Procédures modérées

10 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie de deux heures pour implanter des électrodes et un dispositif d'enregistrement sous la peau, reste isolé cinq semaines, puis est exposé à des odeurs et images de chats pour provoquer un stress de prédation. Le porteur reconnaît que l'isolement prive l'animal de son comportement social et que la présence simulée d'un prédateur induit "probablement" un stress, objet même de l'étude. Ce projet préliminaire vise à obtenir des données pour une demande de financement, et les animaux sont tués pour analyser leur cerveau et les tissus entourant l'implant.

Objectifs

Ce projet utilisant un nombre réduit d’animaux (n=10) est une demande préliminaire à une demande ANR jeune chercheur. Il a pour but de valider la fonctionnalité et la pérennité d’un système d’enregistrement électrophysiologique, la tolérance de l’animal à l’implantation sous cutanée du dispositif dans une durée de 30 jours maximum. Il aura également pour but d’exposer le rat à un contexte de prédation, uniquement sous réserve d’une totale cicatrisation des plaies et de scorage de suivis nuls. Cette expérience permettra de récolter des données préliminaires de sommeil simulant l’exposition à un contexte de prédation le plus écologique possible. Ces données serviront de base à une resoumission de projet à l’ANR en mars 2022. L’objectif global de l’ANR est de comprendre comment la prédation (l'un des principaux facteurs de sélection naturelle) a façonné le phénotype et l'évolution du sommeil. En effet, l’omniprésence du sommeil dans le règne animal suggère qu'il est essentiel à la survie, cependant, le sommeil et ses sous-états restent mal compris. Les animaux exposés à la prédation doivent être plus vigilants pour augmenter leur chance de survie, cependant quand ils dorment ils sont potentiellement plus vulnérables car moins sensibles à leur environnement. Le sommeil constitue donc un comportement extrêmement risqué pour de nombreuses espèces. Pour cette raison, la pression de prédation a été proposée comme explication de la diversité des habitudes de sommeil observées chez les mammifères et autres animaux. Une variabilité de certaines caractéristiques du sommeil, telles que sa durée quotidienne chez les paresseux, les quantités relatives de sommeil paradoxal et sommeil lent chez les rats, la durée quotidienne de sommeil chez les rats, le sommeil unihémisphérique chez les canards et la fragmentation du sommeil chez les colombes, a pu être corrélée indirectement avec une pression de prédation. Cependant, aucune étude n'a testé expérimentalement (sur des animaux élevés en laboratoire ou sauvages) comment les phénotypes du sommeil à plusieurs niveaux (physiologie, activité cérébrale, métabolisme et comportement) sont affectés par la pression de prédation, et si les processus associés à cette interaction sont plastiques (régulé par les effets environnementaux) ou génétiques et donc héréditaires. C’est le but de du projet ANR, qui se basera sur l’étude du sommeil de populations de rats sauvages ayant grandi avec ou sans prédation.

Bénéfices attendus

Outre l’obtention de données préliminaires qui permettront grandement d’augmenter les chances de financement, ce projet permettra le développement d’une méthodologie d’enregistrement complet du sommeil des animaux en conditions semi-naturelles. En effet, le développement d’un implant sous cutané, miniature, de grande autonomie, dédié au sommeil ouvre de nouvelles perspectives pour une meilleure compréhension des animaux en veillant à leur bien être puisqu’ils ne seront plus équipés de câble et pourrons même être, à terme, stabulés en groupe. C’est une vraie amélioration d’un point de vue qualité et quantité des données acquises, permettant ainsi de répondre à des questions plus complexes tout en limitant le nombre d’animaux. Enfin, étudier l’effet de la prédation sur le sommeil permet aussi de comprendre le lien entre stress/peur et sommeil, deux états étroitement liés et source de nombreux troubles chez l’homme.

Procédures

Les 5 animaux seront isolés durant les 5 semaines prévues pour la procédure. Ils subiront une anesthésie générale pour une intervention chirurgicale consistant à implanter des électrodes pour les enregistrements des paramètres physiologiques (activités cérébrales, musculaires, oculaires, cardiaques et température) et un dispositif autonome sous cutané de récolte des données physiologiques pendant 40 jours. La durée de l'intervention chirurgicale durera 2 heures maximum. Après 15 jours de récupération et validation de la tolérance à l'implant sous cutané et 1 semaine pour ceux ayant un implant externe, les animaux seront exposés au protocole de prédation pendant 1 semaine (à raison de 2 fois 3 heures par jour).

Impact sur les animaux

Ils subiront d’abord une anesthésie générale pour une chirurgie implantatoire (pose d’électrodes pour les enregistrements électrophysiologiques du sommeil et d’un implant sous cutané au niveau dorsal pour enregistrer le sommeil en autonomie totale). La procédure chirurgicale de la pose des électrodes est maitrisée. Le caractère novateur de ce projet d’un point de vue expérimental sera la présence d’un implant sous cutané dont la taille a été réduite au maximum (1cm x 4cm x 1.5cm et 15g) et rendu biocompatible (encapsulation en silicone). Ceci pourra donc entrainer une gêne pour l’animal. C’est d’ailleurs ce que nous chercherons à évaluer et à éviter grâce à un suivi quotidien des animaux et à l’optimisation de notre implant. Enfin, si l’aspect implantation sous cutané est validé et ne pose aucun problème aux animaux, durant les 15 jours de récupération, ils seront exposés individuellement et de façon périodique pendant une semaine des stimuli olfactifs et visuels provenant de chats. Bien que les animaux soient en totale sécurité dans leur cage dotée d’un abri, ils vont ressentir probablement un stress dû cette présence. C’est d’ailleurs aussi tout l’objet du projet, évaluer l’impact de ce stress sur leur sommeil. Enfin, dans l'intérêt de leur bonne récupération, l'obtention de résultats reproductibles en éliminant toute interférence provoquée par l'effet groupe, les rats seront isolés durant les 5 semaines de la procédure. Ils n'auront donc pas la possibilité d'exprimer leur comportement social durant cette procédure.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure. Bien que rendu biocompatible, il sera nécessaire d'évaluer le degré de tolérance de l'implant sous cutané. Pour cela, l'implant sous cutané sera retiré. Les données d'enregistrements seront récoltées et les tissus environnants seront prélevés pour effectuer une analyse histologique qui nous indiquera le degré éventuel d'inflammation provoqué par sa présence. De plus, il sera primordial de prélever le cerveau des animaux et d'analyser histologiquement les potentielles structures cérébrales impactées par le contexte de prédation et les perturbations attendues du sommeil.

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer le modèle animal dans le cadre de ce projet qui s’intéresse à la réponse complexe d’un organisme. Le rat est le modèle idéal de par sa taille, sa disponibilité et l’étendu des connaissances que nous avons déjà sur sa physiologie.

Réduction

En augmentant la quantité des paramètres collectés nous réduisons le nombre d’expérience et donc le nombre d’animaux. Par ailleurs, dans le cadre de ce projet, le nombre a été limité au strict minimum (5 animaux avec implant sous cutané et 5 avec implant externe) pour permettre la validation du dispositif et la collecte de données préliminaires. De plus, nos connaissances et notre maitrise en chirurgie implantatoire sur cette espèce nous permet de prévoir un nombre d'animaux minimal. A noter que ces effectifs ne seront pas utilisés dans leur totalité si nous sommes capable d'enregistrer la totalité des expériences prédation avec les animaux avec implant. L'objectif global est recolter des données de sommeil en contexte de predation sur 4 animaux au total et de valider la fiabilité de l'implant sur deux animaux (car sa tolérance a déja été validée sur deux animaux pendant 30 jours) cf DAP V6.

Raffinement

En développant un implant sous cutané, nous permettons à l’animal de se déplacer librement et d’exprimer toute la complexité de son comportement. Ce projet préliminaire s'inscrit d'ailleurs dans un projet futur plus large, qui nous permettra d'enregistrer des animaux en milieu semi naturel donc hautement enrichi. L’enregistrement de plusieurs paramètres physiologiques et cérébraux permet aussi en une expérience d’accumuler beaucoup d’information qui aurait nécessité plusieurs dispositifs parfois filaires auparavant et donc plus gênant pour l'animal.

Choix des espèces

Ce projet est préliminaire et permettra, une fois validé expérimentalement, d’utiliser le dispositif d’enregistrement dans le cadre d’un futur projet de plus grande envergure sur des rats sauvages en milieu naturel. Le rat est suffisamment gros pour supporter notre instrumentation et son sommeil est très bien connu en laboratoire. Par ailleurs c’est une espèce invasive. Il est donc disponible facilement à l’état sauvage. Il a aussi colonisé différent milieu plus ou moins exposé à la prédation, il est donc un modèle de choix pour notre projet. De plus, le sommeil est un état complexe. L’objectif de l’étude est de déterminer quelle part de son expression est influencée par la prédation (rythme, physiologie, mouvement, position, localisation, activité cérébrale). Des rats adultes de 4 mois seront utilisés pour ce projet. Les animaux devront d’une part avoir un âge avec unepleine maturité cérébrale et, d'autre part, une taille et un poids suffisants (400g environ) afin de supporter l’implant sous cutané.

60 brebis de race Lacaune vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes gardées en vie dans l'établissement à l'issue. Chaque animal reçoit un implant de mélatonine et une injection intramusculaire, et subit dix-huit prises de sang, pour tester une hormone de synthèse censée déclencher et synchroniser les ovulations en dehors de la saison sexuelle. Le porteur inscrit le projet dans le remplacement d'une hormone existante par une molécule posant selon lui moins de problèmes de "bien-être animal", à des fins d'insémination en élevage. Il affirme qu'aucune alternative n'existe pour étudier l'efficacité de ces hormones sur l'ovulation.

Objectifs

La reproduction chez les ovins et caprins est saisonnée. Chez les deux sexes, il existe au cours de l’année une période d’activité sexuelle maximale (saison sexuelle), en général d’août à janvier, et une autre d’activité minimale ou de repos sexuel (contre-saison), en général de février à juillet. La durée de la saison sexuelle est très variable selon les races. La reproduction des brebis et des chèvres en contre-saison permet aux éleveurs d’étaler la production de lait ou de viande sur l’année, et ainsi de répondre à la demande des consommateurs.

Bénéfices attendus

La reproduction chez les ovins et caprins est saisonnée. Dans le cadre d’une mise à la reproduction des brebis et des chèvres en période de contre-saison (période de repos sexuel, pratique appelée « désaisonnement »), l’insémination animale est pratiquée chez les petits ruminants quasi exclusivement après un traitement hormonal d’induction et de synchronisation des chaleurs et des ovulations (mimant les mécanismes endocriniens), méthode aujourd’hui la plus efficace pour désaisonner la mise à la reproduction. Le projet s'inscrit dans un contexte d'évolution des pratiques de maîtrise de la reproduction vers la réduction, voire la suppression, de l’utilisation de traitements hormonaux pour la synchronisation des chaleurs et des ovulations. La recherche de méthodes alternatives est en cours via le développement et/ou l’évaluation de traitements vétérinaires (molécules de synthèse) posant moins de problème en termes de bien-être animal et d’enjeux environnementaux.

Procédures

Les brebis seront soumises à une pose d'implant sous-cutané de mélatonine (une seule fois par brebis, durée moyenne d'environ 30 secondes), à des injections par voie intramusculaire (une seule injection par brebis, durée de quelques secondes) et à des prises de sang (au total 18 prélèvements/brebis, durée de prélèvement moyenne d'environ 30 secondes par brebis).

Impact sur les animaux

Lors des prises de sang (par ponction à la veine jugulaire), des injections (par voie intramusculaire) et de la pose des implants sous-cutanés de mélatonine, les animaux peuvent ressentir une douleur légère de courte durée, mais pas de douleur chronique ou aigüe de forte intensité. Ces interventions n’entrainent pas d’altération de l’état général. Une surveillance journalière de l’état général des animaux et du site de prélèvement sera réalisée afin de traiter l’apparition éventuelle d’une inflammation (phlébite) voire d’une infection. La contention des animaux pour les interventions réalisées par les animaliers (en binôme) est faite dans un espace réduit en présence de congénères pour limiter le stress. La présence journalière répétée des animaliers lors de l'alimentation et des soins est associée à une diminution du stress des animaux.

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie dans l'établissement utilisateur à l'issue du projet.

Remplacement

L’étude de l’efficacité des hormones gonadotropes sur l’induction et la synchronisation des ovulations chez les brebis ne peut être réalisée qu’avec l’utilisation d’animaux vivants. Aucune alternative n’existe.

Réduction

Le projet utilisera 60 brebis réparties en 5 lots de 12 brebis. Les variables étudiées seront la proportion de brebis ovulant après traitement, le jour d’augmentation de progestérone plasmatique > 0,5 ng/ml et la proportion de brebis gestantes. Des calculs de puissance ont été faits avec ces 3 variables afin de déterminer le nombre de brebis/lot. Le nombre minimum de brebis à inclure par lot est déterminé par la variable proportion de brebis gestantes. Avec 12 brebis par groupe, nous pourrons montrer : # une différence notable pour la proportion de brebis ovulant après traitement, entre 67 % (8/12, observée dans des études antérieures avec GnRH) et 100 % (12/12, attendue dans le lot témoin avec eCG) avec un risque alpha (p) de 5 % et une puissance de 83 %. # une différence (>= 1,5 jours ± 1 jour) du jour moyen d’augmentation de progestérone après ovulation (entre le groupe avec eCG et un groupe avec GnRH) avec un risque alpha de 5 % et une puissance de 92 % (test de Mann et Whitney). # une différence notable pour la proportion de brebis gestantes, entre 17 % (2/12, échec de fertilité dans les lots avec GnRH) et 67 % (8/12, fertilité attendue dans le lot témoin avec eCG) avec un risque alpha (p) de 10 % et une puissance de 83 %. L’objectif de cette étude exploratoire est de déterminer si les ovulations induites par la GnRH de synthèse sont fertiles et si la fertilité obtenue nous incite à poursuivre (ou pas) cette stratégie pharmacologique.

Raffinement

Les brebis passeront 6 semaines en bergerie de quarantaine avec une visite journalière pour l’alimentation et l’observation sanitaire. L’habituation des brebis à la manipulation dans ce nouvel environnement commencera au bout de 2 semaines après leur arrivée en quarantaine, avec une pesée. Après 4 semaines, les deux prises de sang pour le test de cyclicité seront réalisées. Après 6 semaines en bergerie de quarantaine, les brebis intègreront la bergerie de l’installation pour commencer le traitement de synchronisation des ovulations. Les lots expérimentaux seront alors constitués (habituation au parc de tri et marquage de la toison avec une peinture adaptée, pour repérer les lots). Afin de respecter la grégarité de l’espèce, les brebis sont placées ensemble sur litière paillée et leur contention pour les différentes interventions est faite dans un espace réduit en présence de congénères pour limiter le stress dû à l’isolement. La présence journalière répétée des animaliers lors de l'alimentation et des soins aux animaux est associée à une diminution du comportement de stress. Les brebis sont surveillées de façon journalière. Lors des prises de sang (par ponction à la veine jugulaire), des injections (par voie intramusculaire) et de la pose des implants sous-cutanés de mélatonine, les animaux peuvent ressentir une douleur légère de courte durée, mais pas de douleur chronique ou aigüe de forte intensité. Ces interventions n’entrainent pas d’altération de l’état général. Les animaux seront tondus au niveau du cou pour une visualisation aisée des veines. Dans la mesure du possible, les prélèvements seront réalisés en alternant les veines jugulaires droite et gauche. Une surveillance de l’état général des animaux et du site de prélèvement sera réalisée afin de traiter l’apparition éventuelle d’une inflammation (phlébite) voire d’une infection. En cas de signes de maladie (fièvre >40°C, problèmes respiratoires, décubitus prolongé sur 48 h, anorexie, perte de poids >à 15%...) un traitement adapté (antidouleurs, anti-inflammatoires, antibiotiques) sera mis en place par les animaliers selon le protocole de soins établi par le vétérinaire conseil ou avec son intervention si nécessaire.

Choix des espèces

L’espèce ovine, et notamment la brebis de race Lacaune laitière, est la cible de l’étude de façon à remplacer l’utilisation de l’hormone eCG dans le cadre du traitement d’induction et de synchronisation des ovulations utilisé en élevage (afin de pratiquer l’insémination animale). De façon à tester l’efficacité d’hormones gonadotropes pour contrôler le cycle oestrien des brebis, le projet utilisera des brebis adultes de race Lacaune, sexuellement matures et ayant déjà agnelé lors d’une reproduction antérieure.

48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses par un régime, elles subissent un test de reconnaissance d'objet, une mesure d'oxygène cérébral sous anesthésie puis une perfusion intracardiaque, dans un projet dont l'objectif déclaré est de former des chercheurs à ces techniques. Le porteur affirme que l'expertise des instructeurs garantit un nombre d'animaux réduit et que la démonstration des gestes chirurgicaux justifie les effectifs. Il indique que l'étude des effets d'un régime sur la cognition est "essentielle" et exige un tissu cérébral intact et un animal conscient.

Objectifs

Notre institut se propose de former de nouveaux chercheurs sur les méthodes modernes qui permettent d'étudier les effets nocifs de l'obesité sur la fonction cérabral. Plusieurs études ont révélé les effets délétères de l’obésité sur le cerveau, elle est associée à un risque plus élevé de développer des troubles neurologiques comme la maladie d’Alzheimer. Actuellement, entre 70 et 80% des patients obèses présentent aussi une stéatose hépatique. Cette maladie représente aujourd’hui l’affection hépatique chronique plus courant et affecte 25% de la population. Il est prévu qu’elle devienne en 2030 la raison la plus fréquente de greffe hépatique. Des études récentes ont confirmé les effets nocifs de cette affection hépatique sur la fonction cérabral ainsi que sur la physiologie générale. Ces effets comprennent des changements comportementaux ( anxiété et dépression)voire des troubles neuropathologiques comme la neuroinflammation et l’hypoxie. Les altérations du métabolisme peuvent persister pendant de nombreuses années chez les patients. Au cours de cette periode, ils génèrent, lentement et silencieusement des lésions cérébrales qui s’aggravent à mesure que l'obésité persiste et que la maladie du foie progresse. Il reste aujourd’hui à étudier si ces altérations cérébrales négatives sont réversibles et si cette maladie chronique qui endommage le cerveau, le rende plus sensible au déclin cérébral lié à l’âge. Ces informations ne sont pas connues. Ce projet est conçu pour étudier les effets à long terme de l'obésité et de la stéatohépatite sur certains aspects de la fonction cérébrale et de la physiologie. Afin de répondre aux questions ci-dessus, nous utiliserons un modèle murin (souris C57BL6) d’obesité et de stéatose hépatique. Ce modèle suivra 26 semaines de régime riche en graisses, riche en fructose et riche en cholestérol (régime spécifique NASH). Un groupe d’animaux suivra un régime normal . Les techniques utilisées seront: 1. Un examen comportemental axé sur l'anxiété. 2. Une mesure de la pression partielle d'oxygène dans les tissus cérébraux effectuée par la fluorescente optique in vivo sur animal anesthésié. 3. L’imagerie confocale sur des tranches de cerveau. La durée de ce projet de formation est de 4 ans et nous utiliserons un nombre total de 48 souris sauvage C57BL/6J.

Bénéfices attendus

Les données obtenues devraient fournir les premières preuves sur la façon dont l'obésité et les maladies du foie associées peuvent affecter le cerveau à long terme. Ce projet a aussi pour but de former les étudiants afin qu’ils soient en mesure de réaliser au mieux les procédures qu’ils auront apprises et transmettre ainsi ces techniques dans leur laboratoire d’origine. Une meilleure connaissance des nouvelles techniques leur permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés lorsqu’ils voudront réaliser ces techniques pour leurs besoins de recherche.

Procédures

- Régime Nash : 4 semaines. -Test de la reconnaissance de nouveaux objets : 2 seances de 5 minutes, 2 seances de 10 minutes. -Mesure de la pression partielle d'oxygène dans les tissus cérébraux effectuée par la fluorescente optique in vivo sur animal anesthésié : 15 minutes préparation, 60 minutes d'enregistrements. -Perfusion intracardiaque : 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les souris C57BL/6J soumises au régime spécifique NASH ont déjà été entièrement caractérisées par Taconic (https://www.taconic.com/mouse-model/diet-induced-nash-b6). Elles ne présentent aucun phénotype dommageable.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés. Les tranches de cerveau seront utilisées pour l'imagerie confocale.

Remplacement

L'utilisation d'animaux est essentielle car tous les systèmes du corps sont nécessaires pour étudier les altérations du métabolisme. Nous devons surveiller les effets systémiques et centraux d'un régime spécifique ainsi que son impact sur la cognition. Des modèles animaux in vivo sont nécessaires pour ces études car ils portent sur le rôle d'une maladie qui affecte différents organes (cerveau, foie, tissu adipeux). De plus, les tests de la fonction cognitive nécessitent une physiologie stable, un tissu cérébral intact et un état conscient.

Réduction

L’expertise de nos instructeurs sur ces modèles garantit que le nombre d'animaux utilisés est minimisé par une pratique toujours de haute qualité dès le départ. De même il est extrêmement important pour nos objectifs éducatifs de pouvoir démontrer et mettre en pratique les actes de préparation chirurgicaux, le nombre d'animaux sera donc adapté en conséquence. Ce chiffre permettra aux instructeurs de montrer les techniques et aux étudiants de faire les expériences.

Raffinement

Nos mesures mises en place pour réduire la douleur pendant les procédures expérimentales impliquent une induction et suivi de l'anesthésie, une mise en place d'analgésie, une installation tout au long des procédures chirugicales de contrôle de la température par tapis chauffant. Les souris seront placées en cage de 4-5 souris sur un rack ventilé, placé dans une salle d'hébergement. Un enrichissement de leur milieu (carrés de cellulose, maisons en papier mâché que les animaux peuvent utiliser pour se cacher et/ou ronger) permettra de favoriser les comportements d'exploration et d'empêcher le stress.

Choix des espèces

L'utilisation d'animaux est essentielle car tous les systèmes du corps sont nécessaires pour étudier les altérations du métabolisme. Nous devons surveiller les effets systémiques et centraux d'un régime spécifique ainsi que son impact sur la cognition. Des modèles animaux in vivo sont nécessaires pour ces études car ils portent sur le rôle d'une maladie qui affecte différents organes (cerveau, foie, tissu adipeux). De plus, les tests de la fonction cognitive nécessitent une physiologie stable, un tissu cérébral intact et un état conscient. Les souris soumises au régime spécifique NASH ont déjà été entièrement caractérisées par Taconic (https://www.taconic.com/mouse-model/diet-induced-nash-b6) et sont nécessaires dans cette étude car elles représentent étroitement la maladie humaine. Afin d'étudier le système neurovasculaire, nous avons besoin d'un système mature, nous utiliserons donc des souris d'au moins 3 mois.

230 furets vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une instillation nasale de variants du SARS-CoV-2 sous anesthésie, puis des lavages nasaux quotidiens et des prises de sang, pour comparer gravité, réplication et transmission entre furets naïfs, vaccinés ou convalescents. Le porteur décrit une infection peu symptomatique, avec au plus une toux faible et une apathie transitoire, et garde certains animaux jusqu'à quatre mois comme convalescents avant de les tuer. Il affirme que l'excrétion virale et la transmission entre individus ne peuvent être reproduites in vitro.

Objectifs

La gestion de l'épidémie de COVID19 est compliquée par l'émergence régulière de nouveaux variants de SARS-CoV-2 dont les mutations génétiques influencent la capacité du virus à se transmettre entre individus infectés, la gravité de l’infection et l’efficacité protectrice issue d’une vaccination ou d’une infection préalable. Le présent projet a pour objectif d’évaluer ces caractéristiques pour 5 variants en faisant appel à des études in-vitro et in-vivo. Pour les études in-vivo, le furet est un bon modèle de l’infection humaine de l’appareil respiratoire supérieur. Ce projet vise donc à évaluer pour chaque variant testé 1/ la gravité de l’infection 2/ sa vitesse de réplication chez le furet 3/ sa transmission entre furets. Pour chaque variant testé, cette évaluation se fait par comparaison avec un variant pour lequel la gravité de l’infection, la vitesse de réplication et la transmissibilité sont connues. L’autre partie du projet vise pour chaque nouveau variant à mesurer l’efficacité vaccinale ou la protection conférée par une infection préalable à SARS-CoV2. Les mêmes caractéristiques de gravité de l’infection, de vitesse de réplication et de transmissibilité seront ainsi évaluées chez des furets vaccinés ou convalescents d’une infection préalable. Les furets seront gardés en groupes sociaux de trois animaux à six animaux dans des cages de dimensions répondant à celles requises par la réglementation. Un enrichissement composé de tunnels, de coins de repos, d’espaces de jeux et d’exploration sera assuré. Tous les prélèvements seront effectués sous anesthésie générale. Le suivi des animaux sera réalisé quotidiennement, puis deux fois par jours dès apparition des symptômes. Le nombre d’animaux utilisé par variant est de 46 furets pour obtenir les données requises pour caractériser un nouveau variant, pour évaluer la protection vaccinale et la protection conférée par une infection préalable. Le projet est prévu pour l’étude de l’émergence de 5 nouveaux variants.

Bénéfices attendus

La caractérisation des nouveaux variants d’intérêt, l’évaluation de la protection vaccinale et la protection conférée par une infection préalable est une aide aux pouvoirs publiques dans l’anticipation et la gestion des nouveaux variants.

Procédures

Les inoculations expérimentales seront réalisées sous anesthésie générale gazeuse pour un furet par lot (virus instillé dans les narines). Des lavages nasaux seront réalisés quotidiennement sous anesthésie générale gazeuse (500µl d’une solution saline instillés à l'entrée de chaque narine, le liquide de lavage étant recueilli sous l'animal par gravité) (1minute). Des prises de sang seront réalisées à J4 et J8 sous anesthésie générale gazeuse dans la veine cave antérieure (3minutes).

Impact sur les animaux

L’infection à SARS-CoV-2 chez les furets est peu symptomatique: pas ou peu de perte de poids, peu d'hyperthermie. Une faible toux a été remarquée chez certains animaux et une apathie transitoire vers le 7ème- 8ème jour d’infection avec le variant alpha. L’inflammation locale des voie aériennes supérieures reste modeste et courte. L'inoculation virale intranasale et les lavages nasaux sont peu invasifs. Les furets étant des animaux sociaux, ils seront hébergés par groupes d’au moins 3 animaux avec des contacts permanents 6 heures après l’inoculation expérimentale des donneurs.

Devenir

Certains animaux issus de la procédure 1 seront gardés en vie jusqu'à 4 mois maximum après la fin de la procédure en tant que convalescents immunisés pour la procédure 2. Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure 2.

Remplacement

Les objectifs de ce projet requièrent une excrétion physiologique virale, de la transmission inter individus par la pénétration du virus dans des tissus des volutes nasales et le développement de réponses immunitaires locales et périphériques qu'il n'est pas possible de reproduire in-vitro. Le modèle animal reste donc nécessaire pour étudier la capacité réplicative de variants et son impact après infection chez des animaux immunisés ou non.

Réduction

Les nombres de furets par lot sont réduits. Certains lots pourront être supprimés. Ainsi, pour la procédure 1, les 2 lots utilisés pour le variant de référence pourront être supprimés s’il est conservé pour plusieurs variants à tester. Les lots sacrifiés à J8 des procédures 2 et 3 pourront s’avérer inutiles s’il est démontré par les résultats des essais préliminaires que la meilleure date pour avoir un maximum de titre viral est J4 (voir procédures 2 et 3). Aucune approche statistique n'a été réalisée, car les comparaisons entre variant seront qualitatives ou semi-quantitative.

Raffinement

Les furets sont anesthésiés pour tout prélèvement (prise de sang, lavage nasal) et pour les inoculations. Les furets seront gardés en groupes sociaux de trois à six animaux dans des cages de dimensions répondant à celles requises par la réglementation. Un enrichissement composé de tunnels, de coins de repos, d’espaces de jeux et d’exploration sera assuré. Tous les prélèvements seront effectués sous anesthésie générale. Le suivi des animaux sera réalisé quotidiennement, puis deux fois par jours dès apparition des symptômes.

Choix des espèces

Les furets constituent un modèle expérimental reproduisant la pathogénicité généralement peu marquée et courte de l’appareil respiratoire supérieur, ce qui est aussi observé lors de COVID-19. Les animaux auront plus de 18 semaines, car il est nécessaire que les animaux aient un système immunitaire mature afin que le modèle animal soit le plus proche possible de l’infection adulte humaine.

105 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie cérébrale sous anesthésie pour injecter un virus et implanter une fibre optique, puis un test de reconnaissance d'objet avec enregistrement de l'activité neuronale, avant une perfusion intracardiaque terminale. Le porteur décrit des souris invalidées pour un gène lié à l'autisme et à la déficience intellectuelle, et indique que la chirurgie peut causer œdème et douleur post-opératoire. Il affirme que ces procédures sont "essentielles" et qu'aucun modèle informatique des comportements complexes n'existe encore.

Objectifs

Le but de notre projet est d'étudier la contribution d'un gène muté dans le trouble du spectre autistique. Nous explorerons son rôle dans l'apprentissage et la mémoire. Nous analyserons l'activité des circuits neuronaux du cortex préfrontal par photométrie par fibre lors d'un test de reconnaissance d'objet chez des souris invalidées pour le gène d'intérêt comparées aux souris sauvages. Nous étudierons l'activité de différentes sous-populations neuronales impliquées dans la neurotransmission excitatrice et inhibitrice.

Bénéfices attendus

Ces expériences devraient permettre de déterminer le rôle du gène d'intérêt dans l'activité des circuits corticaux préfrontaux lors de la mémoire de reconnaissance, contribuant ainsi à mieux comprendre son implication dans l'autisme et la déficience intellectuelle. L'étude dans des modèles murins des conséquences neurobiologiques de l'absence des gènes mutés dans l'autisme et autres troubles neurodéveloppementaux est une étape clé dans la compréhension des mécanismes impliqués dans la pathogénèse de ces maladies, afin de permettre à terme de développer des approches thérapeutiques adaptés.

Procédures

Une procédure chirurgicale est effectuée sous anesthésie générale pour injecter dans le cerveau un virus exprimant un marqueur calcique fluorescent et implanter la fibre optique pour la photométrie par fibre. La durée de la chirurgie est de 30-40 min. Aucun phénotype dommageable n’est prévu suite à la procédure. Après une période de récupération de 3 semaines, les souris sont habituées pendant 3 jours (10 min, 2 fois par jour) à un champ ouvert où sera effectué le test de reconnaissance d'objet. Le jour du test, l'activité neuronale est enregistrée par photométrie par fibre pendant 15-20 min en état basal, puis pendant 10 min lorsque l'animal explore 2 objets identiques. L'animal est ensuite replacé dans sa cage et au but de 10 min, il est réintroduit dans le champ et l'activité neuronale est enregistrée pendant 10 min lorsqu'il explore un objet familier et un objet nouveau. Au total, la procédure dure 45-50 min. Après 2 jours de repos, les souris sont enregistrées à nouveau lors d'un deuxième test de reconnaissance d'objet (45-50 min). A la fin des expériences, les animaux subiront une perfusion intracardiaque avec un agent fixateur pendant 3 min, sous anesthésie profonde, afin de prélever le cerveau pour des analyses histologiques. Au total, la procédure de perfusion dure 10-15 min.

Impact sur les animaux

La chirurgie pour injecter le virus dans le cerveau et implanter la fibre optique peut causer un œdème localisé associé à une douleur post-opératoire passagère. Il existe un risque faible d'infection suite à la chirurgie et l'implantation de la fibre optique. La manipulation par l'expérimentateur et l'exposition à un environnement nouveau lors du test comportemental peuvent engendrer un léger stress chez les souris. Les souris mâles logées dans la même cage peuvent parfois se battre et être blessées.

Devenir

Tous les animaux injectés avec le virus et utilisés dans les expériences de photométrie par fibre (n=105) seront perfusés avec un agent fixateur à la fin des expériences, afin de prélever le cerveau pour des analyses histologiques.

Remplacement

Nos travaux nécessitent l’utilisation de rongeurs puisque nous étudions des mécanismes pathologiques complexes associés à l’autisme et la déficience intellectuelle tels que des déficits cognitifs et l'activité des circuits neuronaux intacts. Les procédures d’expérimentation animale décrites ici sont donc essentielles pour mieux comprendre les conséquences de l'inactivation du gène d'intérêt dans le cerveau. La nature expérimentale de notre recherche nécessite l’utilisation de modèles animaux plutôt que des sujets humains. De plus, il n’existe pas encore de modèle computationnel des comportements complexes animaux.

Réduction

Nous utiliserons au maximum 105 souris. Nous réduisons le nombre d’animaux au strict nécessaire afin d’obtenir des résultats robustes statistiquement dans ce type d'expériences. Pour cela, le nombre d’animaux doit se situer entre 12-15 par condition étudiée. En effet, la variabilité interindividuelle élevée observée lors des tests comportementaux, y compris le test de reconnaissance d'objet, nécessite de groupes de taille relativement élevée. La taille des groupes est déterminée sur la base de la littérature scientifique et notre propre expérience dans ce type d'analyses. Les données seront analysées à l'aide de tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Dans le cadre du raffinement de l’expérimentation animale, les protocoles utilisés ont été optimisés pour exposer les animaux au minimum de douleur possible. L’injection stéréotaxique de virus et la pose de fibres optiques sont réalisées sous anesthésie totale et locale pendant la chirurgie et un analgésique est administré en péri-opératoire. Les animaux sont observés quotidiennement par une personne compétente. Toute souris qui montre des signes de mauvaise santé engendrant une souffrance selon des points limites préétablis, est exclue du protocole et euthanasiée. Les souris sont hébergées à raison de 4 animaux par cage dans une animalerie de stabulation (température 19–21°C, cycle jour–nuit 12h–12h), avec accès libre à l’eau et aux croquettes. La stratégie d’enrichissement consiste à ajouter un nid des lanières de papier Kraft. La litière est changée tous les 7 jours pour éviter le stress. Une semaine avant le test de reconnaissance d'objet, les souris sont manipulés quotidiennement par l'expérimentateur pendant 5 min afin de les habituer et réduire le stress. De plus, les souris sont exposées au champ ouvert plusieurs fois avant le test de reconnaissance d'objet, d'abord en groupe et ensuite individuellement, afin de réduire le stress engendré par l'environnement nouveau. 48 h de repos sont réservées entre les procédures comportementales.

Choix des espèces

Le système nerveux de la souris présente des analogies avec celui de l’être humain. De plus, ce rongeur constitue un modèle de choix bien caractérisé pour les études neurobiologiques et comportementales en rapport avec l'autisme et autres troubles neurodéveloppementaux. Enfin, on a accès à des souris transgéniques afin d’étudier le rôle des gènes d’intérêt, ce qui permet d’aborder leur fonction dans le cerveau de manière intégrée, dans l’organisme vivant. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (2-6 mois). L'autisme étant un trouble qui persiste toute la vie, nous avons choisi d'étudier les conséquences de la perte du gène chez l'adulte, une fois que l'ensemble du système nerveux est développé.

96 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont exposées pendant 115 jours au dioxyde de titane, additif alimentaire E171, avec gavages et prélèvements de fèces réguliers, pour évaluer ses effets sur l'intestin et le métabolisme. Le porteur affirme attendre un léger surpoids, une perméabilité et une inflammation intestinales, et présente le recours à l'animal comme "difficilement remplaçable" pour reproduire les échanges entre organes sur une longue durée. Il indique que les résultats doivent aider industriels et autorités à décider du maintien de l'autorisation du E171.

Objectifs

Les particules minérales manufacturées sont abondantes dans les produits de la vie quotidienne (cosmétiques, textiles, matériaux de construction), dont l’alimentation. Parmi ces particules, le dioxyde de titane (TiO2) est un additif alimentaire utilisé comme colorant/opacifiant et agent de brillance dans les confiseries, les aliments transformés, les sauces et le glaçage. En Europe, l'utilisation du TiO2 alimentaire (référencé E171) est autorisée sans établissement d'une dose journalière acceptable. L'autorité européenne de sécurité sanitaire des aliments (EFSA) a estimé les niveaux d'exposition journalière au E171 entre 0,9 et 10,4 mg/kg de poids corporel (p.c)/jour chez l’enfant et entre 0,3 et 6,8 mg/kg p.c/j chez l’adulte. Face à ces niveaux élevés de consommation, les conséquences pour l’homme d'une exposition chronique aux particules de TiO2 soulèvent des questions de santé publique. Les craintes vis-à-vis de cet additif composée de particules micro- et nanométriques reposent sur des effets génotoxiques, de stress oxydant et inflammatoires des nanoparticules de TiO2 observés sur cellules intestinales. Cependant, la toxicité orale du TiO2 est encore peu étudiée et les autorités sanitaires ont conclu à la nécessité de tests pour évaluer les risques pour la santé des additifs alimentaires contenant des nanoparticules, particulièrement avec le E171. Dans les pays occidentaux, l'augmentation de la prévalence de l'obésité associée à des désordres métaboliques suggère des facteurs de risque liés au mode de vie. Parmi ces facteurs, l'ingestion chronique de particules inorganiques a été proposée. Le but de ce projet est d'étudier le lien entre l'exposition orale chronique au E171 et l'apparition et/ou l'aggravation de désordres métaboliques et intestinaux.

Bénéfices attendus

Outre l'apport de données inédites sur les effets d'une ingestion de TiO2 alimentaire sur le développement de désordres intestinaux et métaboliques, ce projet aidera les parties prenantes et les industriels dans leur décision de maintenir ou non l'autorisation et l'utilisation du E171 dans les aliments. Ce projet pourrait également permettre d'établir un lien potentiel entre facteurs environnementaux (ici ingestion d'additif alimentaire) et augmentation exponentielle dans les pays occidentaux de désordres métaboliques. En conclusion, ce projet fournira des données précieuses pour l'évaluation des risques chez l'Homme d'une exposition au TiO2 alimentaire.

Procédures

Les animaux seront soumis à un gavage avec du Dextran-FITC à J94 pour évaluer la perméabilité intestinale et à un gavage avec du glucose à J108 pour réaliser le test de tolérance au glucose. Des prélèvements de fèces seront réalisés tout au long de l'expérimentation (1 fois toutes les deux semaines).

Impact sur les animaux

Il est attendu que les animaux exposés au E171 développent un léger surpoids accompagné d'une perméabilité inestinale, d'une inflammation intestinale a bas bruit ainsi que d'une intolérance au glucose. Toutefois ces désordres intestinaux et métaboliques devraient être d'une intensité inférieure a celle observé lors d'un traitement des animaux avec un régime riche en graisse. Nos données préliminaires n'indiquent aucune altération de comportement et de prise alimentaire chez les animaux exposés au E171 incorporé aux croquettes à la dose testé dans cette étude.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de réasliser différents prélèvements de tissus sur l'animal en fin d'expérience.

Remplacement

Le projet étudie les effets du E171 (nanomatérieux alimentaires) après une période d'exposition chronique de 115 jours. De plus, l'étude portera sur les impacts sur l'axe microbiote-intestin-foie. Aucun modèle alternatif ne permet de recréer tous les dialogues inter-organes sur une période aussi longue. Le recours à l'animal est donc nécessaire et difficilement remplaçable par des modèles in vitro ou ex-vivo.

Réduction

Les régulations attendues, principalement concernant les tests de tolérance au glucose peuvent être assez fines. Ainsi, chaque groupe expérimental sera donc constitué de 12 souris pour que les résultats soient statistiquement exploitable, après analyse avec des tests statistiques adaptés. De plus, les procédures de notre projet seront réalisées 2 fois pour pouvoir générer suffisamment d'échantillons pour nos différents end points.

Raffinement

Pour réduire au minimum la douleur, la souffrance et l'angoisse infligées aux animaux, la coupure effectuée au niveau des queues de souris nécessaire pour la mesure de perméabilité intestinale et le test de tolérance au glucose seront réalisé sous analgésie locale. De plus, de l'enrichissement sera disposé dans les cages, sous la forme d'une maisonnette et de dispositif de nidification. Le bien-être des animaux sera assuré par une observation quotidienne et également par un suivi de poids et prise alimentaire hebdomadaire.

Choix des espèces

La souris est un modèle reconnu en toxicologie, pour lequel de nombreux outils sont développés afin d’étudier le microbiote et l’intestin. Les souris utilisées seront âgées de 5 semaines afin de faire des observations sur des souris adultes et matures.

402 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisées dans d'autres protocoles au sein de leur établissement d'origine. Elles reçoivent une implantation de tumeur cérébrale sous anesthésie puis une irradiation de 20 Gy fractionnée en deux séances par jour sur quatre jours, avec prélèvement de sang, pour comparer protonthérapie et rayons X sur la réponse immunitaire. Le porteur indique que les séances répétées peuvent baisser la fréquence respiratoire et entraîner une perte de poids, et que la chirurgie tumorale peut être douloureuse. Il affirme que l'étude du système immunitaire lié à une tumeur cérébrale ne se fait pas in vitro et qu'aucune espèce moins évoluée que la souris ne convient.

Objectifs

« La radiothérapie (RT) fait partie des traitements les plus utilisés chez les patients atteints de cancer. A l’heure actuelle, en France, 60% des patients diagnostiqués pour un cancer sont traités par RT. Pour les tumeurs du cerveau, la RT fait partie du traitement standardisé. Nous avons précédemment montré que l’irradiation aux rayons-X pouvait modifier le système immunitaire dans le cas des tumeurs du cerveau, notamment en augmentant la proportion de cellules associées à une progression tumorale et en diminuant la quantité de cellules anti-tumorales dans le sang. Contrairement à la RT conventionnelle qui utilise des rayons-X, la protonthérapie utilise des particules chargées plus lourdes et de haute énergie. Parce qu’elle peut déposer de façon précise des doses d’irradiation dans le tissu, la protonthérapie peut être utilisée pour : i) limiter les risques de toxicité en réduisant l’exposition du tissu sain, et ii) augmenter la dose déposée à la cible pour accroître le contrôle tumoral. Le premier objectif de cette étude est d’appréhender si la protonthérapie pourrait présenter des avantages par rapport aux rayons-X au niveau du système immunitaire anti-tumorale dans le cas d’une irradiation cérébrale. Le second objectif est de déterminer si la combinaison de la protonthérapie et de stratégies thérapeutiques ciblant le système immunitaire serait bénéfique pour le traitement des tumeurs du cerveau. »

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront d’améliorer les connaissances scientifiques sur les effets de la protonthérapie sur l’inflammation. De plus, cela permettra de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques combinant la protonthérapie et l’immunothérapie (dont les tumeurs cérébrales sont très résistantes). Le projet scientifique global présente également une partie clinique dont le comité de proection des personnes a été accepté en décembre 2021. Les résultats du projet ci présent pourront ainsi être comparés aux données cliniques. Ainsi, l’ensemble de ces résultats pourra rapidement être adapté à la clinique dans le but d’améliorer la prise en charge thérapeutique des patients atteints de tumeurs cérébrales. Plus généralement, ce projet permettra d’appréhender en détail les relations entre la protonthérapie et les immunothérapies.

Procédures

Les animaux subiront plusieurs types d’interventions (irradiations, prélèvements sanguins, …). Les interventions spécifiques, leurs fréquences et leurs durées pour chaque animal sont détaillées en Annexe I. -Initiation du développement de la tumeur : L’implantation des tumeurs est réalisée sous anesthésies L’implantation dure quelques minutes et n’est réalisée qu’une seule fois. -L’irradiation du cerveau : alors qu’ils sont anesthésiés. L’irradiation est réalisée sous anesthésie générale. Lors de l’irradiation, une dose totale de 20Gy sera délivrée de manière fractionnée comme en clinique : 2.5Gy/séance avec deux séances par jour (espacées de 6h) sur 4 jours consécutifs. - Le prélèvement sanguin sera réalisée sur souris éveillée Ce prélèvement dure une minute et n’est réalisé qu’une seule fois/souris.

Impact sur les animaux

L’irradiation par elle-même n’induit pas de douleurs mais peut induire une diminution de la fréquence respiratoire en dessous de 30 respirations/min. Les répétitions bijournalières et ce sur 4 jours consécutifs peuvent également induire une perte de poids des animaux jusqu’à 10 jours après irradiation. Le prélèvement sanguin ne provoque pas de douleurs, de perte de poids ou de comportement anormal. La procédure chirurgicale pour l’établissement du modèle de tumeur cérébrale peut induire des douleurs. Le transport des animaux peut induire un stress surtout que cette étude.

Devenir

Tous les animaux de l'étude qui seront transportés dans notre EU pour les protocoles d'irradiation retournenront dans leur EU d'origine pour la poursuite des protocoles

Remplacement

L’évolution du système immunitaire et ce en lien avec la circulation sanguine cérébrale après un traitement ainsi que la formation et l’évolution de l’inflammation tumorale ne peuvent pas être évaluées in vitro. Les expériences in vivo sont absolument nécessaires pour étudier l’impact d’un traitement et tester de nouvelles stratégies thérapeutiques. Pour tester de nouvelles stratégies thérapeutiques qui pourraient être transposées à la clinique, on ne peut pas utiliser d’espèces moins évoluées que la souris. La souris présente un système immunitaire similaire à l’homme et nous disposons d’un modèle in vivo de tumeur cérébrale bien maitrisé dans le laboratoire qui récapitule plusieurs caractéristiques retrouvées chez les patients.

Réduction

Afin d’assurer une puissance statistique suffisante pour les analyses, le nombre d’animaux nécessaires / groupe prend en compte la variabilité entre les individus basée sur des expériences antérieures et des expériences préliminaires. Ce nombre d’animaux a été déterminé mathématiquement grâce à des logiciels statistiques adaptés afin de réduire au maximum tout en assurant une puissance statistique satisfaisante. Afin de réduire le nombre d’animaux au maximum, à chaque fin de protocole, les tissus (cerveaux, rates et ganglions lymphatiques) seront prélevés pour des études post-mortem.L’imagerie nous permet de réduire drastiquement le nombre d’animaux en évitant des euthanasies à tous temps. »

Raffinement

Les animaux subiront une période d’habituation, d’acclimatation avant la radiothérapie. Les animaux subissent une anesthésie pendant l’irradiation. Les animaux sont surveillés tous les jours pendant toute la durée du protocole, weekend compris. Le poids des souris est suivi tous les 2-3 jours avant, pendant et deux semaines après l’irradiation. Pendant l’irradiation et la semaine suivante, les animaux disposent de croquettes humidifiées dans le fond de la cage ainsi que du complément alimentaire (DietGel Recovery) afin de limiter la perte de poid. Pour le modèle de tumeur, les animaux sont anesthésiés pendant la chirurgie. Après la chirurgie, les animaux sont surveillés tous les jours pendant le protocol, weekend compris. Les souris sont hébergées dans des cages avec 5 souris/cage dans un environnement enrichi (roues/cartons/bâtons à ronger). Le transport des animaux sera pris en charge par un transporteur agréé.

Choix des espèces

Les modèles tumoraux chez l’animal sont indispensables pour récapituler au mieux l’environnement des tumeurs qui se développent chez les patients. Nous utiliserons une souche de souris qui présente toutes les populations de cellules immunitaires et parce que le modèle de tumeur cérébral utilisé repose sur l’injection de cellules tumorales issues de cette souche. De plus, pour cette espèce et pour les cellules étudiées, tous les outils de caractérisation sont déjà validés. Les animaux seront agés de 7 semaines. Ce stade correspond à de jeunes adultes et est parfaitement adapté en termes de physiologie aux pathologies ciblées.

30 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules tumorales humaines puis des injections intrapéritonéales quotidiennes pendant quatre semaines, pour tester des inhibiteurs d'EZH2 contre le carcinome à cellules de Merkel. Le porteur indique qu'aucune analgésie ne sera administrée afin de ne pas interférer avec les traitements, et qu'une perte de poids, une tumeur de plus d'un centimètre cube ou une ulcération déclenchent la mise à mort par élongation cervicale. Il affirme que le recours au modèle murin est "obligatoire" pour développer ces tumeurs.

Objectifs

Le carcinome a cellules de Merkel (CCM) est un cancer cutané rare et agressif survenant principalement chez le sujet âge de plus de 65 ans et le patient immunodéprimé (hémopathies, greffe d’organe, infection par le VIH). Son incidence, estimée à 1/100 000 par an, est en constante augmentation. La survie a 5 ans est estimée à 40%. Dans 80% des cas, le génome du Polyomavirus à cellules de Merkel (MCPyV) est intégré dans celui des cellules tumorales induisant alors l’expression de deux oncoprotéines virales (antigène grand T ; LT et antigène petit t ; st). Dans ce contexte, une étude récente menée au sein du laboratoire a permis de mettre en évidence l’induction de l’expression d’EZH2 (Enhancer of zest homolog 2), une histone méthyltransférase, par les oncoprotéines virales. Cette enzyme est impliquée dans l’agressivité et la prolifération tumorale d’autres cancers. De plus, une forte expression d’EZH2 a pu être confirmée au sein d’une cohorte de 96 patients présentant un CCM avec un niveau d’expression plus important dans les tumeurs MCPyV positives. L’effet des inhibiteurs d’EZH2 à déjà été démontré sur d’autre tumeurs solides. Dans ce contexte la cytotoxicité de deux de ces drogues a pu être démontrée au sein de notre laboratoire, in vitro sur des lignées cellulaires humaines de CCM. L’objectif de cette étude est d’évaluer in vivo, l'effet inhibiteur sur la croissance tumorale du GSK343 et du DZNeP dans un modèle murin de xénogreffe, maîtrisé dans le laboratoire, utilisant la lignée WaGa.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de valider dans un modèle pré-clinique l'utilisation d'inhibiteur d'EZH2 dans l'indication du carcinome à cellules de Merkel. Ces molécules pourraient potentiellement être utilisées chez l'Homme en complément de l'immunothérapie ciblant PDL1.

Procédures

Les souris recevront par voie sous-cutanée des cellules WaGa afin d'établir le modèle tumoral. Suite à leur inclusion, elles recevront quotidiennement par voie intrapéritonéale les deux molécules évaluées ou le véhicule pendant 4 semaines.

Impact sur les animaux

Chez l’Homme, le carcinome à cellules de Merkel est décrit comme non douloureux, néanmoins, toute dégradation de l’état de santé des animaux limites (aspect « piqué » du pelage, perte de poids de 20% et prostration des animaux, volume tumorale supérieur à 1cm3 ou apparition d’ulcération), conduira à leur mise à mort par élongation cervicale.

Devenir

L'évaluation de la masse finale des tumeurs impose la mise à mort de l'ensemble des souris.

Remplacement

Afin d’étudier l’impact du traitement sur la croissance tumorale, le test sur modèle murin est obligatoire

Réduction

Une seule dose de chaque traitement sera testée sur la base des résultats de cytotoxicité in vitro préalablement obtenus au laboratoire ainsi que des données de la littérature réduisant ainsi le nombre de souris utilisées. De plus, un test de Wilcoxon a permis de déterminer le nombre d'animaux nécéssaires.

Raffinement

Les souris seront hébergées avec un enrichissement social (5 souris de même sexe / cage) dans des cages enrichies avec des maisonnettes en plexiglas et du papier absorbant. Du fait du statut immunodéficient des souris, l’ensemble du matériel d’enrichissement, ainsi que l’aliment et l’eau de boisson seront stérilisés. Après les injections intra-péritonéales, les souris recevront sous forme de récompense des friandises (cacahuètes en coque, catalogue PLEXX). Aucun traitement d'analgésique ne sera administré afin d'éviter toute interférence avec les traitements testés.

Choix des espèces

Le seul modèle disponible de CCM étant des lignées humaines, l’utilisation d’un modèle murin immunodéficient est obligatoire afin de permettre le développement de tumeurs chez la souris. Les NOD/SCID sont un modèle de référence pour les xénogreffes de cellules humaines . 7 semaines incluant la semaine d’acclimatation d'une semaine. Stade physiologique : croissance