Procédures modérées

90 primates non-humains vont être utilisés, tous gardés vivants et réutilisés à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trente macaques à longue queue subissent des écouvillons vaginaux trois fois par semaine sur plusieurs mois et des prélèvements d'endomètre par les voies naturelles ou par laparotomie, trente singes vervets des prélèvements sanguins tous les deux jours puis une biopsie utérine par laparotomie, et trente ouistitis une ablation de l'utérus par hystérectomie. Le porteur décrit un projet visant à comprendre l'évolution de la menstruation chez les primates, dont l'humain. Il affirme que le recours aux primates non-humains est "indispensable", ce trait étant selon lui impossible à étudier in vitro.

Objectifs

Les menstruations sont une caractéristique dont l’évolution est récente, et n’existent que chez quelques espèces de mammifères, dont les humains et certains primates : chez les autres espèces, la muqueuse utérine se résorbe en fin de cycle sans saignements. Ce phénomène reste mal connu d’un point de vue scientifique, et est pourtant crucial pour la compréhension de certaines maladies gynécologiques. Chez l'Homme, la menstruation s'accompagne de changements importants dans la composition cellulaire du tissu endométrial, d'une colonisation par des cellules du système immunitaire et d'une réponse anti-inflammatoire. En l'absence de données chez les primates, nous ne savons pas si ces modifications cellulaires sont spécifiques de la menstruation, ou également partagées par les espèces non menstruantes. Dans ce projet global réalisé sur plusieurs sites, nous proposons de récolter des échantillons d'endomètre utérin chez l'Homme et 4 espèces de primates non-humains menstruantes (babouin et macaque) ou non-menstruantes (saïmiri et ouistiti) avant et au moment de la menstruation pour caractériser ce tissu au niveau cellulaire et moléculaire. Nous étudierons l’évolution, l'expression et la régulation des gènes dans les différentes populations cellulaires qui composent l’endomètre utérin chez ces espèces, pour comprendre comment la menstruation a été adoptée au cours de notre histoire évolutive et ainsi clarifier un aspect important de la physiologie humaine.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de caractériser les réseaux moléculaires mis en jeu lors du cycle hormonal et de la menstruation à l'état sain chez les primates, et d'évaluer leur conservation entre espèces. La caractérisation de cet état sain est une base indispensable à la compréhension des mécanismes pathologiques, et pour évaluer si l'utilisation actuelle de primates non-humains comme modèles de recherche pour les maladies telles que l'endométriose est pertinent.

Procédures

Macaque cynomolgus : - écouvillons vaginaux sur animaux éveillés 3 fois par semaine pendant 3 mois minimum - prélèvement sanguin sous anesthésie avant le prélèvement d’endomètre - prélèvements d’endomètre en passant par les voies naturelles (insertion d’un spéculum dans le vagin et passage d’une curette par le col de l’utérus) sous échoguidage. Si le passage du col de l’utérus est impossible (variabilté anatomique), une biopsie directe de l’utérus sera réalisée après laparotomie sous anesthésie. Vervets : - Prélèvements sanguins sous anesthésie tous les 2 jours pour suivi de cycle (dosage hormonal) - prélèvements d’endomètre par biopsie directe de l’utérus après laparotomie sous anesthésie. Ouistitis : - Récolte d’urine par habituation tous les 2 jours pour suivi de cycle (dosage hormonal) - prélèvement d’endomètre par hystérectomie après laparotomie sous anesthésie. Si la quantitié de tissu n’est pas suffisante, une ablation totale de l’utérus peut être envisagée.

Impact sur les animaux

Les dommages prévus dépendent des interventions et des espèces concernées. Il s’agit du stress causé par les captures et contentions répétées des animaux (toutes les espèces), la douleur liée à l’injection intra-musculaire de l’anesthésique pouvant être réalisé 2 fois en tout (macaque) ou tous les 2 jours (vervets), la douleur liée à la création d’hématomes possibles dans le cas de prélèvements sanguins répétés à la veine fémorale (vervets), la douleur liée à la chirurgie de laparatomie nécessitant une ouverture pour accéder à l’utérus (macaques, vervets) et enfin la douleur liée à la chirurgie d’hystérectomie (ouistitis). Les chirurgies, bien que réalisées sous anesthésie générale et couverture analgésique, peuvent engendrer une période de récupération pendant laquelle l’animal peut présenter une réduction de la mobilité et une réaction inflammatoire locale.

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie après avis favorable d’un vétérinaire pour vérifier leur état de santé.

Remplacement

La menstruation étant un trait spécifique aux primates qui ne peut être étudiée sur des modèles in vitro, l'utilisation de modèles primates non-humains est indispensable dans le cadre de ce projet.

Réduction

Entre 3 et 10 réplicats biologiques de bonne qualité sont nécessaires pour la reproductibilité et le pouvoir statistique des analyses de génomique fonctionnelles envisagées dans ce projet. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés et le nombre d'interventions par animal, tout en assurant la qualité du jeu de données, nous prélèverons un échantillon de tissu sur 5 individus différents/espèce à deux points du cycle menstruel (avant et pendant la menstruation), soit un total de 10 individus par espèce. Pour pouvoir prélever 10 individus, le suivi des cycles se fera sur 30 individus/espèce au total (pour être spurs d'avoir suffisament de femelles avec des cycles réguliers pour planifier les biopsies). Cette stratégie d'échantillonnage tient compte de la possibilité que certains échantillons ne soient pas de qualité suffisante pour poursuivre les analyses, sans remettre en cause la viabilité du projet. Il s'agit d'étude qualitative dans ce projet.

Raffinement

Chaque prélèvement d’endomètre sera réalisé sous anesthésie générale et couverture antalgique appropriée. Des points-limites spécifiques permettent de soustraire l’animal à la souffrance. Ce projet ne nécessite pas l’isolement d’animaux, ils seront donc hébergés dans leurs groupes sociaux d’origine. Toutes nos animaleries font l’objet d’un planning de mise à disposition d’enrichissements adaptés à chaque espèce. Les enrichissements sont soit structurels (divers perchoirs, balançoires…), périodiques (jeux de manipulations proposés selon un rythme hebdomadaire) ou alimentaires (graines dans la litière pour fourragement, glaçons surprises, friandises….). Ce programme est supervisé par le responsable du bien-être animal du site.

Choix des espèces

La menstruation est présente chez certains primates et absente chez d'autres. Nous avons sélectionné pour l'étude quatre espèces de primates non-humains et l'Homme. Parmi ces primates, le macaque menstrue mais le vervet, qui leur est plus proche que l'Homme, ne menstrue pas. Le ouistiti, plus éloigné évolutivement, ne menstrue pas et constitue le groupe externe caractéristique de l'état ancestral. Cette configuration nous permettra de mettre en évidence les différences fonctionnelles qui sous-tendent l'apparition des menstruations chez les primates sans effet confondant de la structure de l'arbre phylogénétique. L'étude nécessitant des échantillons de tissu utérin à la fin du cycle menstruel, tous les animaux utilisés sont des adultes en âge de procréer.

1000 souris et 1000 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, un millier d'entre eux réutilisés et les autres tués à l'issue. Ils subissent selon les cas une ligature d'un uretère, l'ablation des deux tiers puis de la totalité d'un rein ou des protocoles de diurèse, avec des prélèvements sanguins et une insuffisance rénale attendue, pour tester des candidats médicaments de firmes pharmaceutiques. Le porteur indique que les animaux des procédures chirurgicales sont euthanasiés pour prélever les reins, ceux d'une procédure pouvant être gardés vivants sauf si un prélèvement incompatible avec la survie est requis. Il reconnaît que des cultures cellulaires apportent des données préliminaires mais affirme qu'elles ne peuvent "entièrement suppléer" le modèle animal, faute d'environnement immunologique intact.

Objectifs

Le vieillissement de la population et l’augmentation du nombre de patients atteints de diabète ou d’hypertension artérielle entraînent une forte accélération de l’incidence des néphropathies menant à l’insuffisance rénale chronique. L’insuffisance rénale aiguë, qu’elle soit par exemple d’origine obstructive (obstruction des voies urinaires dont la cause peut-être la présence de calculs ou d’un adénome prostatique) ou toxique (intoxication médicamenteuse), est également une situation clinique fréquente. Si elle n’est pas prise en charge, une insuffisance aiguë peut rapidement évaluer en insuffisance chronique. Quelle qu’en soit l’origine, la majorité des atteintes rénales chroniques, aboutissent au développement d’une fibrose tubulo-interstitielle dont la présence signe l’évolution vers la perte de la fonction rénale. L’insuffisance rénale chronique est un enjeu majeur en santé publique. La fibrose rénale représente le trait histologique commun des néphropathies associées à une insuffisance rénale chronique évolutive. Elle se caractérise par une accumulation de protéines de la matrice extracellulaire conduisant à la destruction progressive du parenchyme rénal. L’insuffisance rénale peut rapidement détériorer l’état de santé des patients (exemples : anémie, fatigue, confusion mentale, troubles psychiques, hypertension, troubles du rythme cardiaque) ou mettre en jeu le pronostic vital (exemples : œdème aigu du poumon, coma, accident vasculaire cérébral, les infarctus du myocarde). Comprendre et lutter contre le développement de l’insuffisance rénale et de l’apparition de la fibrose représente ainsi un enjeu scientifique et médical de la plus grande importance. Les tests décrits dans ce projet ciblent l'évaluation des effets de substances dans le cadre de développement préclinique de produits pharmaceutiques. Ces modèles sont mis en place et utilisés afin de tester l'efficacité de médicaments, ou de s'assurer qu'ils ne modifient pas la fonction rénale ou n'induisent pas eux-mêmes une insuffisance rénale.

Bénéfices attendus

Ces différents modèles sont nécessaires à la découverte et la mise sur le marché de nouveaux médicaments sûrs et efficaces pour traiter l'insuffisance renale aiguë ou chronique. Par exemple, il n’existe pas, pour l’instant, de traitements médicamenteux établis pour traiter la fibrose rénale. Jusqu’à présent, la dialyse ou la greffe restent les seules stratégies appropriées.

Procédures

Dans les procédures chez la souris (fibrose par ligature d’un uretère, diurèse), un prélèvement sanguin terminal (sans réveil) sous anesthésie gazeuse (isoflurane) peut être réalisé. Dans les procédures chez le rat, un prélèvement sanguin sous anesthésie gazeuse (isoflurane) est réalisé juste avant l'euthanasie. Selon les besoins de l'étude (rat/souris), des prélèvements sanguins supplémentaires (fréquence selon les besoins de l'étude) peuvent être réalisés (sous anesthésie avec retour à l'état conscient). Dans ce cas, le volume prélevé sera inférieur ou égal à 15% de la volémie sanguine et ne sera répété que toutes les 2 semaines au minimum. Dans la procédure de ligature d’un uretère, une phase de chirurgie est nécessaire. Les animaux sont anesthésiés (isoflurane) et reçoivent une administration d'un antalgique. Une laparotomie médiane est pratiquée en condition d'asepsie. Un uretère est ligaturé. Les plans musculaires et cutanés sont suturés et l'animal est placé près d'un dispositif chauffant jusqu'au réveil. Pendant la phase de récupération post-chirurgicale, les animaux reçoivent un antalgique. Un groupe d'animaux servant de contrôle (groupe Sham) subit la même procédure chirurgicale à l'exception de la ligature de l’uretère. Dans la procédure de 5/6 néphrectomie, deux phases de chirurgie sont nécessaires. Pour chaque phase (espacée d’une semaine), les animaux sont anesthésiés (anesthésie gazeuse isoflurane) et reçoivent une administration d'un antalgique. Une petite laparotomie latérale est pratiquée en condition d'asepsie. Dans la première phase, le rein gauche est exposé et les 2/3 du rein sont excisés. Dans la seconde phase, le rein droit est entièrement excisé. Après chaque phase de chirurgie, les plans musculaires et cutanés sont suturés et l'animal est placé près d'un dispositif chauffant jusqu'au réveil. Un groupe d'animaux servant de contrôle (groupe Sham) subit la même procédure chirurgicale à l'exception de la 5/6 néphrectomie. Dans les 3 procédures, les animaux sont traités avec la substance d’essai en une plusieurs occasions, la voie et la durée du traitement étant adaptés aux besoins de l’étude. Le traitement est généralement effectué en une occasion (procédure de diurèse) ou pendant plusieurs semaines (4 ou 12 semaines maximum après la ligature d’un uretère ou la 5/6 néphrectomie).

Impact sur les animaux

Dans ce type de procédures, il est attendu une insuffisance rénale. Dans les modèles nécessitant une intervention chirurgicale (réduction de la masse rénale, ligature unilatérale d'un uretère), les animaux doivent être hébergés en cage individuelle (avec enrichissement) pendant la période de récupération post-chirurgicale (quelques jours). Pendant les périodes de récolte de l'urine (24 heures maximum), l'isolement des animaux est nécessaire et peut aller jusqu'à 24 heures (pour la détermination de la filtration glomérulaire, les urines doivent impérativement être collectées individuellement pendant 24 heures). Après la procédure de ligature d'un l'uretère, la rétention de l'urine ou hydronéphrose peut être accompagnée de douleurs lombaires. Les stades d'œdème aigu du poumon, coma, accident vasculaire cérébral ou infarctus du myocarde, observés chez l'homme à un stade avancé de l'insuffisance rénale nécessitant le plus souvent une greffe (d'œdème aigu du poumon, coma, accident vasculaire cérébral ou infarctus du myocarde) ne sont pas atteints dans les procédures décrites dans ce projet (les animaux étant euthanasiés avant ce stade). A ce stade du développement du médicament, il est usuel d’avoir déjà des notions de toxicité des composés. Il n’est donc pas attendu de sévérité forte liée aux molécules testées.

Devenir

Dans la procédure 1, les animaux peuvent être gardés en vie et réutilisés, sauf si, pour les besoins de l’étude, un volume de sang (et/ou un prélèvement d'organe) non-compatible avec la survie est nécessaire. Dans les procédures 2 et 3, les animaux sont euthanasiés, le prélèvement des reins (pour analyses) ne permettant pas le réveil et le maintien en vie.

Remplacement

En amont des tests in vivo sur des modèles d’insuffisance rénale, des tests in vitro (exemple: culture cellulaire 3D de fibroblastes) peuvent être envisagés. Cependant, même si ces tests peuvent apporter des données préliminaires ou complémentaires (mort cellulaire, prolifération des fibroblastes, modification de la matrice extracellulaire), ils ne peuvent entièrement suppléer les modèles animaux car ils ne permettent pas d’évaluer les pathologies dans un environnement biologique et immunologique intact comme cela est possible chez l’animal.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé pour chaque étude a été optimisé de façon à obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif. Nos analyses statistiques (Student'st test) indiquent qu’un effectif de 6-12 animaux par groupe selon la procédure (nombre de groupes variable en fonction du nombre de doses et de produits à tester) est généralement nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test. Lorsque celà est possible, des prélèvements sanguins intermédiaires (autre que terminal) peuvent être envisagés sur un même animal, permettant ainsi de générer de données sur la cinétiques d'action de la molécule testés sans utiliser un plus grand nombre d'animaux.

Raffinement

Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites permettant de sacrifier précocement tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général et un suivi de poids). De plus, les animaux sont manipulés fréquemment par des techniciens formés et attentifs et suivis par le vétérinaire. Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objet de nidification, objet à ronger ou à mastiquer, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données. Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De la même manière, lorsque les protocoles l’exigent, les chirurgies sont raffinées au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins post-opératoires complets.

Choix des espèces

L’impact de substances pharmacologiques sur le système renal du rat et de la souris dans les modèles décrits, sont prédictifs de leur efficacité en clinique. Rongeurs sevrés, âge variant entre 3 semaines et et 6 mois, conformément aux données historiques.

128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection d'anticorps, trois expositions intranasales à la bléomycine et une trachéotomie sous anesthésie sans réveil, pour provoquer une fibrose pulmonaire et mesurer la toxicité de nouveaux conjugués anticorps-médicament anticancéreux. Le porteur indique que le modèle entraîne une perte de poids et des difficultés respiratoires liées à la fibrose induite. Il présente ces études comme "essentielles" pour sélectionner le candidat le moins toxique avant une première administration chez l'humain, les bénéfices annoncés pour la santé humaine restant à moyen terme.

Objectifs

Les modèles animaux permettent l’étude des effets positifs et négatifs de drogues anticancéreuses à l’échelle de l’organisme. Ces études précliniques sur l’animal permettent la validation de thérapies anticancéreuses plus efficaces et moins toxiques pour le traitement des patients. Les études proposées visent à évaluer l’induction d’une fibrose pulmonaire chez l’animal par de nouvelles molécules développées pour être des traitements anticancéreux. Connaître ce paramètre pour un composé permet de prédire l’apparition de toxicités pulmonaires observées chez l’Homme avec ce type de traitements. Les études proposées portent sur différents variants d’un anticancéreux en développement et visent à déterminer lequel des composés présente le profil de toxicité le plus favorable, afin de le qualifier pour un développement préclinique plus poussé

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à moyen terme. Ce projet permettra d’étudier l’impact du design du conjugué anticorps-médicament sur la toxicité pulmonaire. Ces études sont essentielles pour la sélection du ou des ADC (anticorps-drogue conjugué) induisant le moins de toxicité pulmonaire, et de sélectionner le candidat médicament pour les études précliniques réglementaires avant une première administration chez l’homme.

Procédures

Injection d'anticorps : nombre 1 durée : quelques secondes Exposition intra nasale a la bléomycine : nombre 3 durée : quelques secondes. Trachéotomie : nombre 1 : Durée 30 minutes sans réveil.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont celles inherentes au modèle telles qu'une perte de poids, une apprition d'une fibrose induisant des difficultées respiratoire

Devenir

Toutes les souris seront mise a mort en fin de procédure pour analyses. Nous avons choisi des effectifs permettant une analyse statistique pertinente et une reproductibilité des résultats tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux, à savoir 8 souris par groupes. De ce fait nous utiliserons les tests de Mann-Whitney si la comparaison se fera entre 2 groupes ou Wilcoxon si le nombre de groupes à comparer est supérieur à 2. Ces tests reposent sur l’analyse de données non paramétriques, calculée quand le nombre de sujet est inférieur à 30. Ce test nous permet d’analyser nos données en combinant un test statistique fiable et un nombre d’animaux réduit.

Remplacement

Cette étude vise à évaluer l’induction d’une toxicité pulmonaire par un composé, nécessitant ainsi l’utilisation d’un modèle animal. Des études in vitro et in vivo ont été réalisées en amont afin de sélectionner uniquement les molécules ayant le plus grand intérêt thérapeutique pour l’étude de toxicité pulmonaire.

Réduction

Nous avons choisi des effectifs permettant une analyse statistique pertinente et une reproductibilité des résultats tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux, à savoir 8 souris par groupes.

Raffinement

Avant le début des procédures, les souris seront habituées aux expérimentateurs de l’étude par une observation quotidienne, afin de pouvoir réduire, supprimer ou soulager leur stress et leur détresse. Des points limites adaptés comme une surveillance quotidienne, des pesées régulières (1 fois par semaine) ont été définis pour détecter et minimiser toute souffrance, toute douleur et tout stress des animaux.Les souris seront stabulées dans les cages d’un portoir ventilé avec un cycle jour/nuit de 12h (température, humidité). Les animaux seront hébergés 4 femelles par cage (cages : hauteur supérieure à 15cm, surface de 500cm2) dans un environnement enrichi pour limiter le stress. L’enrichissement choisi consiste en la présence d'un dome et de frissotis.

Choix des espèces

La modélisation de la toxicité pulmonaire par la bléomycine est une méthode très répandue chez la souris. Pour cette procédure, nous avons besoin d’utiliser des souris de 6 semaines ayant un système immuniatire mature.

63 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues épileptiques, elles subissent une microchirurgie cérébrale d'environ une heure pour l'implantation d'électrodes, puis des séances d'enregistrement de l'activité cérébrale dans un espace réduit de quinze centimètres de côté, à raison de huit sessions de deux heures sur un mois. À la fin, elles sont mises à mort pour prélever le cerveau et récupérer le bloc d'électrodes collé au crâne. Le porteur indique développer des modèles informatiques de tissu épileptique mais affirme qu'ils ne peuvent remplacer le modèle vivant, l'épileptogenèse mettant en jeu un processus qu'il décrit comme non reproductible.

Objectifs

Les Oscillations Haute-Fréquence (HFO) sont des signaux de courte durée (dizaines de ms) et de faible amplitude, enregistrés en électroencéphalographie intracérébrale (iEEG), dans une bande de fréquence particulière (200-600 Hz). Leur valeur clinique a été rapportée dans de nombreuses publications qui montrent que i) les HFO peuvent être observées avec des macro-électrodes intracrâniennes chez des patients atteints d’épilepsie focale pharmaco-résistante, ii) leur fréquence d’apparition est plus élevée dans les tissus cérébraux à l’origine des crises, dits zones épileptogènes, iii) il existe une corrélation forte entre la résection des zones cérébrales générant des HFO et l’issue favorable de la chirurgie dans le cadre des épilepsies pharmaco-résistantes. Notre hypothèse de travail est qu’il est possible de proposer un nouveau design d’électrode qui améliorerait l’enregistrement et la détection de HFO pathologiques dans les signaux iEEG. L’objectif général du projet Neuro-Sense est d’augmenter la valeur diagnostique des HFO en tant que biomarqueur fiable des zones épileptogènes.

Bénéfices attendus

Le but ultime du projet est d’amener à la conception d’électrodes hybrides macro-micro. En effet, le traitement des HFO est un problème difficile par essence, du fait des caractéristiques des signaux. Ces signaux présentent un grand éventail de formes, dont seulement une partie peut être expliquée par les modèles informatiques à ce jour. En améliorant leur observabilité, nous souhaitons d’une part débloquer des clefs de compréhension de leurs rôles dans l’épilepsie, et d’autre part faciliter la circonscription de la zone à enlever dans le cadre des chirurgies de résection pour les épilepsies pharmaco-résistantes

Procédures

Micro chirurgie cérébrale sous anesthésie générale avec analgésie, 1h par souris sur 63 animaux. Limitation de mobilité légère (monitoring iEEG et mesure d’impédance), 24h par souris répartissur 1 mois en session de 2h30 sur 63 animaux.

Impact sur les animaux

Toutes les souris auront comme effets indésirables : - Une chirurgie sous anesthésie générale et analgésie pour la pose d’électrodes dans le cerveau afin de pouvoir mesurer l’activité cérébrale (1h à 1h30 par souris) - Une limitation de l’espace disponible pour se déplacer (15x15cm) durant les périodes d’enregistrement (8x2h par souris réparties sur 1 mois)

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux sont mis à mort pour pouvoir prélever le cerveau pour des analyses histologiques et récupérer le bloc d’électrodes collé sur le crâne. Les animaux ne peuvent donc ni être réutilisés dans un autre projet ni adoptés.

Remplacement

Nous utilisons et développons dans notre laboratoire des modèles informatiques de neurones ou de tissu épileptique mais ils ne sont pas capables de remplacer les modèles in-vivo dans leur ensemble, ce qui est notamment le cas de l’épileptogenèse (mise en place de l’épilepsie) qui met en jeu un processus physiologique complexe non reproductible.

Réduction

Du fait de l’utilisation de modèles informatiques et des précédents projets de recherche, nous connaissons le nombre d’évènements attendus par heure d’enregistrement, nous pouvons donc réduire le nombre d’animaux au strict nécessaire pour répondre à nos questions.

Raffinement

Cela fait plus de 10 ans que nous maîtrisons la mise en place de ce modèle mTLE au laboratoire. Au cours de cette décennie, nous avons amélioré les pratiques chirurgicales pour optimiser les protocoles de manière à réduire au maximum la souffrance animale. Les chirurgies seront réalisées par un personnel formé à la chirurgie et maîtrisant la totalité des techniques chirurgicales utilisées ici. Nous prenons en charge la douleur due à la chirurgie en utilisant un anesthésique et analgésique adaptés à la douleur provoquée et à notre projet. Le stress des animaux est également pris en compte dès leur réception et jusqu’à leur mise à mort en enrichissant les cages d’hébergement et en utilisant la technique de mise à mort réglementaire la plus douce possible. Tout au long de la chirurgie et également durant le réveil post-opératoire, nous faisons attention au maintien de la température corporelle, paramètre très important chez cette espèce qui est particulièrement sensible à l’hypothermie.

Choix des espèces

Ce type d’étude nécessite l’utilisation de mammifères épileptiques, dont l’épileptogenèse est bien établie, ainsi que leur neuroanatomie et neurophysiologie. La souris a été choisie comme modèle expérimental pour son adéquation avec les contraintes expérimentales. Nous utiliserons des animaux âgés de 8 à 10 semaines ayant un poids de plus de 20g. Cet âge et surtout ce poids permettent une meilleure réussite de la chirurgie ainsi qu’un ratio poids de l’animal/ poids du dispositif d’enregistrement de seulement 2.5%. Cet âge, considéré comme adulte, est également nécessaire pour que le cerveau soit complètement mature et que le volume de la boite crânienne soit stable.

650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent quatre chocs électriques pour induire un état de stress post-traumatique, une chirurgie cérébrale d'environ trois heures avec implantation permanente d'une fibre optique, un hébergement isolé prolongé et une batterie de tests comportementaux mesurant la peur, l'anxiété, la mémoire, l'évitement et l'hypervigilance. Le porteur reconnaît que la stimulation optogénétique n'est pas transposable directement chez l'humain, mais affirme qu'elle fournira des résultats "nécessaires" pour justifier des études de neurostimulation. Il conclut qu'aucune méthode sans animaux ne peut répondre à la question, le modèle reposant sur l'observation du comportement de l'animal vivant.

Objectifs

L’État de Stress Post-Traumatique (ESPT ou PTSD, pour Post-Traumatic Stress Disorder, APA 1994) est une pathologie psychiatrique qui touche 8 à 12% de la population générale. Elle survient après l’expérience d’un événement traumatique pouvant être létal, causer une blessure grave ou menacer l’intégrité physique. Il existe plusieurs modèles murins permettant de mimer différents aspects du trouble de stress post-traumatique (PTSD). Le plus utilisé est basé sur le principe de conditionnement de peur au contexte où un contexte nouveau est associé à un événement aversif (chocs électriques). Les souris se rappelleront que l’évènement aversif a eu lieu spécifiquement dans ce contexte et en auront peur lorsqu’elles y seront réexposées. Dans le cas d’un évènement aversif léger, en réexposant l’animal de façon répétée au contexte sans choc électrique, l’expression de la peur associée devrait diminuer jusqu’à disparaitre. Les souris comprennent qu’il n’y a plus de danger dans ce contexte. Ce processus, nommé extinction de peur, est défaillant dans le cas du PTSD. Il est donc important que, chez la souris, la peur associée au contexte persiste après plusieurs réexpositions au contexte. De plus, des traits caractéristiques du PTSD (anxiété, trouble de la mémoire, évitement, hypervigilance, freezing ou immobilité lié à la peur) peuvent être observés à l’aide de différents tests comportementaux. Pour cette étude, nous voulons montrer qu’en activant le cortex infralimbique (zone du cerveau responsable de l’extinction de peur chez la souris) lors du rappel de l’évènement, nous arrivons à accélérer et accentuer l’extinction et que cette amélioration engendrerait une diminution des symptômes associés au PTSD.

Bénéfices attendus

Dans un premier temps, nous démontrerons que les symptômes du PTSD persistent après plusieurs rappels de l’évènement aversif confirmant la qualité du modèle murin de PTSD. De plus, Le cortex infralimbique a été montré comme responsable de la diminution de l’expression de la peur après l’occurrence d’un évènement aversif léger et que, dans le cas d’un PTSD, son activité est largement diminué. Pourtant un nombre très limité d’étude cherche à rétablir cette activité. La technique de stimulation choisie nous permettra d’être spécifique quant à la région ainsi que les neurones stimulés, à l’inverse d’autres techniques de neurostimulations. La stimulation pouvant être effectuée sur l’animal libre de ses mouvements, nous pourrons montrer son importance au cours du rappel de l’évènement aversif. L’optogénétique, même si non transposable chez l’homme directement, nous permettra ainsi l’obtention de résultats nécessaires pour la justification d’études de neurostimulation non invasive. Enfin, à ce jour aucune étude sur le PTSD chez l’animal n’a pris en contre des animaux femelles. En clinique, parmi les techniques thérapeutiques utilisées aujourd’hui, les thérapies d’exposition semblent être de plus en plus pratiquées. En mettant le patient dans une situation où il est obligé de se remémorer le traumatisme de façon répété dans le temps tout en étant dans un endroit où il se sent en sécurité, les psychiatres cherchent à diminuer l’expression des émotions négatives associées. Malheureusement ces thérapies peuvent prendre du temps et ne sont pas aussi efficaces pour tous les patients. Nous voulons monter qu’en stimulant la région responsable de l’extinction, nous pouvons accélérer le processus. Même si non transposable chez l’Homme directement, cette étude nous permettra ainsi l’obtention de résultats nécessaires pour montrer l’importance de venir stimuler le cortex infralimbique pendant le rappel de l’évènement. Enfin, à ce jour, on constate qu’aucune étude sur le PTSD chez l’animal n’a pris en compte des animaux femelles, posant un problème majeur dans la mise au point de thérapie chez l’Homme.

Procédures

Au cours de la première procédure, les souris vont être divisées en 3 groupes (un sous-groupe femelles et un sous-groupe mâle) suivant le protocole choisi : Le groupe PTSD qui recevra 4 chocs électriques dans un nouveau contexte, le groupe conditionnement de peur qui recevra 4 chocs électriques de plus faible intensité et le groupe contrôle seulement exposé au contexte sans chocs électrique. Trois semaines plus tard, toutes les souris sont réexposées au contexte pendant 20min par jour sur 3 jours. Enfin, les souris suivront une batterie de tests comportementaux, les deux semaines suivantes, pour tester différents phénotypes (l’expression de la peur dans le contexte de PTSD, l’anxiété, la mémoire épisodique, l’évitement d’un élément de rappel du contexte de PTSD dans un contexte neutre, la généralisation de la peur à un contexte similaire à celui du PTSD, l’hyperréactivité). Chaque test a une durée maximale de 15min et est effectué un fois. Le test d’hyperréactivité est répété quatre fois en 6 semaines. Les souris effectueront 2 tests comportementaux par jours maximum. Pour les procédures 2 et 3, les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale. Cette procédure dure environ 3h sous anesthésie gazeuse. Elle consiste en une injection dans le cerveau et l’implantation d’une fibre optique qui dépassera du crâne de quelques mm (environs 1.25 mm). Cette fibre est nécessaire pour venir activer les neurones à l’aide d’une stimulation lumineuse (LED) et restera donc implanté indéfiniment. Au cours de la chirurgie les souris recevront une injection d’anesthésique local au niveau du crâne, d’analgésique et d’anti-inflammatoire. Pour la procédure 3, deux semaines après la chirurgie, les souris suivront un protocole de PTSD puis de 3 réexpositions au contexte 3 semaines plus tard (cf procédure 1). Les jours de réexpositions, les souris suivront un protocole de stimulation soit au cours des différentes réexpositions soit le matin des réexpositions dans un autre contexte neutre. Les souris de la procédure 2 suivront le protocole de stimulation uniquement, 5 semaines après la chirurgie dans le contexte neutre.La stimulation pour activer les neurones se fera sur l’animal éveillé et vigile. Il s’agira d’une session unique de 10 min (procédure 2) ou de 3 sessions de 10min (1 session par jour sur 3 jours ; procédure 2 et 3). Cette stimulation n’est pas ressentie par l’animal et n’aura aucun effet néfaste.

Impact sur les animaux

Le PTSD est caractérisé en psychiatrie par une persistance de différents symptômes envahissants sur une durée de plus d’un mois. Lors de la mise au point du modèle, nous serons donc tenus de montrer la persistance de différents symptômes sur le long terme. La batterie de tests comportementaux demande de sortir les animaux de leur cage pour les mettre dans de nouveaux environnements inconnues et parfois lumineux, bruyant ou leur rappelant l’évènement aversif. Les tests peuvent donc entrainer un stress ne persistant pas lors de leur retour en cage d’hébergement. Il a de plus été montré à plusieurs reprises que la mobilité des souris ayant suivit un protocole de PTSD était réduite lors de l’exploration dans différents contextes comparé à des souris n’ayant pas subis d’évènement aversif et ce plusieurs jours à plusieurs semaines après. Les souris montreront des comportements de peur associés au contexte aversif encore un mois après le conditionnement. Toutefois, les souris ne devraient pas montrer de perte de poids importante lié à l’induction du PTSD ni de signes de mal-être dans la cage d’hébergement. Le modèle de PTSD a montré son efficacité dans plusieurs études ultérieures. Pour cela, les souris ont été hébergées seules au moins 14 jours avant le début des expérimentations. Nous hébergerons donc les souris en cages isolées afin de reproduire le modèle de PTSD et d’obtenir la même symptomatologie mais ceci risque d’induire un stress supplémentaire prolongé. Toutefois, les cages seront transparentes, rangées les unes à côté des autres et se trouveront sur un portoir ouvert. Les souris pourront donc se voir, s’entendre et se sentir. De plus, cette étude nécessite d’effectuer des chirurgies au niveau du cerveau. Les souris auront besoin de quelques jours pour se remettre de la chirurgie et de deux semaines avant toutes autres procédures. Le cerveau n’étant pas sensible, la douleur liée à la chirurgie sera dû à l’incision de la peau du crâne et les petits trous effectués dans le crâne. Enfin, la stimulation lumineuse ne sera pas ressentie par les animaux et n’aura aucun effet néfaste mais demandera de brancher les animaux à un câble ajoutant une gêne dans les déplacements tant que l’animal n’y est pas habitué. Les souris seront donc habituées au branchement dans leur cage d’hébergement plusieurs jours avant la stimulation. Cette habituation sera accompagnée d’une récompense alimentaire.

Devenir

Les 210 animaux de la procédure 1 seront euthanasiés. Les souris étant isolées pour l’ensemble de la procédure afin de reproduire un modèle de PTSD existant et ayant été validée dans différentes études, il ne sera pas possible de les regrouper à la suite de cette procédure. En effet des souris regroupées après isolement deviennent agressives et tendent à se battre violemment. En fin de procédures 2 et 3 tous les animaux seront destinés à l’étude immunohistochimique. Pour cela, nous devons fixer le cerveau avec une solution de paraformaldéhyde injecté dans la circulation sanguine de l’animal euthanasié. Cette solution de paraformaldéhyde est nécessaire à la fixation des tissus afin qu’il n’y ait ni dégradation ni modification post mortem. Cela nous permet de récupérer les cerveaux et de les conserver pour confirmer le site d’injection lors de la chirurgie ainsi que faire d’autres études histologiques à la fin des procédures. Sans cela nous ne pourrons pas montrer que les résultats obtenus sont une conséquence de l’activation de la zone cérébrale visée.

Remplacement

Aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le PTSD chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant.

Réduction

Les effectifs sont optimisés, les observations comportementales nécessitent une taille d’effectif suffisant compte tenu de la variabilité inter-individuelle (n=35 sujets par groupe). Ne pouvant nous appuyer sur aucune étude conte tenue de la variabilité entre mâle et femelle, nous sommes obligé de les considérer comme des groupes séparés. Les procédures 1 et 2 sont des procédures préliminaires qui nous permettront d’arrêter l’étude si les résultats ne vont pas dans le sens attendu et nécessaire pour la suite.

Raffinement

Le stress traumatique appliqué aux animaux, chocs électriques de 2sec à 1.5 mA dans un contexte inconnu, peut être qualifié de moyen, en raison de sa brièveté. Les conditions d’élevage des animaux seront optimales au regard des normes en vigueur. Tous les animaux seront hébergés dans des cages individuelles avec enrichissement du milieu (cabanes, smarthome® et tubes). Les expérimentateurs sont experts dans la préhension/contention des souris et sont soucieux d’éviter tout stress lors de la réalisation des procédures. Pendant la chirurgie, les animaux sont sous anesthésie gazeuse, ils sont placés sur une couverture chauffante pour éviter toute hypothermie et leurs cornées sont protégées de la déshydratation par un gel. Les animaux resteront pendant deux semaines dans leur cage après la chirurgie sans aucune manipulation excepté pour le change des cages afin qu’ils puissent se remettre de la procédure. Un antidouleur (buprénorphine à 0.1mg/kg) sera injecté en sous-cutané en fin de chirurgie et les souris seront monitorée tous les jours pendant la semaine qui suit afin de vérifier que nous n’atteignons pas le point limite.

Choix des espèces

Le choix de la souris se justifie par la similarité entre la neurobiologie humaine et la neurobiologie murine, par l’expérience du laboratoire dans l’évaluation comportementale des rongeurs ainsi que dans la mise en application de la stimulation optogénétique. La zone ciblée dans cette étude (cortex infralimbique) est un équivalent fonctionnel du cortex préfrontal ventromédian chez l’Homme. Les souris C57/BL6N seront adultes (âgées de 10 semaines) à J0 de l’expérimentation afin de comparer les effets chez des animaux dont le phénotype comportemental est stabilisé (période neuro-développementale terminée).

1415 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 1400 d'entre elles subissent une compression chirurgicale du nerf sciatique qui altère la marche et peut provoquer une douleur, suivie d'analyses du déplacement, 415 recevant en plus des injections de tamoxifène cinq jours par semaine. Le porteur indique surveiller quotidiennement la douleur avec une grille dédiée et administrer des dérivés morphiniques, et met à mort les animaux par exsanguination sous anesthésie pour prélever sang et nerfs. Il étudie le rôle d'un gène dans la réparation de la gaine des nerfs et affirme que ce processus complexe ne peut être modélisé in vitro.

Objectifs

Le but est de caractériser chez la souris la cinétique des évènements cellulaires et moléculaires impliqués de la réparation de la gaine isolante des nerfs (gaine de myéline, riche en lipide et cholestérol) après écrasement du nerf sciatique. Nous voulons analyser les conséquences sur cette régénération de l’absence d'un gène impliqué dans le métabolisme du cholestérol (le Liver X Receptor β -LXRβ-) dans les cellules qui forment la gaine de myéline (les cellules de Schwann). Nous nous intéresserons au fonctionnement du nerf en régénération, aux changements de son architecture tissulaire et aux modifications de l'activité des acteurs impliqués dans la réparation de la gaine de myéline. L’objectif est de mieux comprendre l’impοrtance du gène LXRβ dans les cellules de Schwann pour la réparation de la gaine de myéline.

Bénéfices attendus

L’ensemble des résultats nous permettra de décrire avec précison les évènements cellulaires et moléculaires au sein des cellules de Schwann lors de la remyélinisation du nerf sciatique chez la souris et de comprendre l’implication du gène LXRβ dans ce processus complexe. Les résultats attendus pourraient ainsi permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement des atteintes de la gaine de myéline des nerfs périphériques.

Procédures

415 des 1415 animaux seront traités au Tamoxifène pendant 2 semaines, à raison d'1 injection/jour dans le péritoine pendant 5 jours/semaine au moyen d'une seringue à aiguille fine, adaptée pour limiter au minimum la douleur de l'injection. Elle a pour but d'induire une recombinaison génétique du gène étudié dans les cellules de Schwann à l'âge adulte. Pour étudier la réparation de la gaine de myéline, 400 animaux parmi les 415 traités au Tamoxifène et 1000 animaux non traités au Tamoxifène seront destinés à la procédure chirurgicale de compression du nerf sciatique. Cette procédure a pour but d'induire une altération de la gaine de myéline. Elle dure quelques minutes et sera effectuée sous anésthésie générale après traitement analgésique pour limiter la douleur liée à l'opération. Après l'opération, nous suivrons au cours des semaines suivantes la récupération des fonctions du nerf sciatique par diverses études comportementales (analyse de la démarche de l'animal, analyse de la mobilité des doigts...).

Impact sur les animaux

L'injection de Tamoxifène dans le péritoine des souris est une procédure couramment exécutée en laboratoire qui ne produit pas de douleur notable chez l'animal. Une grille spécifique de prise en charge de la douleur a toutefois été créée pour évaluer les conséquences douloureuses qui pourraient survenir suite à l'invalidation génétique induite par ce traitement. Chez la souris, la démyélinisation induite par compression du nerf sciatique altère la locomotion et peut entraîner une douleur. Nous quantifierons quotidiennement la douleur chez les souris en utilisant la grille spécifique d'évaluation de la douleur que nous avons mis en place afin de prendre en charge chez ces animaux les nuisances induites par cette procédures.

Devenir

Nous souhaitons analyser chez tous les animaux concernés le statut immunitaire. Nous devons pour cela prélever une grande quantité de sang pour pouvoir analyser les marqueurs inflamatoires et immunitaires systémiques. Ainsi, à l'issue de chaque procédure, les 1415 animaux seront sacrifiés par exsanguination sous anesthésie générale avec traitement analgésique préalable. Après la mise à mort des animaux, les 2mL de sang prélevés seront analysés pour établir le profil cytokinique et les nerfs seront disséqués pour analyse biochimique et histologique.

Remplacement

La remyélinisation est un processus complexe qui nécessite l’intervention de multiples acteurs cellulaires qui ne peut être modélisé in vitro. La qualité de la mise en place de la gaine de myéline et de son maintien a des conséquences fonctionnelles qui nécessitent l’analyse de composantes sensori-motrices propres aux animaux vivants.

Réduction

Nous avons limité au minimum le nombre d'animaux nécessaire pour atteindre la puissance statistique suffisante pour l'analyse des altérations comportementales induites par la perturbation du systême sensori-moteur. Nous soumettrons les données au test satistique one way ANOVA suivi d'un test de Bonferroni et comparerons les groupes d'animaux deux à deux (sauvages vs transgéniques / lésés vs non lésés).

Raffinement

Afin de limiter au minimum la souffrance des animaux une grille spécifique d'évaluation de la douleur a été mise en place. Elle permettra une prise en charge adaptée de la douleur due aux injections et aux opérations chirurgicales (traitement journalier des animaux avec des dérivés morphiniques). Pour l'opération chirurgicale de compression du nerf sciatique, un traitement analgésique avant l'opération est prévu ainsi que durant les 5 jours qui suivent l'opération. L'état général des animaux sera quotidiennement évalué (mobilité, aspect du pelage...) et du gel d'hydratation ainsi que des croquettes seront mis à disposition des animaux au fond de la cage si un défaut de locomotion des souris était constaté.

Choix des espèces

Les souris sont des mammifères au système métabolique et physiologique suffisamment proche de l’Homme pour être utilisées dans une étude pertinante de la gaine isolante des nerfs (myéline) et pour élucider l’importance d'un gène (le LXRβ) dans la réparation de cette gaine. De plus, les techniques d’analyse à notre disposition pour évaluer l’implication de ce gène sont très bien adaptées chez la souris. L’analyse comportementale ainsi que les techniques biochimiques et histologiques envisagées pour étudier la myéline nous permettront d’apporter des réponses claires sur le rôle du LXRβ sur la qualité de la gaine des nerfs. Les animaux utilisés sont âgés de 6 à 12 semaines, âge adulte classique pour étudier les phénomènes de réparation de la gaine de myéline pour lequel le système nerveux a achevé son développement et est pleinement fonctionnel.

240 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 160 étant tués à l'issue et 80 réutilisés dans d'autres études. Ils sont vaccinés par diverses voies puis infectés par le SARS-CoV-2 par voie nasale, trachéale ou en aérosol, et subissent des prélèvements de sang jusqu'à cinq fois par semaine, des lavages des poumons, des biopsies pulmonaires, intestinales, de moelle et de peau, ainsi que des ponctions lombaires. Le porteur affirme n'avoir détecté aucune souffrance liée à l'infection après un an et demi d'expérience, tout en reconnaissant des risques de pneumothorax ou de saignements lors des biopsies. Il teste des candidats vaccins présentés comme un "enjeu international majeur" et justifie le macaque par la proximité de sa réponse immunitaire avec celle de l'humain.

Objectifs

Le projet a pour objectif d’évaluer la capacité à provoquer une réponse immunitaire et l’efficacité de différents candidats vaccins innovants contre le virus SARS-CoV2, dans un contexte où les vaccins actuels ne sont que partiellement efficaces pour lutter contre la pandémie de Covid-19 que nous connaissons maintenant depuis deux ans. Plusieurs vaccins contre le SARS-CoV2 sont disponibles chez l’humain depuis 1 an environ, toutefois leur efficacité à long-terme est aujourd’hui remise en cause. En effet, la réponse immunitaire induite semble s’estomper au bout de quelques mois, ce qui nécessite l’administration de doses de rappel régulières. De plus, l’émergence de variant diminue l’efficacité de ces vaccins, qui devront certainement être modifiés pour rester suffisamment efficaces. En outre, les vaccins actuellement disponibles ne bloquent pas totalement la dissémination du virus. Il ne faut donc pas que les candidats vaccins moins avancés dans leur développement soient précocement abandonnés alors qu’ils pourraient suppléer à d’éventuels points faibles des vaccins déjà établis. Dans ce contexte, nous testerons dans un modèle animal de Covid-19 différents types de vaccins tels que de nouveaux vaccins à base d’ARN messager, des vaccins à base de séquences d’ADN, de virus atténués ou inactivés ainsi que des vaccins plus classiques de type protéique. Ces derniers pourraient représenter une alternative efficace pour stimuler la réponse immunitaire suite aux vaccins à ARN messager actuellement utilisés. Nos recherches précliniques actuelles devraient permettre de rentrer rapidement en phase d’essai clinique et nous faisons en sorte de pouvoir répondre aux exigences des critères d’entrée en essai clinique. Certaines études sont même des demandes explicites des agences.

Bénéfices attendus

La recherche d’un vaccin efficace contre le SARS-CoV2 est un enjeu de santé publique, dans la mesure où cette pandémie continue d’affecter notre société, en créant un afflux de malade dans les hôpitaux malgré les vaccins actuellement disponibles. La limite des vaccins actuels face aux nouveaux variant émergents nous encourage à trouver des moyens de lutte plus efficaces. En effet, ces vaccins voient leur efficacité décroître au bout de quelques mois et des rappels réguliers sont nécessaires pour maintenir une immunité efficace contre le virus. De plus, ces vaccins n’empêchent ni la dissémination du virus, ni même l’apparition de symptômes chez les personnes vaccinées. Aujourd’hui, de nouvelles stratégies vaccinales à l’aide de vaccins candidats de type protéique ou à ARN/ADN doivent être développées pour protéger plus efficacement de l’infection par le SARS-CoV2 et réduire sa propagation La pandémie perdure depuis 2 ans, elle a causé la mort de millions de personnes et impacte fortement la société, trouver un vaccin pour l’endiguer définitivement et y mettre fin est un enjeu international majeur.

Procédures

L’ensemble des procédures seront effectués sur des animaux anesthésiés pour éviter toute souffrance. L’immunisation des PNHs sera effectuée par voies (intramusculaire, intranasale et autres voies muqueuses, sous-cutanée, intradermique, délivrance par endoscopie): mise à part l’endoscopie le temps de l’intervention est inférieur à 30 minutes. Immunisation par voie intestinale ou gastrique peut prendre jusqu’à 1h30. Nous effectuerons le challenge viral par voie nasale et trachéale ou par voie aérosol et cela durera 30 minutes. Des puces de température pourront être implantés pour suivre la température corporelle en continu (intervention 45 minutes) Afin de caractériser nos candidats vaccins et l’infection SARS-CoV2, nous effectuerons des prélèvements de sang au maximum 5 fois par semaine par voie veineuse en limitant la quantité prélevée à 7.5% de la volémie sanguine totale/semaine. Ceci nécessitera un temps d’anesthésie de 20 minutes. Pour suivre l’évolution de la charge virale, nous effectuerons des prélèvements ou lavages aux/des sites infectieux et muqueuses (tractus respiratoire) au maximum 5 fois par semaine (10 minutes). Pour accéder au tractus respiratoire inférieur, nous effectuons des lavages broncho-alvéolaires (LBA) avec 4 jours d’intervalle minimum entre chacun des lavages (30 minutes). Différents types de biopsie pourront être réalisés en fonction des besoins de l’étude, comme des prélèvements de ganglions lymphatiques avec deux semaines d’intervalle minimum (45 minutes). Nous pourrions avoir besoin d’effectuer des biopsies pulmonaires pour évaluer la réponse locale ainsi que des biopsies de moelle osseuse et des biopsies intestinales par endoscopie (90 minutes d’intervention maximum). Des ponctions lombaires pour accéder au liquide cérébrospinal (1 fois par semaine au maximum) et des biopsies de peau pourraient être envisager (20 min d’intervention). Nous utiliserons aussi des méthodes non invasives pour l’analyse de nos candidats vaccins en utilisant l’imagerie CT et PET-CT avec injection de Fluor 18 (90 minutes maximum). Dans des cas très particuliers, nous pourrions effectuer une plasmaphérèse pour éliminer des anticorps spécifiques (1 fois par mois, 4 heures). De l’urine pourrait être aussi récupérée par sondage, pour mesurer la concentration urinaire du vaccin (20 minutes pour les 2 semaines). Enfin, des empreintes conjonctivales pourraient permettre d’accéder aux cellules immunitaires (1 fois/semaine pendant 20 minutes)

Impact sur les animaux

Après plus d’un an et demi d’expérience, nous n’avons pas détecté de souffrance suite à une infection par le SARS-CoV2 de notre modèle de PNH et cela quel que soit le variant utilisé (Wuhan/Beta/Delta…). Toutefois, l’hébergement individuel lors des phases de challenge pourrait entrainer un stress qui sera compensé par un programme défini par la cellule « bien-être animal » de l’établissement pour l’enrichissement de leur milieu de vie. Au niveau des procédures expérimentales, peu d’effets indésirables sont attendus. Dans de très rares cas, un pneumothorax (présence anormale d'air dans la cavité pleurale) ou un hémothorax (épanchement de sang dans la cavité pleurale) sont possibles à la suite des biopsies pulmonaires et seront observables en direct lors de l’endoscopie. Les animaux seront suivis sur des paramètres cliniques comme l’oxymétrie et la fréquence cardiaque pendant et après l’intervention pour s’assurer de l’absence de lésion. Les biopsies digestives par endoscopie sont parfois associées à des saignements digestifs. Lors de la réalisation de l’endoscopie, le site biopsié sera observé pour identifier et traiter tout saignement. Il est possible que les biopsies entrainent des inflammations et plaies locales qui seront surveillées quotidiennement jusqu’à la récupération complète de l’animal.

Devenir

Certains animaux vaccinés et non infectés par le SARS-CoV2, suite à l’inefficacité de l’immunisation, pourront être euthanasiés pour prélever différents tissus et procéder à des analyses de biodistribution, par exemple. Toutefois, dans la majorité des cas, les animaux ayant subi une immunisation inefficace pourront être réutilisés dans différentes études au sein du département afin de limiter le nombre total d’animaux utilisé. Les animaux infectés pourront être euthanasiés pour accéder aux tissus et mesurer par exemple la charge virale dans les poumons et d’autres tissus cibles ou encore pour caractériser les lésions pulmonaires par analyses histologiques (charge virale, lésions pulmonaires…) L’autre partie des animaux infectés par le SARS-CoV2 sera conservée pour servir de modèle de réinfection ou d’animaux convalescents.

Remplacement

L’évaluation de vaccins contre le SARS-CoV-2 nécessite un modèle expérimental permettant d’étudier les différentes composantes des réponses immunitaires (humorales, cellulaires) et les changements induits suite à l’immunisation et à l’infection virale. A ce jour, ces différents éléments ne peuvent pas être étudiés à l'aide de simulations informatiques ou dans des modèles in vitro. L'utilisation d'un modèle animal est nécessaire pour reproduire les symptômes et réponses immunitaires induits pas un virus respiratoire. Le primate non humain est choisi comme modèle animal dans cette étude, car il présente une réponse immunitaire et vaccinale semblable à celle de l’humain pour la plupart des infections respiratoires. De plus, les outils nécessaires sont disponibles et maitrisés chez cette espèce.

Réduction

Nous recevons de nombreuses demandes de partenaires pour tester des candidats vaccins. Notre expérience nous a montré que pour le développement d’un type de vaccin, les différentes phases de développement nécessitent plusieurs études pour ajuster la dose et la composition du vaccin, et dans ce cas précis la séquence ADN, dans un contexte d’émergence continuelle de variant. Nous considérons que nous aurons au moins besoin de 5 protocoles par candidat vaccin et nous anticipons 6 études à venir rapidement au cours de l’année 2022/2023. La majorité des candidats-vaccins sont d'abord évalués dans des modèles animaux murins, afin de réduire au maximum l'utilisation de primates non-humains. Ainsi nous anticipons 30 protocoles avec un maximum de 6 primates non-humains par groupe. Ce chiffre, qui permettra une analyse statistique fiable des résultats, représente le nombre maximum de primates non-humains par groupe. Dans certains cas, il pourra être réduit pour des phases pilotes comparant des doses ou des voies d’administration par exemple. Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, nous limiterons le nombre d’animaux contrôle non vaccinés en incluant des contrôles historiques au sein des études.

Raffinement

Tous les animaux sont des animaux d’élevage de seconde génération toutes les procédures seront effectuées sur des animaux anesthésiés. De plus, des protocoles d’analgésie ont été définis et validés par l’équipe vétérinaire afin de minimiser la douleur à chaque intervention en fonction de l’espèce utilisée. Les hébergements en individuel sont limités au maximum. ils seront hébergés en individuel contigus uniquement après la phase d’infection. Cet hébergement individuel contigu permet des interactions sociales (conservation du contact physique par le haut de la cage et sensoriel par la mise en place de plaques translucides entre les cages latérales, et cages face à face séparées d’environ 2m). L’enrichissement sera augmenté (distribution 2 fois par semaine d’enrichissements destructibles au lieu d’1). Les interventions par chirurgie mini-invasive, ciblant des organes et tissus préalablement identifiés par imagerie médicale seront privilégiées afin de raffiner les méthodes expérimentales employées et ainsi réduire la douleur postopératoire. Grâce à l’utilisation de différentes techniques d’endoscopie (bronchoscopie) les tissus cibles seront prélevés avec précision en un nombre réduit d’incisions. Les volumes de sang prélevés seront réduits au minimum nécessaire. En cas d’apparition de signes locaux suites aux prélèvements, un traitement symptomatique local pourra être instauré après examen par le vétérinaire. Pour les prélèvements des fluides bronchiques une attention sera portée aux animaux lors de ce geste. Un anesthésique local sera utilisé lors de l’intubation et les animaux seront étroitement surveillés jusqu’à leur réveil. Lors des séances d’imagerie in vivo, l’animal sera placé sur un matelas chauffant avec un maintien hydrique et ses constantes biologiques seront surveillées. Si l’animal présente des signes cliniques (difficultés respiratoires, vomissement, tachycardie, arythmie, hypoglycémie) avant ou lors de la séance d’imagerie, la session sera interrompue. Si l’animal montre des signes de douleur trop importante, un traitement symptomatique pourra être mis en place par le vétérinaire responsable. Si l’état général de l’animal ne s’améliorait pas malgré la prise de mesures, alors l’euthanasie de l’animal serait envisagée.

Choix des espèces

Les espèces de primates non-humains retenues pour cette étude ont été sélectionnées pour deux raisons : - elles représentent le seul modèle réunissant les éléments nécessaires à l’évaluation de vaccins : les réponses immunitaire et vaccinale sont similaires à celles de l’humain, et les techniques et outils d’exploration de la réponse immunitaire et de la réponse vaccinale sont disponibles et maitrisés chez ces espèces, contrairement à d’autres modèles d’infections respiratoires régulièrement utilisées comme le furet. - elles ont déjà fait l’objet de publications scientifiques en tant que modèles d’infection par le SARS-CoV2, et présentent des symptômes semblables à ceux observés chez l’Homme. Les espèces choisies présentent un système immunitaire et une physiopathologie de l’infection par le SARS-CoV2 très proches. Le système immunitaire et la réponse vaccinale évoluent en fonction du stade de développement et de l’âge des individus. Les candidats vaccins étudiés étant susceptibles de faire l’objet d’essais cliniques chez l’adulte, il est donc nécessaire de réaliser ces études chez un animal au système immunitaire « mature », soit de plus de 2 ans.

168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales mammaires sous anesthésie, puis pour certaines un anticorps couplé à un isotope radioactif par voie intraveineuse et cinq séances d'imagerie. Le porteur indique que la tumeur peut réduire l'activité motrice et faire perdre du poids, la mise à mort intervenant avant que la tumeur n'atteigne 2000 mm³. Le projet teste un anticorps comme outil de diagnostic d'un cancer du sein agressif, bénéfice clinique présenté au conditionnel, et il affirme que la création de tumeurs chez la souris est "indispensable".

Objectifs

La capacité de notre organisme à se défendre face à des substances étrangères est aujourd’hui l’un des axes de thérapie innovantes notamment contre le cancer. Les anticorps sont des molécules biologiques impliquées dans l’immunité. De ce fait, les anticorps ciblant les tumeurs sont aujourd’hui largement utilisés pour le traitement de patients atteints de cancer. La spécificité des anticorps à aller préférentiellement sur la tumeur permet d’une part de gagner en efficacité thérapeutique mais également de se servir de ces anticorps comme molécule diagnostique. L’association d’un anticorps avec un isotope radioactif permet dans le cadre de la médecine nucléaire d’obtenir un outil d’imagerie in-vivo, non invasif et à haut taux de spécificité. Compte tenu de l’expérience déjà acquise au sein de notre laboratoire, le projet porte sur l’étude des tumeurs liées au cancer du sein. L’objectif de notre projet est de développer une molécule de type anticorps associé au cuivre-64, isotope radioactif, ciblant un type particulier de cancer du sein exprimant une protéine impliquée dans la régulation de la prolifération cellulaire (HER2 positif). Ces cancers HER2 positifs sont plus agressifs et ont un pronostic moins favorable que les autres types de cancers du sein.

Bénéfices attendus

L’objectif de cette étude est de confirmer dans un modèle de cancer mammaire chez la souris la capacité de notre anticorps à ne reconnaître que les cellules cancéreuses porteuses d’une protéine particulière (HER2) à la surface de leur membrane. En cas de confirmation, résultats pourront directement influencer les pratiques cliniques actuelles concernant l’exploration fonctionnelle de ce type de cancer du sein plus agressif et au pronostic moins favorable qu’un cancer du sein n’exprimant pas HER2.

Procédures

L'étude implique des groupes de souris contrôle sans tumeur donc non injectées et des groupes de souris porteuses de tumeurs qui seront injectées avec des cellules tumorales sous anesthésie générale. Ensuite certains groupes de souris contrôles et des groupes avec tumeur recevront une injection d'anticorps radiomarqué par voie intraveineuse sous anesthésie générale (durée 5 minutes) et seront soumis (étude in vivo) à 5 séances d'imagerie d’une durée de 10 à 40 minutes (en fonction du point temporel) alors que d'autres seront inclus dans l'étude ex-vivo (pas d’imagerie, une anesthésie finale en fin d'étude).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont le développement d'une tumeur au niveau du site d'injection. Cette tumeur peut éventuellement induire une diminution de l'activité motrice et/ou une perte de poids lorsque celle-ci a un développement trop important. Les points limites de l'étude ainsi que la durée de l'étude devraient limiter ses effets indésirables. Les études d'imagerie n'induisent pas de stress ou d'effet indésirables par eux même.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de l'étude avant l'atteinte du volume de 2000 mm3 de la tumeur.

Remplacement

L’objectif du projet est d’étudier les effets d’un anticorps couplé à une molécule radio-active à demie vie longue pour suivre au cours du temps la capacité de cet anticorps à détecter sa cible au sein de la tumeur. Les modèles in vitro ne permettent pas de créer une tumeur vascularisée possédant non seulement un amas de cellules tumorales, mais également une matrice extracellulaire, des cellules stromales de soutien et des vaisseaux sanguins, autant de cibles potentielles des stratégies antitumorales. C’est pour ces raisons que la création de modèles tumoraux chez la souris sont indispensables pour vérifier l’intérêt thérapeutique de cet anticorps comme outil de diagnostic en clinique.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été calculé comme étant le minimum pour pouvoir faire des études statistiques dans ce type d’étude qui présente une grande variabilité interindividuelle.Les résultats obtenus entre les groupes seront analysés par des méthdoes statistiques adaptées permettant d'évaluer si le nouvel outil diagnostic utilisé en imagerie permet un meilleur diagnostic des tumeurs. Le type d'imagerie que nous utilisons permet de réduire le nombre d’animaux car un même animal peut être suivi à des différents points temporel. En fonction des données recueillies au cours de l’étude d’imagerie, le nombre de points de mesure prévu dans l’étude de distribution de biodistribution pourra être revu à la baisse ce qui concourra à réduire encore le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux sont placés à plusieurs par cage afin de respecter l'interaction sociale et dans un environnement enrichi (frisure de papier kraft, carré de cellulose, tunnel) afin de stimuler leur activité motrice. Les animaux reçoivent de l'eau et de la nourriture ad libitum. Des tunels sont également ajoutés dans les cages pour limiter l'agressivité entre congénères. Un suivi quotidien est assuré par du personnel spécialisé afin de mettre en évidence d'éventuels signes précoces de mal être. Pour se faire, des points limites spécifiques ont été établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront, de sortir l'animal de l'étude et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort. Une grille d'observation adaptée à ce protocole permet de mettre en évidence ces points limites. Pendant les séances d'imagerie les animaux sont anesthésiés, hydratés et rechauffés et leurs paramètres vitaux (température et fréquence respiratoire) monitorés en continu. Un gel ophtalmique est appliqué en début de séance pour éviter le dessèchement oculaire

Choix des espèces

La souris est un modèle reconnu dans la communauté pour le développement de cancer induit par l'injection de cellules cancéreuses et permet également de tester la pertinence d’une approche thérapeutique. L’âge de 7 semaines correspond aux standard de la littérature dans ce domaine.