Procédures modérées

5 vaches laitières vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis éventuellement réintégrées au troupeau non expérimental. Hébergées en stabulation entravée pendant quinze semaines, elles subissent des prélèvements sanguins et des prélèvements répétés de jus de rumen par une canule, avec collectes totales d'urine et de fèces sur cinq jours par période. Le porteur indique que certains régimes peuvent réduire l'ingestion et la production laitière. Il affirme qu'aucune autre approche ne peut remplacer la vache pour étudier les flux d'azote, notamment au sein du rumen.

Objectifs

Dans l’objectif d’atteindre la multi-performance, les élevages laitiers doivent mieux valoriser les ressources alimentaires, notamment celles non consommables par l’homme, comme les fourrages, distribués frais ou conservés. Les conséquences de ces associations de fourrages conservés et pâturés (ou distribués en affouragement vert) sur les performances animales, la possibilité de réduire les intrants, l’efficience d’utilisation de l’azote et la composition des effluents doivent être approfondies. Cet essai aura pour but de suivre les variations de flux d’azote à l’échelle de la vache laitière lorsque celle-ci est nourrie avec des rations associant herbe fraiche et ensilage de maïs selon des proportions variables. Il sera réalisé à l'auge afin de pouvoir mesurer précisément les flux d'azote (ingéré et excrété) à l'échelle individuelle et de la journée. Cinq traitements expérimentaux seront comparés : un traitement à base d’une ration mélangée d’ensilage de maïs et de tourteau de soja en proportion 85/15, 3 traitements permettant l'ajout progressif d’herbe verte à cette même ration mélangée maïs-soja, à hauteur de 25, 50 et 75% d’herbe verte, et 1 traitement à base d’herbe verte seule.

Bénéfices attendus

L’influence des traitements sur la composition des effluents (urine seule, fèces seuls, lisiers reconstitués) sera évaluée afin d’estimer les pertes d’azote vers l’environnement, potentiel source de pollution, et le potentiel d’émission de NH3. Le suivi en cinétique des paramètres fermentaires dans le rumen (ammoniac, acides gras volatiles, pH), et de la caractérisation de l'activité fermentaire du rumen (dégradation d'un aliment témoin permettront de caractériser les conséquences de ces stratégies d'alimentation sur la dynamique des fermentations, la digestibilité de l'azote et la valeur protéique réelle des rations étudiées.

Procédures

Cet essai concerne des animaux vigiles qui seront hébergés en stabulation entravée, durant 15 semaines (3 semaines de mesures de référence, puis 4 périodes de 3 semaines). Les vaches seront nourries à volonté et traitent 2 fois par jour. Des échantillons de lait seront prélevés à la traite (10 traites par semaine). Lors des mesures de bilan ingestion-excrétion d’azote, des prélèvements sanguins seront réalisés à la veine caudale, à raison de 4 par périodes (soit 16 au total), chaque prélèvement de sang durant 5 minutes maximum (nettoyage de la peau et prélèvement de sang). Des collectes totales d’urine et de fèces seront aussi réalisés pendant 5 jours consécutifs par période, en continu. Des mesures de l’activité fermentaire du rumen seront aussi réalisées, avec les prélèvements en cinétique de jus de rumen par la canule à raison de 10 prélèvements par période, de 5 minutes maximum chacun répartis sur 1 journée (soit 40 prélèvements au total), ainsi que des mesures de dégradabilité in sacco avec incubation de coques de soja dans le rumen sur une période de 24h, 1 fois par période (soit 4 fois au total, 5 minutes de pose et de retrait des sachets dans le rumen).

Impact sur les animaux

Il est possible que certains des régimes étudiés entrainent une baisse des quantités d'aliments ingérées et donc une baisse de production laitière. Quantifier les effets de ces régimes sur l’ingestion et la production des animaux est un des objectifs de l’essai. Toutefois ces cinq traitements sont des rations pratiquées en élevage qui ne devraient pas entrainer de conséquences néfastes sur la santé des animaux.

Devenir

Suite à l’estimation de l’état général des animaux en fin d’essai, la décision pourra être prise par le responsable de l'installation de réintégrer ces vaches dans le troupeau non expérimental. Si une alerte au niveau de l’état général d’un animal le justifiait, la cellule bien-être (SBEA) et le vétérinaire seraient consultés.

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer les animaux par une autre approche pour cet essai car le but est d’étudier les flux d'azote à l'échelle de la vache, incluant des mécanismes de recyclage/mobilisation notamment au sein du rumen et par la salive.

Réduction

Le schéma expérimental en carré latin ainsi que l'analyse statistique des données permettront de répondre aux objectifs scientifiques tout en limitant le nombre de vaches à 5 dans ce projet. L’utilisation d’un carré latin permet que chaque animal soit son propre témoin, pour ainsi réduire le plus possible le nombre de vaches tout en gardant une puissance statistique suffisante pour montrer les effets des traitements expérimentaux. L'utilisation d'analyses de variance permettra de tester l'influence du facteur "proportions d’herbe verte" sur les variables de production (ingestion, production laitière...) et de flux d'azote (azote ingéré, azote excrété dans le lait, l'urine, les fèces) en corrigeant des effets "vache" et "période".

Raffinement

Les animaux seront élevés et suivis conformément aux règles d’élevage et de bonnes pratiques en place dans l’élevage. Un suivi régulier du comportement des animaux sera mis en place pour détecter le plus rapidement possible tout signe de souffrance ou de douleur. Les animaliers chargés du suivi ont tous une solide formation en élevage laitier et sont sensibilisés à la douleur animale. Le suivi régulier par le vétérinaire sanitaire assure également la bonne santé des animaux. Des points limites adaptés ont été définis afin d’éviter au maximum toute forme de souffrance des animaux. En cas de problèmes détectés, les animaux seront isolés et soignés selon les prescriptions du vétérinaire. Les régimes testés, classiques, n'induiront a priori aucune douleur ou souffrance.

Choix des espèces

Les vaches laitières utilisées seront de race Prim’Holstein. Pour diffuser les résultats, la race Prim’Holstein, qui est la race la plus répandue dans le monde en bovin lait, est la race appropriée.

200 truites sauvages vont être capturées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis relâchées après intervention. Le porteur décrit une capture par pêche électrique suivie de l'insertion chirurgicale d'une marque dans la cavité abdominale sous anesthésie, une seule fois par animal. Il indique que tous les poissons sont remis à l'eau après contrôle sanitaire et récupération complète de l'anesthésie. L'objectif affiché est de suivre les déplacements de truites porteuses de larves de moule perlière entre un bief et un cours d'eau.

Objectifs

Le tronçon de cours d’eau et son bief, objet de l’étude, abrite la plus importante population de moules perlières du bassin versant. Les différentes études conduites sur le site montrent que la population de moules perlières est vieillissante, pas ou très peu renouvelée, et pourrait disparaitre à moyen terme (une vingtaine d’années). Les observations régulières de glochidies (stade larvaire enkysté des larves de moules) sur les branchies de truite confirment cependant la reproduction des moules sur le bief mais celle-ci ne présume pas de l'accomplissement du cycle biologique de l'espèce au-delà de ce stade, notamment de la réussite du développement benthique des jeunes moules. En effet, les très rares observations de juvéniles pourraient indiquer la très faible survie de ces individus, pour des raisons qui restent encore à préciser (colmatage des substrats…). Le cours d’eau à proximité du bief pourrait présenter des habitats de meilleur qualité pour les moules que ceux du bief, du fait notamment du moindre colmatage des fonds. Les études piscicoles ont montré par ailleurs une densité de truites relativement faible dans le bief si on la compare à celle du cours d’eau principal. Sur ces constats, la question se pose de l’interaction de la population de moule du bief entre les deux milieux : que deviennent les glochidies produites par les moules du bief une fois fixées sur les truites ; parviennent-elles, au moins pour une partie, à rejoindre le cours d’eau et disséminer ainsi l’espèce depuis le bief ? Répondre à ces interrogations et caractériser le rôle éventuel du bief comme « réservoir biologique », pour la population de moule perlière, nécessite de comprendre le déplacement des truites porteuses des glochidies entre les deux milieux aquatiques.

Bénéfices attendus

Comprendre et mesurer les déplacements des truites entre le bief et le cours d'eau qui l’alimente et caractériser le rôle du bief comme « réservoir biologique » pour la population de moule perlière, c’est-à-dire comme milieu (« hot spot » de biodiversité) à partir duquel l’espèce pourrait se disséminer dans la rivière et participer ainsi à accroitre sa population.

Procédures

Capture de poissons sauvages par pêche électrique puis insertion chirurgicale, sous anesthésie générale, de marques semi actives, de type Pit-Tag, dans la cavité péritonéale (temps d'intervention 10 minutes maximum). Une seule opération de ce type est effectuée par animal.

Impact sur les animaux

Insertion de marques PIT-tags dans la cavité péritonéale des truites, suite à anesthésie générale et incision (temps d'intervention 10 minutes maximum). Une seule opération de ce type est effectuée par animal, le déplacement de ce dernier, ou son bien-être n'est pas modifié par la présence de la marque. Toutes les précautions sont prises lors de l'intervention chirurgicale pour limiter le risque d'infection. En ce qui concerne les opérations d’échantillonnage par pêche électrique, ces dernières sont mises en œuvre par du personnel formé, elles sont encadrées et réglementées par arrêté préfectoral. Toutes les dispositions sont prises pour assurer la sécurité des personnes (port des EPI, utilisation du matériel certifié) et limiter au maximum le risque de blessures ou de dommages vertébraux sur les poissons (réglage des appareils en fonction de la conductivité et de la température de l’eau). Le ratio taille (poids) de la marque / taille (poids) de l'individu sera évidemment respecté en utilisant des transpondeurs de type « Pit-tag » de tailles 12, 13 et 23 mm adaptées à la taille et au poids des poissons marqués (le poids du Pit-tag ne devant pas dépasser 2% du poids de l’individu). Dans notre cas la taille minimum des poissons marqués sera de 100 mm et la taille maximale de 250 mm. Les poids respectifs des individus iront de 30 g à 350 g.

Devenir

Le but de cette étude étant de connaitre les déplacements des truites porteuses de glochidies de moule dans le temps, tous les animaux capturés temporairement pour les besoins de marquage seront relâchés immédiatement après l’intervention.

Remplacement

La capture et le marquage in situ d’un certain nombre d’individus de truite sont rendus nécessaires pour les besoins de l'étude. S’agissant d’une expérimentation en milieu naturel sur des espèces sauvages (truite et moule perlière), il n’est pas envisageable de réaliser cette étude in vitro ou en conditions contrôlées avec des poissons d’élevage qui ne reproduiraient pas le comportement des poissons sauvages.

Réduction

La taille de l'échantillon doit être suffisante pour dégager des résultats fiables et statistiquement interprétables. Le test statistique paramétrique dit U de Mann-Whitney sera utilisé afin de vérifier l’hypothèse de sélectivité de franchissement des obstacles en fonction de la taille des individus, ainsi que des tests non paramétriques (AFC ou ACP)). Les opérations de marquages prévoient un objectif d’une centaine de truites par an pendant 2 ans, soit 200 truites sur la durée totale de l’étude. Cette taille de l’échantillon (tailles des populations de truite estimées à environ 300 individus dans le bief et plusieurs milliers dans le cours d'eau à proximité du bief) sera suffisante pour répondre nos interrogations quant au déplacement de l’espèce porteuse de glochidies de moule entre le bief et le cours d’eau.

Raffinement

Toutes les manipulations se feront sous anesthésie par du personnel qualifié sur le site d’étude. L'ensemble des poissons ne sera remis à l'eau qu’après contrôle de l’état sanitaire (absence de lésions) et récupération totale de l’anesthésie. Les points limites (comportement du poisson lors de l’anesthésie, pigmentation anormale liée au choc électrique) sont suffisamment prédictifs et précoces pour limiter la souffrance de l’animal et exclure des individus avant intervention chirurgicale le cas échéant. Suite aux recommandations du vétérinaire-référent, l’anesthésie sera réalisée par balnéation dans une solution de benzocaïne Benzoak®avec une posologie de 25mg/L. Compte tenu du caractère nouveau de l’emploi de cette molécule dans nos procédures, si nous constatons sur les 10 premiers poissons que la mise en place de ce nouveau protocole d’anesthésie est difficilement maitrisable, nous reviendrons à un protocole initial, utilisé jusqu’alors et maitrisé, via la balnéation dans une solution d’iso eugénol Aqui-S à 8mg/L sur le reste de notre procédure.

Choix des espèces

La truite commune, (Salmo trutta fario) est l'espèce cible de l'étude à travers son rôle de poisson hôte pour la moule perlière (Margaritifera margaritifera). Ce sont bien les truites qui seront capturées et marquées pour être suivies dans leurs déplacement entre les milieux aquatiques (bief et cours d’eau). Les moules ne feront pas l’objet de manipulation et seront simplement comptées à leur stade larvaire fixé sur les branchies de la truite. Nos suivis antérieurs sur le site d’étude ont montré que les stades juvéniles immatures de truite étaient en majorité parasités par les larves de moule (54% de truitelles d’un an et 38% de truites sub-adultes), ces cohortes étant numériquement dominantes dans le milieu aquatique au moment de la reproduction estivale des moules. Ce sont donc ces stades de développement des truites qui seront majoritairement marqués.

Les souris reçoivent sous la peau une greffe de cellules tumorales, puis une ou deux séances d'irradiation à faible dose sur la tumeur et quatre injections dans l'abdomen, sur neuf jours, d'une immunothérapie anti-PD-L1 ou d'anticorps témoins. 800 souris immunocompétentes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tumeurs. Le projet cherche le meilleur schéma d'irradiation à associer à l'immunothérapie, une association qui "pourrait à terme bénéficier aux patients réfractaires à l'immunothérapie" selon le porteur. Parmi les effets indésirables, il ne cite que ceux des injections et de l'irradiation, sans un mot sur la croissance des tumeurs, et annonce un "volume tumoral limite" sans en donner la valeur.

Objectifs

Il y a deux objetifs. 1) Evaluer l'efficacité anti-tumorale de la radiothérapie délivrée à faible dose en combinaison avec une immunothérapie en utilisant un modèle préclinique de lignée tumorale murine greffée chez des souris immunocompétentes. 2) Etudier les mécanismes par lesquels la radiothérapie à faible-dose est capable d'induire une réponse immunitaire anti-tumorale potentialisée par l'immunothérapie et ainsi expliquer l'effet synergique du traitement associant radiothérapie à faible dose et immunothérapie.

Bénéfices attendus

Malgré une amélioration sans précédent du pronostic de nombreux cancers grace à l'immunothérapie, de trop nombreux patients présentent une réponse insuffisante à ces nouvelles thérapies. L'optimisation et la compréhension des traitements combinés associant une radiothérapie à faible dose et une immunothérapie pourrait à terme bénéficier aux patients réfractaires à l'immunothérapie et présentant un cancer à un stade avancé inaccessible à une radiothérapie standard qui serait trop toxique pour les organes et tissus sains adjacents. Dans ce cadre, la mise au point du meilleur schéma de radiothérapie faible dose à utiliser en combinaison à l'immunothérapie, ainsi que la compréhension des mécanismes à l'origine de l'efficacité d'une telle association doivent être recherchés sur modèle animal préclinique avant une transposition au patient.

Procédures

Irradiation sur la tumeur uniquement : 1 à 2 séances d'environ 1 minute chacune. Injections sous-cutanées de cellules tumorales: 1 seule injection, 1 minute. Injections intra-péritonéales d'immunothérapie ou d'IgG contrôle : 1 injection d'une minute tous les 3 jours pendant un total de 9 jours, soit 4 injections au total.

Impact sur les animaux

Ils sont liées aux injections en intrapéritonéales ou sous-cutanées sous anesthésie locale et aux séances d'irradiations localisées. Les séances d'irradiation seront effectuées sur la tumeur uniquement grace à des caches adaptés, le risque de dommages aux tissus et organes sains adjacents est donc très limité. Aucun effet indésirables de ces irradiations localisées n'est donc à prévoir.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de pouvoir procéder à des analyses de laboratoire sur les tumeurs prélevées.

Remplacement

Le cancer est aujourd’hui la 1ère cause de décès chez l’homme et la 2ème chez la femme en France. Malgré la révolution thérapeutique que constitue l’immunothérapie, seul un nombre limité de patients présente une réponse tumorale significative aux inhibiteurs de checkpoints immunitaires utilisés seuls. Un nombre croissant de données suggère que de faibles doses de radiothérapie délivrées sur la tumeur pourraient augmenter la réponse anti-tumorale induite par l’immunothérapie, le tout avec un excellent profil de tolérance. La compréhension des mécanismes soutenant cette stratégie d’association est source d’espoirs pour de nombreux patients atteints de cancers métastatiques présentant une réponse insuffisante à l’immunothérapie et un pronostic réservé. Le recours à un modèle animal est nécessaire car les interactions entre radiothérapie, immunothérapie, tumeur et système immunitaire de l'hôte font appel à des processus cellulaires et moléculaires complexes impossibles à reproduire de façon fiable sur des modèles alternatifs. De plus, l’étude de l’efficacité de l’association entre radiothérapie à faible dose et immunothérapie sur une tumeur constituée ne peut se vérifier que sur un modèle in-vivo.

Réduction

Nous allons tester plusieurs schémas d’irradiation à faible dose délivrés en 1 ou 2 séances, associés ou non à une immunothérapie anti PD-L1. Afin de réduire au minimum le nombre d’animaux nécessaire, nous avons réalisé une analyse statistique à priori à l’aide du logiciel GPower, version 3.1. Afin de calculer le nombre d’animaux nécessaire pour mettre en évidence des différences significatives, nous avons choisi le test ANOVA avec les paramètres suivants : effect size f = 0.25 ; puissance = 0.9 ; risque d’erreur α = 0.05. En considérant un total de 32 lots, nous avons besoin de 25 souris par lot, soit 800 souris au total. 1) Efficacité de la radiothérapie faible-dose délivrée en 1 fraction associée à l’immunothérapie anti PD-L1 : 16 lots, 25 souris/lot soit 400 souris. Dans le détail : 1 lot non-irradié avec IgG contrôle (groupe contrôle), 1 lot non-irradié avec immunothérapie anti PD-L1 (groupe anti PD-L1 seul), 7 lots avec IgG contrôle + des doses croissantes d’irradiation délivrées en une séance (monofractionnée), 7 lots avec anti PD-L1 + des doses croissantes d’irradiation délivrées en une séance (monofractionnée). 2) Efficacité de la radiothérapie faible-dose délivrée en 2 fractions associée à l’immunothérapie anti PD-L1 : 16 lots, 25 souris/lot soit 400 souris au total. Dans le détail : 1 lot non-irradié avec IgG contrôle (groupe contrôle), 1 lot non-irradié avec immunothérapie anti PD-L1 (groupe anti PD-L1 seul), 7 lots avec IgG contrôle + des doses croissantes d’irradiation délivrées en 2 séances (bifractionnée), 7 lots avec anti PD-L1 + des doses croissantes d’irradiation délivrées en 2 séances (bifractionnée). Dans le but d’utiliser le moins d’animaux possible, une analyse statistique a été effectuée a priori. Celle-ci a estimé le nombre de souris nécessaire à 800.

Raffinement

Des stratégies d’expérimentation et d’observation visant à réduire au minimum la souffrance des animaux seront mises en oeuvre. Dans ce cadre, les administrations d’immunothérapies s’effectueront sous anesthésie locale pour réduire le risque de stress et de douleur. Par ailleurs, les souris seront hébergées en groupe, avec nourriture et eau ad libitum, ainsi qu’un environnement enrichi en coton et nids en carton pour respecter leur bien-être. Une surveillance du poids et du volume tumoral sera effectuée régulièrement. Le respect des points limites et d’un volume tumoral limite seront strictement observés.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale de référence pour les études de radiobiologie, utilisée dans la quasi-totalité des études dans ce domaine. La physiologie et la génétique de la souris sont de mieux en mieux connues, ce qui facilite le transfert en clinique des résultats acquis lors des expérimentations précliniques dans cette espèce. Les animaux seront utilisés entre l’âge de 8 et 10 semaines bien après sevrage, âge à partir duquel les souris peuvent supporter les rayonnements ionisants.

Pour étudier comment une séparation précoce d'avec la mère, présentée comme un reflet de la prématurité humaine, modifie la perception de la douleur, 160 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélever leurs tissus nerveux. La moitié des ratons est retirée de la cage maternelle trois heures par jour, du deuxième au douzième jour de vie, sous une lampe chauffante. Le porteur parle d'"épisodes de stress non douloureux", tout en décrivant chez les rats séparés une anxiété chronique et, d'après des travaux antérieurs, des "hypersensibilités douloureuses". Chaque mère est tuée après le sevrage, sans retour à l'élevage, parce que selon le porteur la séparation "altère le fonctionnement de son système nerveux" et accroît son anxiété.

Objectifs

Pendant très longtemps, la douleur du nouveau-né a été ignorée et négligée lors de sa prise en charge. Ce n’est qu’au début des années 90 que ce problème a commencé à être pris en compte en clinique humaine et de nombreux progrès restent à faire. Les nouveaux nés ressentent non seulement la douleur mais sont extrêmement sensibles aux stimulations aversives. Ceci est d’autant plus vrai pour les enfants nés prématurés (nés avant la 35ème semaine de grossesse) dont la prévalence mondiale était de 9.6 % en 2005. La prématurité conduit ces enfants à développer parfois des troubles moteurs et comportementaux et une hypersensibilité douloureuse pouvant perdurer à l’âge adulte. La séparation maternelle néonatale (SMN, 3h/jour du 2ème au 12ème jour post-natal) est un stress postnatal qui a été décrit comme un modèle reflétant la prématurité humaine. De nombreux travaux ont montré que les animaux exposés à ce stress postnatal présentaient des hypersensibilités douloureuses des troubles des comportements sociaux, une modification de la perception douloureuse au niveau de la moelle épinière ainsi que des déficits cognitifs. Dans ce contexte, nous cherchons à affiner notre compréhension de l’impact de la séparation maternelle néonatale sur le codage de l’information nociceptive par les structures nerveuses spinales et supraspinales. L’objectif est de caractériser les modifications fonctionnelles au niveau neuronal qui rend compte des symptômes observés.

Bénéfices attendus

L’ensemble de ces travaux nous permettra de mieux comprendre les phénomènes de sensibilisation nociceptive ainsi que des déficits cognitifs qui semblent se mettre en place durablement suite à des épisodes de stress non douloureux durant la période néonatale en utilisant le modèle de séparation maternelle néonatale. Nous répondrons à la question d'une origine d'un dysfonctionnement de communication nerveuse expliquant les symptômes qui façonne l’expérience douloureuse et augmente le risque de développer une neuropathologie chronique selon les études épidémiologiques sur le sujet.

Procédures

La moitié des animaux sera soumis au protocole de séparation maternelle néonatale : séparation des ratons de la cage de leur mère 3h/j du 2ème au 12ème jour post-natal.

Impact sur les animaux

La séparation maternelle neonatale chez le rat est un modèle classique de stress psycho-social et a donc des conséquences sur le comportement des animaux (expression de symptomes d'anxiété chronique et troubles de l'adaptation au stress). Les ratons sont placés sous une lampe rouge chauffante avant d’éviter tout risque d’hypothermie. Le protocole de SMN est également connu pour augmenter les comportements maternels après retours de ratons dans la cage de la mère. Après sevrage, la mère ne réintègrera pas le processus de reproduction mais sera euthanasiée puisque la séparation maternelle altère le fonctionnement de son système nerveux, ce qui induit au niveau comportemental une anxiété accrue.

Devenir

Les enregistrements electrphysiologiques nécassitant le prélèvement de tissus nerveux, tous les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Ce projet portant sur l’étude d’un système intégré et mature, il nous a été impossible de remplacer l’utilisation d’animaux par des tests in-vitro.

Réduction

Nous prévoyons un nombre d’animaux suffisant pour d’obtenir des résultats exploitables en termes statistiques. Le nombre d’animaux prend en compte les deux sites d’enregistrement nécessaires (moelle épinière et hippocampe) ainsi que les variabilités interindividuelles nécessitant un certain nombre d’animaux pour obtenir des résultats statistiquement significatifs lors des tests paramétriques.

Raffinement

Notre étude s'interesse à l'impact de l'environement sur les nouveaux-nés. Pour pouvoir comparer nos groupes d'animaux, il nous faut un environnement enrichi tout en étant le plus homogène possible. Ceci nous permets d'étudier uniquement l'impact de la séparation maternelle. Les animaux sont ainsi hébergés en cage collectives afin de préserver les interactions sociales avec leurs congénères et ont constamment à leur disposition de la frisure pour nid, un bâton à ronger et un tunnel. Ils sont placés en conditions de températures et hygrométrie contrôlées, en cycle jour/nuit de 12h/12h avec eau et nourriture ad libitum. Durant la séparation maternelle néonatale, les ratons sont placés sous une lampe rouge chauffante afin d'éviter toute hypothermie.

Choix des espèces

Nos précédentes études étant réalisées sur le rat, nous conserverons ce modèle qui est bien caractérisé sur le plan comportemental. Le modèle de séparation a déjà été bien décrit et caractérisé chez cette espèce, permettant ainsi de confirmer la robustesse des résultats obtenus. De plus le modèle chez le rat nous permet de modéliser l’état de développement d’un fœtus lors du 3e trimestre de gestation, puisqu’à la naissance le système nerveux du rat est au même niveau de maturation que celui du fœtus au début du 3e trimestre de gestation. Les évènements de maturation ayant lieu lors du 3e trimestre de gestation chez l’homme, correspondent à ceux qui ont lieu lors des 2 à 3 premières semaines de vie post natales chez le rat. Nous utiliserons des rats agés de 30 et 50 jours postnataux, une période qui correspond à la phase de maturité du système nociceptif. Les précédentes études portant sur l’hypersensibilités nociceptives des animaux séparés maternels chez le rat jeune et adulte, le projet continuera sur cette ligne en faisant des enregistrements électrophysiologiques in vitro chez des animaux à un stade de développement équivalent

Sous anesthésie, les souris reçoivent une sonde thermique dans le ventre, puis une partie est vaccinée et portée pendant deux jours à 2 ou 3 °C au-dessus de sa température par un champ magnétique, avec une prise de sang chaque semaine sans anesthésie. D'autres se voient implanter sous la peau du flanc un objet métallique d'un centimètre de côté, que le champ chauffe trois heures dix jours plus tard. 880 souris adultes vont être utilisées dans ces procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Il s'agit de mesurer l'effet d'une fièvre ou d'une inflammation locale sur la production d'anticorps, une piste qui "pourrait" selon le porteur servir un jour à renforcer la vaccination. Il justifie le choix de l'espèce par un système immunitaire "proche de l'homme" et par une espèce qui "régule la température comme l'homme".

Objectifs

La température corporelle des mammifères dont l'homme est régulée, mais peut augmenter, notamment dans tout le corps lors de la fièvre, et localement dans les zones inflammées. L’élévation de la température peut être induite par différents mécanismes, notamment la production de chaleur dans de la graisse. La température est capable d’influencer la réponse du système immunitaire. L’effet de la température sur la réponse humorale, qui est caractérisée par la production d'anticorps par des cellules spécialisées, les lymphocytes B (LB), reste mal connu. La capacité des LB à produire des anticorps en réponse à la vaccination ou à des microbes est un processus complexe, nécessitant la coopération avec d'autres cellules, et la formation de structures spécialisées dans les organes du système immunitaire (ganglions lymphatiques ou rate), difficile à modéliser in vitro. Notre but est donc d’étudier in vivo chez des souris l’effet d’une augmentation locale (comme dans l’inflammation locale) ou du corps entier (comme dans la fièvre) de la température sur la réponse humorale. Dans un premier temps, nous analyserons l'effet de l'élévation globale de la température corporelle sur la réponse humorale en réponse à une vaccination. Nous étudierons également si la production de chaleur dans la graisse spécialisée participe à l’élévation de la température lors de la fièvre, et si elle modifie la réponse humorale. Enfin, nous mettrons au point un modèle permettant de tester l’effet d’une augmentation locale de la température autour d’un ganglion lymphatique, mimant l’effet d’une inflammation locale, sur la réponse humorale.

Bénéfices attendus

Comprendre l’effet de la température sur la réponse humorale pourrait avoir un impact dans le domaine de la vaccination : l’élévation de température pourrait, par exemple, être utilisée pour augmenter la réponse immunitaire (cette stratégie est déjà à l’étude dans le domaine des cancers). De plus, l’identification de la production de chaleur par la graisse comme mécanisme de contrôle de la température et de la réponse humorale pourrait permettre d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques pour augmenter (vaccination) ou diminuer (maladies causées par une réponse immunitaire trop importante ) la réponse humorale.

Procédures

Les souris seront injectéés avec des sondes thermiques dans le ventre, sous anesthésie générale de 10 minutes maximum. Certaines souris seront vaccinées par voie sous-cutanée (durée de l'injection : 1 minute), et une élévation de température de 2 à 3°C sera induite pendant 2 jours à l'aide d'un champ magnétique. Du sang sera prélevé une fois par semaine (animaux vigiles, durée du prélèvement 1 minute), et au moment de l'euthanasie sous anesthésie (durée du prélèvement : 2 minutes). D'autres souris seront implantées avec des objets métalliques de 1cm x 1cm sous la peau du flanc par chirurgie sous anesthésie générale (durée de la chirurgie : 10 minutes), dans une position n'affectant pas la mobilité des animaux. 10 jours plus tard, une élévation locale de température de 2 à 3°C sera induite pendant 3 heures à l'aide d'un champ magnétique, puis les souris seront mises à mort.

Impact sur les animaux

L'élévation de la température et la vaccination, peuvent dans certains cas induire une douleur et une perte de poids (déshydratation) modérée et transitoire (2 jours), correspondant à la fièvre. L'implantation d'objets métalliques peut également mener à un inconfort et une douleur modérée et transitoire, correspondant à une petite chirurgie cutanée (3 jours). Les expériences se terminent par l'euthanasie des souris.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés afin de pouvoir prélever différents organes nécessaires à l'analyse de la réponse immunitaire.

Remplacement

Nous avons effectué des expériences in vitro afin d’étudier l’effet d’une élévation de la température sur les lymphocytes B. Il est cependant impossible in vitro de reproduire l’environnement complexe impliquant la coopération entre de nombreux types cellulaires qui permet aux lymphocytes B de produire des anticorps in vivo. Il est également impossible d'étudier in vitro la contribution à la fièvre et l’inflammation de la production de chaleur dans la graisse. Il est donc nécessaire d’étudier cette réponse in vivo, dans un modèle animal dont le système immunitaire et le contrôle de la température est proche de l’homme, comme la souris. Pour les implants d’objets métalliques, nous avons au préalable testé la capacité du champ magnétique à élever la température d’objets en différents métaux sans les implanter à des souris, et avons sélectionné les 3 plus ‘chauffant’ pour les tests in vivo.

Réduction

Le nombre de sours (880) a été défini afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant l’obtention de résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

L'implantation des objets métalliques par chirurgie se fait sous anesthésie générale, avec analgésie. De plus, nous avons mis au point une grille permettant de quantifier la douleur des souris. Les critères sont la perte de poids, l’apparence, le comportement, l'activité de souris et des signes cliniques tels que les yeux anormaux, un écoulement nasal, ou un fèces anormal. Les animaux seront observés le lendemain puis deux fois par semaine suite à l'injection des sondes thermiques, tous les jours pendant 3 jours suite à l'implantation d'objets métalliques, et 7 jours suite à la vaccination, puis 2 fois par semaine. Des points limites ont été établis, et selon le score de douleur et sa persistance, la douleur sera traitée soit par analgésie, soit les animaux seront euthanasiés. La perte de poids pouvant être signe de déshydratation sera traitée par injection de solution de réhydratation. Afin de diminuer le stress potentiel des souris, elles sont habituées avant les expériences à être manipulées et à des changements d'environnement. Enfin, les animaux sont maintenus sans isolement, avec enrichissement (bâtons à ronger, éléments permettant la nidification, accès illimité à la nourriture et l’eau de boisson), et sont observés tous les jours.

Choix des espèces

La souris dispose d'un système immunitaire proche de l'homme, bien caractérisé. De plus, c'est un animal qui régule la température comme l'homme. Les animaux seront utilisés entre 8 et 20 semaines (âge adulte),

1 200 souris saines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des composés par injection ou gavage, jusqu'à dix-huit administrations sur six semaines, afin de déterminer la dose maximale tolérée avant de futures études d'efficacité. Le porteur précise que les dommages attendus tiennent à une toxicité que les tests in vitro n'auraient pas détectée et que les animaux atteignant un point limite seront tués. Il affirme qu'il n'est pas possible d'étudier la tolérance d'un composé sans animaux, les approches in vitro et in silico ne tenant pas compte de l'"organisme entier".

Objectifs

Notre laboratoire travaille avec des laboratoires qui développent des composés à visée thérapeutique. Ces laboratoires nous sollicitent ensuite afin de réaliser par imagerie In Vivo des études d’efficacité sur des modèles animaux de pathologie ; classiquement il s’agit de modèles de cancer. Avant de pouvoir réaliser ces études d’efficacité, il est nécessaire d'évaluer la dose maximale tolérée qui pourra être utilisée. Les expériences menées dans ce projet sont donc des études préliminaires de tolérance menées chez l'animal sain. L’objectif est également de cibler au mieux les doses à utiliser afin de limiter le nombre de lots expérimentaux dans les projets futurs d'efficacité menés sur l'animal porteur d'une pathologie. Avant de recevoir les composés et d’envisager l’administration à des souris, le client aura réalisé une analyse de la littérature afin de vérifier si des études ont déjà été faites sur des composés de même classe et qu’ils ne possèdent pas de toxicité avérée. Le client aura également réalisé des tests in vitro pour déterminer la dose efficace 50% du composé. A partir de cette dose, la dose efficace équivalente chez la souris est déterminée par des calculs prenant en compte différents facteurs tel que le volume sanguin. C’est à partir de cette dose théorique que les doses à tester sont déterminées. Notre laboratoire n’a pas la capacité de tester des marqueurs biochimiques ou des marqueurs de tolérabilité et/ou l’obtenir des données de pharmacocinétiques. Ces analyses nécessiteraient en outre l’utilisation d’un grand nombre de souris supplémentaires. De plus, ce projet ne s’inscrit pas dans le cadre des études réglementaires de toxicité. Le déroulement des études prévues permettra de limiter au maximum du nombre de souris. Si la dose administrée est tolérée, une dose supérieure pourra être administrée au lot de souris suivant et ainsi de suite jusqu'à l'observation d'effets indésirables. (perte de poids, diarrhée, urine foncée, altération du comportement…). Dans ce cas, la dose supérieure ne sera pas administrée et si l'un des points limites est atteint, l'animal sera mis à mort. La dose sélectionnée sera la dose précédant celle qui a induit des effets indésirables.

Bénéfices attendus

Les expériences menées dans cette saisine ne s'inscrivent pas dans les études réglementaires de toxicité mais en tant qu'études préliminaires menées chez l'animal sain, avant des essais menés sur l'animal porteur d'une pathologie. Ce projet permet de cibler les doses qui seront utilisées pour de futures études d'efficacités évalué par imagerie. Lors de ces études, le nombre de lots utilisés sera donc réduit.

Procédures

- Pour le projet" Détermination de la dose maximale tolérée pour une injection unique": Pour chaque souris, administration du composé par voie IP (100µL/10g souris) ou par voie iv (sous 100-150µL) ou par gavage (200µL) en fonction du poids de l'animal. Les administrations seront réalisées sur animal vigile par du personnel qualifié. Nous pourrons être amenés à prélever du sang sur animal vigile au niveau sous mandibulaire: Sur chaque souris, au maximum 3 prélèvements de 100µl avec au minimum 1 semaine d'intervalle entre chaque prélèvement. - Pour le projet" Détermination de la dose maximale tolérée pour des injections répétées": Pour chaque souris,administration du composé par voie IP (100µL/10g souris) ou par voie iv (sous 100-150µL) ou par gavage (200µL) en fonction du poids de l'animal. Les administrations seront réalisées sur animal vigile par du personnel qualifié. La dose sera administrée à plusieurs occasions, avec un maximum de 18 administrations sur 6 semaines maximum et au maximum 1 administration 1 fois/jour. Nous pourrons être amenés à prélever du sang sur animal vigile au niveau sous mandibulaire. Sur chaque souris,au maximum 7 prélèvements de 100µL avec au minimum 1 semaine d'intervalle entre chaque prélèvement.

Impact sur les animaux

Les dommages attendus sont liés à une toxicité in vivo qui n'aurait pas pu être détectée in vitro. Une observation méticuleuse de l'état général des animaux tout au long des expériences ainsi que la définition de points limites pertinents permettra d'anticiper toute douleur ou souffrance chez les animaux.

Devenir

Toutes les souris seront mise à mort à l'issue de chaque procédure car elles ne peuvent pas être réutilisées pour la procédure suivante ou une autre étude.

Remplacement

Dans le cadre du développement de futurs médicaments, il est nécessaire d'évaluer leur toxicité potentielle en fonction de la dose administrée. Pour ce type de développements, les études sont classiquement réalisées in vitro, in silico ou avec des modèles animaux. Les études in vitro et in silico ne tiennent pas compte de la complexité d'un organisme entier (variété des tissus, communications inter organes etc...) et il n'est pas possible à l'heure actuelle d'étudier la tolérance d'un composé sans utiliser d'animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux sera réduit au minimum permettant d'obtenir des résultats pertinents soit 2 souris par doses. Il n’y a pas de test statistiques prévu. Les doses testées seront administrées de la dose la plus faible à la dose la plus forte, en décalé dans le temps sur des souris différentes (24h minimum ou plus entre 2 doses, en fonction de la cinétique d'élimination du composé, estimée par le client) ainsi si des effets indésirables sont observés sur 1 des 2 souris d’une dose, la dose inférieure sera retenue comme étant la dose maximale tolérée et les autres souris ne seront pas injectées avec les doses supérieures.

Raffinement

Les souris sont hébergées dans des cages en portoir ventilé avec un accès à l’eau et la nourriture ad libitum, un cycle jour/nuit 12h/12h pendant toute la durée de l’expérimentation et des objets d'enrichissement du milieu (celluron). Les animaux sont observés scrupuleusement quotidiennement afin de respecter leur bien-être et de déceler tout signes d’apparition d’effets indésirables (perte de poids, diarrhée, urine foncée, altération du comportement, douleurs…). Nous avons mis en place une grille de scoring et des points limites.

Choix des espèces

Ces études sont menées chez la souris saine car elles se situent en amont d'essais qui seront ensuite réalisés sur des animaux modèles de pathologie expérimentale.(modèles animaux de cancer par implantation orthotopique ou sous-cutanée de cellules tumorales par exemple) La taille de l'animal est compatible avec l'administration de composés parfois difficiles à produire par les chimistes en grande quantité et la petite taille de la souris (nécessitant donc peu de composés) en fait un animal souvent utilisé pour les premières études réalisées in vivo. C'est chez la souris qu'il existe le plus grand nombre de modèles de pathologies. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte, entre 6 et 12 semaines en fonction de la demande du chercheur. En effet, par la suite, les études d’efficacité se feront sur des modèles pathologiques de souris. Les modèles cancéreux sont induits sur des souris de 6 semaines minimum. Les traitements peuvent commencer immédiatement et jusqu’à 6 semaines après l’induction d'où le choix de l'utilisation d'animaux agés de 6 à 12 semaines.

930 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une ou deux chirurgies avec pose de fibres optiques et de cathéter gastrique, puis des tests de comportement, de métabolisme du glucose et de calorimétrie, pour étudier le rôle d'une structure du cerveau dans la régulation de l'appétit. Le porteur indique que le port des fibres et du cathéter induit un stress initial et une mobilité réduite, et qu'une fuite gastrique entraîne la mise à mort immédiate. Il affirme que l'étude, fondée sur la physiologie intégrée, ne peut être menée in vitro ni sur des invertébrés.

Objectifs

La régulation de l’homéostasie énergétique est un processus physiologique capitale et extrêmement conservé. Le contrôle de cette régulation repose sur la capacité du cerveau à intégrer de multiples signaux indiquant les états nutritionnels/énergétiques de l'organisme, et à mettre en place des réponses appropriées. Les dysfonctionnements de ce contrôle peuvent conduire à une pléthore de troubles alimentaires (surpoids, obésité). Même si l'hypothalamus a été désigné comme le régulateur principal de l'équilibre énergétique, d'autres circuits ont été récemment identifiés. Parmi les structures extra-hypothalamiques, le noyau paraventriculaire du thalamus (PVT) apparaît comme un centre critique car il joue un rôle essentiel dans le relais bidirectionnel des informations du tronc cérébral vers des structures telles que l'amygdale, le striatum ventral, le cortex préfrontal et l'hypothalamus. Le PVT est principalement composé de neurones glutamatergiques. Un nombre croissant d’évidences indique un rôle clé des neurones PVT dans le contrôle des comportements liés à la nourriture. Cependant, ces études se sont principalement concentrées sur l'alimentation sans tenir compte des composantes énergétiques et métaboliques de ce comportement complexe ni de l'hétérogénéité des types cellulaires des neurones PVT. Il est intéressant de noter qu'une sous-population neuronale du PVT exprime les récepteurs D2 de la dopamine, fournissant un outil pour discriminer les sous-types cellulaires du PVT. On ignore encore si et comment les neurones exprimant les D2R peuvent moduler les adaptations homéostatiques, l'équilibre énergétique et les comportements liés à la prise alimentaire. Les objectifs de ce projet sont : 1. Disséquer la contribution des neurones PVTD2R dans la régulation de la prise alimentaire et le métabolisme énergétique. 2. Étudier les propriétés électrophysiologiques des neurones PVTD2R 3. Étudier le rôle des projections des neurones PVTD2R 4. Comprendre la dynamique de l’activité des neurones PVTD2R

Bénéfices attendus

Les dernières estimations de l'Organisation mondiale de la santé (OMS) révèlent qu'en Europe, plus de la moitié des hommes et des femmes sont en surpoids, et environ un tiers sont obèses. Cela représente également un fardeau social, économique et sanitaire. Bien que certains traits génétiques (causes monogéniques) aient été identifiés et largement étudiés, il est largement reconnu que le syndrome métabolique est par essence un trouble multifactoriel et multidimensionnel qui englobe des réseaux complexes des maladaptations physiopathologiques. Malgré les progrès et les efforts, nous sommes toujours confrontés à un besoin de stratégies innovantes et plus efficaces contre les troubles métaboliques. La prise alimentaire et la régulation de l’homéostasie énergétique ont souvent été étudiées sous l’angle d’une implication et dysfonctionnement de l’hypothalamus. Cependant, d’autres structures extra-hypothalamiques jouent aussi un rôle clé dans ces processus. Nos résultats préliminaires indiquent que le noyau paraventriculaire du thalamus PVT aurait un rôle central dans la régulation de la prise alimentaire et du métabolisme énergétique. Le projet ThalHOME vise à établir un nouveau cadre conceptuel qui voit dans les neurones D2R du PVT une population centrale pour la régulation des processus physiologiques et physiopathologiques sous-jacents au développement du syndrome métabolique. Nous sommes convaincus que la mise en lumière des aspects intégratifs de la physiopathologie du PVT dans la surconsommation alimentaire sera essentielle pour élaborer et accélérer les stratégies préventives et thérapeutiques. En outre, à long terme, les stratégies virales utilisées par ThalHOME pourraient être plus facilement adaptées et transposées aux troubles humains que les procédures chirurgicales invasives actuellement utilisées en thérapie (sleeve gastrectomie, bypass gastrique).

Procédures

Les animaux seront soumis : -pour 7 lots à une chirurgie (1j), puis après une période de repos, à des tests de comportements, de métabolisme du glucose et/ou de mesure de calorimétrie indirecte. Des prélèvements sanguin sur animaux vigiles seront fait sur deux de ces lots. -pour 2 lots à deux chirurgies qui se feront en une ou deux fois en fonction du bien être de la souris et de sa capacité à supporter une anesthésie longue. Si cela doit se faire en deux fois les souris auront une phase de repos de 10-15j minimum avant la deuxième anesthésie. Après une période de repos de deux semaines minimum, les lots seront soumis à des tests de comportements, de métabolisme du glucose et/ou de mesure de calorimétrie indirecte. Des prélèvements sanguin sur animaux vigiles seront fait sur un de ces deux lots.

Impact sur les animaux

Le fait de porter des fibres optiques sur la tête de l'animal pendant les enregistrements peut initialement induire un stress; de même pour le cathéter gastrique. Cela peut entraîner une immobilité ou une mobilité réduite, ce qui constitue un comportement initialement indésirable cependant les fibres/cathéters étant légèrs, les animaux s'habituent très rapidement. De plus avant d'imager l'activité neuronale, l'animal sera soumis à plusieurs séances d'habituation d'une durée de 30 min pendant 2 à 3 jours, ce qui lui permettra de s'habituer aux procédures d'enregistrements et de perfusions. Le cathéter peut également se déloger de l'estomac, se qui provoque une fuite gastrique en intrapéritonéale. L'animal sera mis à mort immédiatement.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour effectuer des prélèvements de tissus.

Remplacement

Dans le cadre de notre projet , nous devons utiliser des souris in vivo. Tout d'abord, nous ne pouvons pas réaliser ces expériences in vitro ou sur cultures de cellules puisque pour notre étude nous avons besoin d'observer les paramètres comportementaux et de physiologie intégrée. De plus, les invértébrés ne possèdent pas les structures cérébrales et endocrines équivalentes aux mammifères pour le contrôle de l'homéostasie énergétique et la régulation de la récompense alimentaire.

Réduction

Les groupes expérimentaux ont été créés en considérant la variabilité biologique entre individus et la complexité des procédures envisagées. Le nombre d'animaux utilisé est fortement lié à la puissance statistique afin de s'assurer avec certitude de la validité des résultats obtenus. Afin d'optimiser nos cohortes et réduire le nombre d'animaux transgéniques générés par croisements nous utiliserons l'ensemble des portées (mâles et femelles). Selon les dessins expérimentaux et les nombres de variables (groupes; temps; régimes; comportements) nos effectifs seront déterminés et nos résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Par rapport aux nombres d'échantillons nous utiliserons principalement des tests paramétriques et si nécessaire des tests nonparamétriques.

Raffinement

Le soin apporté aux animaux par le personnel zootechnique et les expérimentateurs a pour but d'améliorer le bien-être des souris en général, et, de réduire, supprimer ou soulager les douleurs dans les procédures invasives en particulier. Pour chaque source potentielle de stress, des mesures bioéthiques sont prises afin de minimiser toute gêne pour l’animal. Les sources de souffrance et l’angoisse des animaux pourraient provenir des conditions d’hébergement et du régime alimentaire. L’accueil est effectué dans une structure d’animalerie agréée en matériel et en personnel. Le milieu de vie en cages d’hébergement est enrichi par des objets adéquats, comme un nid en coton, batons de bois ou tunnels en carton. Une visite quotidienne de l’animalerie est organisée pour vérifier l’absence d’anomalie pour les cages, les biberons, les rations alimentaires et le comportement des animaux. Nos protocoles ont été mis au point de façon à veiller au bien-être animal en améliorant leur environnement et en surveillant leur état de santé: notamment nous chercherons à éviter et limiter la douleur et la souffrance, à assurer des soins pré-, per- et postopératoires adéquats, à recourir à l'anesthésie et à l'analgésie, à appliquer les points limites établis préalablement et, enfin, à utiliser les procédures réglementaires et appropriées de mise à mort.

Choix des espèces

Notre étude repose entièrement sur la physiopathologie intégrée et nécessite du modèle rongeur, notamment la souris car celle-ci permet l’utilisation de stratégies transgéniques et virale qui sont peu développées ou absentes dans d’autres modèles. Toutes les souris seront utilisées à l’age adulte (au moins 2 mois) afin que les réseaux neuronaux soient stables.