Procédures modérées

1200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité modérée. Chaque animal reçoit des injections induisant une encéphalomyélite, modèle de sclérose en plaques, dont le porteur décrit les signes attendus, une faiblesse pouvant aller jusqu'à la paralysie des membres. Les souris sont suivies par un score clinique pendant 28 jours puis tuées pour prélever cerveau, moelle épinière et organes. Le porteur affirme que ce modèle est la seule alternative adaptée à l'étude des mécanismes immunitaires de la maladie.

Objectifs

Notre projet a pour objectif général de caractériser la composante immunitaire de l’inflammation chronique. Celle-ci est liée à des pathologies aussi diverses que les cancers, les maladies cardio-vasculaires et les maladies autoimmunes, notamment la sclérose en plaques (SEP), maladie autoimmune du système nerveux central (SNC), touchant plus de 100.000 personnes en France et 3 millions dans le monde. Il a en effet été montré que chez des patients atteints de SEP, les lymphocytes T régulateurs (Treg) perdent leur fonction suppressive. De plus, dans un environnement inflammatoire, l’identité même des Tregs est modifiée, menant à des modifications épigénétiques et phénotypiques, et aboutissant à une perte de leur capacité régulatrice. La compréhension de ces phénomènes pourrait pourtant permettre de mieux comprendre le déficit fonctionnel des Treg au cours de la SEP, et de définir des cibles thérapeutiques et donc de nouveaux traitements de cette pathologie. Les modèles animaux de SEP permettent, contrairement à ce qui est possible chez les patients, d’étudier l’inflammation locale. L’objectif de ce projet est d’étudier les modifications d’identité des Tregs au cours de l’inflammation chronique dans un modèle de SEP, l’encéphalomyélite autoimmune expérimentale (EAE) chez la souris.

Bénéfices attendus

La SEP est une maladie extrêmement invalidante, réduisant l’espérance de vie, induisant un coût social important et touchant plus de 3 millions de patients dans le monde. Les traitements actuels permettent dans certains cas de ralentir la progression de cette pathologie, mais l’arsenal thérapeutique n’est encore pas assez développé, et bon nombre de patents ne répondent pas, ou plus, aux traitements. Cette pathologie a pour origine un dysfonctionnement du système immunitaire dont les mécanismes ne sont pas encore bien identifiés. Les recherches portant sur la compréhension de ces mécanismes immunologiques sont indispensables à l’élaboration de nouveaux traitements de la SEP. Le système immunitaire formant un système complexe dont la globalité n’est pas pleinement reproductible in vitro, les modèles animaux de cette maladie permettent de mieux comprendre les étapes cellulaires et moléculaires à l’origine de l’initiation, du développement et de l’entretien des atteints du SNC caractérisant la SEP et menant au handicap qui en résulte. Les bénéfices attendus de notre projet sont, à court terme, de comprendre les mécanismes immunitaires de l’inflammation chronique du SNC dans le modèle d‘EAE pour, à plus long terme, définir des cibles thérapeutiques qui constitueront la base de nouveau traitements de la SEP chez les patients.

Procédures

2 injections sous cutanées et 2 injections intra-péritonéales en 2 jours, sur animaux vigiles, d'une durée de moins d'une minute par injection. Un prélèvement de sang rétro-orbitaire sous anesthésie générale (1 à 2 minutes pour le prélèvement, environ 1h d'anesthésie) une semaine avant le début des injections et un prélèvement de sang intra-cardiaque (1 à 2 minutes de prélèvement) sous anesthésie générale terminale également en fin d'expérimentation. Les traitements seront réalisés quotidiennement par voie orale (moins de 2 minutes) ou intra-péritonéale (moins de 1 minute) dans un volume maximum de 0.2 ml et dilués dans de l’eau ou du PBS, au maximum pendant toute la durée de l’expérience, soit 28 jours. Le scoring (environ 2 minutes par souris) sera effectué par examen clinique des animaux : simple observation de la queue (flaccidité ou non), des pattes postérieures et antérieures (mobiles ou non). L’état général des animaux sera évalué à chaque scoring. Le scoring sera réalisé trois fois par semaine pendant 28 jours.

Impact sur les animaux

Les effets attendus sont les signes cliniques de l’EAE : perte de mobilité (faiblesse à paralysie des membres postérieurs et antérieurs) réversibles après 2 semaines en absence de traitement.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure. Ceci permettra d'effectuer de nombreux prélèvements d'organes (cerveau, rate, moelle épinière, ganglions, moelle osseuse et sang) et de réaliser de nombreuses analyses in vitro complémentaires aux résultats cliniques obtenus.

Remplacement

Notre projet porte sur la compréhension de la physiopathologie d’une maladie autoimmune inflammatoire, la SEP. Aucun système in vitro ou in silico ne peut à l’heure actuelle reproduire la complexité des mécanismes cellulaires et moléculaires initiant et entretenant cette pathologie. Les modèles animaux de SEP, dont le principal est l’EAE, miment le développement de l’autoimmunité et le declenchement de l’inflammation chronique du SNC. Ils sont ainsi la seule alternative adaptée à l’étude des mécanismes immunitaires de la SEP.

Réduction

Cette étude utilisera un total de 1200 animaux. Le nombre de souris nécessaires dans chaque procédure est défini sur la base d'un calcul de puissance et des études réalisées historiquement dans le laboratoire. Le nombre de souris défini pour chaque groupe devrait être suffisant pour obtenir des données statistiquement exploitables. Nous avons tenu également compte d'une possible perte d'animaux liée à la procédure expérimentale. Des analyses statistiques seront réalisées pour obtenir une interprétation fiable des résultats. Sur les animaux seront prélevés sur chaque animal le sang, le cerveau, la moelle épinière la rate, les ganglions et la moelle osseuse afin d’obtenir un maximum d’information sur l’homéostasie immunologique dans les différents tissus et limiter ainsi la répétition d'expériences.

Raffinement

Les souris sont maintenues en groupe de plusieurs individus afin de respecter leurs besoins sociaux. Elles sont hébergées dans des cages enrichies avec du coton et des igloos pour améliorer leur bien-être. Une période d’adaptation est respectée avant le début de la procédure pour réduire le stress des animaux lié à leur transport. Toutes les conditions sont réunies pour prendre en compte la douleur des animaux, notamment avec la mise en place d'une anesthésie. Des points limites ont été définis pour limiter la souffrance des animaux sans remettre en cause les objectifs du projet et les données obtenues. Les animaux sont suivis quotidiennement par les animaliers et les expérimentateurs, Le score clinique précis des souris et évalué 3 fois par semaine par les expérimentateurs. L’euthanasie se fera sous anesthésie générale.

Choix des espèces

Le modèle de l’EAE existe chez la souris, le rat et le primate non humain. Il reproduit les signes cliniques, histologiques et immunologiques de la maladie humaine, la SEP. Le choix de la souris est de plus justifié par l’existence d’outils biotechnologiques (anticorps, dosage de molécules..) adapté à cette espèce. L’induction de l’EAE se fera sur des animaux de 5-10 semaines. Les scores cliniques de l’EAE seront évalués pendant 2 à 8 semaines après l'induction. L'âge des souris au moment de leur utilisation est déterminé par la maturation du système immunitaire

18 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en gravité modérée. Chaque animal reçoit le virus de la grippe ou des extraits de levure, subit des lavages des poumons et des prélèvements de moelle osseuse sous anesthésie, avant d'être tué pour récolter les poumons. Le porteur indique que l'infection grippale provoque de la fièvre, une baisse d'appétit et des troubles respiratoires pendant plusieurs jours. Il présente le porc comme un bon modèle de la grippe humaine et affirme que les analyses in vitro ne suffisent pas à répondre à l'objectif.

Objectifs

L’immunité entrainée est liée à une mémoire à long terme de certaines cellules immunitaires. Elle se caractérise par une réponse accrue lors d’une ré-infection avec le même micro-organisme ou avec un micro-organisme différent. Cette seconde réponse plus forte représente une mémoire immunitaire vis à vis d’un large éventail de pathogènes, ce qui est différent de la mémoire obtenue par la vaccination qui elle, est spécifique de l’agent pathogène utilisé. Le concept d’immunité entrainée a été décrit dans de nombreuses études chez la souris. Ainsi, il a été montré que différents stimuli (par exemple des extraits de paroi de levure (β-glucanes), ou le vaccin atténué de la tuberculose (BCG)) pouvaient protéger contre des infections mortelles par des bactéries, des champignons ou des parasites de manière non spécifique. A l’occasion d’un précédent projet mené chez le porc, des cellules immunitaires pulmonaires (appelées macrophages alvéolaires) ont été récoltées chez 3 porcs ayant été infectés 3 semaines plus tôt par le virus de la grippe et chez 3 autres porcs n’ayant pas été infectés (porcs naïfs). Ces macrophages alvéolaires ont été restimulés in vitro avec une molécule permettant de simuler une infection virale. Les macrophages alvéolaires de porcs précédemment infectés par la grippe ont présenté des réponses immunitaires plus fortes que ceux issus de porcs naïfs. Ces résultats suggèrent fortement un entrainement des macrophages alvéolaires porcins par l’infection grippale. Cet entrainement pourrait avoir un effet protecteur sur des sur-infections par d’autres virus infectant le système respiratoire. Les objectifs de ce projet sont (i) de confirmer ces résultats préliminaires d’entrainement des macrophages alvéolaires par une infection grippale et (ii) d’évaluer l’entrainement des monocytes (cellules immunitaires circulant dans le sang), voire de leurs précurseurs dans la moëlle osseuse, et des macrophages alvéolaires chez le porc par une injection de β-glucanes (stimuli connu pour induire une immunité entrainée chez l’homme et la souris).

Bénéfices attendus

Ces éléments aideront à approfondir les connaissances sur l’immunité entraînée chez le porc et sur son induction. De plus, le porc étant un bon modèle de l’infection grippale chez l’Homme, ces résultats pourraient permettre une extrapolation dans le domaine médical.

Procédures

Les animaux (n=18) recevront du virus grippal ou des β-glucanes ou du milieu de culture par voie trachéale ou péritonéale (jour 0 (J0)). Les porcs seront soumis à : 1/ un lavage broncho-alvéolaire sous anesthésie générale de courte durée (

Impact sur les animaux

Suite aux inoculations par un virus grippal, une hyperthermie est attendue, ne persistant guère plus de 4 jours, ainsi qu’une baisse d’appétit pendant les 3 - 4 jours suivant l’infection et des troubles respiratoires (dyspnée, toux, éternuements) pendant la semaine suivant l’infection. Aucun effet indésirable n’est attendu suite à l’administration de β glucanes.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour pouvoir récolter les poumons.

Remplacement

Les analyses in vitro ne permettent pas de répondre à l’objectif, des expériences sur l’animal vivant sont nécessaires.

Réduction

Il est nécessaire d’avoir 3 lots d’animaux à comparer : 1 lot inoculé par le virus grippal H1N2, 1 lot traité aux β-glucanes et 1 lot inoculé par du milieu de culture (témoin). Chaque lot comprendra le même effectif, à savoir 6 animaux. Ce nombre est le minimum pour obtenir des données statistiquement fiables. Le groupe de porcs recevant les β-glucanes comportera 4 animaux ce qui est suffisant pour vérifier si ces composés permettent un entrainement immunitaire chez cette espèce. Les lots infectés par le virus grippal et le lot témoin comporteront 7 animaux ce qui permettra d’obtenir des données statistiquement fiables.

Raffinement

Chaque lot sera dans une animalerie différente contenant 2 parcs, soit 3 ou 4 porcs par parc, élevés en groupe stable au cours de la durée totale du projet. Ils seront alimentés à volonté et auront accès à discrétion à de l’eau. Le confort thermique des animaux sera assuré par des lampes chauffantes. Enfin, ils auront accès à des jouets. Après chaque acte vétérinaire, une récompense type grenadine sera distribuée aux animaux. Une attention particulière sera apportée au suivi clinique de chaque animal au quotidien pendant toute la durée de la procédure expérimentale. Les lavages broncho-alvéolaires et les ponctions de moelle osseuse se feront sous anesthésie générale. Pour ces dernières, une anesthésie locale et l’administration d’un antidouleur seront également effectuées. Après les lavages broncho-alvéolaires, une visite supplémentaire aura lieu quelques heures après l’intervention afin de contrôler le réveil des animaux.

Choix des espèces

Le porc est l’espèce cible du virus influenza porcins H1N2. Les animaux seront sevrés à 4 semaines d’âge et inoculés à 9 semaines d’âge. Cet âge correspond à la fin de la période de post-sevrage, à un moment où le système immunitaire est considéré comme mature. Dans nos conditions expérimentales, nous savons que des animaux de 9 semaines développent des symptômes grippaux lorsqu’ils sont inoculés par voie trachéale avec une souche H1N2, c’est pourquoi nous prévoyons d’inoculer les animaux à cet âge, par cette même voie. De plus, les études préliminaires avaient été réalisées à partir de macrophages alvéolaires de porcs infectés à cet âge. Nous souhaitons donc nous placer dans les mêmes conditions.

12 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité modérée. Ces souris génétiquement modifiées développent une alopécie et un retard de développement important, puis sont tuées par dislocation cervicale au vingt-deuxième jour pour prélever leur peau. Le porteur étudie une protéine qu'il dit potentiellement impliquée dans le psoriasis et les cancers de la peau, en s'appuyant aussi sur des cultures de cellules. Il affirme que la souris est le seul mammifère permettant le mutant conditionnel recherché.

Objectifs

Le projet s'intéresse à une protéine potentiellement impliquée dans les cancers de la peau et le psoriasis. L'objectif principal est donc de mieux comprendre les fonctions de cette protéine dans la prolifération, dans la différenciation cellulaire et dans le développement de la peau. L'étude sera effectuée sur l'épiderme d'une souris transgènique n'exprimant plus la protéine d'intérêt dans sa peau. Le modèle utilisé permet de réaliser efficacement des expérimentations complémentaires sans utilisation d'animaux mais avec des cellules de la peau en culture.

Bénéfices attendus

Savoir si la protéine est impliquée dans certaines maladies de la peau telle que le psoriasis ou le cancer de la peau. Comprendre le mécanisme d'action de cette protéine dans la prolifération et la différenciation de kératinocytes de l'épiderme et donc dans les autres cellules de l’organismes et donc de comprendre un mécanisme clef de l’épigénétique. On rappelle que l’épigénétique est la science qui étudie l’expression du génome par les cellules, une des clefs du vieillissement et des cancers, entre autres…

Procédures

Pas d'intervention sur ces animaux. Les souris avec un phénotype vont être mises à mort au 22éme jour et la peau sera par la suite prélevée.

Impact sur les animaux

Les souris avec un phénotype vont avoir de l'alopécie (problème d'émergence de poils) et un retard de développement important. Il n y’a pas de mortalité entre la naissance et le 22éme jour.

Devenir

Les animaux seront mises à mort par disolocation cervicale pour récupérer la peau.

Remplacement

Les souris nous permettrons de procéder à la délétion complète de la protéine d'intérêt (qui est exprimer par deux gènes) à un temps voulu et qui sera spécifique à l’épiderme. Le choix d'utiliser des souris se justifie par le fait que c’est un mammifère proche de l’Homme, qui est un très bon modèle pour les manipulations génétiques puisque nous partageons plus de 95% de nos gènes. De plus, la connaissance approfondie de cette espèce assure une bonne prise en charge de l’animal, de son environnement (enrichissement du milieu) et de sa potentielle douleur. De plus, nous avons besoin d’un mutant conditionnel pour les deux gènes considérés, la souris est la seule espèce mammifère où cela est possible. Les autres modèles eucaryotes (levure, C. elegans et drosophile n’offrent pas les mêmes possibilités d’étudier différenciation et prolifération). A partir de ses souris, nous pourrons ensuite étudier les processus moléculaires et biochimiques à l’aide de cultures primaires de kératinocytes.

Réduction

À partir des mêmes souris avec un phénotype, des prélèvements de peau seront prélevés pour effectuer différentes analyses. En plus, à partir de ses souris, nous pourrons ensuite étudier les processus moléculaires et biochimiques à l’aide de cultures primaires de kératinocytes. Nous travaillerons aussi sur animaux mâles et femelles afin de diminuer le nombre d’animaux dans l’élevage nécessaire.

Raffinement

Les souris seront observées selon une fréquence adaptée à la survenue des symptômes. Un enrichissement adapté à l'état de la souris sera mis en place (en particulier, des matériaux pour un nid volumineux seront fournis), l'alimentation aussi sera adaptée pour faciliter la lactation de la mère allaitante (mettre des croquettes mouillées ou de l'hydrogel). De la buprénorphine sera administrée en attente du point limite si besoin.

Choix des espèces

Le choix d'utiliser des souris se justifie par le fait que c’est un mammifère proche de l’Homme, qui est un très bon modèle pour les manipulations génétiques puisque nous partageons plus de 95% de nos gènes. De plus, la connaissance approfondie de cette espèce assure une bonne prise en charge de l’animal, de son environnement (enrichissement du milieu) et de sa potentielle douleur. De plus, nous avons besoin d’un mutant conditionnel pour les deux gènes considérés, la souris est la seule espèce mammifère où cela est possible. Les autres modèles eucaryotes (levure, C. elegans et drosophile) n’offrent pas les mêmes possibilités d’études. L'étude sera effectuée sur des souriceaux qui ont 22 jours, car le phénotype commence à apparaitre à partir de 18éme jour. On constate de l'alopécie qui est présente sur la souris et un retard de développement et quelques échantillons pris à ce stade ont été déjà envoyés à des collaborateurs. Donc, la suite de l'étude doit être effectuée au 22éme jour.

6 912 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit une infection vaginale expérimentale par des bactéries pathogènes, jusqu'à vingt administrations intra-vaginales et huit lavages par animal, des prélèvements sanguins et des injections d'œstradiol. Il indique que l'infection provoque une inflammation locale, une gêne et des démangeaisons, et que les administrations répétées peuvent l'aggraver. Il affirme que la complexité de l'écosystème vaginal rend le modèle animal "indispensable" pour prolonger des résultats déjà obtenus in vitro.

Objectifs

La sphère vulvo-vaginale est un écosystème fragile dont la bonne santé dépend de plusieurs composantes, notamment son microbiote, l'immunité et l'état de santé de son hôte et de nombreux paramètres externes (pollution, médicaments, hygiène de vie, etc.). La rupture de cet équilibre peut entrainer la survenue d'épisodes infectieux, souvent récurrents, qui ont un impact négatif sur la qualité de vie et peuvent également constituer des facteurs de risque pour d'autres problèmes de santé plus graves (difficultés à la procréation, cancers gynécologiques). Si l'antibiothérapie est une approche thérapeutique efficace, les effets secondaires de ces médicaments, tant sur l'hote que sur l'environnement (antibiorésistance) rendent pertinent l'usage de thérapies complémentaires. Parmi elles, l'utilisation de probiotiques per os ou localement est déjà documentée comme étant efficace pour prévenir la survenue de ces infections ou faciliter le retour de la flore vaginale à un équilibre physiologique après un traitement. Le projet consiste donc à déterminer et à quantifier l'effet de l'administration vaginale de probiotiques ou de post-biotiques (i.e., produits actifs dérivés de probiotiques ou de parties de probiotiques dépourvus de vitalité) sur la sévérité et la cinétique d'infections vaginales bactériennes par des pathogènes bactériens représentatifs de ceux les plus souvent identifiés dans les vaginites bactériennes chez la femme. Pour cela, une infection vaginale avec un de ces pathogènes sera réalisée expérimentalement chez la souris, classiquement utilisée pour ces approches exérimentales en raison de l'existences de données scientifiques sur des modèles similaires. L'effet de l'administration locale de différentes préparations de probiotiques ou post-biotiques, préventive ou curative, sera évalué en mesurant l'évolution de paramètres physiopathologiques pertinents, notamment la charge bactérienne au cours de l'infection, sa durée, la sévérité de l'inflammation développée par l'hôte (paramètres sanguins ou locaux), et l'évolution de la flore vaginale.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de collecter et de comparer les données décrivant l'efficacité de différentes modalités de traitement (cinétique, présentation galénique et formulation) sur les infections vaginales bactériennes. Ces données permettront de supporter le développement et/ou l'usage de produits ou futurs produits de santé à usage gynécologique chez la femme et contribuer à limiter l'usage des antibiotiques et/où à limiter leurs effets secondaires.

Procédures

Les animaux seront soumis à des administrations intra-vaginales et à des lavages vaginaux. Chaque animal sera soumis à un maximum de 20 administrations (absence de manipulation pendant le week-end) et 8 lavages vaginaux. Des prélèvements sanguins caudaux pourront être réalisés tous les 7 à 14 jours en adaptant le volume prélevé à la fréquence de prélèvement. Les injections hebdomadaires d'oestradiol sous-cutanées seront répétées au maximum 4 fois. Chaque acte a une durée ne dépassant pas 1 minute et l'ensemble des procédures est réalisé sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Les bactéries pathogènes administrées aux animaux sont susceptibles de provoquer une inflammation locale modérée pouvant entrainer une sensation de gêne et des démangeaisons. Les différents traitements à évaluer ainsi que leurs véhicules (solution saline ou matrice lipidique) sont connus pour être bien tolérés y compris au niveau des muqueuses. L'administration répétée peut éventuellement entrainer/aggraver une inflammation locale. Ces effets indésirables seront surveillés et évalués selon les critères présentés dans la section ad hoc.

Devenir

Les animaux étant hébergés dans une animalerie de confinement A2 et/ou étant exposés à des pathogènes de classe 2, ils seront euthanasiés en fin de procédure.

Remplacement

Des expériences sur modèles in vitro ont déjà prouvé la pertinence de l'approche scientifique et donné des résultats positifs. Cependant, la physiologie de l'écosystème vulvo-vaginal et sa physiopathologie sont l'expression de nombreux facteurs et mécanismes tels que l'immunité de l'hôte, son microbiote vaginal, leurs influences mutuelles réciproques ainsi que les intéractions de ces deux composantes avec les agents pathogènes étudiés. Une telle complexité ne saurait être reconstituée avec pertinence dans des modèles non-in vivo. L'utilisation de modèles animaux est donc indispensable pour transférer les concepts déjà établis in vitro à la physiopathologie animale puis humaine.

Réduction

La variabilité des réponses à l'infection et au traitement, notamment au niveau de l'évolution du microbiote vaginal, justifie une taille de goupe expérimental de 12 animaux par condition. Un effectif inférieur expose à un risque de devoir reproduire les procédures pour valider statistiquement la solidité des résultats obtenus. Cependant, une partie des variables expérimentales (temps de traitement, doses, formulations, etc.) sont déjà définies par l'expérience interne du laboratoire ainsi que par les données de la litterature, limitant le recours à des ajustements des protocoles et à des mises au point.

Raffinement

Le regroupement des actes quotidiens (administrations, pesées), et l'observation attentive de critères précis permettent de réduire le stress et la souffrance des animaux à leur minimum. Les administrations et lavages vaginauxs ainsi que les injections sous-cutanées sont des actes rapides qui seront réalisés sur animaux vigiles par du personnel expérimenté à ces procédures.

Choix des espèces

Sur les critères de la facilité d'hébergement et de manipulation, et de la pertinence scientifique du modèle basée sur les travaux publiés dans la littérature scientifique, la souris est l'espèce la plus adaptée au développement de ce projet. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes sexuellement mâtures (début des procédures à l'âge de 6-7 semaines).

540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes sont exposées au bisphénol A par l'eau de boisson, leurs petits reçoivent des injections sous la peau dès la naissance, subissent des tests comportementaux, puis une perfusion intracardiaque sous anesthésie pour prélever le cerveau. Le porteur indique que les injections chez les nouveau-nés peuvent provoquer une douleur locale et que la séparation d'avec la mère génère un stress. Il affirme que l'étude de la myéline ne peut se concevoir qu'in vivo et qu'un modèle exposé par voie orale est le seul moyen de mimer l'exposition humaine.

Objectifs

Les troubles du développement cérébral, incluant des déficits d'apprentissage, de l'attention ou encore les troubles du spectre autistique, constituent un problème de santé publique majeur. Les perturbateurs endocriniens sont aujourd'hui mis en cause dans l'augmentation de la fréquence de ces pathologies. En mimant ou en bloquant les effets de certaines hormones, les perturbateurs endocriniens peuvent avoir des conséquences néfastes sur le développement cérébral. Parmi les composés préoccupants, le bisphénol A (BPA) est un agent plastifiant omniprésent dans notre environnement. Ainsi, dès la conception puis pendant la grossesse et la lactation, les fœtus et les nourrissons sont exposés au BPA provenant de l’organisme de leur mère à travers le placenta puis le lait maternel. L’une des étapes cruciales du développement cérébral correspond à la mise en place de gaines de myéline autour des prolongements de certains neurones. Ces gaines de myéline, très riches en lipides, permettent d’accélérer la transmission des messages nerveux et d’assurer un fonctionnement optimal du cerveau. Nous émettons l’hypothèse que le BPA pourrait perturber la mise en place des gaines de myéline dans le cerveau au cours du développement. En administrant du BPA à des souris au cours de la grossesse et de l’allaitement, nous avons pour objectif d’étudier l’impact de ce perturbateur endocrinien sur la mise en place de la myéline chez les descendants des mères exposées. Nous avons également comme objectif de mieux comprendre par quel mécanisme moléculaire le BPA pourrait exercer ses effets néfastes. Nous étudierons les effets du BPA en analysant la composition lipidique de la myéline chez les souriceaux exposés depuis la gestation. Le comportement des souris sera également évalué à différents stades, ainsi que la structure et la composition du cerveau des souris adultes.

Bénéfices attendus

Malgré son interdiction dans les biberons et les contenants alimentaires, le BPA est toujours omniprésent dans l’environnement, exposant les individus de façon permanente dès la conception. La concentration utilisée dans ce projet s’approche des concentrations retrouvées chez l’homme en cas d’exposition importante, et la voie d’exposition choisie (digestive) correspond à la voie d’exposition majoritaire chez l’homme. Ce projet permettra de compléter les connaissances sur la toxicité du BPA dans le cerveau immature en s'intéressant à une cible jusque-là peu étudiée, à savoir la myéline, dont les altérations pourraient participer à l’apparition de pathologies. L’étude des mécanismes moléculaires par lesquels le BPA exerce ses effets permettra d’améliorer l’évaluation de la toxicité de ce composé et notamment de mieux comprendre pourquoi il exerce des effets différents chez les mâles et les femelles.Il est crucial de mieux comprendre comment le BPA et les perturbateurs endocriniens exercent leurs effets sur la santé, particulièrement pendant les périodes critiques développementales, afin de contribuer à l’évaluation du risque qu’ils représentent et ce dans l’optique de protéger les populations les plus vulnérables.

Procédures

Les femelles gestantes puis allaitantes seront soumises à une exposition au BPA par l’eau de boisson pendant 30 jours, sans générer de stress ou de souffrance. Les souriceaux seront soumis à une injection par jour sous la peau pendant les 2 jours suivant sa naissance. En tenant compte du maintien du souriceau, la durée de l'intervention est de 10 secondes au maximum. L'injection elle-même dure 1 seconde. Les souriceaux seront également soumis à 2 tests comportementaux à 8 et 9 jours post-nataux. La durée de séparation avec la mère n’excède pas 10 minutes pour chaque test. Après la fin de l'allaitement, les souris âgées de 1 à 2 mois seront soumises à 3 tests comportementaux. Ces tests sont non invasifs et peu contraignants, les animaux sont libres d’explorer l’enceinte et ne reçoivent pas de stimulus désagréable ou douloureux. Certaines souris seront soumises, à l'âge de 2 mois, à une injection d’anesthésique afin de réaliser une sédation profonde. Une perfusion intracardiaque de solution saline sera réalisée, entrainant la mort rapide de l’animal. Le délai entre la sédation et la mort n’excèdera pas 2 minutes.

Impact sur les animaux

Pour tous les animaux de ce projet, un stress pourra être engendré par la séparation des souriceaux de leurs mères au cours de tests comportementaux et lors de la réalisation d’injections sous-cutanées. Les injections sous-cutanées réalisées chez les souriceaux nouveau-nés pourraient entrainer une douleur locale et transitoire. Au cours des tests comportementaux réalisés chez les souris après le sevrage, un stress pourrait être engendré par la manipulation des souris. La perfusion intracardiaque réalisé sur des animaux profondément anesthésiés pourrait également générer une douleur de courte durée. Afin de minimiser ces nuisances, ce projet prendra en compte la réglementation des 3R selon les modalités décrites par la suite.

Devenir

L'ensemble des animaux sera euthanasié à l'issue de chaque procédure afin de procéder au prélèvement de leurs cerveaux, dans le but de réaliser différentes analyses moléculaires et tissulaires.

Remplacement

La mise en place de la myéline est un processus développemental long et complexe impliquant de nombreuses interactions cellulaires entre les différents types cellulaires du cerveau. Pour cette raison, son étude ne peut être envisagée qu’« in vivo ». En outre, un modèle animal exposé par voie orale est actuellement le seul moyen pertinent de mimer l’exposition humaine au BPA.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire a été estimé grâce à notre expérience pour les différentes analyses et nous permettra de répondre aux questions scientifiques de ce projet. Différentes analyses seront réalisées sur un même animal, permettant de réduire le nombre total d'animaux. Des tests statistiques adaptés seront réalisés.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes dans des cages enrichies en sopalin pour la réalisation des nids. L'administration du BPA par l’eau de boisson, non invasive, ne générera pas de stress ou de souffrance. Les faibles doses de BPA administrées n'affecteront pas le bien-être des animaux. Seules deux injections seront réalisées chez les souriceaux, permettant un traitement efficace sur une période de 3 semaines. Au cours des tests comportementaux, des précautions seront également prises pour minimiser le stress des animaux.

Choix des espèces

Ce projet sera réalisé chez la souris car plusieurs effets du BPA sur le développement cérébral ont été observés chez la souris dans la littérature scientifique. De plus, le laboratoire est spécialisé dans l'étude du développement cérébral chez la souris, pour lequel nous disposons de nombreux outils et approches. L’exposition au BPA pendant la gestation et l’allaitement sera réalisée de la seconde semaine de gestation jusqu'à la fin de l'allaitement. Cette période d’exposition classiquement utilisée dans la littérature permet d'éviter toute malformation potentielle due au BPA pendant les premiers jours de gestation. Chez la souris, la formation de myéline dans le cerveau au cours de la deuxième semaine après la naissance, progresse rapidement et se poursuit au moins jusqu’à un à deux mois. Un effet du BPA ayant été observé chez les femelles âgées de deux semaines pendant le pic de myélinisation, ce stade a été choisi dans ce projet pour étudier le mécanisme d’action du BPA. Nous complèterons les résultats par des analyses comportementales à différents stades et par des analyses moléculaires et tissulaires à 2 mois. Ces différentes études seront réalisés aux stades adéquats en accord avec la littérature scientifique et l'expérience du laboratoire.

520 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit l'induction d'une infection urinaire par sondage de l'urètre sous anesthésie, répétée une fois, puis un traitement par l'eau de boisson pendant douze semaines associant une mycotoxine et un carcinogène. Il indique que l'infection provoque un inconfort et qu'une perte de poids supérieure à 20 % entraînerait la sortie de l'animal du protocole. Il affirme que le recours à l'animal est "irremplaçable", l'interaction entre plusieurs organes ne pouvant selon lui être modélisée in vitro.

Objectifs

Nous sommes constamment exposés à une multitude de contaminants chimiques ou toxines biologiques, qui même à faible doses peuvent affecter notre santé, par exemple en provoquant le cancer. La plupart des recherches examinent l'effet de ces contaminants ou toxines une par une, mais rarement en combinaison. Dans ce projet, nous étudierons si la combinaison d'une toxine produite par une bactérie pathogène et d'un contaminant naturel des aliments, une mycotoxine, pourrait provoquer un cancer de la vessie. L'une des infections les plus courantes est l'infection urinaire causée par Escherichia coli. Ce microbe produit des toxines qui peuvent endommager notre ADN et induire des mutations cancérigènes. Une femme sur deux est touchée par cette infection au cours de sa vie. Des études antérieures ont montré que les personnes souffrant de ce type d'infection ont tendance à avoir plus de cancers de la vessie. Nous sommes aussi fréquemment exposés à des toxines prédentes dans l'alimentation, comme celle produite par des moisissures qui poussent sur les céréales: une mycotoxine appelée déoxynivalénol ou DON. Le DON est éliminé par notre corps dans l'urine. On trouve des traces de DON dans 40 à 98% des Européens, c'est donc un contaminant très fréquent. On sait que lorsqu'ils sont ensemble, DON et Escherichia coli induisent encore plus de dommages à notre ADN. Est-ce que manger un aliment contaminé par le DON tout en ayant une infection urinaire pourrait endommager nos cellules et favoriser le cancer de la vessie?

Bénéfices attendus

Dans ce projet, nous répondrons à cette question en étudiant si la combinaison du deoxynivalenol et de l’infection avec Escherichia coli induisent des lésions cancéreuses à long terme. Si nous confirmons qu'ensemble ils peuvent conduire au cancer de la vessie, nous alerterons les médecins et les régulateurs, pour éventuellement modifier la façon de traiter les infections de la vessie et pour diminuer les quantités tolérables de DON dans nos aliments.

Procédures

Une infection urinaire sera induite chez les animaux par injection via leur urèthre, avec une sonde, sous anesthésie générale. Le sondage et l'injection sont effectués par une personne expérimentée, en 1 minute environ. L'injection est répétée une fois sur chaque animal une heure après la première (pour garantir l'infection). Le suivi des animaux est ensuite effectué par des prélèvement d'urine quotidiennement, sur animal vigile avec une simple contention manuelle. Le traitement des animaux avec le contaminant alimentaire et le carconogène urinaire est effectué par l'eau de boisson, sans intervention, pendant 12 semaines. Ces produits ne montrent pas d'effet sur la prise de boisson aux doses utilisées.

Impact sur les animaux

Les traitements avec le contaminant alimentaire et le carcinogène urinaire ne sont pas connus pour induire de la douleur. Les infection urinaires induisent de l'inconfort au niveau de l'aine, mais aucun autre signe clinique est attendu.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à l'issu de l'expérience afin de prélever les tissus qui seront analysés. La technique d'euthanasie est la même que celle utilisée chez les vétérinaires.

Remplacement

Remplacer : des études ont été préalablement conduites sur des cellules en culture permettant d’élucider comment agissent les toxines produites par les UPEC sur les cellules eucaryotes. Le recours à l’animal est cependant irremplaçable car aucun autre modèle ou tube à essai ne permet d’évaluer les répercussions à long terme de cette bactérie et ses toxines sur la vessie. Une veille scientifique sera mise en œuvre pour identifier toute méthode scientifique alternative à l’expérimentation animale dans le domaine.

Réduction

Réduire : Une attention toute particulière est portée sur le nombre d’animaux strictement nécessaire pour chaque expérience. Le nombre maximum de rats envidagé est de 520 animaux. Plusieurs paramètres seront analysés chez chaque animal (poids, nombre de bactéries, prélèvements d’urine, de tissus et de sang lors du sacrifice) pour réduire le nombre d’animaux nécessaires.

Raffinement

Raffiner : Le protocole d’expérimentation sera adapté afin de minimiser la morbidité et la douleur. Une perte de poids (non attendue) supérieure à 20 % du poids initial nous conduira à sortir l’animal du protocole expérimental et à l’euthanasier. Pour les protocoles où la douleur ne peut pas être prise en charge par des analgésiques, une observation accrue et des critères d’arrêt plus stricts seront mis en place.

Choix des espèces

L'utilisation de méthode alternative in vitro a été préalablement réalisée pour démontrer l'impact des différentes toxines et métabolites sur la cellule eucaryote en culture. Cependant, le recours à l'animal est irremplaçable car les objectifs sont i) de découvrir les rôles des toxines bactériennes produites pendant l'infection urinaire et le cancer de l'urothélium, ii) de déterminer le lieu et la cinétique de production de ces toxines dans le tissu de la vessie et iii) de mesurer les effets des facteurs alimentaires sur leur production lors de l'infection urinaire. Étant donné que les infections urinaires sont des infections ascendantes impliquant plusieurs organes, que la production de toxines bactériennes peut être affectée par les réponses de l'hôte à différents endroits dans l'organisme, cette interaction complexe ne peut pas être modélisée in vitro.

10 800 poissons salmonidés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit une stérilisation par choc de pression, la greffe de cellules germinales par injection dans l'abdomen d'embryons tout juste éclos, un marquage par transpondeur et une collecte de gamètes sous anesthésie. Il indique que les embryons surnuméraires sont tués vingt-quatre heures après l'éclosion et que les animaux greffés sont tués après la collecte des gamètes. Le projet est présenté comme un outil de conservation d'espèces menacées, le corégone et l'omble chevalier, en les faisant produire par des espèces d'élevage.

Objectifs

L'objectif du projet est de développer une méthode pour la conservation des ressources génétiques et la restauration des espèces de salmonidés en voie de disparition dans leur milieu naturel. Nous nous focaliserons sur le corégone (Coregonus lavaretus) et l’Omble chevalier (Salvelinus alpinus).

Bénéfices attendus

Les Corégones et l’Omble chevalier sont des espèces de Salmonidés en danger d’extinction dans leur milieu naturel en raison de l’anthropisation des lacs ou ils vivent, d’une surpêche, et du changement climatique. Les cellules germinales souches d’une espèce à préserver peuvent être cryopréservées dans l’azote liquide et être greffées ultérieurement à des animaux receveurs appartenant à une espèce proche (greffes interspécifiques) pour générer des gamètes conformes à l’espèce donneuse de cellules germinales souches. Le projet proposé permettra de vérifier si les greffes de cellules germinales souches de Corégones ou d’Ombles chevaliers sont possibles dans une ou plusieurs espèces de salmonidés bien disséminés sur le territoire national et dont l’élevage est bien maîtrisé en pisciculture commerciale (truite Arc-en-ciel, la truite fario et l’Omble de fontaine). Le projet permettra aussi d’évaluer le sexe et les stades de maturation sexuelle favorable à l’efficacité des greffes.

Procédures

Le projet, qui s'étallera sur une durée de 5 ans, prévoit de greffer par injection intra-abdominale des cellules germinales souches de Corégones et d'Ombles chevaliers à des embryons juste éclos et anesthésiés de truites arc-en-ciel, de truites fario, ou de saumon de fontaine rendus stériles par triploïdisation. La triploïdisation est préalablement réalisée par un choc de pression de 700 bars pendant 3 minutes, 40 minutes après la fécondation. La piqûre nécessaire à la greffe est réalisée à l'éclosion en moins de deux minutes par embryon. 72 lots de 150 embryons seront produits par lot pour déterminer le sexe et le stade de maturation sexuelle des animaux donneurs favorables au taux de succès de la greffe. Les animaux injectés seront marqués individuellement sous anesthésie à l'aide de transpondeurs en moins de 2 minutes chacun pour permettre leur regroupement dans des bassins adaptés à l'évolution de leur croissance et la vérification de leur ploïdie. 15 mâles et 15 femelles pour chaque lot seront gardés jusqu'à la collecte des gamètes à l'âge de 2 ou 3 ans. La collecte des gamètes sur des animaux anesthésiés nécessite environ 3 minutes par animal. La greffe des cellules germinales souches aux embryons tout juste éclos n'entraine pas de souffrance ou de malformations particulières chez les animaux de la prise alimentaire à l'âge adulte.

Impact sur les animaux

Le stress et la souffrance des animaux sont pris en charge lors des procédures expérimentales car celles-ci sont réalisées sous anesthésie. La greffe peut conduire à une surmortalité des embryons entre 4 et 10 jours après la greffe, c’est-à-dire bien avant la première prise alimentaire. Cette surmortalité peut être limitée en prenant des embryons issus de femelles de 3 ans. Les animaux qui survivent jusqu’au début de la prise alimentaire se développent ensuite normalement par rapport à des congénères triploïdes non greffés.

Devenir

Les embryons triploïdes surnuméraires non injectés seront euthanasiés 24h après l'éclosion. Tous les embryons injectés seront marqués à l'aide d'un transpondeur et gardés en vie jusqu'à la maturation sexuelle. Au maximum, 15 mâles et 15 femelles par lot seront gardés jusqu'à la collecte des gamètes. Les animaux greffés seront euthanasiés après la collecte des gamètes car la maturation sexuelle entraine une augmentation de la susceptibilité des animaux aux maladies.

Remplacement

La régénération de populations animales à partir de matériel biologique n'a pas d'approches expérimentales alternatives qui permettraient de s'affranchir de l'utilisation d'animaux. Le stress et la souffrance des animaux sont pris en charge lors des procédures expérimentales en réalisant systématiquement une anesthésie des animaux. Une surveillance quotidienne permet d’euthanasier les larves, alevins, adultes malformés car ils sont susceptibles de ressentir de la souffrance en raison de la présence de récepteurs nociceptifs. Ces malformations sont potentiellement liées aux gestes expérimentaux mais elles sont aussi observées dans le cadre d'élevage de poissons diploïdes ou triploïdes non manipulés. Les animaux transplantés avec des cellules souches germinales sont apparemment normaux à l'âge adulte et ils atteignent une croissance (poids et taille) similaire à celle de leurs congénères non manipulés maintenus dans les mêmes conditions d'élevage.

Réduction

Le nombre de lots expérimentaux a été adapté au plus juste pour adresser les points majeurs qui affectent la réussite des greffes. Le nombre d'animaux par lot tient compte de la mortalité observée dans les élevages et du nombre d'animaux nécessaires pour l'évaluation de la variabilité de la fertilité et de la qualité des gamètes des animaux greffés.

Raffinement

Le stress et la souffrance des animaux sont pris en charge lors des différentes procédures grâce à l'anesthésie des animaux.

Choix des espèces

Les espèces donneuses de cellules germinales souches (Corégones et Ombles chevaliers) sont des espèces en danger d'extinction dans leur milieu naturel. Les espèces receveuses (truite Arc en ciel, truite fario et Omble de fontaine) ont été choisies car d'une part, leur parenté taxonomique devrait être favorable au succès des greffes et à la production de gamètes de qualité, et d'autre part, leur élevage est bien maîtrisé dans les fermes aquacoles. De plus, la stérilisation de ces espèces par triploïdisation fait partie des procédures standards d'élevage.