leurs effets sur les contenus en différents neuromédiateurs cérébraux.

Bénéfices attendus

La technique de neurochimie va permettre d'orienter la recherche de nouvelles molécules à visée thérapeutique - en permettant de vérifier leurs actions positives sur des systèmes neurochimiques connus pour être défaillants dans certaines pathologies psychiatriques (trouble du sommeil, dépression, anxiété, schizophrénie...). - au contraire en vérifiant leur absence d'effet délétère sur certains systèmes neurochimiques pouvant être impliqués dans des effets indésirables (addiction, hypolocomotion...). - en aidant la chimie médicinale à déterminer les familles de molécules ayant le plus d'activité sur un système neurochimique ciblé et à optimiser le(s) composé(s).

Procédures

Les animaux vont recevoir une administration aigüe ou chronique (maximum 15 jours, deux fois par jour) de molécules à tester. La mise à mort se fera au maximum 4 h après la dernière administration de composé.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues lors de ce protocole sont celles liées à l'administration du produit à tester et à son éventuelle toxicité. Les nouvelles molécules ont déjà passé une batterie de tests in vitro qui permet de sélectionner les molécules les plus sélectives et sans effet sur certaines cibles pouvant être à l'origine d'effet non désiré. Les effets indésirables liés aux produits testés pourront être une prostration ou une hyperlocomotion, une perte de poids (si traitement chronique), des stéréotypies, de l'agressivité voir des convulsions. Si ces signes sont détectés, les animaux sont écartés de l'expérimentation et euthanasiés.

Devenir

L'euthanasie des animaux est nécessaire afin de prélever les différentes structures centrales d'intérêt.

Remplacement

L’utilisation de souris ou de rats pour les mesures de neurochimie est justifiée par la nécessité de pouvoir déterminer les effets de nouvelles molécules sur un système nerveux intègre. En effet, le fonctionnement neurochimique du cerveau est particulièrement complexe avec de nombreuses interactions entre les différents systèmes neurochimiques des différentes régions du cerveau.

Réduction

Les tests de plusieurs molécules pourront être groupés afin de n'utiliser qu'un seul groupe témoin et le cas échéant un groupe testant les effets de molécule(s) de référence. Une prise en compte des données de pharmacocinétique dans le choix de doses et le(s) temps d'euthanasie post administration sera effectuée. Les résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques adaptés.

Raffinement

L'euthanasie des animaux est réalisée dans une pièce séparée de la pièce de traitement afin de minimiser le stress pour les animaux en attente. Lors du change des animaux (une fois par semaine) une feuille de Suivi Bien-Être Animal est remplie en fonction d’une grille de 30 critères. Si nous constatons une déviation concernant au moins 3 critères sans qu’une action puisse corriger ces déviations, alors l’euthanasie de l’animal est envisagée. Ces grilles de critères bien-être animal sont archivées. Dans le cas d'une expérimentation chronique, en plus de la surveillance continue pendant 1h30 post-traitement, une fiche de suivi journalier est mise en place : tout signe de mal être (prostration, poils hérissés, perte de poids supérieure à 15% dans le cas des traitements chroniques, convulsions) entraînera l'exclusion de l'animal du protocole et son euthanasie (par exposition à une concentration croissante de CO2).

Choix des espèces

- La taille adéquat de l’animal : les rats et les souris présentent une taille suffisante pour permettre des microdissections de structures déterminées du cerveau. - Le rat et la souris sont déjà largement caractérisés d’un point de vue comportemental et neurochimique et ils ont un système nerveux suffisamment évolué pour extrapoler à l’homme certains résultats. De plus, la neuroanatomie est particulièrement bien détaillée et documentée chez le rat et la souris. Les études de neurochimie pourront être menées aussi bien sur de jeunes animaux sevrés que sur des animaux adultes en fonction des objectifs.

30 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une à deux chirurgies sous anesthésie, dont l'ablation des glandes parathyroïdes, puis reçoivent des candidats-médicaments avec prélèvements sanguins. Le croisement du champ structuré et de la narration indique que 25 sont tués à l'issue et 5, capables de réguler naturellement leurs hormones, sont réutilisés. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de méthode de substitution car la régulation du calcium nécessite un "organisme entier" et que l'animal constitue un "passage obligatoire" avant l'humain.

Objectifs

L'hypoparathyroïdie est caractérisée par une diminution de la production de l'hormone parathyroïdienne. Chez l'homme, elle est souvent causée par une maladie auto-immune ou des suites d'une chirurgie au niveau des glandes thyroïdes ou parathyroïdes. L'Hormone ParaThyroïdienne (ou PTH) participe avec la vitamine D au métabolisme et à la régulation du calcium de l'organisme. Les symptômes de l'hypoparathyroïdie sont dus à une baisse de la concentration du calcium dans le sang (ou hypocalcémie) et consistent en des fourmillements dans les mains ou autour de la bouche et des crampes musculaires. Le traitement comprend en première intention une supplémentation en calcium et en vitamine D. Ce traitement n'est pas satisfaisant sur tous les patients car il ne permet pas une régulation très fine de la calcémie au cours de la journée (pics d'hypercalcémie suivis de phases d'hypocalcémie). De plus ce traitement ne permet pas de diminuer le risque de complications à long terme de l'hypoparathyroïdie (complications rénales et osseuses principalement). Dans ce cas des traitements à base de parathormone recombinée sont nécessaires mais aucun traitement de ce type n'est approuvé à ce jour. L'objectif de ce projet est d'évaluer l'impact de candidat-médicament qui mimerait l'action endogène de la parathormone dans le traitement de l'hypoparathyroïdie sur le métabolisme osseux et rénal du calcium chez le primate non-humain atteint d'hypoparathyroïdie, modèle mis au point au préalable sur animal anesthésié.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de démontrer les effets bénéfiques et /ou l'absence d'effets délétères de nouveaux médicaments pour traiter l'hypoparathyroïdie, une pathologie humaine touchant 40 personnes pour 100000 et pouvant avoir une application également en médecine vétérinaire. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont une acquisition de connaissances sur l’espèce utilisée (primate non humain) par le développement d’outils de raffinement de plus en plus adaptés et le choix de l’espèce la plus prédictive en fonction de l’objectif scientifique attendu.

Procédures

Dans ce projet, les animaux subiront une à 2 interventions chirurgicales sous anesthésie générale selon un protocole chirurgical et analgésique maitrisé accompagné d'un suivi post-opératoire adapté. Les différents candidats médicaments ou compléments alimentaires seront administrés par voie orale ou sous-cutanée et différents prélèvements sanguins seront réalisés. Après récupération, les animaux sont maintenus en groupes sociaux pour améliorer leur bien-être et la qualité des données recueillies.

Impact sur les animaux

Les symptômes de l'hypoparathyroïdie sont connus et clairement identifiés, et consistent en des fourmillements dans les extrémités ou autour de la bouche et des crampes musculaires. Ces effets sont liés à une hypocalcémie et seront maitrisés par des apports quotidiens en calcium ou des traitements à base d'analogue de la parathormone endogène, partiellement ou totalement absente dans ce modèle. Les effets potentiellement indésirables du/des produits font l’objet d’échanges avec les inventeurs du nouveau candidat médicament pour adapter les outils d’observations des animaux afin d’anticiper au mieux de potentiels signes cliniques.

Devenir

Les animaux nécessitant un traitement à vie après parathyroidectomie, ils ne pourront pas être maintenu en vie ni réutilisés dans une autre procédure. Ils seront donc sacrifiés en fin de procédure. Les animaux non hypoparathyroidiens suite à l'ablation des glandes parathyroides seront gardés en vie uniquement s'ils sont capables de réguler naturellement leur taux en hormones thyroidiennes et parathyroidiennes.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le primate non-humain car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur le métabolisme et la régulation du calcium dans l'organisme sur des sujets atteints d'hypoparathyroïdie, ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. En effet, l’objectif principal de ce projet est de mesurer les taux de calcium circulant dans le sang, et d'évaluer les mécanismes de régulation de ce dernier, ce qui n’est pas possible de mesurer sur des cellules ou organes isolés mais qui nécessite un organisme entier dont la physiologie est fonctionnelle. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le primate non humain est l’espèce non-rongeur qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Une étude pilote avec un nombre réduit d'animaux et réalisée de manière séquentielle permettra d'affiner le modèle et de réduire à terme le nombre total d'animaux dans le projet. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 4 par groupe. Des mesures réalisées avant la parathyroïdectomie permettront de recueillir des valeurs de base pour les différents taux d'hormones thyroidiennes et parathyroidiennes et pour les différents biomarqueurs sanguins et urinaires par animal. Chaque animal sera donc son propre contröle.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuels signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures de contention pour les différentes administrations et prélèvements.

Choix des espèces

Le primate non humain a été démontré comme étant l'espèce animale non rongeur la plus pertinente pour le développement de traitement hormonal de l'hypoparathyroïdie. Des tests ont été réalisés chez le chien et il a été démontré que, à la différence de l’homme, la forte capacité d'excrétion calcique spécifique à cette espèce provoque une toxicité rénale et en particulier un risque de calcul urinaire. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie cérébrale sous anesthésie permettant de manipuler des sites d'action de la nicotine, puis une évaluation comportementale de la balance entre effets appétitifs et aversifs, avant mise à mort. Le porteur limite les effets indésirables déclarés à l'inconfort lié à la chirurgie. Il justifie le recours à la souris par l'interdiction de ces techniques invasives chez l'humain et l'absence de modélisation, et revendique un intérêt "fondamental" pour comprendre la dépendance au tabac.

Objectifs

La nicotine est le composé du tabac responsable de la dépendance qui est observée chez près de 40% des fumeurs. La nicotine agit de façon complexe sur le cerveau, pouvant être appétitive ou aversive selon les doses et les individus. Il est considéré que cette balance entre effets appétitifs et aversifs joue un rôle important dans le fait de continuer à fumer ou non après les premières cigarettes. Ce projet scientifique a pour but d’étudier les mécanismes cérébraux de la balance entre effets appétitifs et aversifs de la nicotine. Nos travaux récents indiquent que la balance appétence/aversion dépendrait d’un équilibre entre l’action de la nicotine sur deux structures cérébrales distinctes. Nous manipulerons des sites d’action spécifiques de la nicotine dans ces structures cérébrales et évaluerons la balance appétence/aversion au travers du comportement chez la souris.

Bénéfices attendus

Ces expériences produiront des connaissances uniques sur les mécanismes cérébraux qui sous-tendent la balance entre effets récompensants et effets aversifs de la nicotine. Comprendre cette balance et être en mesure de la modifier est d’un intérêt fondamental pour une meilleure compréhension de la vulnérabilité à développer et maintenir une consommation de tabac. Cette compréhension est aussi d’intérêt thérapeutique dans le cadre de la dépendance au tabac ainsi que pour le raffinement de l’usage thérapeutique de la nicotine elle-même.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale sous anesthésie gazeuse et sous analgésique.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables sont l'inconfort associé à la chirurgie dans des conditions où toutes les mesures sont prises pour réduire douleur et risque d’infections (aseptie, anesthésie, analgésie anti-inflammatoire, suivi post-opératoire).

Devenir

Les animaux ne peuvent pas être impliqués dans de nouvelles procédures et sont euthanasiés au moyen d’une procédure réglementaire réalisée exclusivement par une personne experte.

Remplacement

Les procédures décrites ont recours exclusivement à la souris de laboratoire pour les raisons suivantes : 1. Il est interdit de mettre en œuvre chez l’homme des techniques neurobiologiques invasives telles que celles décrites ici et qui permettent d’établir des liens de causalité tels que ceux que nous cherchons à tester, 2. Il n’existe pas encore de modélisation mathématique des processus psychopharmacologiques dont nous cherchons à comprendre les mécanismes biologiques, 3) nous étudions comment l’intégration des effets appétitifs et aversifs de la nicotine affecte la prise de nicotine. Cette balance entre appétence et aversion, et son intégration comportementale, ne peuvent être observées et étudiées sur des lignées cellulaires ou tout autre modèle ex vivo.

Réduction

L'utilisation d'un trop grand nombre d'animaux est contraire à l'éthique, mais si trop peu d'animaux sont utilisés, l'expérience peut manquer de puissance statistique et se révélée vaine donc non éthique. Nos effectifs sont déterminés et nos résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Le confort de l’animal est noté quotidiennement au moyen d’une grille d’évaluation. Un soin particulier est porté à la formation des expérimentateurs pour une manipulation adaptée des animaux. Les soignants qui s’occupent de nos animaux sont encadrés par, ou sont eux-mêmes, des personnels diplômés soigneurs animaliers. Les animaux sont hébergés en cycle inversé (obscurité : 7h-19h). Les expériences se déroulent donc quand les animaux sont actifs (phase nocturne) et leur sommeil est ainsi respecté. Les animaux sont pris en main de façon appropriée [jamais par la queue, les pattes reposant sur un support (bras, main…) pour éviter la sensation du vide], 2 fois par semaine (habituation) puis quotidiennement pour une familiarisation optimale avec l’expérimentateur. Pour enrichir l’environnement, des carrés de cellulose, permettant la confection de nids, sont placés dans chaque cage d'habitation et renouvelés systématiquement lors du change. Les paramètres environnementaux des pièces d’hébergement et d’expérience sont contrôlés en permanence. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie gazeuse, sous analgésique et sur couverture chauffante.

Choix des espèces

Compte tenu des questions que nous posons, il est nécessaire d’utiliser une espèce mammifère dont le développement des réseaux neuronaux permet l’expression d’un comportement aussi complexe que la prise de drogue. Or il a été montré un continuum entre les mécanismes psychologiques et biologiques des processus de récompense entre le rongeur et l’homme, et ces processus sont à la base du comportement que nous étudions. Les outils de chémogénétique nécessaires au test des hypothèses que nous formulons ont été développés chez la souris. Les souris utilisées seront agées de 10 semaines à leur arrivée. Il s’agit de souris jeunes adultes. Cette période du développement correspond à la période de vulnérabilité à la nicotine. Par ailleurs, la plasticité vasculaire diminue chez les souris dès 4-5 mois faisant courir un risque lors de la chirurgie vasculaire.

187 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit sous anesthésie une injection de vecteur viral dans le cerveau et l'implantation d'une fibre optique, opération d'une à deux heures, puis des séances de stimulation par ultrasons, avant mise à mort pour analyse du cerveau. Le porteur décrit la chirurgie comme d'impact "modéré et limité dans le temps" et la stimulation comme "indolore et non invasive". Il affirme qu'aucune méthode alternative in vitro n'est disponible, l'étude du comportement reposant sur l'animal vivant.

Objectifs

Ce projet porte sur la neurostimulation ultrasonore. Cette technique permet théoriquement d’activer des zones du cerveau à travers le crâne de manière indolore et non invasive, offrant donc un espoir pour de nouvelles thérapies pour certains troubles neuropsychiatriques sévères. L’objectif de ce projet sera de caractériser les paramètres physiques et expérimentaux permettant une neurostimulation fiable et optimale de plusieurs zones du cerveau qui sont connues pour jouer un rôle important dans ces troubles. Cette caractérisation sera réalisée chez la souris avec une méthode de photométrie par fibre. Celle-ci permet de visualiser l’activité neuronale par imagerie chez la souris, laquelle sera soumise à différents types d’émissions d’ondes ultrasonores. La mesure de l’activité des neurones sera permise par (1) l’expression d’un gène spécial (dont la protéine dégage de la fluorescence en fonction de l’activité des neurones) qui devra être injecté (= transfecté) dans la zone du cerveau que l’on souhaite stimuler et imager, et (2) par une canule optique implantée dans la zone cérébrale dont on veut suivre l’activité neuronale, laquelle pourra être reliée par fibre optique à l’appareil de photométrie lors des mesures et des stimulations ultrasonores transcrâniennes. Le projet comprendra 2 phases : (1) une phase de développement permettant de déterminer l’expression optimale du gène transfecté pour des zone du cerveau superficiel ou profond (40 souris maximum). (2) une phase de caractérisation des effets de neurostimulation par les ultrasons dans différentes zones cibles en fonction des différents paramètres physiques et expérimentaux suivants : fréquence (2 niveaux 0.5 et 1.5 MHz), pression acoustique (10 niveaux de 0 à 500 kPa), distance de la cible (3 niveaux : rayon de 0 – 0.5 – 1 cm), niveau d’anesthésie (3 niveaux de 0.5% – 1% – 1.5% d’isoflurane). La deuxième phase nécessitera 21 souris par zone sur les 7 zones cibles donc un total de 147 souris.

Bénéfices attendus

Ce projet pourra permettre de caractériser les paramètres optimaux de neurostimulation par ultrasons. Ceci est essentiel pour une meilleure évaluation des potentialités thérapeutiques de cette méthode pour de nombreux troubles neuropsychiatriques (comme l’autisme, la dépression et les troubles anxieux)

Procédures

Comme indiqué dans les procédures, tous les animaux (phase 1 et phase 2) seront soumis à une injection de vecteur de transfection et à une implantation de fibre optique sous anesthésie générale (isoflurane), ces interventions durant environ 60 à 120 min. Les animaux des phases 1 et 2 (187 souris maximum) suivront cette procédure (chaque souris subira une seule injection et une seule implantation). Un suivi post-opératoire sera réalisé consistant à un monitoring du poids, de l’alimentation, et de l’observation du comportement en cage accompagné d’un traitement analgésique pendant 3 jours (metacam). Lors de la phase 2, la réalisation des stimulations ultrasonores transcrânienne sera réalisé à la suite d’anesthésie générale gazeuse afin d’installer les animaux dans le dispositif sans stress et de placer le transducteur qui délivre les ondes ultrasonores de manière précise. Cette intervention est néanmoins indolore et non-invasive.

Impact sur les animaux

La chirurgie permettant l’injection du vecteur viral puis l’implantation de la fibre optique pour la photométrie a un impact modéré et limité dans le temps (quelques heures ou jours) sur le bien-être animal, les animaux récupérant rapidement de ce type de chirurgie, et l’encombrement et le poids de l’implant (canule, et fibre pendant les enregistrements) étant très faibles (< 0,1 g) : de nombreux laboratoires ont déjà utilisé ce type d’approche sur l’animal mobile et éveillé sans impact majeur sur le bien-être. La stimulation ultrasonore transcrânienne est une approche non invasive et indolore. L’animal sera installé sur le dispositif (permettant de calculer des coordonnées stéréotaxiques) et testé lors de chaque session à la suite d’une anesthésie gazeuse, limitant ainsi tout stress de manipulation et associé à l’installation dans le dispositif.

Devenir

Procédure 1 : Tous les animaux sont euthanasiés à l’issue de cette procédure Procédure 2 : Tous les animaux sont euthanasiés à l’issue de cette procédure. Lors des 2 procédures, cette étape de mise à mort est nécessaire pour la caractérisation histologique de l’expression du transgène et du placement des canules optiques.

Remplacement

Aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le stress chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant. L’étude de la réponse cérébrale et comportementale à la stimulation ultrasonore transcrânienne nécessite l’utilisation d’animaux.

Réduction

Les effectifs ont été calculés afin de permettre une réduction des effectifs optimisée permettant de suivre les recommandations éthiques en maintenant une puissance statistique d’au moins 0.8 pour une taille d’effet f de Cohen égale à 0.25 à un seuil de significativité de 0.05.

Raffinement

Les conditions d’élevage des animaux seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement du milieu (cabanes plexiglass et cartons, tubes). Les animaux recevront un traitement analgésique (Buprecare, Metacam) avant, juste après et 24 à 48h suivant l’intervention, puis si nécessaire un traitement antibiotique. Chaque animal est placé sur un matelas chauffant pour éviter toute hypothermie. Les cornées sont protégées de la déshydratation. L’anesthésie gazeuse est ici privilégiée pour mieux contrôler la profondeur d’anesthésie et pour une meilleure récupération post-opératoire. Une surveillance post-opératoire d’une semaine est réalisée pour suivre chaque souris et intervenir si nécessaire.

Choix des espèces

Aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le stress chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant. L’étude de la réponse cérébrale et comportementale à la stimulation ultrasonore transcrânienne nécessite l’utilisation d’animaux. Les animaux seront adultes (âgés d’environ 8 semaines ou plus) au début de l’étude. Justification : il s’agit de comprendre ces phénomènes dans un cerveau adulte (8 semaines correspondant au début de l’âge adulte chez la souris.

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de mélanome sous la peau puis six à neuf injections d'une molécule développée au laboratoire, avant mise à mort pour analyses. Le porteur qualifie la greffe de "geste rapide et peu douloureux" et n'attend "pas d'effets indésirables particuliers", tout en notant que la tumeur peut gêner le déplacement de l'animal. Il présente la molécule comme une "découverte majeure" et affirme que l'évaluation doit se faire "sur les organismes vivants".

Objectifs

Les objectif de ce projet sont d'évaluer l'efficacité de la molécule thérapeutique développée au laboratoire et de démontrer son inocuité.

Bénéfices attendus

La démonstration de l'efficacité d'une nouvelle molécule anticancéreuse à très faible dose et sans toxicité sur les cellules saine représente une découverte majeure dans le domaine de la cancérologie. Elle serait une avancée notable et un espoir pour les patients intolérants aux thérapies actuelles et souffrant de leurs nombreux effets secondaires.

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection sous-cutanée lors de la greffe des tumeurs (1 fois, 20 secondes) et à des injections intrapéritonéales ou sous-cutanées pour l'admisnitration des traitements (6 à 9 sur toute la durée du protocole ; 15 sec par injection) et la mesure de la tumeur.

Impact sur les animaux

La greffe de tumeurs sous-cutanée est un geste rapide et peu douloureux pour les animaux. De plus, au vu des premiers résulats ìn vitro, nous ne nous attendons pas à des effets indésirables particuliers. La croissance tumorale sur le flanc peut parfois géner le déplacement de l'animal.

Devenir

A l'issue de la procédure le sacrifice des animaux sera effectué afin de procéder aux analyses biochimiques et histologiques.

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, pour être prédictif, les évaluations de nouveaux agents thérapeutiques en oncologie doivent être réalisées sur les organismes vivants. La molécule candidate a été préalablement étudiée ìn vitro. De nouvelles études complémentaires in vitro sont en cours actuellement.

Réduction

Les groupes expérimentaux sont constitués de 10 individus pour le suivi de croissance tumorale afin de disposer d’une puissance statistique suffisante pour l’évaluation des effets de nos traitements. La molécule candidate a été préalablement étudiée ìn vitro. De nouvelles études (tissus-cibles et stabilité de la molécule) sont en cours actuellement. Ces résultats nous permettent d'ajuster plus précisément le nombre d'animaux.

Raffinement

Trois fois par semaine, chaque animal sera examiné, pesé, la taille tumorale sera déterminée à l’aide d’un pied à coulisse. Le raffinement du protocole prendra en compte le suivi rapproché de la taille des tumeurs. Ce suivi individuel permettra la surveillance du bien-être des animaux qui seront hébergés par groupe de dix dans un établissement agréé. La molécule candidate a été préalablement étudiée ìn vitro. De nouvelles études (toxicité) sont en cours actuellement. Ces résultats nous permettent de limiter au maximum les effets potentiellement indésirables sur les animaux.

Choix des espèces

La souris, outre l’avantage lié à ses caractéristiques physiologiques, est un modèle génétiquement homogène et largement commercialisés donc qui permet de standardiser au maximum nos expériences. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles : pas de biais expérimentaux lié à la croissance ou à la puberté. L'utilisation d'un modèle murin offre une large variété d'outils d'analyses biologiques du modèle. Les souris autorisent également une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique chez l’humain. Enfin, le modèle de cellules cancéreuses décrit comme très sensible à notre drogue est d'origine murine.