Procédures modérées

500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur mammaire ou une injection de cellules tumorales dans la veine caudale, une chimiothérapie et jusqu'à six cycles de thérapies dites innovantes, avant une exsanguination terminale par ponction intracardiaque, pour étudier la réponse immunitaire au cancer du sein après traitement. Le porteur décrit une tumeur à croissance rapide pouvant provoquer nécrose, ulcérations cutanées et hémorragies douloureuses. Il juge une étape in vivo "nécessaire" pour se rapprocher de la clinique humaine.

Objectifs

L’objectif du projet est d'évaluer l'impact de la chimiothérapie conventionnelle sur la réponse antitumorale, particulièrement la réponse du système immunitaire sur des tumeurs mammaires murines implantées chez des souris, au niveau du site primaire et des métastases, afin de caractériser des acteurs moléculaires pertinents pouvant être cibler par une thérapie innovante. Le projet global consiste à étudier la réponse du carcinome mammaire et de son environnement immunitaire après chimiothérapie dans un modèle syngénique murin immunocompétent comparé un modèle immunodéficient afin de définir : 1. L’efficacité de la chimiothérapie sur la tumeur initiale et le développement autonome des métastases incluant la caractérisation du programme de mort déclenchée dans les cellules tumorales sensibles et notamment la voie cGAS/STING 2. le remaniement du microenvironnement tumoral qu’il induit, particulièrement au niveau immunitaire (immunité innée et adaptative) locale (tumeur primaire) et systémique (métastases, ganglion de drainage, sang) 3. la nature des clones tumoraux qui résisteront au traitement 4. la réponse immunosuppressive locale qui a permis l’établissement des métastases 5. les stratégies thérapeutiques ciblant les acteurs de mort cellulaire et de réponse anti-tumorale immunitaire pouvant amplifier les effets de la chimiothérapie en diminuant les cellules lui échappant

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est de participer au rétablissement d’une réponse immunitaire antitumorale locale et/ou systémique efficace grâce à la caractérisation et au ciblage des voies de signalisation participant à l’échappement tumoral entre la tumeur et son microenvironnement immunitaire. L’évasion immunitaire dont bénéficie la tumeur repose sur des processus intrinsèques à la tumeur ou sur sa capacité à corrompre l’environnement tissulaire dans lequel elle évolue et l’effet cytotoxique direct d’une chimiothérapie efficace modifie l’équilibre initial. A court et moyen terme, il va donc être important de déterminer le type de mort que les cellules tumorales vont déclencher sous l’effet de la chimiothérapie, et la nature des signaux d’alarme libérés dans l’espace tumoral ainsi que leur cinétique de sécrétion. Ces signaux de nature variée (incluant métabolites, cytokines, acides nucléiques, vésicules, organites...) influent sur les autres cellules tumorales ou immunitaires au niveau local ou systémique, contribuant à l’adaptation de la tumeur, du système immunitaire et finalement à la récidive de la maladie. Ceci va permettre de générer des données biologiques intégrant le caractère inflammatoire et/ou immunomodulateur de la mort cellulaire induite par le traitement anticancéreux au niveau de la tumeur primitive (ou sa maladie résiduelle quand une exérèse a été pratiquée) ou des métastases associées. A moyen et long terme, ceci permettra d’identifier les processus cytotoxiques qui seront capables de favoriser une réaction immunitaire antitumorale locale et systémique, en l’associant éventuellement avec les approches d’immunothérapie actuellement en cours de développement.

Procédures

Chaque animal de l’étude recevra : • une allogreffe tumorale au niveau 4e coussinet mammaire après incision cutanée et sous anesthésie générale (durée : 20 minutes) avec exérèse tumorale chirurgicale sous anesthésie générale 1é jours plus tard (durée : 20 minutes) o u une injection intraveineuse de cellules tumorale dans la veine caudale sans allogreffe associée (durée : 5 minutes) • 3 injections de chimiothérapie par voie intra-péritonéale sur animal vigile (durée : 2 minutes) • Administration d’une ou de plusieurs thérapies innovantes (jusqu’à 6 cycles par animal) par voie intra-péritonéale ou per os/gavage sur animal vigile ou sous anesthésie générale (durée : 2-5 minutes) • 5 séances de bioluminescence après anesthésie générale et injection intra-péritonéale de Luciférine (durée : 30 minutes) • Une exsanguination terminale par ponction intra-cardiaque sous anesthésie générale injectable juste avant la mise à mort (durée : 15 minutes)

Impact sur les animaux

Le modèle 4T1 est un modèle de cancer mammaire montrant une croissance tumorale rapide et une extension métastatique précoce notamment au niveau du poumon dans les premiers stades puis au niveau de divers organes ensuite (foie, os, rate, cerveau). La croissance de la tumeur et des ses métastases peut provoquer des effets indésirables sur les animaux recevant cette lignée. Tout d’abord au niveau local d’implantion de la tumeur primaire (dans le coussinet mammaire de la 4e mamelle), l’animal peut subir une nuisance mécanique de la tumeur par son volume pouvant compliquer sa mobilité et son activité. La tumeur primaire, par sa croissance rapide, peut montrer une nécrose centrale par hypoxie, associée à des remaniements cutanés ulcératifs et hémorragiques entraînant une douleur pour l’animal. Ces nuisances au niveau du site local seront réduites par l’exérèse précoce (J12) de la tumeur et seront absentes dans le modèle métastatique par injection de cellules tumorales dans veine cave caudale. Au niveau des différents sites métastatiques, on peut observer des difficultés fonctionnelles de(s) différent(s) appareil(s). Notamment au niveau du poumon, une dyspnée peut être observée, due à la présence mécanique des métastases et/ou à la présence d’un hydrothorax ainsi qu’au niveau de la moelle osseuse avec des fractures spontanées par présence mécanique de la masse dans le fût osseux. De manière plus générale, l’animal peut être touché par des signes plus généraux de mauvais état général comme la perte de poids et d’appétit ainsi qu’une hypothermie persistente. Des observations et examens cliniques seront réalisés très régulièrement afin de mettre en lumière les animaux montrant des signes cliniques atteignant des points limites pour leur administrer un analgésique en cas de signes de douleur (opioïdes) ou procéder à une mise à mort anticipée.

Devenir

Dans le cas d’une allogreffe tumorale (Procédure 1), la tumeur sera analysée par une séance de Bioluminescence puis sera traitée par une séance de chimiothérapie -avec ou sans traitement innovant- avant l’exérèse de sa tumeur. Dans le cas d’une injection intraveineuse de cellules tumorales (Procédure 2), l’animal subira seulement une injection dans la veine caudale des cellules 4T1 sans chimiothérapie néo-adjuvante ni exérèse tumorale. Ensuite, dans tous les cas (Procédures 1 et 2), les animaux recevront 4 séances d’analyse par bioluminescence et 3 séances de chimiothérapie -avec ou sans traitement innovant-. A la suite de la dernière séance d’analyse par bioluminescence, l’animal sera laissé endormi pour une exsanguination précédent la mise à mort.

Remplacement

Le projet s’intéresse à la caractérisation des mécanismes d’échappement tumoral au système immunitaire, notamment dans la niche métastatique. Il est très compliqué de mimer in vitro une implantation métastatique ectopique complexe dans un terrain pulmonaire riche en divers éléments micro-environnementaux comme notamment les acteurs locaux de l’immunité innée et acquise. Une étape in vivo est donc nécessaire afin de se rapprocher au plus près des conditions de clinique humaine, afin d’observer finement les mécanismes d’action des cellules tumorales et immunitaires dans la niche tumorale. Toutefois, avant implantation in vivo dans la souris, la lignée 4T1-Luc2 sera étudiée in vitro dans sa réponse aux traitements et dans les caractéristiques de résistance à ce dernier. Les prélèvements obtenus par l’expérience in vivo seront analysés ex vivo afin d’en tirer des acteurs moléculaires pertinents qui seront validés, in vitro, sur cultures cellulaires ou organoïdes, puis ciblés par des molécules afin de retourner au modèle in vivo murin dans un dernier temps.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombres d’animaux utilisés, le personnel est formé aux outils statistiques appliqués à l'expérimentation animale (planification, randomisation et analyse) par l’utilisation de traitements statistiques des données (ANOVA, Bartlett,…). Les protocoles d’injection et d’exérèse du modèle 4T1, issus de la bibliographie, sont validés et robustes permettant une prise tumorale optimale sur l’ensemble des individus de la cohorte, limitant l’utilisation d’animaux dont les prélèvements se révèlent non analysables. L’ensemble du protocole expérimental sera précisément défini en amont afin de limiter les biais de non homogénéité entre lots de souris. L’expression par la lignée 4T1 de la luciférase facilite une quantification précise de la croissance tumorale et de l’extension métastatique, réduisant donc le nombre d’animaux pour atteindre des résultats statistiquement significatifs. Elle permet aussi un suivi cinétique non invasif des masses et donc sans sacrifice à différents temps de lots d’animaux. Le personnel collaborera avec d’autres équipes, notamment dans le partage des animaux (les animaux disponibles devenus trop âgés pour la greffe ou de sexe masculin) et dans le partage des données notamment par la mise en commun des données et des expertises analytiques.

Raffinement

Le bien-être des animaux de l’étude sera particulièrement porté à l’attention du personnel qui veillera aux meilleures conditions d’hébergement possible, notamment via un maintien des groupes sociaux (3-4 animaux par cage) et l’enrichissement de l'habitat (frisottis de papier ajoutés aux cages). La gestion du stress des animaux sera maximisée, par une contention la plus rapide et la moins fréquente possibles. Différents lieux accueilleront les animaux pour un distanciation maximale entre les lieux d’hébergement, de soins et de sacrifice. Enfin, la douleur des animaux utilisés sera fréquemment monitorée par un examen clinique des animaux tous les 2-3 jours (et tous les jours en fin d’expérimentation) afin de déterminer le plus précocément possible les points critiques chez un animal et d’adapter le protocole d’analgésie (c.f. Annexe 5).

Choix des espèces

La souris est l’espèce de choix pour ces essais : - modèle 4T1 de cancer du sein décrit précisément dans la bibliographie pour les souris immunocompétentes Balb/c - concordance du modèle 4T1 murin avec les observations cliniques chez les patientes femmes atteints d'un carcinome mammaire et sur son évolution métastatique - Similitudes de la physiologie et de la taille du génome entre la souris et l'homme - l'organisme murin évolue rapidement (courte durée de vie) et permet des analyses compatibles avec les impératifs de progrès thérapeutiques à apporter en clinique humaine -certaines souches sont génétiquement modifiées, permettant la création de modèles tumoraux particuliers (absence du système immunitaire pour mettre en lumière le rôle de ce dernier dans l’échappement au traitement des cellules tumorales). Les animaux utilisés ont un âge qui varie entre 6-8 semaines à leur inclusion dans le protocole. En effet, la prise tumorale est dépendante de l'imprégnation hormonale : plus elle est précoce et prolongée, plus le taux de prise de greffe est important. Dans le cas des modèles 4T1, elle est estimée à proche de 100% dans ses conditions chez les souris immunocompétentes d'après la bibliographie existante. De plus, le temps de latence estimé avant prise tumorale est de 2-3 semaines et les métastases sont détectables à partir de 4-5 semaines : les souris auront atteint l'âge adulte, un âge où elles pourront supporter le développement de la tumeur.

6 615 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des greffes de cellules de mélanome, sous la peau, dans la veine caudale ou par injection intrasplénique sous anesthésie, puis des injections d'inhibiteurs trois fois par semaine pendant jusqu'à soixante-dix jours, pour tester des molécules censées lever la résistance aux traitements du mélanome. Le porteur décrit des tumeurs pouvant provoquer nécroses cutanées, perte de poids et prostration avant l'atteinte des points limites. Il affirme qu'il n'est "pas possible de s'affranchir" de la souris faute de méthode reproduisant des interactions aussi complexes.

Objectifs

Malgré les progrès dans le traitement des patients atteints de mélanomes avec les thérapies ciblées (TT), combinaison d’inhibiteurs (vémurafénib/tramétinib ou dabrafénib/cobimétinib), et les immunothérapies (ICT) (nivolumab, pembrolizumab et/ou ipilimumab), plus de la moitié des patients développent des résistances à ces traitements. De nouvelles approches thérapeutiques pour permettre de contourner ces résistances et resensibiliser les patients aux traitements deviennent alors nécessaires. Notre équipe a montré que l'altération du paysage épigénétique est un événement clé associé à la plasticité des cellules de mélanome et à l'acquisition de résistances. L'épigénétique est l'étude de l'activité des gènes sans modification de la séquence d'ADN. Nous avons étudié le rôle de l’épigénétique sur les résistances des cellules de mélanome au TT et aux ICT. In vitro, nos résultats montrent que l’inhibition de répresseurs transcriptionnels (appelés CtBP1 et CtBP2) et du modificateur épigénétique (appelé G9a) est capable de resensibiliser les cellules de mélanome résistantes aux TT et aux ICT. L’objectif du projet est de valider in vivo, chez la souris, les résultats montrant la re-sensibilisation des cellules de mélanome aux TT et/ou ICT. Par ailleurs, les mélanomes métastasent facilement aux poumons, au foie et dans les os, entre autres, causant le décès des patients. La localisation des métastases influence les réponses aux traitements, qui peuvent être différentes en fonction de l’environnement pulmonaire, hépatique ou osseux. Nous étudierons donc l’effet des drogues épigénétiques sur le développement des métastases dans divers organes. Ainsi, nous validerons nos résultats montrant une diminution de la capacité métastatique des cellules de mélanome.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une validation in vivo, chez la souris des observations faites in vitro, sur la capacité des drogues épigénétiques à resensibiliser les cellules de mélanomes résistantes aux thérapies ciblées. Il permettra aussi de vérifier les effets de ces drogues dans le contexte d’un système immunitaire complet et de vérifier que les drogues utilisées n’affectent pas le système immunitaire. Ces validations sont indispensables pour envisager un développement clinique de nos approches thérapeutiques (inhibiteur épigénétique en association avec les thérapies ciblées ou les immunothérapies).

Procédures

Pour les procédures 1 et 5 une injection de cellules en sous cutanée au niveau du flanc gauche sur souris vigile puis administration par injection intra-péritonéale des différents composés (inhibiteurs) 3 fois par semaine jusqu’à 70 jours maximum après début du traitement (864 souris procédure 1 et 648 souris procédure 5, au total 1512 souris). Pour les explorations métastatiques, les souris seront injectées 15 min avant l'imagerie par voie intra-péritonéale avec de la D-luciferine puis anesthésiées avec de l'isoflurane selon le protocole préconisé (voir procedure expériementale). Pour les procédures 2 et 6, la formation de métastases pulmonaires grâce à l’injection veine caudale sera suivie par bioluminescence 24h après l'injection (=confirmation du signal) puis 2 fois par semaine pour suivre l'évolution des métastases, puis administration par injection intra-péritonéale des différents composés (inhibiteurs) 3 fois par semaine jusqu’à 70 jours maximum après début du traitement (864 souris procédure 2 et 648 souris procédure 6, au total 1512 souris). Pour les procédures 3 et 7, une injection intrasplénique de cellules sur souris sous anesthésie générale (anesthésie environ 1h et acte chirurgicale environ 30min), puis administration par injection intra-péritonéale des différents composés (inhibiteurs) 3 fois par semaine jusqu’à 70 jours maximum après début du traitement (864 souris procédure 3 et 648 souris procédure 7, au total 1512 souris). Le suivi des métastases se fera comme pour la procedure 2 et 6. Pour les procédures 4 et 8, une injection intracardiaque de cellules sur souris sous anesthésie générale (environ 30min), puis administration par injection intra-péritonéale des différents composés (inhibiteurs) 3 fois par semaine jusqu’à 70 jours maximum après début du traitement (1188 souris procédure 4 et 891 souris procédure 8, au total 2079). Le suivi des métastases se fera comme pour la procedure 2 et 6.

Impact sur les animaux

Avant l’arrivée aux points limites décrits dans chaque procédure, les animaux pourront subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous seront très attentifs. Ces effets indésirables pourront être causés soit par la croissance de la tumeur, soit par l’injection des drogues thérapeutiques, soit par l’acte chirurgical initial. La croissance de la tumeur pourra entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance (poils hérissés, dos voûté, perte de poids, mobilité réduite, prostration), ainsi que des altérations visibles de la peau (nécrose…). L’injection des drogues pourra également entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance et des altérations locales au site d’injection (rougeur, infection, nécrose,..). Le site d’injection IP sera surveillé et changera de côté pour chaque injection. En cas d’altération au site primaire d’injection, l’injection suivante s’effectuera de l’autre côté. En cas de rougeurs des deux côtés, l’injection sera reportée au tour suivant. L’acte chirurgical (injection intracardiaque, injection intra splenique) pourra également entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance et des altérations locales au site de l’opération. La cicatrice sera surveillée. En cas de persistance des signes décrits ci-dessus, l’animal sera sacrifié. Il a été montré dans la littérature que la combinaison de DMSO + PEG 300 + Tween 80 ne présente aucune toxicité pour l’animal et a déjà été administré chez les patients atteints d’un cancer. (Kalepu & Nekkanti, Acta Phamaccutica Sinica B, 2015). Les drogues A et B ont déjà été testées in vivo par des pairs et les concentrations utilisées sont réduites par rapport aux données de la littérature (Chen et al., Journal of Cancer, 2021, doi: 10.7150/jca.50255).

Devenir

Tous les animaux seront sacrifiés.

Remplacement

En termes de remplacement, il n'est pas possible de s'affranchir de l'utilisation de souris car il n'existe pas de méthodes alternatives qui permettent de reproduire des interactions physiologiques aussi complexes. Les études in vitro que nous avons réalisées dans un premier temps ont montré l’efficacité des drogues épigénétiques dans l’induction de la mort ou l’arrêt de la prolifération des cellules de mélanome cutané ainsi que dans l’inhibition de leur capacité invasive.

Réduction

En termes de réduction, le nombre d'animaux nécessaire à cette étude a été déterminé à l'aide d'un test de puissance statistique dans le cas où la différence de moyenne de chaque groupe est supérieure au moins d’un quart à notre écart type (1.25 fois notre moyenne contrôle) et une puissance de 0.9 et un risque de 0.01. Pour la réalisation de ce projet, il faudra 6615 souris. Les groupes contrôles sont mis en commun pour les différents traitements avec les inhibiteurs afin de réduire le nombre d’animaux. L'utilisation de ces animaux sera optimisée en prélevant les tumeurs/métastases et organes (tels que le foie, la rate, les poumons) pour des analyses histologiques et biochimiques. Il est fort probable que le nombre d’animaux utilisés soit très inférieur à la fin du projet. En effet, certaines procédures ou parties de procédures pourront être abandonnées, ou le nombre d’animaux réduit, en fonction des résultats obtenus.

Raffinement

En termes de raffinement, les souris seront hébergées à plusieurs par cage avec un environnement enrichi et seront observées deux ou trois fois par semaine selon la procédure par les demandeurs du projet afin de prendre en charge tout signe de douleur, de stress ou d’inconfort. Les manipulateurs sont en possession du niveau opérateur ou concepteur qui permet d’avoir une bonne vision et une excellente capacité à détecter les problèmes de santé, stress ou malaise. Le suivi est fait par des méthodes non invasives (mesure des tumeurs sous cutanées au pied à coulisse, pesée des animaux régulières). Des points limites précis sont définis dans chaque procédure. Le nombre d’animaux sera réduit au maximum grâce à un suivi longitudinal précis et quantifiable par imagerie.

Choix des espèces

La souris est un mammifère ayant de similitudes génétiques avec l’homme. De plus, elle a un cycle de vie court, un cycle de reproduction bien connu, une faible taille ce qui permet d’avoir des conditions d’hébergement plus faciles. Nous utiliserons un modèle de souris C57BL/6J (pour les cellules de mélanome murin) et Nude (pour les cellules de patients). Grâce à un système immunitaire très faible, la souris nude pourra recevoir des cellules humaines sans risque de rejet. D’autre part, ce modèle de souris est commercialisé, bien établi et d’importantes études ont déjà été réalisées à partir de ce modèle. Pour les procédures expérimentales, les souris C57BL/6J et Nude sont utilisées au stade adulte (7 semaines). Elles sont commandées à 6 semaines, puis l’expérience commence après une semaine d’acclimatation. Concernant les souris Nude, déprimées en cellules T, il a été montré qu’après 10 semaines il pouvait y avoir un retour d’une petite proportion de cellules T dans ces souris. En effectuant les injections à 7 semaines, la prise tumorale aura eu lieu avant le possible retour de la population des cellules T, et les tumeurs grossiront principalement en absence de la population T sur une majeure partie de l'expérimentation. Ceci est scientifiquement cohérent avec les expériences déjà faites dans l’équipe et les données de la littérature (Ohanna et al, Genes&Dev, 2011; Bonet et al, Journal of Biological Chemistry, 2012 ; Ohanna et al, Oncotarget, 2013).

90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont soumises à une course de deux heures sur tapis roulant en pente descendante, destinée à provoquer des microtraumatismes musculaires, avec prélèvements de sang et de fèces, puis tuées pour recueil de matériel biologique, afin de tester un extrait de microalgue censé accélérer la récupération. Le porteur situe l'objectif du côté des stratégies nutritionnelles pour sportifs, tandis que les lésions musculaires sont provoquées volontairement. Il affirme que l'étude des relations entre alimentation et activité physique ne peut s'envisager que chez l'animal.

Objectifs

La principale conséquence de lésions musculaires induites par l'exercice pour l'athlète est la perte de la fonction musculaire squelettique et la douleur. C'est pourquoi de nombreux nutriments et aliments fonctionnels ont été étudiés pour leur capacité à atténuer les effets de ces lésions et à accélérer la récupération, ce qui est l'objectif de nombreuses stratégies nutritionnelles pour les athlètes. Dans cette étude, nous cherchons à évaluer l'effet d'un extrait de microalgue sur la récupération musculaire suite à un test de blessure provoquée par un exercice physique.

Bénéfices attendus

Dans cette étude, nous évaluerons la capacité d'un extrait de microalgue à atténuer les effets de lésions musculaires et à accélérer la récupération suite à un exercice physique. Des modifications métaboliques seront identifiées par des dosages des marqueurs des voies du métabolisme énergétique et musculaire. Des marqueurs inflammatoires et du stress oxydant seront également recherchés.

Procédures

Un prélèvement de sang sur animal vigile sera réalisé au début de l'étude. Deux recueils de fèces seront effectués à 4 semaines d'intervalle (isolement en cage individuelle pendant 1h au maximum). Une course de 2h (+20 min d'habituation/échauffement) sur tapis roulant aura lieu en fin de protocole.

Impact sur les animaux

La course sur tapis roulant peut engendrer un stress chez l'animal. Au lieu d'une période d'acclimatation typique qui dure de quelques jours à plusieurs semaines, une brève période d'acclimatation au début de la séance d'exercice sera réalisée. Les souris seront placées sur un tapis roulant stationnaire pendant quelques minutes pour leur permettre de se familiariser avec l'environnement de course avant une augmentation progressive de la vitesse et de la pente pendant 20 minutes. Cette période a pour but de réduire le stress provoqué par un environnement nouveau tout en prévenant toute adaptation au protocole de course qui est connu pour atténuer de manière significative les effets nocifs sur les muscles . Les blessures causées par ce type de course en pente descendante sont de l'ordre de microtraumatismes musculaires et courbatures.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux seront mis à mort pour recueil du materiel biologique nécessaire aux analyses.

Remplacement

L'étude des relations entre alimentation et activité physique ne peut s'envisager que dans un modèle in vivo. Aucun modèle in vitro n’a pour l'instant la capacité d’intégrer cette complexité multifactorielle.

Réduction

Le nombre d'animaux est le nombre minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives entre les groupes. Des études du même type portent sur 8 à 10 animaux, du fait de la forte variabilité entre animaux au niveau de la performance sportive. Nous travaillerons avec 9 animaux par groupe afin que le nombre d'animaux par cage soit homogène (3 souris par cage). Nous chercherons à mettre en évidence des différences statistiquement significatives entre 3 groupes ou plus à l'aide de tests statistiques non paramétriques de Kruskall-Wallis. Dans le cadre de comparaisons entre 2 groupes, un test statistique de Mann-Whitney sera appliqué.

Raffinement

Les animaux sont hébergés par groupe de 3 animaux par cage. L'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique et de matériel de nidification (bandelettes de papier kraft). Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Les animaux seront observés hebdomadairement afin de détecter des comportements agressifs de certains animaux, si tel est le cas l'animal agressif sera isolé de ses congénères dans une cage individuelle. Si un animal est blessé, il sera soigné par badigeonnage de bétadine sur la zone lésée, il sera également isolé le temps de la cicatrisation de ses blessures. Dans tous les cas, les animaux isolés resteront en contact visuel, olfactifs et auditifs avec leurs congénères. La course sur tapis roulant pouvant engendrer un stress chez l'animal, afin de limiter ce stress, chaque souris sera placée sur le tapis roulant fixe pendant quelques minutes afin de se familiariser avec l'environnement. Pendant les 20 premières minutes d'exercice, les animaux seront familiarisés avec le tapis roulant à une vitesse lente et régulière, qui sera progressivement augmentée. Au cours des phases d’exercice sur tapis, les animaux bénéficieront d’une surveillance constante. Si un animal venait à se blesser pendant la course (contusion), ils seraient alors immédiatement pris en charge selon les recommandations du vétérinaire référant. Pour chaque procédure, des points limites spécifiques et des points d'arrêt ont été définis.

Choix des espèces

La souris est un modèle classiquement utilisé dans les études concernant la mobilisation des ressources énergétiques, notamment au cours d’un exercice imposé. Le modèle C57Bl/6J est une souche reconnue pour ce type d'expérimentation. Les animaux seront âgés de 6 semaines à l’achat et d’environ 7 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondant tels que le vieillissement.

864 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une transplantation chirurgicale d'îlots pancréatiques sous la capsule rénale ou par voie intraportale et des injections répétées, après induction d'un diabète, pour tester une molécule censée améliorer la survie des greffons. Le porteur renvoie l'application clinique au conditionnel, les résultats devant "facilement" être transposés, tandis que les souris sont rendues diabétiques puis opérées. Il indique avoir mené des essais in vitro préliminaires mais affirme qu'"aucune méthode alternative" ne permet d'aller plus loin.

Objectifs

Notre projet porte sur l'application préclinique de nouveaux composés ciblant une voie innovante que nous avons identifiée chez les mammifères, et dont les inhibiteurs peuvent prévenir les lésions tissulaires induites par l'ischémie associées au processus de transplantation. Après avoir démontré leur efficacité dans un modèle préclinique de transplantation rénale et d'accident vasculaire cérébral, notre objectif est d'évaluer leur utilité dans la transplantation d'îlots pancréatiques, connue pour être une thérapie curative du diabète de type 1. Les applications cliniques ont clairement montré que cette procédure améliore le contrôle glycémique chez les patients mais elle présente certaines limites liées à la survie des Îlots.

Bénéfices attendus

L'objectif de cette étude est de déterminer l'efficacité de notre traitement pour améliorer le rendement, la survie et la fonctionnalité des îlots avant et après transplantation. Les résultats pourront ainsi être facilement transposés à la clinique.

Procédures

Les animaux receveurs seront soumis à une procédure chirurgicale de transplantation soit sous la capsule rénale (procédures 1 et, 2) soit par voie intraportale (procédure 3). Les actes chirurgicaux seront effectués une seul fois par animal et dureront le moins longtemps possible (20-30 minutes max). Les animaux bénéficieront d'un suivi journalier dans les premiers jours post-opération. Les animaux seront soumis à des injections IP (avec aiguille G25), selon la procédure, avec des produits (médicaux ou pharmacologiques) qui n’entrainent aucune souffrance physique.

Impact sur les animaux

Les souris diabétiques développeront l'hyperglycémie typique de cette pathologie qui sera monitorée par bandelettes. Le traitement pharmacologique préconisé dans les procédures utilise un produit déjà breveté qui ne cause aucune toxicité pour l'animal. Les animaux receveurs qui subiront une procédure chirurgicale seront attentivement suivis afin d'éviter toute complication post-opératoire (infection, inflammation et douleur).

Devenir

Les animaux seront tous euthanasie à la fin de chaque procedure ou lors qu'ils attaignent le point limite identifié.

Remplacement

Des études préliminaires sur lignée cellulaire (INS-1E) et îlots primaires isolés de souris nous ont permis 1) d'établir la concentration optimale du produit pour obtenir la meilleure survie et fonctionnalité des îlots pancréatiques et 2) de démontrer la capacité de notre composé à protéger les îlots en culture des phénomènes d’anoxie. Toutes ces étapes d'optimisation ont été effectuées in vitro avec un nombre très limité d'îlots par rapport aux expériences de transplantation. Néanmoins, aucune méthode alternative au modèle in vivo n’est disponible pour aller plus loin dans notre étude.

Réduction

Les études d'optimisation in vitro nous ont permis de réduire le nombre de souris nécessaire pour les procédures chirurgicales. En plus, selon les résultats obtenus dans les procédures 1 et 2, nous pourrons éventuellement choisir un seul type de préparation d'îlots avant transplantation (pré- ou per-conditionnement), en réduisant le nombre des souris nécessaires dans la procédure 3. Le nombre de souris utilisé dans l'étude est strictement calculé pour obtenir des résultats statistiquement concluants.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe et en milieu enrichi. Ils seront surveillés quotidiennement (comportement, apparence, signes cliniques) par le personnel animalier d'une part, et par les personnes en charge de l'expérimentation d'autre part. Toute apparition de signes de douleur tels que prostration, dos vouté, isolement et poil hérissé entrainera l’ouverture d’une fiche de score avec des points limites bien définis qui entraineront l'euthanasie de l‘animal par dislocation cervicale. Une attention particulière sera portée au point d’injection abdominal (rougeur) et à la zone de chirurgie pour les animaux transplantés.

Choix des espèces

Aucune méthode alternative ou modèle in vitro n’est disponible pour aller plus loin dans notre étude. En effet, la complexité des organes ne peut être récapitulée in vitro, ni le modèle d’ischémie et reperfusion. Les alternatives d’anoxie et d’hypoxie in vitro sont limitées dans leur mise œuvre et dans la pertinence des résultats obtenus. Les animaux seront utilisés entre 8 et 10 semaines post-natales qui est par expérience l’âge optimal pour la chirurgie.

9 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un traitement laser oculaire sous anesthésie puis des séances d'imagerie sur trois semaines, pour qu'une entreprise vérifie que son laser de traitement de la rétine ne provoque pas de cataracte avant un passage chez l'humain. Le porteur indique qu'une cataracte est possible, voire systématique dans le groupe le plus exposé, avec perte définitive de la vision de l'œil traité et stress pouvant entraîner une perte de poids. Il affirme que l'essai doit "obligatoirement" être mené in vivo et présente le lapin comme le seul animal à l'anatomie oculaire proche de l'humain.

Objectifs

Une société Suisse a développé un traitement laser (proche infrarouge) des maladies chroniques de la rétine (DMLA, glaucome, Rétinopathie diabétique) qui a pour but d’interagir avec le métabolisme cellulaire rétinien. Dans ce cadre, elle souhaite réaliser une expérimentation animale préliminaire pour vérifier que la technologie laser utilisée n’est pas cataractogène. L’apparition de cataracte est liée soit à un effet photothermal du laser (échauffement de tissus absorbant l’énergie laser comme l’iris) et/ou à un effet photo-chimique. Le traitement laser étudié n’étant pas ciblé sur l’iris et le cristallin étant optiquement transparent (absorption de l’énergie faible à nulle), il est supposé que l’effet photothermal du laser utilisé sera négligeable et non associé à un risque de cataractogenèse. Néanmoins, un effet photochimique (réaction chimique catalysée par la lumière) ne peut être exclu et est variable en fonction de l’intensité d’énergie utilisée. La présente étude propose ainsi d’évaluer l’absence de cataractogenèse liée au traitement laser étudié 1/à une énergie de travail qui serait utilisée chez l’Homme, 2/à une énergie seuil de référence (énergie maximale autorisée par législation par exemple), 3/ainsi qu’une énergie très supérieure à la dose maximale utilisée. Sera étudiée à court terme l’apparition d’une cataracte dans le cristallin de lapins après les tirs lasers.

Bénéfices attendus

Ce projet permetterait de connaître la sécurité pour le cristallin de l'utilisation d'un laser innovant ayant pour but de traiter des rétinopathies chroniques jusqu'ici très difficile à traiter voir impossible. Avec les résultats de ce projet, l'entreprise developpant ce dispositif pourra alors se tourner vers une étude clinique.

Procédures

Les 9 animaux recevront à j0 un traitement laser sans contact, sans docking et sous anesthésie générale qui a une durée théorique de 1 minute. Puis à J0 (postlaser immédiat), J1, J7, J14 et J21, la rétine et le cristallin des 2 yeux de l'animal seront observés par des techniques d'imageries sans contact (Lampe à fente, tomographie à cohrence optique et rétinographe) et sous anesthésie générale. Les observations ont une durée théorique de 30 minutes.

Impact sur les animaux

Une cataracte (opacification du cristallin) de l'oeil traité par le laser est possible pour les groupes 1 et 2 voir systématique pour le groupe 3. Cette atteinte du cristallin n'est pas douloureuse, mais est accompagné d'une perte de la capacité visuel définitive de l'oeil cataracté et par conséquent cela peut entrainer un stress pouvant se traduire par une perte de poids (supérieure ou égale à 10% en 3 jours) ; des perturbations comportementales graves et persistantes comme la piloérection, dos voûté, prostration, isolement, agressivité à l'ouverture de la cage et des perturbations graves et persistantes liées au système digestif (marqueur de stress chez le lapin) comme la constipation (absence de fèces), selles liquides. Les atteintes rétiniennes par un laser n'entraine aucune douleur et hémorragies. Le côté thermique du laser aura pour effet de cautériser les saignements. Le seul impact délétère pouvant être une atteinte de la capacité visuel de l'oeil traité. Si cela était le cas, le stress induit sera alors surveillé selon les mêmes critères que pour les atteintes du cristallin.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort par surdose d'anesthésiant sous anesthésie générale.

Remplacement

Ce nombre doit OBLIGATOIREMENT ÊTRE MIS EN ŒUVRE IN VIVO avant de pouvoir utiliser pour la première fois le laser chez l’Humain. Aucun dispositif ex vivo ou in silico ne peut remplacer la complexité de l'organisation de l'oeil et de l'histologie du cristallin.

Réduction

Il a été jugé que le nombre minimum, mais suffisant d’animaux était de 3 lapins par groupe pour l’expérimentation pour prendre en compte les différences interindividuelles pour ce type de traitement laser indolore.

Raffinement

Les animaux arriveront au moins une semaine (7 jours) avant tout manipulation. Tout est mis en œuvre pour LIMITER AU MAXIMUM LE STRESS ET LA DOULEUR DE L’ANIMAL (anesthésie générale pendant le traitement laser et les observations). Chaque animal bénéficie d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. La douleur est rigoureusement contrôlée grâce à des points limites évalués en amont, et gérer grâce aux moyens pharmacologiques appropriés (myorelaxant/anesthésie). Par ailleurs, les lapins sont hébergés en cage règlementaire pouvant communiquer entre elles ; dans un environnement enrichi (jouet kong et autres jeux). Enfin, l'eau et la nourriture (granules et foin) sont mises à disposition "ad libitum" et de la musique est diffusée en salle d’hébergement pour diminuer le stress et atténuer les bruits environnementaux. Toutes les techniques d'imagerie et la technique laser se font sans contact avec l'oeil et sans docking. Le traitement est indolore. La mise à mort de l'animal est faite sous anesthésie générale

Choix des espèces

D'un point de vue éthique et pratique, les lapins sont les seuls animaux communément utilisés en expérimentation animale et présentant une anatomie oculaire proche de l'homme. Pour que le traitement soit représentatif de ce qu’il puisse être chez l’homme dans le futur, la chambre antérieure de l’œil de l’animal ne doit pas être trop petite. C’est pour cela que nous optons pour des lapins âgés d’environ 3 mois (12 semaines).

6 120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection de cellules tumorales sous anesthésie, cinq gavages, quatre injections et des prélèvements de sang, puis est tuée pour analyse des tumeurs et organes, afin d'étudier le rôle du microbiote intestinal dans la réponse aux traitements anticancéreux. Le porteur renvoie au développement de médicaments à base de bactéries comme bénéfice attendu, tandis que des tumeurs sont induites chez chaque souris. Il affirme la "nécessité d'un organisme entier" porteur de tumeur et juge ces modèles "indispensables".

Objectifs

L’efficacité des traitements anticancéreux ciblant le système immunitaire fait actuellement l’objet de nombreuses études cliniques. Ces traitements permettent une réinduction de la réponse immunitaire qui se trouve supprimée par les cellules cancéreuses. Cependant, certains patients développent une résistance à ce traitement. Des résultats obtenus au sein de notre laboratoire ont démontré le rôle crucial du microbiote intestinal dans l’activation du système immunitaire permettant d’améliorer l’effet de thérapies anticancéreuses. Chez les patients atteints d’un cancer, de nombreux facteurs entraînent un déséquilibre du microbiote qui pourrait être impliqué dans la résistance aux traitements. En effet, des données publiées ont démontré que la prise de traitements antibiotiques impacte l’efficacité des traitements utilisés chez des patients atteints de cancer. Par ailleurs, des données générées par des études cliniques chez des patients atteints de cancer ont identifié certaines bactéries associées à l'efficacité des traitements anticancéreux. En conséquence, ce projet a pour but de caractériser le rôle des bactéries isolées du tube digestif des patients atteints de cancer (et de leurs produits actifs (métabolites)) et d'évaluer leur capacité à moduler la réponse aux thérapies anticancéreuses chez des souris porteuses de tumeurs.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de comprendre comment certaines bactéries améliorent l’efficacité des traitements utilisés chez des patients atteints de cancer. Il permettra de développer de nouveaux médicaments contenant des bactéries pour améliorer les réponses aux traitements anticancéreux chez les patients atteints de cancer. En effet, beaucoup de patients développent des résistances à ces thérapies. Des essais cliniques utilisant des bactéries vivantes sont en cours de réalisation.

Procédures

Les animaux seront soumis à une seule injection de cellules tumorales durant toute la durée de l’expérience (sous anesthésie, durée: 5 minutes ). Ces injections se feront après anesthésie générale gazeuse. 5 gavages oraux espacés à intervalle de 3 jours seront effectués (durée: quelques secondes). 4 injections sous anesthésie locale seront pratiquées (durée 20 minutes, incluant l'anesthésie locale). Du sang pourra être prélevé au niveau submandibulaire après anesthésie générale sous anesthésie gazeuse (1 fois par semaine), durée 10 minutes).

Impact sur les animaux

Croissances tumorales. Nuisances limitées liées à la présence d'une tumeur par animal.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour analyses sur les tumeurs et organes.

Remplacement

Les procédures expérimentales mises en jeu ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants (nécessité d’un organisme entier, vivant, avec un système immunitaire complexe, proche de l’homme, porteur de tumeur). Les modèles de souris traitées par antibiotiques nous sont indispensables pour étudier les interactions avec le microbiote intestinal et les mécanismes qui régissent l'efficacité des thérapies anticancéreuses. Les modèles in vitro de lignées cellulaires testés ne permettent pas de récapituler la complexité des interactions entre l’hôte, le cancer, son microbiote intestinal, son système immunitaire et des thérapies anticancéreuses.

Réduction

Les groupes seront constitués d’un minimum d’animaux assurant la fiabilité des résultats en termes de statistiques. Le nombre de prélèvements pré- et post-mortem seront optimisés dans le souci du confort de l’animal afin d’étudier le plus de paramètres possibles et ainsi d’éviter la répétition d’expérimentation. Deux bactéries ou selles de volontaires sains seront testés simultanément pour limiter le nombre de groupes contrôle et référence.

Raffinement

Le milieu sera enrichi afin de réduire le stress des animaux. L’inoculation des cellules tumorales se fera sous anesthésie générale. L’injection intra-péritonéale des traitements anticancéreux ainsi que les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale. Une surveillance accrue du comportement des animaux sera effectuée et mis au regard de points limites.

Choix des espèces

La souris est un mammifère et un modèle décrit, validé, facile à mettre en œuvre et admis dans la communauté scientifique. Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’efficacité des traitements utilisés chez des patients atteints de cancer. Des femelles seront utilisées car les modèles de tumeur ont été obtenus à partir de souris femelles. Les précédentes expériences publiées ont été validées à l’aide de souris femelles ayant atteint l'âge de maturité sexuelle. Les souris seront donc utilisées à partir de l’âge de 7 semaines, période à laquelle la maturité sexuelle est atteinte chez les souris.

124 bars européens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 48 tués pour prélèvement de tissus après la première saison de reproduction et 76 gardés en vie et réutilisés pour suivre leur reproduction sur cinq ans. Chaque poisson subit une vingtaine de manipulations sous anesthésie, biométrie, prises de sang et biopsies ovariennes ou vérification de la présence de sperme, à raison d'une par mois quatre mois par an. Le porteur décrit une exposition prolongée à une eau acidifiée pour mesurer les effets du changement climatique sur la reproduction. Il affirme qu'il "n'existe pas d'alternative" à l'expérimentation puisqu'il cherche les mécanismes physiologiques dépendant du pH.

Objectifs

Les émissions de CO2 causées par l'homme vers l’atmosphère sont absorbées par les océans, entraînant une acidification des océans, correspondant à une baisse des valeurs de pH de l’eau océanique. Le GIEC (Groupement d’Expert Intergouvernementaux sur l’Evolution du Climat) prévoit une baisse de 0,4 unité de pH pour 2100, soit un pH de 7,6 contre 8 aujourd’hui. Cette acidification de l’eau affecterait le fonctionnement du système nerveux central des poissons marins, avec un impact indirect sur la maturation sexuelle et la reproduction. Les dernières études scientifiques démontrent que les bars élevés depuis leur naissance dans une eau avec un pH abaissé à 7,6 ont une période de ponte plus tôt dans l’année et la qualité des gamètes diminue également chez les deux sexes. Dans ce contexte, ce projet vise à étudier les effets intergénérationnels sur la maturation sexuelle et la reproduction du bar européen d’une exposition à long terme à l’acidification pendant 5 saisons de reproduction successives.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer les effets à long terme et intergénérationnels de l’acidification océanique sur les reproductions successives d’un poisson marin à fort intérêt écologique et économique. Les connaissances ainsi acquises contribueront à l’évaluation des effets du changement climatique sur les organismes marins et pourront potentiellement faire évoluer la stratégie de gestion et de conservation des écosystèmes marins.

Procédures

Les poissons seront soumis à des manipulations répétées (biométrie, prise de sang, biopsie ovarienne/vérification de la présence de sperme), une fois par mois pendant 4 mois par ans (en janvier, février, mars et avril) et durant 5 ans consécutifs. Soit pour 1 poisson 20 manipulations de 5 min en 5 ans.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont modérés. La pêche des poissons peut entraîner un léger stress car les poissons sont sédatés dans leur bac avant d’être pêchés et anesthésiés. Après l’anesthésie, les manipulations s’enchaînent (biométrie, prise de sang, biopsie ovarienne pour les femelles ou massage abdominale pour les mâles) en moins de 5 minutes par poisson. L’intervalle d’un mois est suffisant pour la réalisation de ces manipulations répétées sur un même individu sans que cela n’engendre aucun signe de souffrance, de perte d’appétit ou de retard de croissance. On ne s’attend pas à avoir de nuisances dues à la répétition de ces gestes (4 fois par an et pendant 5 ans successifs) car ce sont des gestes réalisés en routine pour l’élevage commercial et le contrôle de la reproduction de cette espèce.

Devenir

A la fin de la première période de reproduction (en avril de la première année du projet) 6 mâles et 6 femelles par bassin (c’est-à-dire 48 animaux en total) seront mis à mort pour faire de prélèvements tissulaires. Les animaux restant (124-48=76) seront gardés en vie afin de suivre leur reproduction le temps du projet (5 ans). Cette décision a été prise par le responsable du projet en accord avec la SBEA.

Remplacement

Il n’existe pas d’alternative à cette expérimentation animale car nous cherchons précisément à identifier les mécanismes physiologiques contrôlant la reproduction des poissons qui dépendent des conditions de pH de l’eau.

Réduction

Le nombre de poissons a été déterminé à partir de premières données (biochimiques) issues d’expérimentations précédentes (avec les poissons de la génération F0). Des calculs de puissance statistique reposant sur des analyses de variance (ANOVA pour mesures répétées et modèles mixtes linéaires) ont été réalisés en ce sens afin de déterminer le plus petit nombre d’animaux permettant une analyse statistique rigoureuse avec un nombre minimal de réplicats (2 bassins par traitement), compte tenu de l’étendue de la variabilité interindividuelle des réponses hormonales entre les individus. De plus, le bar étant une espèce grégaire (qui vit en banc), ce nombre correspond au maintien d’une densité minimale compatible avec le bien-être animal et le bon déroulement de l’expérience (i.e. n’induisant pas de perturbations physiologiques pouvant fausser l’étude).

Raffinement

Les poissons seront mis à jeun 48h avant la procédure pour éviter la défécation et les vomissements. Les manipulations (biométries, prises de sang, biopsies ovariennes et massages abdominaux) sont regroupées afin de ne pas multiplier les anesthésies. Les poissons sont sédatés dans leur bac, puis pêchés délicatement à l’épuisette vers le bac d’anesthésiant. Le bac d’anesthésie contient un bullage qui permet d’apporter un maximum d’oxygène aux branchies et d’éviter toutes formes d’hypoxie. Les manipulations hors de l’eau dure moins de 5 minutes. Les poissons sont manipulés avec soin, ils sont posés sur un linge humide et épais pour protéger leurs écailles. Un linge humide est déposé sur les yeux pour les protéger et limiter le stress. Après les manipulations, les poissons sont placés dans un bac de réveil avec une légère sédation. Quand les mouvements respiratoires et l’équilibre sont revenus, ils sont transférés dans leur bassin d’élevage. Une attention particulière sera portée aux poissons les heures suivant les manipulations.

Choix des espèces

Les expériences proposées utiliseront le bar européen (Dicentrarchus labrax) comme modèle animal. Il existe une grande quantité d’informations disponibles concernant la zootechnie, la biochimie, le comportement et l’endocrinologie du bar ce qui permet d’envisager une étude approfondie des effets de l’acidification sur la physiologie de cette espèce. Les données obtenues par ce projet seront comparées à celles obtenues précédemment chez les bars géniteurs (F0) du lot utilisé dans ce projet (comparaison intergénérationnelle). Des stades adultes seront utilisés pendant la saison de reproduction, afin de répondre à l’objectif principal du projet : l’étude de la maturation sexuelle en fonction des traitements, qui implique nécessairement l’utilisation de poissons adultes matures des 2 sexes.