Procédures modérées

20 rats Wistar mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection dans la veine pénienne sous anesthésie puis deux prélèvements de sang, avant d'être mis à mort pour mesurer la toxicité d'un biomédicament destiné au carcinome à cellules de Merkel. Le porteur indique surveiller le pelage "piqué", une perte de poids de 20 % et une hausse des transaminases comme seuils déclenchant la mise à mort. Il présente l'étude comme une obligation réglementaire préalable à un essai clinique de phase I.

Objectifs

Le carcinome a cellules de Merkel (CCM) est un cancer cutané rare et agressif survenant principalement chez le sujet age de plus de 65 ans et le patient immunodéprimé (hemopathie, greffe d’organe, infection par le VIH). Son incidence, estimée a 1/100000 par an, est en constante augmentation. La survie a 5 ans est estimée a 40%. Au stade métastatique inopérable les cliniciens ont peu d’options thérapeutiques induisant une réponse tumorale durable. L’pression du CD56, glycoprotéine de surface impliquée dans l'adhésion cellulaire, a été observée dans 66% des cas de CCM confirmant le choix de cette cible thérapeutique. Un immunoconjugué (anticorps anti- CD56 couplé à la drogue MMAE) a été développé, l’Adcitmer, pour cibler spécifiquement le CD56 et induire la mort des cellules tumorales. L'évaluation in vitro de cette molécule a confirmé son effet cytotoxique sur les lignées de CCM. Pour finir, l'impact sur la croissance tumorale a été montré dans un modèle murin de xénogreffe utilisant une lignée humaine de CCM . L’objectif de cette étude est d’évaluer in vivo, la toxicité de l’Adcitmer chez le rat.

Bénéfices attendus

Le bénéfice premier attendu est d'obtenir la dose maximale tolérée afin de pouvoir proposer une fenêtre thérapeutique optimale pour un essai préclinique réglementaire puis un essai clinique de phase I.

Procédures

Les animaux seront injectés une seule fois dans la veine penienne puis deux prélèvements sanguins seront effectués à 4 et 21 jours post-injection de l'Adcitmer. L’injection dans la veine pénienne durera 5 min par animaux, le prélèvement sanguin durera 3 min également.

Impact sur les animaux

Après 21 jours ou en cas d’atteinte de points limites (aspect « piqué » du pelage, perte de poids de 20%, prostration des animaux ou augmentation des transaminases de 1,5 fois par rapport à la limite supérieur de la norme (normes pour le rat Wistar mâle : ASAT 93 +/- 20 UI/L et ALAT : 32 +/- 5 UI/L), les animaux seront sacrifiés afin d’observer l’impact de l’Adcitmer sur les rats traités versus les rats témoins. Le cœur, la rate, le foie et les poumons seront prélevés pour vérifier que le traitement n’a pas altéré la morphologie des organes. L’analyse histologique sera assurée par les pathologistes de l’équipe. Les critères de jugement de l’étude sont : - Une réduction significative du poids des animaux (une puissance de test supérieure à 80% avec un seuil de risque alpha de 0.05, un test U de Mann Whitney) - Un changement du comportement des animaux Ce protocole suit la règle des 3R : Réduction : Trois doses de traitement seront évaluées sur la base des résultats de réduction de la croissance tumorale préalablement obtenu chez la souris au laboratoire avec trois injections à 10mg/kg in vivo ainsi que des données de la littérature réduisant ainsi le nombre de rats utilisés. Raffinement : Les rats seront hébergés dans des cages enrichies avec des abris et du matériel de nidification et une plateforme. L’interaction avec les soigneurs aura lieu tous les jours pour les adapter aux contacts deux semaines avant le début de l’étude afin de réduire le stress lié aux manipulations. Afin de réduire le stress, les rats seront hébergés par paires. Remplacement : La molécule a été évaluée sur des cellules saines n’exprimant pas le CD56 in vitro et n’a pas montré de toxicité in vivo dans un model murin de xénogreffe de CCM. Cependant, une étude de toxicité in vivo est obligatoire afin d’étudier l’impact du traitement sur les organes et le comportement des animaux.

Devenir

La mise à mort de tous les animaux permettra d'évaluer la dose maximale tolérée afin de pouvoir proposer une fenêtre thérapeutique optimale pour un essai préclinique réglementaire puis un essai clinique de phase I.

Remplacement

La molécule a été évaluée sur des cellules saines n’exprimant pas le CD56 in vitro et n’a pas montré de toxicité in vivo dans un model murin de xénogreffe de CCM. Cependant, une étude de toxicité in vivo est obligatoire afin d’étudier l’impact du traitement sur les organes et le comportement des animaux.

Réduction

Trois doses de traitement seront évaluées sur la base des résultats de réduction de la croissance tumorale préalablement obtenu chez la souris au laboratoire avec trois injections à 10mg/kg in vivo ainsi que des données de la littérature réduisant ainsi le nombre de rats utilisés.

Raffinement

Les rats seront hébergés dans des cages enrichies avec des abris et du matériel de nidification et une plateforme. L’interaction avec les soigneurs aura lieu tous les jours pour les adapter aux contacts deux semaines avant le début de l’étude afin de réduire le stress lié aux manipulations. Afin de réduire le stress, les rats seront hébergés par paires.

Choix des espèces

Le modèle Wistar est un modèle de référence dans les études de toxicité des immunoconjugués. Les males ont été choisi pour injecter en intraveineuse dans la veine pénienne la molécule après une anesthésie. Ceci permet une meilleure réussite et reproductibilité des injections par rapport à la veine caudale. De plus, l’utilisation de sujets d’un même sexe permet de réduire la variabilité interindividuelle et donc de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour observer un effet significatif. 8 semaines (incluant la semaine d’acclimatation). Stade physiologique : croissance.

300 souris vont être utilisées, tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intraveineuses déclenchant une colite chronique puis des injections de traitement, la maladie pouvant provoquer douleurs abdominales, isolement et perte de poids. Le porteur indique qu'un score clinique atteignant 8 sur deux jours consécutifs déclenche l'euthanasie, et que des souris sont tuées à différents temps pour analyser la réponse immunitaire. Il affirme qu'aucune méthode ne remplace un système immunitaire complet, ce qui rend selon lui l'animal "indispensable".

Objectifs

De nombreux mécanismes sont impliqués dans l’arrêt du processus inflammatoire engendré par le système immunitaire lors de la reconnaissance d’antigènes qu’ils soient étrangers (pathogènes extérieurs) ou propres à l’organisme (le soi). Les cellules myéloïdes qui sont une population du système immunitaire jouent un rôle très important dans ces mécanismes. Elles permettent pour certaines d’éteindre ce processus inflammatoire en phagocytant les cellules effectrices devenues alors inutiles sans créer d’inflammation elles-mêmes. Lors d’une inflammation chronique, il y a un déséquilibre entre l’activité des cellules effectrices et l’élimination de ces cellules par les cellules myéloïdes. Nous souhaitons examiner le potentiel de molécules sous la forme d’anticorps monoclonaux anti-protéine A ou anti-protéine B ciblant spécifiquement ces cellules myéloïdes à inhiber la réponse inflammatoire, qui diminuent notamment la sécrétion d’IL-12 et augmente la sécrétion d’IL-10 par les macrophages in vitro, et ce dans plusieurs maladies inflammatoires qui ne mettent pas en jeu les mêmes cellules effectrices.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre dévaluer le potentiel thérapeutique d'une toute nouvelle molécule ciblant un processus immunitaire découvert récemment. Il sera comparé à des traitements standards dans le but d'évaluer le bénéfice d'une telle stratégie et de bien caractériser les mécanismes mis en jeu dans les phénomènes biologiques liés à l'activité de la molécule.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections intraveineuses (pour induire la pathologie) dans tous les cas, à des injections intrapéritonéales pour les traitements. Il y aura éventuellement des prélèvements sanguins sur animaux anesthésiés. La durée de l'acte en tant que tel ne durera pas plus de 5min et s'étalera sur 3 semaines comme indiqué dans le schéma protocolaire.

Impact sur les animaux

La colite chronique entraîne parfois des douleurs abdominales et un isolement des animaux concernés ainsi qu'une perte de poids. Un score clinique + un score pathologique lié à la colite seront réalisés pour maîtriser au mieux ces paramètres.

Devenir

Les animaux recevant des injections intrapéritonéales ou intraveineuses seront alors remis dans leur cage. A l'issu de certains axes, les animaux seront euthanasiés poru évaluer biologiquement la réponse immunitaire.

Remplacement

A ce jour, aucune méthode ne peut remplacer un système immunitaire complet et donc rend indispensable l’utilisation d’animaux. Des études préliminaires sur des cellules ex vivo ont permis d’identifier une activité biologique du médicament et donc ont orienté les paramètres à évaluer lors de l’étude in vivo de la molécule.

Réduction

L’ensemble des animaux prévus ne sera pas utilisé selon les résultats observés sur un traitement curatif ou prophylactique. Seulement dans le cas de l’observation d’un effet, nous réaliserons ensuite des études pour déterminer les mécanismes mis en œuvre, notamment en euthanasiant des souris avant d’atteindre le point limite à différents temps après l’initiation de la pathologie. Enoutre, dans le but d'utiliser un nombre d'animaux cohérent avec une pertinence statistique, nous avons défini le nombre d'animaux par groupe de 10 animaux pour l’ensemble des groupes ainsi que l’ensemble des axes, ce qui permet d'interpréter de manière objective les résultats tout en utilisant un nombre réduit d'animaux.

Raffinement

Nous chercherons à obtenir dans un premier temps des différences significatives et reproductibles sur l’inflammation observée entre les groupes de souris. La douleur sera dans la mesure du possible évitée en euthanasiant les animaux si leur score clinique global atteint 8 sur deux jours consécutifs tel que décrit dans le tableau de score clinique général ou par injection d’analgésique dans le cas de morsure par exemple. Seulement dans le cas de l’observation d’un effet, nous réaliserons ensuite des études pour déterminer les mécanismes mis en œuvre, notamment en euthanasiant des souris avant d’atteindre le point limite à différents temps après l’initiation de la pathologie.

Choix des espèces

Nous travaillerons avec la souris qui est un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les examens précliniques. Il s’agit en effet d’un modèle animal pour lequel de nombreux outils génétiques et biologiques sont disponibles. Les modèles d’inflammation dans ces souris autorisent une relevance pathologique satisfaisante en comparaison avec la réalité clinique. Adulte-8-10 semaines, car l’inflammation générée par le transfert de cellules pathogéniques est le plus homogène dans cette tranche d’âge contrairement à des âges précoces ou avancés où les défenses immunitaires sont différentes et peuvent induire une hétérogénéité de réponse inflammatoire.

360 truites arc-en-ciel vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 48 tuées à l'issue et 312 remises dans un circuit d'élevage. Chaque femelle reçoit une marque électronique dans le muscle dorsal et subit jusqu'à six prélèvements de sang sur dix mois, pour définir le ratio en acides gras de l'alimentation des reproductrices. Le porteur présente l'objectif comme la mise au point d'aliments aquacoles durables sans farine ni huile de poisson, à visée agronomique et commerciale. Il affirme que l'étude portant sur la reproduction ne peut être menée ni sur lignée cellulaire ni par modélisation.

Objectifs

Le développement durable de l’aquaculture en France, mais aussi dans le monde, pourrait rapidement être remis en question par la disponibilité de plus en plus limitée de la farine et de l'huile de poisson qui sont les ingrédients traditionnels des aliments pour poissons. Les résultats de la recherche dans le domaine de la nutrition des poissons ont permis de fortement diminuer la part de farine et d’huile de poissons dans les aliments aquacoles au profit d’ingrédients végétaux aujourd’hui majoritaires dans les régimes de toutes les espèces aquacoles. Toutefois, des taux de substitution très élevés restent critiques et ont des effets délétères sur la croissance, la robustesse et les performances de reproduction des poissons. L’une des causes repose sur la forte diminution des aliments en acides gras polyinsaturés habituellement apportés par la farine et l’huile de poissons. Il faut donc poursuivre l’effort d’optimisation des apports alimentaires et de l’utilisation des nutriments pour la croissance et la reproduction des poissons pour le développement durable de l’aquaculture. Dans ce contexte, il est nécessaire de déterminer les ratios optimums en acides gras polyinsaturés dans l’aliment et optimiser des formulations alimentaires pour accroitre la robustesse des génitrices ainsi que la qualité des œufs et des descendants. L’objectif est de créer des aliments plus performants et adaptés aux différents stades physiologiques de la truite reproductrice en restant dans une optique d’aquaculture durable.

Bénéfices attendus

Cette expérimentation permettra de définir le ratio optimal en acide gras essentiel dans l’aliment à destination des reproductrices de truite arc en ciel pour accroitre leur robustesse, leurs performances de reproduction et la qualité de leurs œufs. Elle permettra d’établir le lien entre la physiologie de la nutrition (stockage, mobilisation et transfert des acides gras, la physiologie de la reproduction (évolution des hormones de reproduction) ainsi que des paramètres liés à la santé de l’animal (eicosanoides) au cours du cycle de vitellogénèse. Cette expérimentation servira de base pour la définition de formules alimentaires durables (sans huile et farine de poisson) adaptées le plus possibles aux besoins nutritionnels des génitrices de truite.

Procédures

Chaque procédure sera réalisée sous anesthésie (MS222). Un pit tag, pour permettre l'indentification individuelle des femelles de truite, sera injecté en début d'expérimentation dans le muscle supérieur dorsal. Des prélèvements de sang seront réalisés une fois tous les 2 mois (6 prélèvements maximum par individu) sur une durée d'expérimentation de 10 mois. La quantité de sang prélevée sera de 2ml sur des femelles adultes d'environ 1kg.

Impact sur les animaux

L'élevage ne créera aucune nuisance ou effet indésirable sur les animaux car c'est un protocole classique d'élevage avec des aliments qui répondent aux besoins nutritionnels des poissons. Les prises de sang seront réalisées une fois tous les 2 mois sur les animaux. L'injection du pit tag et les prélèvements de sang (2ml) seront réalisés sur des poissons de grandes tailles (environ 1kg) préalablement anesthésiés (MS222). Le pit Tag une fois injectée créera une petite blessure au niveau de la piqure, le poissons devraient cicatriser et récupérer en quelques jours (le taux d'infection avec ce type de procédure reste très faible). La prise de sang ne posera aucun effet indésirable car les vaisseaux sanguins de la truite sont d'accès facile et leur volume sanguin important. La fréquence de prélèvement (une fois tous les 2 mois) ne créera pas non plus d'effets indésirables car la capacité de l'organisme à remplacer le volume sanguin prélevé ne sera pas impactée. Au moment de la ponte, 6 poissons par traitement (total = 48 poissons) seront euthanasiés et des prélèvements de tissus seront réalisés en vue d’analyses biologiques.

Devenir

48 poissons seront euthanasiés en fin d'expérimentation pour permettre les prélèvements de tissus en vue d'analyses biologiques. Les 312 poissons non mis à mort repartiront dans un circuit classique d'élevage.

Remplacement

L'étude porte sur l'impact d'une stratégie alimentaire sur la reproduction des animaux, elle ne peut donc pas être appréhendée sur lignée cellulaire ou par modélisation.

Réduction

Nous avons prévu une densité optimale d’animaux par bassin permettant d’éviter les comportements agressifs qui peuvent survenir avec un petit groupe de poissons (relation dominant/dominé). Ainsi pour une espèce comme la truite, il est nécessaire d’avoir une densité minimale d’élevage pour optimiser le bien-être de l’animal et limiter les comportements agressifs. La densité d'élevage utilisée au cours de cette expérimentation correspond à celle préconisée en aquaculture biologique. Nous avons choisi de baser nos analyses biologiques sur du sang pour réduire le nombre de poissons euthanasiés pour des prélèvements biologiques. De plus, nous identifions les femelles par des pit tags pour avoir comme unité statitique un animal et non un bassin, ce qui nécessiterait beaucoup plus d 'animaux mis en élevage. Ceci nous permet ainsi de fortement réduire le nombre d'animaux mis en expérimentation tout en s'assurant d'une puissance statistique suffisante dans le traitement de nos résultats. En effet, des précedentes études présentant le même schéma expérimental ont permis de valider ce nombre minimal de poisson mis en élevage pour obtenir des résultats statistiques viables. Les animaux après leur reproduction repartiront dans un circuit classique d’élevage.

Raffinement

Les conditions d’élevage seront optimisées. Le comportement et les mortalités seront contrôlés 2 fois par jour lors de l’alimentation des animaux. Si une perte de poids anormale ou un comportement atypique étaient observés (comportement de fuite anormal pendant l’alimentation, léthargie, hyperactivité locomotrice, perte d’intégrité physique suite à un cannibalisme ou à des comportements agressifs), les animaux concernés seraient euthanasiés. La personne qui injectera le pit tag et effectuera les prélèvements de sang est familiarisée avec l’espèce animale et la technique choisie. Les animaux seront manipulés avec ménagement et calme. Une faible quantité de sang sera prélevé (2mL sur des animaux de 2kg) ce qui ne provoquera pas d'effets notables sur le volume d'éjection cardiaque ou sur la pression artérielle.

Choix des espèces

La truite arc-en-ciel, espèce de salmonidé, est une espèce d'un grand intérêt agronomique.

4 467 souris transgéniques vont être élevées comme modèle de sclérose latérale amyotrophique, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles ne subissent aucune intervention dans l'élevage lui-même mais sont produites pour alimenter d'autres projets, transférées vers l'établissement expérimentateur ou euthanasiées à 100 jours si elles ne le sont pas. Le porteur affirme que la culture cellulaire ne permet pas d'appréhender la complexité du système moteur et que ce modèle est le plus utilisé pour cette maladie. Les animaux gardés jusqu'à 100 jours restent asymptomatiques, une surveillance quotidienne devant repérer d'éventuels tremblements ou faiblesses musculaires.

Objectifs

La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) est une pathologie humaine létale et rare, dans laquelle on observe une dégénérescence et donc une disparition progressive des neurones du cortex moteur , du bulbe et de la corne antérieure de la moelle épinière. Ceci induit des paralysies pouvant toucher les muscles des membres ou de la sphère ORL (et conduire à un handicap sévère) et/ou une atteinte respiratoire (par paralysie du muscle diaphragmatique) qui est le plus souvent responsable de complication mortelle. Si la majorité des malades n'a aucune anomalie génétique, environ 5% des patients sont atteints d'une forme familiale notamment liée à des mutations sur le gène d'une protéine appelée la Super Oxyde Dismutase1 (SOD1). Dans l'objectif d'étudier les mécanismes de la maladie et de développer de nouveaux traitements, un modèle murin de cette maladie à été développé . Ces animaux contiennent une mutation dans le gène SOD1 et développe une pathologie dégénérative motrice pure qui possède beaucoup d'analogie avec la pathologie humaine. Cette lignée transgénique animale est, à ce jour, le modèle animal le plus utilisé pour la recherche sur la SLA. Notre objectif est de constituer un élevage de ces animaux qui seront utilisés pour différents projets de recherche. Un total de 4467 animaux est prévu pour l'ensemble des projets issus de cet élevage. Pour toutes ces recherches la règle des 3R sera strictement respectée. Ainsi le nombre d'animaux produit par cet élevage correspond très exactement à tous les projets de recherche qui ont été déclarés par les établissement expérimentateurs. Par ailleurs, les souris produites par l’élevage seront transmises à l’établissement expérimentateur avant l’apparition des symptômes de la maladie. Aucune douleur, souffrance ou angoisse n’est donc infligée aux animaux.

Bénéfices attendus

L'utilisation de modèles murins SOD1 G93A est nécessaire pour la recherche des mécanismes physiopathologiques de la SLA, ainsi que pour l'étude de molécules et de stratégies thérapeutiques nouvelles.

Procédures

Les animaux ne sont soumis a aucune intervention au seins de l’etablissement d’élévage. Ils seront transférés à l’etablissement expérimentateur à des âges dépendant des procédures expérimentales.

Impact sur les animaux

Tous les animaux sont euthanasiés à l'age de 100 jours s'ils ne sont pas transmis à l'établissement expérimentateur. Avant cet age, ils sont asympotmatique, toutefois les animaux sont surveillés quotidiennement dans le cas ou un symtpome précoce venait a apparaitre (tremblements ou faiblesses musculaires). Si un seul de ces symptomes se manifestait, le responsable du projet sera immediatement contacté pour décider s'il convient de transférer l'animal à l'etablissement expérimentateur ou s'il convient de l'euthanasier par inhalation de C02.

Devenir

Les animaux sont soit transférés vers l’établissement expérimentateur soit sacrifiés.

Remplacement

Aucune autre méthode comme la culture de lignées cellulaires ne permettent d'appréhender la complexité du système moteur et d'évaluer la pertinence thérapeutique de nouvelles molécules et son intérêt dans la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA).

Réduction

Le nombre d’animaux produit par cet élevage correspond au nombre d’animaux nécessaire pour entretenir l’élevage et pour réaliser les projets ayant fait l’objet d’une validation par le comité d’éthique. Le nombre d’animaux produit par l’élevage sera revue à la baisse en fonction de l’évolution de ces projets .

Raffinement

Les animaux seront placés dans des cages enrichies (carré de cellulose lab'nest ). Ils seront stabulés dans une animalerie thermorégulée avec hygrométrie contrôlée et cycle lumière inversé. L'accès à la nourriture et à l'eau sera ad libitum et un changement de litière sera effectué chaque semaine.

Choix des espèces

La souris SOD1 G93A est un modèle de choix afin de réaliser des études précliniques car c’est le modèle le plus couramment utilisé pour étudier la SLA et par conséquent c’est le modèle le plus caractérisé. Pour la reproduction les animaux seront utilisés entre 7 et 12,5 semaines pour les mâles et 7 et 24 semaines pour les femelles afin d'assurer une reproduction efficace.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intrapéritonéale de cellules cancéreuses puis un gel associé à une chimiothérapie, avec un suivi tumoral par bioluminescence sous anesthésie jusqu'à douze séances, avant une ponction cardiaque terminale. Le porteur affirme observer rarement l'atteinte d'un point limite et décrit une maladie bien supportée, tout en surveillant la perte de poids qui déclenche une mise à mort sous 24 heures. Sur le remplacement, il indique que les essais in vitro ne reproduisent pas la complexité d'un "organisme vivant" et conclut à l'impossibilité de se passer de la souris.

Objectifs

La carcinose péritonéale est une situation médicale où le péritoine, qui est l’enveloppe qui entoure les organes de l’abdomen, se trouve recouvert de nodules de tumeur cancéreuse. Cette situation est un processus métastatique qui va conduire au décès du patient. La carcinose péritonéale est associée à un mauvais pronostic avec une survie médiane sans traitement de 5 mois. Le traitement à visée curative de la carcinose péritonéale repose sur la chirurgie de réduction tumorale qui a pour but de retirer toute la maladie macroscopique suivie de la chimiothérapie hyperthermique intrapéritonéale CHIP (c’est-à-dire le traitement d’une chimiothérapie chauffée à 43°C directement dans l’abdomen qui a pour but d’agir sur les nodules microscopiques). Ce traitement est très efficace, le taux de survie à 5 ans est alors de 45- 51%, avec une médiane de survie de 41 mois. Cependant, ce protocole comporte un risque important de mortalité et de morbidité. C’est pour cela que notre unité a choisi de s’intéresser à une alternative à ce traitement. Nous nous sommes intéressés à un gel associé à une chimiothérapie de contact pouvant être appliqué en postopératoire, qui aurait la capacité d’inhiber l’adhésion des cellules cancéreuses disséminées suite à de la résection de la tumeur primitive ou suite à n’importe quelle chirurgie abdominale. L’objectif de cette recherche est d’évaluer l’apport thérapeutique, soit pour une carcinose déjà présente, soit pour éviter (prophylaxie) qu’une carcinose ne se développe, de ce gel thermosensible qui va se gélifier à température de l’animal (il est liquide a température ambiante) et laisser diffuser sur quelques jours la chimiothérapie qui a été incluse avec celui-ci.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus seraient de trouver une alternative au traitement classique de la carcinose péritonéale et également l'utilisation de ce gel en prévention, donc avant l'apparition de la carcinose péritonéale.

Procédures

Les souris vigiles seront soumis à une injection de cellules cancéreuses en intrapéritonéale (1 fois 30 secondes) qui sera associée deux heure après à une injection en intrapéritonéale également de gel associé à une chimiothérapie (1 fois 30 secondes). Puis sous anesthésie, ils auront un suivi non invasif par bioluminescence pour suivre l'évolution tumorale (3 fois 20 minutes pour les bal/c; 12 fois 20 minutes pour les C57BL/6). A la fin de l'expérience elles auront une injection sous-cutanée de buprénorphine (1 fois 30 secondes) puis 30 minutes après elles seront sous anesthésie générale (isoflurane à 30%) pour réaliser un prélèvement intracardiaque de sang qui permettra une analyse post-mortem.

Impact sur les animaux

Les souris vont développer une carcinose péritonéale après une injection intrapéritonéale de cellules cancéreuses murines ovarienne ou colique. Nous avons une bonne expérience de nos modèles. Il est très rare d’observer une souris qui atteint un point limite. Les souris supportent très bien la maladie et la fin de l’expérience arrive avant que la maladie ne se développe de trop. De plus, le suivi par bioluminescence nous permet d’arrêter l’expérience avant que la progression tumorale soit trop importante. Les points limites observés sont souvent corrélés ensemble avec une perte de poids de l’animal. Si cela devait se produire, l’animal serait mis à mort dans les 24h. Aussi, nous devons confirmer si ce gel pourrait induire une toxicité. Aussi, les doses de chimiothérapie ne seront pas toxiques non plus; la chimiothérapie étant au contact du gel.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à J14 ou à 12 semaines post-injection des cellules CT26-luc ou ID8-luc respectivement par ponction cardiaque puis dislocation cervicale sous anesthésie générale. Ce sera un prélèvement total de sang pour des analyses post mortem; mais aussi de tissus sains pour être analysés par le service d’anatomopathologie.

Remplacement

Nous ne pouvons remplacer le modèle murin car pour tester un éventuel traitement (gel) les expérimentations in vitro ne permettent pas de représenter la complexité d’un organisme vivant.

Réduction

En dessous de 7 animaux par groupe, du fait des variations de nos modèles, en nombre de nodules ou vitesse de propagation de la maladie il y a trop peu de données pour avoir un résultat solide. Compte tenu de notre expérience sur le modèle et de la variabilité observée, un nombre minimum de 10 animaux par groupe est nécessaire. En cas de groupe contrôle régulier nous nous autorisons à diminuer le nombre à 5 en acceptant pour faire les analyses scientifiques de pooler deux groupes contrôles. Ce sont des règles de bonne pratique pour toutes expériences en oncologie sur l’animal, utilisant des xenogreffes. Aussi, nous allons utiliser un seul groupe de souris contrôle pour 3 groupes de traitement. Cela permettra de diminuer le nombre d'animaux.

Raffinement

Le projet n’inclut pas d'interventions douloureuses et les animaux seront observés quotidiennement. Lors du suivi de la croissance tumorale par bioluminescence, les animaux seront sous anesthésie générale gazeuse (isoflurane à 1%) et avant l'intervention finale (ponction cardiaque) les animaux recevront une injection d'analgésie (Buprénorphine - 0,1mg/kg) et seront ensuite sous anesthésie générale (isoflurane à 3%). Différents points limites seront particulièrement surveillés tels que la perte de poids, le comportement (yeux fermés, dos voûté, isolement), l’apparence physique (automutilation, plaies) et la gêne pour se déplacer qui seront notifiés dans un cahier de suivi des animaux 2 fois par semaine. De plus, le suivi par bioluminescence nous permet d’arrêter l’expérience avant que la progression tumorale soit trop importante. Les souris seront hébergées en portoir ventilé avec alimentation standard classique Harlan 20.16) et eau stérile ad libitum. Cycle nycthéméral 12h jour/12h nuit Température : 22°C Aussi, les souris disposeront d’enrichissement tels que maison rouge, nids en papier kraft ou buchette de bois à ronger pour leur permettre d’exprimer tout le comportement social normal d’une souris et ainsi améliorer leurs conditions d’hébergements. En cas d’atteinte des points limites, ils seront alors exclus de l'expérience dans les 24heures.

Choix des espèces

Il s’agit de souris femelles immunocompétentes (BALB/c ou C57BL6). Ces types de souris sont utilisés largement dans la recherche en cancérologie pour sa capacité d’incrémenter l’incidence tumorale après injection des cellules cancéreuses. Les souris seront utilisées à l’âge de 7-8 semaines pour ne pas interagir avec les processus de vieillissement et pour qu’elles ne soient pas trop jeunes pour supporter la chimiothérapie.

620 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par perfusion transcardiaque, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit des injections virales par stéréotaxie et l'implantation d'une fibre optique ou d'une électrode, puis est mis à jeun pour être motivé lors de tâches cognitives sous imagerie cérébrale. Le porteur invoque la déclaration de Bâle et affirme qu'aucune lignée cellulaire ne reproduit le cerveau intact. Les bénéfices annoncés pour la schizophrénie ou l'autisme relèvent de perspectives de recherche fondamentale.

Objectifs

Des preuves expérimentales de plus en plus nombreuses indiquent que le dysfonctionnement du cortex préfrontal est à l'origine de déficiences cognitives et d'autres symptômes de la schizophrénie, de l'autisme, de la dépression, de la douleur chronique et d'autres troubles. Cependant, nous ne comprenons pas comment les circuits du cortex préfrontal fonctionnent normalement ni comment ils se dérèglent dans ces troubles. Nos objectifs sont 1) de caractériser les schémas anormaux d'activité des circuits qui peuvent se produire dans le cortex préfrontal et contribuer aux symptômes de ces troubles, et 2) d'identifier les mécanismes tels que la neuromodulation, la connectivité synaptique, les oscillations cérébrales, etc. qui contribuent aux schémas d'activité normaux et pathologiques. Nous espérons que ces études nous permettront d'identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces troubles. Ce projet se subdivise en 2 objectifs : 1. Analyser la dynamique neuronale et 2. l’importance fonctionnelle d’interneurones spécifiques pendant des comportements dépendant du cortex préfrontal in vivo.

Bénéfices attendus

Les maladies du cerveau ont des répercussions majeures sur la santé des individus, leur autonomie, leur éducation, leur emploi, leur mobilité et leurs relations personnelles, ce qui représente un lourd fardeau social et économique. Il est d'une importance fondamentale de comprendre les propriétés de base qui régissent la force, la gamme dynamique, l'étendue spatiale, la localisation anatomique et les composants moléculaires des connexions synaptiques entre des types de neurones spécifiques formant un réseau neuronal dans des états normaux et pathologiques. Plus précisément, on pense que le dysfonctionnement du cortex préfrontal est à l'origine de déficiences cognitives et d'autres symptômes de la schizophrénie, de l'autisme, de la dépression, de la douleur chronique et d'autres troubles. Cependant, nous ne comprenons pas comment les circuits du cortex préfrontal fonctionnent normalement ni comment ils se dérèglent dans ces troubles. Nos objectifs sont 1) de caractériser les schémas normaux et anormaux d'activité des circuits qui peuvent se produire dans le cortex préfrontal et contribuer aux symptômes de ces troubles, et 2) d'identifier les mécanismes tels que la neuromodulation, la connectivité synaptique, les oscillations cérébrales, etc. qui contribuent aux schémas d'activité normaux et pathologiques. Nous espérons que ces études nous permettront d'identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces troubles. Grâce à l'utilisation de souris génétiquement modifiées, nous serons en mesure de cibler des types de cellules et des réseaux spécifiques afin de fournir un cadre physiopathologique permettant de comprendre les maladies du cerveau.

Procédures

Procedure 1 : Imagerie calcique in vivo avec ou sans enregistrement électrophysiologique d'animaux éveillés se déplaçant librement pendant des tâches cognitives. Cette procédure utilisera 300 souris transgéniques, toutes les souris subiront insertion de gènes dans des souris adultes en utilisant des vecteurs viraux injectés par stéréotaxie (pour 30-40 minutes par animal), implantation de fibre optique pour imagerie et/ou d'un electrode (pour 30 minutes d’intervention), imagerie calcique in vivo et enregistrement de l’activité électrophysiologie sur des animaux libres de leurs mouvements s’il y a une electrode pendant la tâche de flexibilité cognitive (pour 1 à 3 heures d’intervention), et perfusion transcardiaque pour fixation de tissus. Procedure 2 : Stimulation in vivo avec ou sans enregistrement électrophysiologique d'animaux éveillés et libres de leurs mouvements pendant des tâches cognitives. Cette procédure utilisera 320 souris transgéniques, toutes les souris subiront insertion de gènes dans des souris adultes en utilisant des vecteurs viraux injectés par stéréotaxie (pour 30-40 minutes par animal), implantation de fibre optique pour imagerie et/ou d'un electrode (pour 30 minutes d’intervention), in vivo calcium imagerie et enregistrement de l’activité électrophysiologie sur des animaux libres de leurs mouvements s’il y a une electrode pendant la tâche de flexibilité cognitive (pour 1 à 3 heures d’intervention), et perfusion transcardiaque pour fixation de tissus. Ces expériences peuvent impliquer des injections IP de substances pharmacologiques, la mise à jeun des animaux pour les motiver associée à une tache comportementale (6 jours; n = 300)

Impact sur les animaux

En général, toutes les interventions sont bien tolérées par l'animal et n'affectent pas le phénotype général de la souris. Concernant la chirurgie des implants les nuisances comprennent douleur post opératoire, risque potentiel d’infection et de perte de l’implant. En ce qui concerne les expériences comportementales, les nuisances peuvent inclure stress de la msie à jeun associés à l’isolement et, stress de la manipulation.

Devenir

Procedure 1: Nous enregistrerons l'activité du cerveau de souris (300 souris) éveillées liée à des comportements normaux ou pathologiques. Procedure 2 : Nous manipulerons l'activité du cerveau de souris éveillées (320 souris) liée à des comportements normaux ou pathologiques. Ces expériences nécessitent des analyses anatomiques post-mortem (localisation anatomique des implants, injection de virus, expression de différents gènes). Il est donc nécessaire de prélever le cerveau. Dans ce but, tous les animaux seront mis à mort après fixation par perfusion transcardiaque.

Remplacement

Il n’y a pas d’autres alternatives à l’utilisation d’animaux pour ces expériences, car des modèles adéquats du circuit cortical contenant le nombre, les types et la localisation appropriés de récepteurs dans les réseaux excitateurs et inhibiteurs ne sont pas disponibles. L'objectif de nos expériences est de découvrir les actions des gènes, des neuromodulateurs et des médicaments sur les circuits neuronaux dans le cerveau intact. Il s'agit d'une question empirique qui nécessite l'examen de circuits intacts pour y répondre. Il n'existe aucune lignée cellulaire qui récapitule avec précision la physiologie des neurones des animaux, et comme nos expériences étudient les interconnexions entre les neurones qui se produisent dans le cerveau intact, ces expériences ne seraient pas possibles avec la culture cellulaire. De plus, il n'existe aucun modèle remplaçant l'utilisation d'animaux qui permettrait d'étudier les phénomènes comportementaux et cognitifs proposés ici. Les procédures expérimentales maximiseront donc le bien-être des animaux en appliquant les principes de remplacement, de réduction et de raffinement. Plus précisément, le remplacement partiel/relatif des animaux sera exercé par la mise en œuvre de plusieurs techniques employées à partir d'un seul animal (c'est-à-dire l'imagerie calcique in vivo et les enregistrements électrophysiologiques) afin de maximiser la collecte de données.

Réduction

Le nombre total d'animaux impliqués dans ce projet (n = 620) est calculé en tenant compte des mesures de réduction. Le nombre d'animaux utilisés dans les procédures sera réduit en effectuant différentes procédures sur un seul animal : les animaux seront implantés pour l'électrophysiologie et la photométrie par fibre simultanément, ou l'électrophysiologie et l'optogénétique simultanément afin de maximiser les mesures longitudinales multiples sur le même animal. Nos compétences chirurgicales permettront également de réduire le nombre de victimes chez les animaux et de minimiser les dommages durables. Toutefois, les avantages de la réutilisation des animaux seront mis en balance avec les effets négatifs sur leur bien-être, en tenant compte de l'expérience de toute une vie de l'animal. En outre, notre expertise dans l'entraînement des souris à la tâche de flexibilité cognitive réduira également la variabilité et, dans une large mesure, les nombres globaux nécessaires pour obtenir une signification statistique dans les cohortes. Enfin, notre choix de la taille de l'échantillon est basé sur des études précédentes et est cohérent avec ceux généralement employés dans le domaine. La taille de chaque groupe sera déterminée par l'utilisation de tests statistiques appropriés, y compris le calcul de puissance. La taille réelle de l'échantillon, et donc la signification statistique, dépendra de la variabilité de la lecture biologique. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Toutes les mesures visant à atténuer ou à minimiser la douleur, la souffrance, l'angoisse ou les dommages durables subis par l'animal seront prises. Les protocoles expérimentaux ont été affinés en faisant appel aux pratiques vétérinaires les plus modernes et en prévoyant des périodes de récupération pour réduire le stress et la souffrance des animaux. Plus précisément, la souffrance des animaux est évitée ou réduite au minimum. La douleur et/ou la détresse des animaux seront, le cas échéant, réduites par la sédation, l'analgésie, l'anesthésie ou tout autre moyen approprié pour réduire la douleur ou la détresse, conformément aux pratiques vétérinaires reconnues. Cette action respectera les principes de la déclaration de Bâle (www.basel-declaration.org), qui défend l'idée que les expérimentations animales dans la recherche fondamentale et appliquée doivent être planifiées et réalisées avec un soin extrême et qui contribue à fournir à la société des informations ouvertes et transparentes sur les expérimentations animales.

Choix des espèces

Les propriétés de base des microcircuits neuronaux chez la souris sont similaires à celles d’autres mammifères. Les approches expérimentales multiples réalisées chez la souris permettent une analyse complète allant du comportement jusqu’à l’activité d’un seul neurone. Les souris peuvent être génétiquement modifiées révélant ainsi la fonction de gènes spécifiques. Les phénotypes sont normaux, non dommageables. Les animaux reproducteurs sont maintenus au stade homozygote donc il n’y a pas la nécessité de les génotyper. Si jamais le besoin se crée, il consiste en un prélèvement de queue sur des animaux anesthésiés par isoflurane et marqués par un tatouage au niveau des phalanges avant sevrage. Pour les expérimentations des males transgéniques homozygotes sont croisées avec des femelles commerciales. En effet il est recommandé de réaliser les expérimentations sur des animaux hétérozygotes. Animaux adultes seront utilisés pour toutes le procedures. Toutes les procédures nécessitent des interventions chirurgicales qui ne peuvent être pratiquées que sur des animaux adultes. En outre, toutes les expériences seront réalisées chez des souris adultes, lorsque les circuits corticaux préfrontaux ont atteint un stade de maturation final. Nos animaux sont identifiables par tatouage des phalanges selon la nomenclature universelle. Aucun animal ne sera genotype pour ce projet.

90 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules de cancer du foie humain sont greffées sous leur peau, puis elles reçoivent jusqu'à vingt injections d'anticorps sur dix semaines, avant d'être tuées pour prélever les tumeurs. Le porteur décrit des ulcérations cutanées possibles aux sites de greffe et d'injection, et un anticorps pouvant endommager des tissus sains. Il indique avoir mené des essais in vitro préalables mais conclut à la nécessité d'une validation sur "animal entier".

Objectifs

L’objectif de ce projet est de tester différents anticorps dirigés contre une protéine localisée sur la membrane des cellules qui a été clairement montré comme participant au développement de différents cancers, notamment le cancer du foie qui est le 3ème cancer le plus meurtrier au monde. Depuis une dizaine d’année nous avons développé un anticorps reconnaissant spécifiquement cette protéine membranaire. Nous avons montré que cet anticorps conduit à une inhibition partielle de la croissance tumorale de cellules cancéreuses humaines transplantées dans des souris très immunodéficientes. Nous avons ainsi montré que l’anticorps ralentit la croissance de la tumeur. Récemment, nous avons développé un panel de différents anticorps reconnaissant cette protéine membranaire. Ainsi, afin d’explorer et d’exploiter pleinement le potentiel thérapeutique de ces anticorps, nous souhaitons tester leur efficacité dans un modèle de souris immunodéficientes afin de déterminer lequel présente l’effet le plus prononcé sur la croissance tumorale. Cette étude nous permettra ainsi de déterminer quelle forme d’anticorps est la plus optimale pour un développement clinique ultérieur.

Bénéfices attendus

Ce projet doit nous permettre d’évaluer le potentiel thérapeutique de nos anticorps pour le traitement du cancer du foie afin de profiter aux patients atteints de ce type de cancer pour lequel les options thérapeutiques sont actuellement très limitées, voire inexistantes.

Procédures

Dans ce projet, tous les animaux seront soumis aux interventions suivantes : -Une injection unique, sous la peau, de cellules cancéreuses humaines, réalisée sous anesthésie générale gazeuse, temps nécessaire environ 5 minutes par animal anesthésie comprise. -Une injection bi-hebdomadaire d’anticorps sur animaux vigiles pendant maximum 10 semaines, soit un maximum de 20 injections. Temps nécessaire pour chaque injection environ 1 minute par animal.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sont très limités. Dans certains cas la croissance de la tumeur peut entrainer l’apparition d’une ulcération cutanée au niveau du site d’implantation des cellules. De même, les injections répétées d’anticorps peuvent parfois engendrer une douleur ou très rarement une ulcération au niveau des sites d’injection. Un de nos anticorps peut de se fixer à la protéine membranaire de la souris, ce qui pourrait éventuellement induire des dommages au tissus sains exprimant normalement cette protéine et entrainer une dégradation de l’état général des animaux.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tumeurs qui seront utilisées pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro sur lignées cellulaires afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite maintenant une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux inclus dans cette étude, les tailles d’effectifs ont été déterminée à priori grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont, l’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification et des briques de tremble à ronger, et des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance.

Choix des espèces

Les souris immunodéficientes sont des modèles reconnus dans la communauté scientifique pour la greffe sous cutanée de lignées cancéreuses humaines afin de tester rapidement la pertinence d’une approche thérapeutique. La souche immunodéficiente choisie possède néanmoins certaines cellules capables d’améliorer l’effet thérapeutique des anticorps. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8 semaines afin que ces cellules en question soient matures. De plus il est préférable de greffer les cellules sur des animaux adultes afin que les tumeurs grandissantes entravent le moins possible leur capacité de mouvement.