Procédures modérées

224 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nés sans flore intestinale, ils reçoivent par gavage le microbiote de volontaires humains, subissent des prélèvements de selles hebdomadaires, un passage isolé de 24 heures en chambre respiratoire et une contention en tube pour mesurer leur composition corporelle, avant autopsie. Le porteur reconnaît que l'hébergement individuel et le gavage sont sources de stress, tout en les présentant comme brefs. L'objet du projet est de comparer l'effet sur la santé de yaourts et fromages issus d'élevages "agro-écologique ou intensif", et il affirme un "recours absolu" au modèle animal.

Objectifs

L’objectif du projet est de déterminer si des produits laitiers fermentés (yaourts et fromages affinés) fabriqués à partir de lait de vaches élevées en système agro-écologique ou intensif, impactent différemment la santé du consommateur

Bénéfices attendus

Le projet vise à faire la preuve de concept de la divergence de qualité de différents produits laitiers (fromages affinés ou laits fermentés) fabriqués à partir de lait de vaches en élevage agro-écologique ou intensif et des conséquences positives ou négatives respectives sur la santé du consommateur

Procédures

Les animaux seront soumis à 4 types d'interventions au cours du pojet : 1) gavage orogastrique permettant l'implantation du microbiote du volontaire chez les rats axéniques (animaux nés sans microflore bactérienne colique) : 1 seule intervention, en tout début de projet et d'une durée inférieure à la minute car elle est pratiquée par des zootechniciens formés et expérimentés 2) prélèvements de selles : 1 intervention pas semaine et par animal, d'une durée inférieure à la minute, 3) Le passage dans les chambres respiratoires, qui permet de mesurer les gaz excrétés par les animaux (H2, CO2 et CH4), est réduit à son minimum de 24h et enfin 4) la composition corporelle est mesurée a l'aide d'un appareil analytique type RMN qui effectue les mesures en 3 min, pendant cette durée les animaux sont contentionnés dans un tube PVC afin qu'ils restent immobiles pour la précision des mesures.

Impact sur les animaux

Il s’agit d’un modèle communément utilisé pour les études concernant le tube digestif, en particulier celles réalisées à partir d’animaux gnotobiotiques à microbiote humain. Le rat est en effet reconnu pour sa capacité à conserver un microbiote dont la composition est très proche de celle du microbiote humain du donneur. Les donneurs étant, dans le cadre de ce projet des volontaires sains, l'alimentation est, de plus, adaptée, n'entrainant pas de troubles digestifs ou de croissance. La supplémentation, basée sur des produits laitiers fermentés de consommation courante, n'entraine pas non plus de nuisance ou d'effets indésirables pour les animaux. Cependant le gavage orogastrique qui va permettre l'établissement du modèle peut être source de stress, lié à la contention de l'animal. C'est pourquoi les animaux sont préalablement conditionnés à la manipulation et que le geste technique est réalisé par des zootechniciens formés et expérimentés qui vont limiter significativement la durée de ce stress potentiel (moins d'une minute). De la même façon, le prélèvement de selles chez l'animal peut être source de stress lié, également, à sa contention nécessaire, toutefois considérant la fréquence (1 fois pas semaine) et de la rapidité du geste (moins d'une minute), les effets indésirables sont très limités. Le placement des animaux en cage individuelle peut occasionner un stress lié à la découverte d'un nouvel environnement et à l'absence de congénaire. Bien que les animaux s'adaptent rapidement, une surveillance accrue sera mise en place pendant toute la durée de la procédure pour détecter d'éventuels signes de mal être. Si des signes apparaissent et persistent pendant les 3 premières heures du passage en chambre respiratoires, les animaux retourneront dans leurs hébergements d'origine. Ce stress est limité par le temps de passage dans les chambres respiratoires réduit à son minimum (24h) et des enrichissements type Sizzle Nest sont également ajoutés à l'environnement pour permettre la réalisation de nid par les animaux.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de cette procédure puis autopsiés afin de récupérer l'ensemble des organes et fluides métaboliques nécessaires aux futures analyses biologiques, génomiques et histologiques.

Remplacement

L’évaluation de l’impact santé de produits laitiers fermentés étudiés (yaourts et fromages produits à partir de lait de vaches en élevage agro-écologique ou intensif) nécessite le recours absolu à un modèle animal pour atteindre notre objectif. Il est en effet très difficile voire impossible d’analyser l’effet potentiel de ces produits sur l’intégrité intestinale (perméabilité, immunité) et la santé cardio-métabolique (masse grasse, tissus adipeux et hépatiques) chez l’homme. Ceci nécessite en effet une alimentation contrôlée et similaire pour tous les individus ainsi que des mesures et des prélèvements particulièrement difficiles à effectuer chez l’homme.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été réduit au strict nécessaire pour observer des effets statistiquement significatifs. De plus, les tissus prélevés seront soient analysés pour répondre au questionnements scientifiques proposés par le projet, soient conservés pour de futures analyses, non prélablement prévues dans le cadre du projet, et qui pourraient complémenter les résultats obtenus.

Raffinement

Les procédures, nécessitant un raffinement de leur exécution pour limiter leur impact sur les animaux, sont les gavages orogastriques, les prélèvements de selles et le passage en chambre respiratoire. Celles ci seront réalisées par des zootechniciens formés et expérimentés qui permettront de limiter la durée de la procédure par animal (moins d'une minute pour le gavage et les prélèvemets de selles. De plus, avant la première intervention, une habituation à la contention sera réalisée prélalablement par ces zootechniciens permettant ainsi de diminuer le stress suceptible d'être occasionné par ce geste technique. Les animaux font l'objet d'une surveillance quotidienne pour détecter, réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, la douleur, la détresse ou l'angoisse. la classification modérée lors du passage en chambre respiratoire est justifiée par le fait que les animaux doivent etre places seul dans ces equipements afin de mesurer individuellement les excretions de gaz. Quelle que soit la procédure appliquée, si un animal présentait les signes suivant : perte de poids, prostration, comportement agressif, léthargique, etc... (points limites notables) ou plaies, saignement nasaux ou fécaux, etc...(points limites graves), l'arbre de décision concernant l'application des point limites serait suivi immédiatement.

Choix des espèces

Les espèces animales choisies sont des rats mâles nés axéniques de la lignée Fischer âgés de 8 semaines. Il s’agit d’un modèle communément utilisé pour les études concernant le tube digestif, en particulier celles réalisées à partir d’animaux gnotobiotiques à microbiote humain. Le rat est en effet reconnu pour sa capacité à conserver un microbiote dont la composition est très proche de celle du microbiote humain du donneur. Il permet également le recueil d’une quantité plus importante de fèces et de contenus caecaux nécessaires aux études de la composition et de l’activité du microbiote intestinal que la souris. Les rats seront âgés de 8 semaines au moment de l'implantation du microbiote de volontaire par gavage oro gastrique. Cet âge correspond à un stade de développement optimal pour l'acceptation et la stabilisation dans le temps du microbiote transplanté.

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie d'implantation de cellules tumorales dans le pancréas durant jusqu'à une heure, un suivi par échographie sous anesthésie une à deux fois par semaine, puis un prélèvement de sang et de tumeur avant mise à mort par dislocation cervicale. Le porteur fixe des points limites, une tumeur atteignant 2000 mm³ ou une perte de 20 % du poids déclenchant la mise à mort, sans que ces seuils soient forcément atteints. Le projet vise à mettre au point une technique de greffe présentée comme "plus prédictive" que la greffe sous la peau, et il affirme qu'aucune méthode in vitro ne reconstitue la tumeur et son environnement.

Objectifs

Le pancréas est un organe qui contient 2 types de cellules : les cellules exocrines dont la fonction est de libérer des enzymes et des sucs participant à la digestion et les cellules endocrines qui produisent des hormones notamment impliquées dans l’homéostasie glucidique. Avec 14000 nouveaux cas de cancers diagnostiqués par an, le cancer du pancréas est le 6e cancer le plus fréquent en France. L’adénocarcinome canalaire pancréatique (ACP) qui représente 90-95% des cancers du pancréas, se développe dans le compartiment exocrine et est très agressif et létal, avec un pourcentage de survie des patients à 5 ans inférieur à 10% (seuls 20% des patients souffrant d’ACP survivent plus d’un an). Les prévisions suggèrent que le nombre de cas d’ACP et de décès associés à ce cancer seront multipliés par 2 d’ici 2030. Cette augmentation est associée non seulement au vieillissement des populations, mais aussi à l’augmentation de la prévalence de l’obésité et du diabète dans le monde. Parmi les autres facteurs de risque pour ce cancer, on trouve le tabagisme, l’abus d’alcool et des prédispositions génétiques (

Bénéfices attendus

Actuellement, les études pharmacologiques dans le cadre du cancer canalaire pancréatique sont effectuées sur des modèles de xénogreffes de cellules tumorales humaines sous la peau de souris (greffe ectopique ou hétérotopique). Mais ces modèles ne récapitulent pas toutes les caractéristiques spécifiques associées à l’ACP et notamment le microenvironnement tumoral. La greffe de cellules tumorales pancréatiques dans le pancréas permet de retrouver ce microenvironnement tumoral et est donc considérée plus pertinente pour l’évaluation de nouveaux traitements anti-tumoraux. Ainsi les bénéfices de ce projet seraient de mettre au point un modèle plus prédictif de la pathologie humaine et ainsi de mieux prédire l’efficacité de candidats médicaments chez l’homme.

Procédures

-Puçage : un dispositif sous cutané est implanté à chaque animal quelques jours avant l’étude par trocart afin d’être identifié -Chirurgie pour l’implantation des cellules tumorales dans le pancréas : cette chirurgie durera de 30 min à 1 heure et sera réalisée une seule fois sur chaque animal avec mise en œuvre des bonnes pratiques chirurgicales (asepsie, protocole analgésique pré-post opératoire, surveillance et réveil en enceinte chauffée etc). -Mesure du volume tumoral par échographie sous anesthésie gazeuse. Réalisé une fois avant la greffe puis après rétablissement complet de l’animal suite à la chirurgie (7 à 10 j), à raison de 1-2 mesures échographiques par semaine (8 semaines maximum). La durée d’une mesure est déterminée à environ 30 minutes par souris. -Prélèvement de sang en fin d'étude, sur animal anesthésié et sans réveil consécutif, par ponction à la veine cave ou par ponction cardiaque. -Prélèvement terminal de tumeur : pour tous les animaux en fin d’étude, la tumeur sera prélevée sur les animaux préalablement profondément anesthésiés à l’Isoflurane et euthanasiés par dislocation cervicale.

Impact sur les animaux

Tumeur pancréatique limitée à 2000 mm3 ; perte de poids limitée à 20% du poids maximal ; Signes cliniques rares : Abdomen gonflé ou apparition de métastases.

Devenir

Lorsque le volume tumoral est proche de 2000 mm3, ceci constitue un point limite et l’animal concerné est alors euthanasié. A la fin de chaque étude, tous les animaux sont euthanasiés pour réaliser des prélèvements de sang, de tumeur et/ou d’autres organes. Ces prélèvements seront réalisés pour générer des échantillons qui pourront être utilisés pour des études ultérieures (détermination de l’expression de protéines ou de gène d’intérêt, par immunohistochimie, génomique ou protéomique…).

Remplacement

Ce projet a pour but de mettre au point un modèle de greffe orthotopique de cellules tumorales d’origine pancréatique. L’implantation des cellules dans le pancréas permet ainsi à la tumeur de se développer dans le microenvironnement d’origine d’un cancer du pancréas, permettant ainsi de se placer dans des conditions le plus proche possible de la pathologie humaine. Il est impossible à l’heure actuelle de reconstituer in vitro une tumeur et ses interactions avec le microenvironnement, et donc il n’y a pas de méthodes substitutives.

Réduction

-Un accompagnement par le service biostatistique sera réalisé pour estimer la variabilité de la pousse de la tumeur pour chaque lignée cellulaire étudiée dans le cadre de ce projet. Cette étape permettra d'établir le nombre d'animaux nécessaires par groupe pour les études futures d'efficacité de traitement et de pharmacodynamie. -Lorsque les souris seront euthanasiées, des prélèvements de tumeurs seront réalisés pour générer des échantillons qui pourront être utilisés pour des études ultérieures (détermination de l’expression de protéines ou de gène d’intérêt, par immunohistochimie, génomique ou protéomique…). Cette approche permet donc d’optimiser les études et de réduire le nombre d’animaux en évitant de refaire des études pour obtenir des échantillons

Raffinement

- Les souris sont maintenues en groupes sociaux tout au long de l’étude. L’habitat des souris est enrichi de matériel adapté pour leur permettre d’exprimer leurs instincts naturels comme ronger ou nidifier (tube ou dôme, cocoon, sizzle dry) et de l’aliment est distribué dans la cage pour favoriser le comportement de fouissage. -Les animaux font l’objet d’une observation clinique tout au long de l’étude par les expérimentateurs et par les zootechniciens pour s’assurer de leur rétablissement, de leur bien-être et de l’absence de signe clinique. En cas de signe clinique, les recommandations de la SBEA et les points limites seront appliqués. -La procédure de greffe orthotopique est réalisée selon les bonnes pratiques de chirurgie, avec : odes espaces séparés pour la préparation des animaux et pour la chirurgie oune anesthésie et une analgésie adaptées à la chirurgie oune asepsie maintenue pendant toute la chirurgie -L’analgésie péri-opératoire pourra être adaptée en termes de traitement administré et de durée en fonction des signes de douleurs observés et en concertation avec le vétérinaire. -Le suivi de la croissance tumorale par échographie est une méthode non invasive pour l’animal et sans douleur. Cette mesure est réalisée sous anesthésie gazeuse. Les tumeurs sont mesurées par échographie 1 à 2 fois par semaine, à la fois pour l’objectif de l’étude mais aussi pour limiter la souffrance et appliquer les points limites. En cas de volume tumoral s’approchant des 2000 mm3 lors d’une lecture, les souris seront euthanasiées. -Une palpation de l’abdomen est faite 2 à 3 fois par semaine pour suivre la progression de la tumeur. Elle est faite le jour du suivi échographique pour corréler la palpation à la mesure du volume tumoral, puis entre chaque mesure échographique. Cette palpation permet aussi de détecter un gonflement de l’abdomen en cas d’apparition d’ascite.

Choix des espèces

En oncologie, l’utilisation de la souris est largement décrite dans la littérature pour la recherche pré-clinique. De plus, la greffe orthotopique de cellules tumorales dans le pancréas chez la souris est couramment utilisée dans les études précliniques d’oncologie. Ainsi la souris est le modèle de choix. Les souris sont utilisées à l’âge adulte, à partir de 7 semaines. Il s’agit de l’âge d’utilisation classique des souris dans les protocoles d’efficacité et de pharmacodynamie en oncologie.

560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales humaines sur chaque flanc, des injections et des prélèvements sanguins répétés au niveau du sinus rétro-orbital sous anesthésie, avant une mise à mort pour analyser la tumeur, le sang et la rate. Le porteur indique que les tumeurs peuvent s'ulcérer et fixe ce point comme limite, et utilise des souris immunodéprimées pour qu'elles acceptent les cellules humaines. Le bénéfice attendu se réduit à une "preuve de concept" d'un système de globules blancs modifiés, et il affirme qu'on ne peut s'affranchir du modèle murin.

Objectifs

Les cancers représentent un problème de santé publique majeur causant environ 10 millions de décès par an. Les traitements disponibles présentent de nombreux effets secondaires et nécessitent souvent de multiples interventions, d’où la nécessité de nouvelles alternatives thérapeutiques plus efficaces, plus spécifiques, voir ciblées, et ce, sur le long terme. L'un des principaux problèmes expliquant la progression du cancer est l'incapacité du système immunitaire à éliminer les cellules tumorales, car l’environnement tumorale diminue les fonctions des cellules immunitaires. Récemment, des stratégies d'immunothérapie modulant le système immunitaire du patient pour augmenter son efficacité ont suscitées un fort intérêt. L’objectif du projet est d’améliorer le système immunitaire du patient, en modifiant un sous type de globules blancs, afin qu’il discrimine et détruise spécifiquement les cellules cancéreuses. Une protéine sera ajoutée à la surface des globules blancs pour détecter des marqueurs tumoraux et cette détection conduira à la sécrétion localement des molécules médicaments par le globule blanc modifié. L'objectif de ce système est donc d'apporter une solution thérapeutique durable et spécifique aux cancers en : 1) éliminant les cellules tumorales, 2) favorisant les réponses immunitaires anti-tumorales, et enfin 3) prévenant les rechutes grâce à la persistance des globules blancs modifiés et à leur réactivation en cas de nouvelles poussées de la maladie.

Bénéfices attendus

L’observation d’une diminution de la croissance tumorale dans notre projet, nous permettra d’obtenir une preuve de concept de notre circuit synthétique comme solution thérapeutique durable et spécifique aux cancers.

Procédures

- Greffe sous anesthésie : Injection sous-cutanée de cellules tumorales humaines sur chaque flanc (15 min/animaux). - Co injection de lymphocytes B et T par voie intraveineuse au sinus retro-orbitale sous anesthésie (2 min maximum en prenant en compte l'anesthésie et l'injection, le réveil est quasi immédiat) - Prélèvement sanguin au sinus rétro orbital sous anesthésie locale, toutes les deux semaines en prenant soin d’alterner l’œil prélevé (moins d'1 minute). -Injection IP (moins d'1 minute en prenant en compte la contention et l'injection). Pendant 3 semaines 1 fois par semaine -Prélèvement sanguin au sinus rétro orbital, 1 fois sous anesthésie générale (moins d'1 minute). - Les animaux seront pesés une fois par semaine (environ 1 minute) pendant 30 ou 40 jours en fonction de la procédure. - Les tumeurs seront mesurées au pied à coulisse 2 fois par semaine (environ 2 minutes) pendant 30 ou 40 jours en fonction de la procédure.

Impact sur les animaux

Suite à la greffe de cellules tumorales en sous cutanée, une tumeur va se développer et peut induire des distensions et ulcérations des tissus cutanées. Dans notre cas les durées d’expérimentation ne sont pas suffisamment longues pour permettre l’installation de distension des tissus, le point limite le plus critique est l’apparition d’ulcération des tissus cutanés qui peuvent apparaître chez certains animaux avant la fin de l’expérimentation. Le phénotype des animaux est non dommageable car ils sont élevés dans les conditions appropriées (conditions d’hébergement et d’expériences). Aucune douleur n’est attendue suite aux injections et prélèvements en ip et en iv sous anesthésie gazeuse et locale. De même, la pesée et la mesure des tumeurs ne devraient pas générer de douleur.

Devenir

A l'issue des procédure 1 à 3, les animaux seront mis à mort afin d'évaluer l'efficacité anti tumorale des cellules B modifiées en analysant la croissance tumorale ainsi que l’état d’activation du système immunitaire (cellules, cytokines, anticorps) dans le sang, la rate et la tumeur seront suivies.

Remplacement

Des expériences préliminaires ont été réalisées in vitro. Cependant, on ne peut pas s’affranchir du modèle murin. Après leur injection dans le sang, les cellules B modifiées, migrent efficacement et gagnent les organes périphériques secondaires où s’effectueront les étapes de maturation dépendantes de l’antigène : ganglions lymphatiques, rate... L’architecture et l’interaction avec d’autres composants cellulaires, au niveau du centre germinatif de ces organes, vont permettre leur prolifération et leur différenciation en cellules productrices d’anticorps et en cellules mémoires. C’est alors in vivo que nous pourrons observer d’une part la circulation et l’activation de nos cellules B modifiées et par la suite l’effet anti tumoral de ces cellules.

Réduction

L’estimation du nombre d’animaux par groupe a été défini après discussion avec des statisticiens, ainsi que sur la littérature scientifique pour estimer les effets attendus et a été réduit au minimum sans mettre en péril une interprétation statistique des résultats. La greffe des différentes cellules tumorales sur une même souris a permis de réduire de moitié le nombre d’animaux utilisés dans ce projet. Le nombre d’animaux par groupe (n=8) a été déterminé en prenant en compte le pourcentage de prise de greffe (80%).

Raffinement

Les manipulations des souris NSG immunodéficientes seront effectuées sous un poste de sécurité microbiologique de type II, ce qui leur permettent d’être dans un environnement complétement stérile garantissant ainsi un phénotype non dommageable. Tout au long des expériences, nous veillerons au bien-être des animaux, à réduire au maximum la souffrance et l'angoisse des souris grâce à la mise en place d’une grille de score clinique. Une période d’une semaine d’acclimatation sera mise en place avant le début du protocole et les animaux seront maintenus en groupes sociaux. Si un animal venait à se retrouver seul, une maisonnette en carton sera mise en place dans la cage. La greffe des cellules tumorales ainsi que le suivi de la bioluminescence seront réalisées sous anesthésie isoflurane afin d’éviter toute méthode de contention prolongée. La Co-injection des cellules B reprogrammées et des lymphocytes T CD4+ par voie intraveineuse au sinus retro-orbitale sous anesthésie isoflurane avec au préalable une anesthésie locale. Les prélèvements sanguins au sinus rétro orbital seront effectués sous anesthésie locale. Un prélèvement de sang total sera réalisé à la fin de l’expérimentation, sous anesthésie profonde au sinus retro-orbital ou intra cardiaque.

Choix des espèces

La souris NSG (NOD SCID-/- gammaC-/-) (absence de lymphocytes B, T et NK) a été choisie pour son immunodéficience sévère permettant la xénogreffe de cellules humaines. D’après notre expérience les souris NSG âgées d’environ 6 semaines permettent une meilleure prise de greffe.

260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une craniotomie avec injection intracérébrale et pose d'une barre pour être enregistrées tête fixée pendant qu'elles sont éveillées, un conditionnement comportemental, puis une mise à mort par perfusion transcardiaque. Le porteur reconnaît un maintien en cage individuelle qui prive ces animaux grégaires de relations sociales, ainsi qu'un risque infectieux et l'inconfort du réveil après la chirurgie. Les bénéfices annoncés se limitent à une meilleure compréhension du cerveau présentée comme un "intérêt sociétal considérable", et il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne peut simuler la cognition.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de comprendre comment une structure clé de l'encodage de l'information spatiale et de la mémoire épisodique (l'hippocampe) est contrôlée par des catégories de neurones spécifiques, locaux (interneurones) ou issus de sa principale structure afférente modulatrice (le septum médian). Il s'inscrit dans l'objectif plus général de comprendre les propriétés des réseaux neuronaux qui sous-tendent l'encodage, le traitement et le stockage des informations ainsi que les déficits cognitifs associés aux principales pathologies cérébrales (neurodéveloppementales, neurodégénératives, épilepsie), sur des modèles expérimentaux chez le rongeur (souris).

Bénéfices attendus

Les avantages escomptés sont une meilleure compréhension du fonctionnement cérébral et de ses pathologies, ce qui représente un intérêt sociétal considérable.

Procédures

Les animaux seront soumis à 3 types d'interventions, sur une durée totale de 2 à 4 mois : procédures chirurgicales (injection intracérébrale d'agents neuromodulateurs et implantation d'une barre pour enregistrement en mode tête-fixée chez l'animal vigile), d'une durée de 1 à 6h suivie d'une période de récupération d'au moins une semaine et d'attente de l'expression des constructions virales de 2 à 4 semaines, procédure comportementale expérimentale (enregistrements en mode tête fixée chez l'animal vigile) par sessions quotidiennes de quelques minutes au départ (période d'acclimatation d'1 à 2 semaines) puis progressivement jusqu'à 2 ou 3h (période d'apprentissage et d'entrainement, sur 2 à 4 semaines), et enfin anesthésie terminale (perfusion transcardiaque), procédure d'une durée de 30 à 60 min, au cours de laquelle l'animal est mis à mort.

Impact sur les animaux

Les dommages suivants : - l'élevage d'animaux normaux et transgéniques (mais sans phénotype dommageable) - la stabulation dans des conditions standardisées (et donc monotones) afin de permettre des résultats reproductibles et comparables à ceux d'autres laboratoires - les animaux doivent être maintenus en cage individuelle pendant la periode expérimentale, entrainant un déficit de relations sociales chez des espèces grégaires - du conditionnement comportemental afin de caractériser les réseaux neuronaux pendant la résolution de tâches cognitives et d'états cérébraux contrôlés - des anesthésies (avec ou sans réveil) et interventions chirurgicales (craniotomie) afin d'injecter des constructions virales et d'insérer les électrodes d'enregistrement de l'activité cérébrale, avec le cas échant l'inconfort associé au réveil post-chirurgical et un risque infectieux - des mises à mort prématurées (euthanasie) en fin d'expérience

Devenir

Les animaux doivent être maintenus en vie jusqu'à la dernière procédure (terminale), de façon à ce que les données scientifiques soient recueillies, y compris les données histologiques post-mortem.

Remplacement

L'étude des propriétés des circuits neuronaux impliqués dans la cognition nécessite l'observation et la manipulation de systèmes neuronaux intacts, et ne peut donc se faire que sur l'animal vivant. Il est en effet à ce stade de nos connaissances impossible de modéliser de façon réaliste le fonctionnement cognitif in vitro ou in silico. Nous avons opté pour l’utilisation de la souris car elle présente le meilleur équilibre entre les bénéfices (accessibilité expérimentale et pertinence par rapport aux pathologies chez l'homme) et les dommages escomptés (souffrance liées aux conditions d'élevage ou d'expérimentation).

Réduction

Seules les expériences absolument indispensables ont été prévues, nous avons évité la répétition inutile d'études antérieures, et le protocole expérimental est soigneusement préparé. Le nombre d'animaux nécessaires pour garantir un pouvoir statistique suffisant pour chacune de nos expériences est ici de 182 souris.

Raffinement

Les animaux utilisés sont des souris transgéniques, qui expriment un marqueur moléculaire permettant de cibler spécifiquement les neurones du type d'intérêt, et de leur faire exprimer des molécules nous permettant de contrôler expérimentalement leur niveau d'activité. Il devient ainsi possible de tester des hypothèses quant au rôle de ces neurones dans le circuit de façon causale (que se passe t'il quand ces neurones sont expérimentalement activés ou au contraire bloqués) et non plus seulement corrélative (quand ces neurones sont ils actifs). Les marqueurs moléculaires spécifiques des lignées utilisées n'ont pas d'incidence sur la physiologie, en dehors des strictes périodes de manipulation de l'activité des neurones, et le phénotype des animaux est donc sans conséquence sur leur bien être. Des éléments de distraction (les animaux sont élevés en cages collectives, autant que possible, selon des normes qui respectent leur besoin d'interactions sociales, et le milieu est enrichi avec du matériel de construction du nid) sont introduits dans les cages d'élevage pour pallier à la monotonie des conditions d'élevage en laboratoire. Pour prévenir, détecter et corriger les conditions de mal-être éventuel, les animaux sont suivis de façon très régulière par du personnel spécialisé, formé et sensibilisé au bien-être animal.

Choix des espèces

Nous avons opté pour l’utilisation de la souris car cette espèce présente des similitudes neuronales et cognitives suffisantes pour assurer la pertinence des investigations menées par rapport au cerveau humain. La souris est également une espèce de choix pour modéliser les pathologies cérébrales concernées par cette étude, représentant un bon équilibre entre les bénéfices (disponibilité d'outils de biologie moléculaire, de génétique et de pharmacologie, facilité d'élevage, pertinence par rapport aux pathologies chez l'homme) et les dommages escomptés (souffrance liées aux conditions d'élevage ou d'expérimentation). En outre, une quantité de données considérable dans le domaine des Neurosciences Cognitives a été obtenue avec cette espèce, ce qui nous permet une comparaison des résultats obtenus et une minimisation du nombre d'animaux utilisés en s'appuyant sur des données publiées par d'autres équipes et obtenues à l'aide de protocoles expérimentaux similaires. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes (4-8semaines), car c'est la tranche d'âge qui donne les meilleurs résultats pour les manipulations optogénétiques (meilleur taux de succès d'infection virale, meilleure récupération post-cirurgicale, enregistrements plus faciles sur cerveau jeune du fait des propriétés physiques de la dure mère et du tissu cérébral probablement moins myélinisé) tout en permettant une expérimentation sur un système nerveux qu'on considère mature, et en minimisant autant que possible la durée d'élevage en condition d'animalerie de laboratoire.

650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales dans la muqueuse orale ou, par incision du thorax, dans le poumon, puis subissent des irradiations et des séances d'imagerie scanner sous anesthésie. Le porteur indique que la tumeur ORL peut gêner l'alimentation et la tumeur pulmonaire la respiration, et prévoit des points limites déclenchant la mise à mort. Le projet vise à entraîner des algorithmes d'intelligence artificielle sur les images, retombées cliniques présentées au conditionnel, tandis qu'il affirme que l'étude de la réponse immunitaire exige un "organisme vivant entier".

Objectifs

L'avènement de l'immunothérapie a conduit à un changement de paradigme dans le traitement de plusieurs cancers solides et hématologiques, conduisant à des résultats impressionnants en termes de survie et de réponse tumorale. Cependant, seule une fraction des patients répond à l'immunothérapie, soulignant ainsi le besoin urgent de biomarqueurs pronostiques et prédictifs. L'infiltration immunitaire tumorale est un élément essentiel de la réponse immunitaire contre le cancer, conditionnant la réponse à l’immunothérapie. Le développement de stratégies non invasives pour quantifier cette infiltration immunitaire tumorale et prédire le résultat du traitement pourraient représenter une avancée majeure. Ce projet vise à développer et tester, dans des modèles tumoraux murins, une approche basée sur l’analyse d’images radiologiques (CT-scans) combinée à des méthodes d’intelligence artificielle pour développer des algorithmes prédictifs.

Bénéfices attendus

À l'ère de la médecine personnalisée, où les stratégies thérapeutiques sont de plus en plus adaptées aux profils spécifiques des patients et des tumeurs, le développement d’algorithmes prédictifs pourrait représenter un outil précieux d'aide à la décision, guidant la prise en charge des patients atteints de cancer. La possibilité de déchiffrer de manière non invasive le microenvironnement tumoral et de suivre la réponse au traitement, par le biais de signatures radio-immunes, pourrait impacter de façon majeure la pratique clinique. De plus, l’opportunité de suivre dynamiquement et "en temps réel" l’infiltration de cellules immunitaires peut nous permettre de proposer de nouveaux traitements sur mesure. Cela pourra améliorer l’efficacité des thérapies et réduire les chances d’échec thérapeutique, en sélectionnant les patients qui ont le plus de possibilités de répondre au traitement sélectionné et en arrêtant précocement des traitements inefficaces.

Procédures

Des injections de cellules tumorales seront réalisées chez tous les animaux, soit au niveau de la babine soit au niveau pulmonaire : - Les cellules tumorales seront injectées directement dans la muqueuse orale des souris préalablement anesthésiées, avec une aguille de petit diamètre (aiguille à insuline) (durée < 5 min). - L’injection de cellules dans le poumon prévoit une petite incision chirurgicale à niveau du thorax de souris (sous anesthésie systémique) pour exposer la plèvre. L’injection sera effectuée travers la plèvre avec une aguille de petit diamètre (aiguille à insuline) (durée max 20 min). Les irradiations seront faites sous anesthésie Kétamine/Xylazine (durée 15 min) Les imageries au micro-CT seront faites sous Kétamine/Xylazine ou Isoflurane (durée 15 min)

Impact sur les animaux

Les effets indésirables chez les animaux seront occasionnés par l’injection des cellules tumorales. Des difficultés d’alimentation pour les souris avec une tumeur ORL sont possibles. Pour le modèle pulmonaire, la croissance de la tumeur peut engendrer une difficulté respiratoire. Pour ces raisons, nous avons mis en place des stratégies d'expérimentation et d'observation nous permettant de déterminer des points limites suffisamment précoces afin de limiter la douleur à son minimum. En effet, les animaux seront surveillés quotidiennement.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures expérimentales

Remplacement

Ce projet a pour but d’évaluer les effets de la radiothérapie localisée combinée ou non à des immunomodulateurs sur le microenvironnement tumoral et de suivre la réponse au traitement pour dévoiler des signatures radio-immunes. L’étude du recrutement et de la réponse des leucocytes dans la tumeur nécessite la présence d’un système immunitaire efficace dans un modèle dynamique (depuis la production des cellules dans la moelle osseuse, leur libération dans le sang, leur maturation dans les organes lymphoïdes secondaires, jusqu’au recrutement sur le site tumoral) qui ne peut pas être réalisée in vitro. Ceci met en jeu des interactions complexes nécessitant un organisme vivant entier. Les modèles murins sont imparfaits d’un point de vue purement biologique mais permettent d’étudier la réaction immunitaire anti-tumorale in vivo et ont l’avantage d’être d’une taille bien plus faible que chez l’humain, ce qui permet une inclusion en totalité des tumeurs et des tissus environnant pour une analyse histologique exhaustive. Cette inclusion en totalité ouvre une possibilité plus importante de mise en correspondance spatiale d’images histologiques et radiologiques, non réalisable en clinique, et apportera des éléments concrets quant à la réalité biologique d’hypothèses faites depuis plusieurs années en clinique. De plus, des modèles murins permettant la modulation in vivo de sous-populations spécifiques de cellules immunitaires (par exemple la déplétion vs l'enrichissement en CD8) au sein du microenvironnement immunitaire tumoral pourraient renforcer la signification biologique de notre signature radiomique. Nous envisageons pour cela un traitement personnalisé incluant radiothérapie et agents immunomodulateurs (par exemple anti-TGF beta, anti-CD8) capables d'agir sur la contexture immunitaire tumorale.

Réduction

La génération d’un algorithme prédictif et pronostique par deep learning nécessite l’analyse d’un large set de données. En effet, cela est nécessaire pour un bon entraînement des algorithmes de prédiction. De plus, il est nécessaire d’utiliser une cohorte indépendante sur laquelle tester l’efficacité des algorithmes développés. Il n’existe aucune donnée dans la littérature concernant des analyses radiomiques dans des modèles tumoraux murins. Notre estimation de 50 souris par groupe est donc basée sur des observations cliniques et sera adaptée sur la base des données obtenues pendant la réalisation du projet. En outre, les modèles murins que nous utiliserons ont déjà été testés et validés dans de nombreuses publications, et la collaboration avec Gustave Roussy nous permettra d'avoir des modèles déjà testés et performants, minimisant ainsi le nombre d'animaux nécessaires.

Raffinement

Nous avons mis en place des stratégies d'expérimentation et d'observation afin de réduire au minimum la souffrance et la douleur des animaux. Les souris seront hébergées en groupe pour minimiser le stress de l'isolement. Les animaux seront anesthésiés pour les procédures d’injection des cellules tumorales, d’irradiation et d’imagerie. De plus, l'environnement des animaux sera enrichi en permanence par du coton ou des nids en carton afin de diminuer leur angoisse et favoriser leur bien-être. Une pesée sera effectuée régulièrement. Les points limites seront strictement appliqués. - Le développement de la tumeur ainsi que les signes de toxicité (perte de pois, prostration) seront évalués 3 fois par semaine (euthanasie des souris dès qu’un point limite est atteint). -Un complément alimentaire (Renutryl, Nestlé) sera administré aux souris pour limiter les effets de l'asthénie et de l'irradiation. - Des aliments mous (pellets ramollis d’eau) pourront également être mis dans les cages pour faciliter l’alimentation des animaux

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale de référence pour les études de radiobiologie et est parmi les plus utilisées pour étudier les réponses immunitaires pendant le développement tumoral. De plus, pour des raisons de taille, de prix et de temps nous avons choisi cette espèce. La physiologie et la génétique de la souris sont de mieux en mieux connues et de nombreuses études ont déjà validé des découvertes faites chez la souris en les appliquant pendant des essais cliniques, ce qui promeut et facilite le transfert des résultats obtenus chez la souris en clinique. Les souris seront âgées de 8 ou 9 semaines, âge auquel les souris sont suffisamment matures. De plus, les modèles tumoraux ORL et pulmonaire ont été développés et caractérisés en utilisant des souris de cet âge, et nous allons maintenir ces mêmes paramètres pour cette étude.

192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié est rendue obèse et prédiabétique par un régime hypercalorique de deux à quatre mois, puis toutes sont opérées pour poser un cathéter dans l'intestin grêle et reçoivent des perfusions quotidiennes et des prélèvements de sang à la queue. Elles sont ensuite tuées pour prélever leurs organes. Le porteur présente le projet comme un "passage obligé vers la clinique" et affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité d'un organisme vivant.

Objectifs

De nombreuses bactéries vivent dans le tube digestif, elles représentent 90% du microbiote intestinal. Celui-ci régule le métabolisme énergétique et le système immunitaire. Ces bactéries produisent une grande diversité de substances bactéricides, appelées bactériocines. Ces bactériocines agissent comme des antibiotiques et permettent aux bactéries qui les produisent de se défendre contre des bactéries pathogènes. Nous utiliserons un modèle préclinique de souris, rendues obèses et prédiabétiques par un régime alimentaire riche en graisses. Ces animaux souffrent également de dysbiose. Les animaux contrôles, seront nourris avec un régime standard. Suite à des recherches bibliographiques, nous avons sélectionné une bactériocine, qui pourrait avoir un effet bénéfique sur l’homéostasie glucidique et la composition du microbiote intestinal. Nos résultats précédents nous ont permis de démontrer l’effet positif d’un traitement intra-péritonéal avec cette molécule sur la tolérance au glucose et la sécrétion d’insuline chez des souris prédiabétiques. Ainsi, ce peptide est potentiellement une cible d’intérêt via un effet direct sur des tissus cibles. Nos derniers résultats ont également montré que, lorsque ce peptide est administré par voie orale pendant plusieurs jours, celui-ci est dégradé au niveau du duodénum. Ainsi il n’atteint pas le colon, au niveau duquel il pourrait avoir un effet bénéfique sur la composition du microbiote intestinal. Ce peptide est produit naturellement dans l’intestin et il agit sur son environnement immédiat en participant à l’équilibre de l’écosystème microbiotique. C’est pourquoi nous aimerions l’administrer quotidiennement par voie entérique, à l’aide d’un cathéter placé directement au niveau iliaque de l’intestin grêle chez la souris. Notre projet vise à étudier et valider la preuve de concept du rôle de ce peptide en tant que régulateur de l'homéostasie du glucose et ayant un effet bénéfique sur la composition du microbiote intestinal. Ainsi cette molécule pourrait constituer une nouvelle classe de médicaments pour le traitement du diabète de type 2. Au cours de cette étude, qui durera 5 ans, nous utiliserons 192 animaux.

Bénéfices attendus

Le peptide que nous utilisons est produit naturellement dans l’intestin et il agit sur son environnement immédiat en participant à l’équilibre de l’écosystème microbiotique. Dans des situations de déséquilibre de cet écosystème, comme observé dans les situations d’obésité ou de diabète de type 2 (DT2), une administration par voie entérique de notre molécule pourrait avoir des effets sur la composition du microbiote intestinal et sur la régulation de l’homéostasie glucidique. Notre projet vise à étudier et valider cette preuve de concept, et pourrait constituer une nouvelle classe de médicaments pour le traitement du diabète de type 2.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1. La moitié des animaux sera nourrie avec un régime hypercalorique pendant 2 à 4 mois, ainsi ces animaux deviendront prédiabétiques. 2. Les animaux seront opérés pour placer un cathéter dans l’intestin grêle. Ils seront opérés une fois, la chirurgie sous anesthésie générale dure 45 minutes. 3. Les animaux seront perfusés une fois par jour pendant 10 minutes, pendant 5 jours. Puis ils auront 2 jours de pause avant d’être à nouveau perfusés une fois par jour pendant 10 minutes, pendant 5 jours. Les animaux seront vigiles. 4. Les animaux seront utilisés pour faire des tests : deux fois pendant deux heures, à 7 jours d’intervalle. Pendant ces 2 heures nous mesurerons leur glycémie 6 fois et nous prélèverons un petit volume de sang (au bout de la queue, 4 fois). Les animaux seront vigiles.

Impact sur les animaux

Pour tous nos protocoles nous veillons à diminuer les effets indésirables prévus sur les animaux. Nous utilisons un régime alimentaire riche en gras, pour rendre nos animaux obèses, mais nous leur laissons le régime standard pour que les animaux aient toujours le choix. Malgré leur prise de poids, les animaux se déplacent correctement. Pour la chirurgie nos animaux reçoivent des soins avant, pendant et après l’opération afin d’éviter toute souffrance. Nous les surveillons tous les jours après l’opération jusqu’à leur rétablissement. Avant d’effectuer des tests sur nos animaux, nous les habituons pour diminuer leur stress le jour de l’expérience. Pendant l’expérience, nous respectons les volumes de prélèvement et d’administration autorisés, et nous les surveillons.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure, car nous avons besoin de prélever leurs organes pour les analyser ultérieurement.

Remplacement

Notre projet correspond à un travail de phase préclinique visant à tester l'effet anti-diabétique d'une nouvelle molécule. C'est donc un passage obligé vers la clinique et l'Homme. Il n'existe pas actuellement de modèle in vitro permettant de reproduire la complexité d'un organisme vivant. Enfin, nos modèles murins, à savoir les souris C57BL6j mâles rendues obèses par régime hypercalorique, sont très bien caractérisées au niveau métabolique depuis plusieurs dizaines d'années dans plusieurs laboratoires, dont le nôtre.

Réduction

Dans le domaine de la diabétologie et vu le type de mesures que nous allons effectuer, nous limiterons au maximum le nombre d’animaux par groupe (n=8) de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables et pertinents.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et la prise en charge de la douleur est prévue avant, pendant, et après l’opération. L’ensemble des procédures de ce projet visent à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal.

Choix des espèces

Les souris ont une physiologie métabolique proche de l'Homme notamment en ce qui concerne la régulation de la glycémie; et sont souvent utilisées comme modèles de pathologies humaines, comme l'obésité et le diabète de type 2. De plus, nous voulons tester l'effet de notre molécule sur un modèle animal, dans la perspective de la tester ensuite dans une phase clinique humaine. Afin d'obtenir des souris obèses et prédiabétiques, nous devons les soumettre à un régime hypercalorique, à partir de l'âge de 8 semaines, pendant 2 mois. Ainsi, toutes nos expériences seront réalisées sur des souris adultes d'un âge minimal de 4 mois. Utiliser des animaux adultes mime la situation chez l'Homme où le diabète de type 2 apparait également à l'âge adulte.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont la moitié vigiles au moment de la mise à mort, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souris transgéniques modèles de la maladie d'Alzheimer, elles subissent une chirurgie pour implanter une pompe délivrant le traitement, des tests comportementaux, puis sont tuées pour analyser le cerveau. Les souris perdant plus de 15 % de leur poids ou montrant prostration ou agressivité sont mises à mort. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas de modèles alternatifs validés" et que l'euthanasie est "incontournable".

Objectifs

La maladie d’Alzheimer sous sa forme sporadique est le résultat d’interactions fortes entre des facteurs génétiques et environnementaux. La cause primaire et les mécanismes sous-jacents restent à ce jour inconnus, mais un lien important semble exister entre la maladie d'Alzheimer et le stress. Cependant, le rôle du stress dans cette maladie est très mal connu. Il nous a donc semblé important de caractériser de façon précise l’implication des hormones du stress (les glucocorticoïdes) dans la maladie d'Alzheimer et d’évaluer le potentiel thérapeutique des glucocorticoïdes, grâce à l’utilisation de nouveaux modulateurs sélectifs de leurs récepteurs (sGRm), dans un modèle préclinique de la maladie d’Alzheimer, la souris transgénique J20. Ce projet comprend 2 objectifs principaux: Déterminer l’impact d’un traitement chronique (4 semaines) avec un modulateur sélectif des récepteurs aux glucocorticoïdes sur l’évolution de la pathologie Alzheimer chez des souris J20 ; et d’évaluer l'efficacité de ce traitement chronique à long terme.

Bénéfices attendus

La maladie d’Alzheimer est le résultat d’interactions fortes entre des facteurs génétiques et environnementaux. La cause primaire et les mécanismes sous-jacents au développement de la maladie d'Alzheimer restent à ce jour inconnus, mais un lien important semble exister entre la maladie d'Alzheimer et l’hypersécrétion précoce des hormones du stress ou glucocorticoïdes. Cependant, le rôle de ces hormones, ainsi que leur potentiel thérapeutique dans la maladie d'Alzheimer reste très méconnu. L’objectif de cette étude sera donc d’évaluer le potentiel thérapeutique d’une nouvelle famille de molécules très sélectives modulant l’activité des récepteurs aux glucocorticoïdes. Si l’efficacité de ces modulateurs sélectifs est démontrée, une étude clinique chez des patients atteints de la maladie d'Alzheimer pourra être envisagée très rapidement, dans la mesure où les tests de toxicité chez l’homme ont été validés sur cette famille de composés et que l’une de ces molécules est déjà en clinique (Phase II) dans le cadre d’une autre pathologie associée aux stress.

Procédures

L’ensemble des animaux (160 animaux) seront soumis à une procédure chirurgicale pour la mise en place de la pompe osmotique (durée 5 minutes sous anesthésie gazeuse), à des tests comportementaux et enfin seront mis à mort pour l’analyse des tissus cérébraux. Mise à mort sur animaux anesthésiés (80 animaux) ou vigiles (80 animaux). Les animaux seront suivis entre 4 (80 animaux) et 8 semaines (80 animaux).

Impact sur les animaux

L’incision nécessaire à l’introduction de la pompe osmotique délivrant le traitement peut entrainer un inconfort temporaire (dans les 24h suivant la chirurgie), et induire un grattage plus important au niveau de la cicatrice. Afin d'éviter au maximum cet effet lié à la cicatrisation, l’incision est réalisée au niveau de la nuque de l’animal, une zone moins accessible au grattage.

Devenir

Dans la mesure où il sera nécessaire d’étudier l’impact des différents traitements sur le cerveau, l’euthanasie des souris est incontournable.

Remplacement

De manière très générale, il est aujourd’hui très difficile en neurosciences d’étudier le fonctionnement du cerveaux sur des modèles simplifiés et donc de remplacer l’étude sur l’animal dans sa globalité. En effet, il n'existe pas de modèles alternatifs validés pour étudier la neurodégénérescence et le déclin cognitif dans la maladie d’Alzheimer.

Réduction

Le nombre d’animaux est calculé pour ne pas compromettre les objectifs du projet. Le nombre d'animaux est basé sur une connaissance approfondie des modèles et de l'expérience acquise par notre équipe. Le nombre d'animaux a été déterminé par un logiciel de statistique.

Raffinement

Afin de minimiser les effets du stress, mais également de contrôler l’état général des animaux, l’animalier, et/ou l’expérimentateur, manipuleront quotidiennement les animaux et observeront le comportement général de l’animal, ainsi que leur apparence. Toute observation anormale (comportement, poids, pelage, plaie,…) sera transmise à l’expérimentateur afin d’être traitée dans les plus brefs délais et sera noté dans un tableau de suivi expérimental. Un animal sera euthanasié s’il présente, une perte de poids > 15%, une attitude inhabituelle traduisant un mal être (prostration, agressivité...), ou l’apparition de toute altération de l’état général (altération du pelage, tumeur, excroissance, prolapsus…).

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix au niveau international pour l’étude de la physiopathologie de la maladie d’Alzheimer. Ces études chez l’animal vigile sont nécessaires pour appréhender des mécanismes intégrés et pour évaluer la pertinence de traitements potentiels. De plus, l'utilisation d'animaux transgéniques (modèle de la maladie d’Alzheimer) justifie également le choix de cette espèce. Nous allons réaliser le traitement chronique sur le modèle souris Alzheimer entre 6 et 9 mois. C’est-à-dire à un âge où ces souris présentent des déficits comportementaux, et une augmentation des différents marqueurs biochimiques associés à la physiopathologie Alzheimer, mais aussi une hyperactivité de l’axe du stress (augmentation des taux sanguins en glucocorticoïdes).

64 macaques à longue queue vont être utilisés, réutilisés après avis vétérinaire plutôt que tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, chaque macaque reçoit trois fois une injection de curare qui paralyse sa respiration, compensée par une ventilation assistée, puis des prélèvements de sang répétés, jusqu'à cinq fois par semaine. Le projet teste des anticorps censés lever le blocage neuromusculaire après curarisation, en vue d'un usage chez l'humain. Le porteur affirme que ces réactions affectent "l'organisme entier" et que les procédures ont un caractère de "stricte nécessité".

Objectifs

Les curares sont des composés fréquemment utilisés comme anesthésiants dans les services de chirurgie ou de réanimation. Leurs propriétés paralysantes induisent un blocage neuromusculaire, indépendamment de la sédation, qui facilite notamment les procédures d'intubation et évitent les réflexes musculaires lors des interventions chirurgicales. Même si les curares utilisés en anesthésie sont des molécules relativement sûres induisant peu de réactions adverses sévères (1 patient sur 10 000), il est impossible de prédire leur durée d'action. La curarisation résiduelle, qui ne peut être écartée qu'à l'aide d'un monitorage instrumental quantitatif, est une complication majeure (jusqu'à 83% des patients), responsable d'insuffisances respiratoires et de troubles de la déglutition à l'origine d'une inhalation pulmonaire de liquide gastrique, entraînant un allongement de la durée de séjour à l'hôpital, un engorgement inutile des services de réanimation et une hausse de la mortalité. Pour stopper rapidement la curarisation d'un patient, un antidote est administré après l'intervention pour lever le blocage neuromusculaire. Dans la majorité des cas de curarisation, la décurarisation est obtenue par injection d’une molécule synthétique efficace dès les premières minutes qui suivent l'injection du curare. Cependant, des réactions allergiques ayant été rapportées, ce composé est de moins en moins utilisé en routine clinique. Il est donc particulièrement intéressant d'identifier de nouvelles molécules.. Leur efficacité sera évaluée à l’aide de la méthode de « train of four », utilisée quotidiennement dans les services d’anesthésie qui permet le suivi du niveau de curarisation. Ce projet a pour objectif de caractériser la capacité d'anticorps monoclonaux à lever le blocage neuromusculaire induit par une curarisation au rocuronium. Des études chez des souris immunisées contre le rocuronium ont permis d'identifier plusieurs anticorps qui captent le rocuronium avec des affinités très élevées. Dans ce projet, l'efficacité de ces anticorps sera évaluée chez le Primate Non-Humain, pour, à terme envisager une utilisation chez l'humain, soit en urgence (échec d'intubation), soit en routine clinique afin de lever rapidement le blocage neuromusculaire. Des anticorps monoclonaux dirigés contre d’autres curares (vecuronium, atracurium, succinylcholine et cisatracurium) seront évalués selon le même schéma expérimental.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de caractériser la capacité d’anticorps à lever le blocage neuromusculaire induit par des curares utilisés en anesthésie. En effet, pour faciliter l’intubation et la chirurgie, on cherche à relâcher les muscles du patient en particulier les muscles respiratoires. Jusqu’à la fin de l’intervention médicale, l’effet des curares doit être maximal, mais le patient reste sous l’effet des curares pendant des périodes plus ou moins longues (30-90min), ce qui empêche de le réveiller de son anesthésie. Cette persistance de l’action des curare conduit à encombrer les services de réanimation. On cherche à diminuer cette durée par l’administration de composés capables de capturer le curare (« antidote ») et de lever le blocage neuromusculaire. Une conséquence à plus long terme de ce projet permettrait de limiter le temps de passage des patients en salle de réveil dans les services de réanimation. Plusieurs anticorps monoclonaux anti-curareont été identifiés à partir de souris immunisées. Leurs très fortes affinités in vitro suggèrent que des anticorps anti-curare pourraient être utilisés dans le cadre de la décurarisation soit en urgence (échec d’intubation), soit en routine clinique afin de de lever rapidement le blocage neuromusculaire.

Procédures

Ce projet contient 2 procédures pour lesquelles les animaux recevront, sous anesthésie générale, une injection de curare pour provoquer le blocage neuromusculaire. La paralysie de l'activité respiratoire provoquée par une dose proche ou supérieure à la dose nécessaire pour l'obtention d'un bloc neuromusculaire à 90 % sera compensé par la mise en place d’une ventilation assistée. Chaque animal subira une série de 3 anesthésies avec curarisation et respiration sous ventilation assistée. Cette procédure ne dépassera pas une heure. Des prélèvements sanguins seront réalisés durant les 72 heures suivant l’administration, mais des prélèvements a plus long terme sont envisageables pour évaluer la persistance du produit dans les semaines qui suivent. Des prélèvements de sang par ponction veineuse (7.5% de la volémie sanguine totale/semaine maximum), 5 fois/semaine sous anesthésie seront effectués pour le suivi clinique, hématologique et biochimique des PNH.

Impact sur les animaux

Il n’est pas attendu de douleur particulière liée aux interventions. En cas de réaction allergique au produit injecté, un traitement corticoïde et une prise en charge symptomatique sera envisagée. Il pourrait il y avoir un syndrome fébrile d’environ 1 à 2 semaines avec fièvre, diminution de l’activité et perte d’appétit. L’utilisation d’antalgique n’est pas prévue de façon systématique mais elle pourra être mise en œuvre en fonction d’éventuels signes cliniques de douleur - non attendue - (comportement anormal de l’animal : position antalgique, poil hérissé, gémissement).

Devenir

Tous les PNH seront réutilisés après avis vétérinaire

Remplacement

Les thérapies étudiées dans ce projet font intervenir des réactions qui affectent l'organisme entier, et qui se déploient notamment dans la circulation ainsi que plusieurs tissus et organes. Il est donc impossible de les modéliser de façon pertinente ni de les étudier dans des modèles in vitro. Nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information biologiquement pertinente. L’ensemble des anticorps testés chez le Primate Non-Humain auront été préalablement sélectionnés in vitro sur des lignées cellulaires de muscles ou de tissus puis dans un modèle rongeur sur des critères de sécurité et d’efficacité.

Réduction

De nombreux tests in vitro ont permis de sélectionner, parmi la trentaine d’anticorps anti-rocuronium candidats, les cinq présentant la meilleure affinité. Ces cinq anticorps ont été testé en prophylaxie chez la souris pour la prévention de curarisation, afin d’en identifier deux avec le potentiel le plus important. De la même façon, les anticorps contre succinylcholine, cisatracurium atracurium et vecuronium les plus prometteurs seront sélectionnés. À partir de plus d’une centaine d’anticorps, nous réduisons ainsi le nombre d'anticorps à tester chez le primate non-humain à seulement 8. De plus, pour réduire encore d’avantage le nombre d'animaux prévu dans ce projet, la méthode choisie nous permettra de réaliser plusieurs injections séquentielles sur un même animal.

Raffinement

La méthode nécessitant une anesthésie générale par définition, les animaux ne sont pas vigiles durant la durée de l’expérience. Les mesures sont non-invasives. L’animal n’est pas euthanasié durant la procédure. Des points limites ont été définis. L’état général des animaux est suivi quotidiennement. En cas de modification du comportement un signalement est fait au vétérinaire. Nous allons observer particulièrement les réactions locales sur la peau (démangeaisons, rougeurs, gonflements). Le poids et la température seront suivi à chaque anesthésie. Les animaux seront hébergés en groupe permettant des interactions sociales pendant l’étude avec un programme d’enrichissement décrit par la structure de bien-être animal de l’établissement : distribution 2 fois par semaine d’enrichissements destructibles de type peebletoy ou sachet surprise. La structure du Bien Etre Animal pourra être alertée en cas d’évènement anormal.

Choix des espèces

Les Primates Non Humains adultes, grâce à leur proximité phylogénétique avec l'humain, leur système cardiovasculaire et leur réponse immunitaire matures, permettent de reproduire la physiopathologie observée chez l'humain en cas d’administration de curares à des doses similaires à celles administrées chez l'humain. De plus, les outils d’évaluation de l’efficacité de curarisation utilisés chez l'humain sont utilisables chez le primate en parallèle de la mise en place d’un ventilation assistée, reproduisant ainsi le contexte clinique chez l'humain.

1 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de cancer du sein triple négatif, puis un suivi hebdomadaire par imagerie et des contentions répétées pour mesurer la tumeur, celle-ci pouvant atteindre 2 000 mm³ avant la mise à mort, avec perte de poids et parfois nécrose. Elles sont ensuite tuées pour prélever tumeur, poumons et rate. Le porteur affirme que ces phénomènes "ne peuvent être reproduits in vitro" et conclut que le recours aux animaux est "indispensable".

Objectifs

Les cancers figurent parmi les principales causes de morbidité et de mortalité dans le monde. Les origines du cancer sont multiples et font intervenir à la fois des facteurs génétiques et des agents extérieurs. Il a été démontré que la suractivation et/ou la surexpression de la protéine Rac1 (membre de la superfamille des protéines Rac) entraine l’initiation de différentes étapes de l’oncogénèse telles que la progression, l’invasion tumorale et la formation de métastases. Ces résultats suggèrent que l’inhibition de l’activité de Rac1 serait une nouvelle stratégie thérapeutique contre la progression tumorale et des métastases. Notre objectif général est de développer de nouveaux inhibiteurs de Rac1. Après un programme de recherche dédié à l’identification de nouveaux inhibiteurs, nous avons sélectionné une molécule « lead » qui inhibe spécifiquement la protéine Rac avec une efficacité et une affinité supérieure aux molécules commerciales (EHT1864 et NSC23766). Les propriétés thérapeutiques anti-métastatiques de cette molécule lead ont été évaluées dans des modèles murins de cancer du sein triple négatif . Les résultats prometteurs de cette étude nous ont amenés à développer une série chimique issue de notre molécule lead pour optimiser ce nouvel inhibiteur de Rac et envisager une utilisation clinique. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer les effets anti-tumoraux de ces nouvelles molécules sur la croissance tumorale, le système immunitaire et la survie à l’aide de modèles murins ( immuno-compétents et immuno-déficients) de cancer du sein triple négatif

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’identifier et de caractériser de nouveaux inhibiteurs de Rac. Au regard de nos premiers résultats, ces inhibiteurs devraient présenter des propriétés anti-tumorales et anti-métastatiques. Ainsi le développement de ces molécules permettrait d’envisager de nouveaux traitements (first in class) dans de nombreux cancers invasifs tels que le cancer du sein ou le cancer du côlon pour lesquels les impasses thérapeutiques sont nombreuses, menant au décès du patient.

Procédures

Les animaux (n=1800 maximum) subiront une greffe de cellules de cancer du sein (modèle triple négatif). Une imagerie sera réalisée sur tous les animaux une fois par semaine pour suivre l’évolution des métastases. Tous les animaux seront également soumis à une contention (2 fois par semaine pendant 40 jours maximum) pour évaluer la croissance tumorale (mesure au pied à coulisse). Aucun prélèvement sera réalisé sur animal vigile.

Impact sur les animaux

Ces 2 modèles de cancer du sein triple négatifs sont maitrisés dans notre laboratoire depuis plusieurs années. Notre première étude met en évidence que l’injection chronique d’un inhibiteur de Rac1 n’induit pas de toxicité chez l’animal mais permet de diminuer la fréquence des métastases, le volume de la repousse tumorale et augmente statistiquement la survie des animaux. Les 2 procédures expérimentales consistent à effectuer des greffes sous-cutanés chez des souris. Ce geste chirurgical de grade modéré peut entrainer une légère douleur et une irritation passagère qui seront surveillées et contrôlées par une médication appropriée et décrite dans cette saisine. L’évolution de la tumeur sera surveillée tout au long du protocole pour limiter les nuisances liées au modèle. En effet, par exemple la taille de la tumeur ne doit pas entraver la mobilité de la souris. Par conséquent, si la tumeur atteint 2000mm3, point limite de ces procédures, la souris sera mise à mort. Dans ce type de modèles, les nuisances attendues sont également une perte de poids (ou une non prise de poids, surtout au début du protocole) et parfois une nécrose au niveau de la tumeur peut également apparaitre. Les nuisances attendues dans ce type de modèle devraient être moindre chez les souris traitées avec les inhibiteurs de Rac1.

Devenir

Procédure 1 : Mise à mort des animaux au maximum 40 jours après le début des traitements ou si un point limite est atteint. Procédure 2 : Mise à mort des animaux faite pour récupérer la tumeur, les poumons et la rate. Ces prélèvements biologiques post-mortem seront nécessaires pour étudier et caractériser les lymphocytes infiltrant la tumeur

Remplacement

Le cancer et la formation des métastases sont des phénomènes complexes qui font intervenir de multiples étapes et de nombreux acteurs conduisant en particulier à l’échappement des cellules cancéreuses de la tumeur primaire et leur dissémination dans l’organisme. Tous ces paramètres ne peuvent être reproduits in vitro c’est pourquoi le recours aux animaux est indispensable.

Réduction

Ce projet utilisera au maximum 1800 souris sur 5 ans. L’utilisation d’une technique d’imagerie permet de suivre au cours du temps de façon non invasive la taille des tumeurs ainsi que la cinétique d’apparition des métastases et d’autre part d’évaluer l’efficacité des traitements. Cette approche permet de réduire de façon notable le nombre d’animaux nécessaires par groupe. Cette approche permet également de visualiser et quantifier le volume des tumeurs et donc, en parallèle de l’observation comportementale, de pouvoir adapter l’analgésie à mettre en place et de déterminer le jour auquel il faut procéder à l’euthanasie de l’animal. De plus, en cas de résultats négatifs d’une molécule testée dans la 1ère étape expérimentale, l’étape 2 ne sera pas engagée ce qui réduira considérablement le nombre de souris utilisées (soit 240 souris/molécule testée). Nous utiliserons un test de Mann-Whitney pour les analyses intergroupes, un test de Wilcoxon pour les intragroupes et un test de Log-rank sera utilisé pour l’analyse de la survie. Une p-value inférieure à 0.05 sera considérée comme significative.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement par des personnes expérimentées afin d’assurer le bien-être des animaux et détecter toute souffrance. Uniquement le personnel qualifié et expérimenté réalisera les expérimentations animales afin que les procédures soient réalisées efficacement et avec les soins appropriés afin de réduire au maximum le stress et la souffrance des animaux. Les animaux seront hébergés 3 à 5 par cages et les cages sont enrichies avec des frisottis. Le cycle jour/nuit de 12h des animaux sera respecté

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour étudier la croissance de tumeurs primaires et de métastases issues de cellules cancéreuses humaines (modèles de xénogreffes sur souris immunodéprimées) et murines (modèles syngéniques sur souris immunocompétentes). Pour cette étude, nous utiliserons de jeunes femelles adultes (âgées de 8 semaines) pour bénéficier de l’influence hormonale sur la croissance tumorale (tumeur mammaire)

15 920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le modèle leur impose de sévères atteintes du squelette, cyphose, scoliose et déformation de la cage thoracique, et une espérance de vie réduite par le risque de rupture de l'aorte, entre 27 et 240 jours. Elles reçoivent des injections, jusqu'à six prélèvements de sang et une biopsie de l'oreille, puis sont tuées pour analyse des organes. Le porteur annonce un bénéfice "éventuel à long terme" pour les patients atteints de cette maladie rare et affirme que le projet "ne peut pas se faire sans modèle animal".

Objectifs

L’objectif de ce projet est de développer une nouvelle approche thérapeutique pour une maladie des os avec des troubles cardiovasculaires. En effet, il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement curatif pour cette maladie. Les seules approches thérapeutiques actuellement utilisées sont des approches palliatives et seulement pour les symptômes cardiovasculaires de la maladie.

Bénéfices attendus

Le projet va nous permettre de faire la preuve de concept chez l’animal d'un traitement pour cette maladie. Il s’agit d’une maladie rare sévère pour laquelle à l’heure actuelle il n’existe aucun traitement. Dans le cas où cette approche fonctionnerait cela nous permettrait de continuer le développement dans le but d’apporter un jour un traitement efficace pour les patients. Il s’agit donc d’un bénéfice éventuel à long terme pour ces patients.

Procédures

Les animaux sont soumis à des injections traitements (30 secondes), ainsi que des prélevements de sangs (5 minutes). Les prélèvements de sang sont sur animal anesthésié et un animal aura maximum de 6 prélèvements dans sa vie. Les animaux auront également une biopsie d'oreille pour déterminer s'ils sont porteurs de la maladie (20 secondes).

Impact sur les animaux

Le modèle de souris utilisé dans ce projet a d’importantes atteintes squelettiques comprenant une sévère cyphose, une scoliose et une surcroissance de la cage thoracique ainsi qu’une espérance de vie réduite due à une importante probabilité de rupture aortique. Il est connu que l’espérance de vie de ces animaux est de 27 à 240 jours notamment à cause des problèmes vasculaires intervenant à des âges différents selon les animaux et ne pouvant donc pas être prédits. Cependant ces animaux arrivent à se déplacer et manger. Toutes ces altérations sont caractéristiques de la pathologie.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés. En effet, le projet nécessite d'étudier la structure des organes afin de vérifier l'efficacité du traitement testé et cela ne peut se faire que sur animal euthanasiés.

Remplacement

Globalement, la construction des traitements et l’optimisation de ces derniers se sont faites et continuent à se faire en se basant sur des publications scientifiques, et sur un certain nombre de tests in vitro réalisés. Les différents traitements produits sont précédemment testés in vitro afin de valider leur efficacité. Une importante recherche bibliographique a été effectuée afin d’identifier les cellules atteintes lors de la pathologie et ainsi développer un traitement le plus ciblé possible.

Réduction

Le juste nombre d’animaux a été calculé de manière à réduire le nombre minimum d’animaux par lot, tout en produisant des résultats statistiquement significatifs et robustes. De manière à répondre aux exigences de réduction, nous allons utiliser des groupes contrôles en commun chaque fois que cela est possible. Globalement, un ensemble de 10-12 animaux par groupe sera suffisant pour valider l’efficacité d’un traitement.

Raffinement

​Les animaux sont hébergés en groupe à maximum 5 par cage . Chaque cage contient des enrichissements de type tige en papier, igloo et buchette de peuplier afin de satisfaire l’instinct naturel des souris à ronger et éviter les malocclusions des incisives. Le suivi quotidien (weekends et jours fériés inclus) des animaux par le personnel de l’établissement utilisateur et les visites régulières des expérimentateurs (à minima trois fois par semaine) nous permettront de déceler précocement tout signe de souffrance ou d’angoisse et nous appliquerons strictement les points limites définis. En cas d'altération de l'état de l'animal, la surveillance sera rapprochée et les animaux seront soignés en fonction de la sévérité de la douleur observée. Les procédures mises en place dans ce projet ne nécessitent aucune analgésie particulière. En cas d'apparition d'une souffrance ou toxicité inattendue, les animaux seront exclus de l'étude et mis à mort dans les 24 heures avec l’accord du directeur d’étude et/ou d’un vétérinaire.

Choix des espèces

Ce projet ne peut pas se faire sans modèle animal car avant de pouvoir envisager un traitement, et de commencer une étude clinique sur les patients souffrant du Syndrome de Marfan, il est nécessaire de démontrer que les molécules choisies ont l'effet attendu au niveau du modèle animal de la maladie, et qu'elles ne présentent pas d'effets toxiques majeurs. Ce modèle de souris est pertinent car il a été construit pour mimer la pathologie et plusieurs études démontrent que les principales caractéristiques de la pathologie sont retrouvées dans ce modèle. Les animaux seront utilisés de la naissance jusqu’à environ 24 semaines maximum afin de pouvoir caractériser chacune des étapes du développement de la pathologie.