Procédures modérées

780 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur foie et leur sang, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une fibrose du foie leur est provoquée par un régime alimentaire spécifique, et 255 subissent six prélèvements sanguins répétés au sinus rétro-orbital sous anesthésie, pour tester des vecteurs censés bloquer les gènes de la maladie. Le porteur renvoie au conditionnel la mise au point de traitements contre la fibrose et la cirrhose. Il affirme qu'on ne peut reproduire l'architecture d'un "organe entier" autrement que chez l'animal.

Objectifs

La fibrose hépatique correspond à une cicatrisation du foie, en réaction à une agression, qui finit par entraîner un mauvais fonctionnement de cet organe. La cause première de fibrose hépatique est l'alcoolisme, mais les maladies chroniques du foie comme les hépatites, ou les maladies métaboliques liées à l’obésité, sont aussi à l'origine de fibroses. Une fibrose peut à son tour dégénérer en cirrhose, puis en cancer du foie - l'un des plus mortels. Il n'existe à l'heure actuelle pas de traitement contre la fibrose. Vu l’augmentation de l’obésité dans la population, les maladies du foie vont devenir un problème mondial de santé publique dans les années à venir. L’objectif de notre projet est de développer des médicaments pour traiter la fibrose hépatique métabolique. Le principe de ces médicaments est d’empêcher les gènes responsables de la maladie de s’exprimer. Nous allons élaborer des vecteurs synthétiques capables de délivrer ces médicaments spécifiquement dans le foie pour réduire au silence les gènes impliqués dans le développement de la fibrose.

Bénéfices attendus

La fibrose hépatique n’ayant à ce jour pas de traitement, nous pensons que cette étude sera un premier pas vers la mise au point de nouveaux médicaments pour soigner la fibrose et la cirrhose hépatiques, actuellement incurables.

Procédures

Un prélèvement sanguin de 100 à 150 μL par voie retro-orbitale après anesthésie totale par un mélange kétamine (100mg)/kg/xylazine (10mg/kg) sera effectué toutes les 2 semaines sur une partie des animaux prévus dans le projet. Soit 6 prélèvements répétés sur 255 animaux. La durée du prélèvement est d'environ 5 minutes.

Impact sur les animaux

Le régime alimentaire utilisé pour induire une fibrose hépatique aux animaux entraine une légère perte de poids des animaux pendant les 3 premières semaines pour reprendre ensuite une croissance normale. L’état des souris sera surveillé quotidiennement et leur poids mesuré toutes les semaines.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à la fin de chacune des procédures. En effet, il est indispensable de récupérer le foie et le sang des souris pour pouvoir étudier les effets des vecteurs thérapeutique sur la fibrose hépatique.

Remplacement

Les procédures expérimentales nécessaires à ce projet ont été élaborées et réfléchies afin de minimiser le nombre d’animaux tout en permettant de réaliser une étude statistique valable. Le modèle de fibrose que nous avons choisi consiste uniquement en l’apport d’une alimentation spécifique, il a l’avantage de refléter fidèlement la pathologie humaine. Avant d’être administré aux souris, les systèmes thérapeutiques développés seront préalablement testés sur des cellules en cultures. Seuls les systèmes présentant une efficacité suffisante seront testés chez la souris.

Réduction

D’après la littérature et d’après notre expérience sur le modèle CDAHFD, la variabilité des réponses à l’induction de la fibrose est très faible (sur plus de 100 souris étudiées, toutes développent une fibrose hépatique). Cependant, suivant les durées de régime, la variabilité de l’expression de certains marqueurs peut être plus ou moins marquée. Ainsi, d’après nos résultats précédents, l’étude d’une réponse aux agents thérapeutiques nécessite des lots minimum de 15 animaux pour pouvoir réaliser une étude statistique. Pour les études d’effet thérapeutique nous réaliserons dans un premier temps, l’expérience sur un lot de 10 animaux, testerons la validité statistique des résultats, et nous recommencerons l’expérience sur 5 animaux supplémentaires si nécessaire. Pour les études de biodistribution, des lots de 5 animaux sont suffisants. Ainsi, le nombre d’animaux indiqués est un nombre maximum. Le test statistique utilisé sera un test non paramétrique Mann–Whitney permettant l'analyse d'échantillons de petites tailles.

Raffinement

Ce régime entraine une légère perte de poids des animaux pendant les 3 premières semaines pour reprendre ensuite une croissance normale. L’état des souris sera surveillé quotidiennement et leur poids mesuré toutes les semaines. Le milieu sera enrichi pour le bien-être des animaux (cotons de nidifications, bâtonnets et igloos…). Des mesures visant à réduire la douleur des animaux seront prises, les injections de médicaments seront réalisées sous anesthésie générale et un suivi attentif des animaux est prévu à chaque étape des procédures. Les animaux seront régulièrement évalués à l’aide de points limites bien définis. Pour chaque animal mis à mort, nous exploiterons un maximum de données disponibles.

Choix des espèces

Les objectifs du projet sont de tester différents agents thérapeutiques pour traiter la fibrose hépatique et d’étudier l’évolution des marqueurs de cette pathologie. Le recours à des animaux est indispensable pour atteindre de tels objectifs, puisque la fibrose hépatique prend place au niveau d’un organe entier, le foie. Il n’est actuellement pas possible de reproduire l’architecture et la complexité d’un organe entier autrement que chez l’animal. De nombreux modèles de fibrose hépatiques existent et sont bien connus chez la souris. En soumettant les animaux à un régime alimentaire spécifique, bien caractérisé par l’équipe, cela permettra de récapituler, les différentes étapes du développement et les potentielles variabilités de la maladie à l’échelle de l’organisme entier. Un tel niveau d’information ne peut pas être obtenu à l’aide d’un modèle in vitro.

420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Infectées par le virus de la Vaccine par voie intranasale sous anesthésie, elles reçoivent du chloramphénicol par injections répétées et une prise de sang au sinus rétro-orbital juste avant la mise à mort, pour étudier le métabolisme des lymphocytes T CD8. Le porteur indique fixer un point limite à 20 % de perte de poids, l'antibiotique n'ayant pas encore été testé dans ce contexte infectieux. Il affirme que la complexité de la réponse immunitaire rend son étude in vitro impossible.

Objectifs

Lors d’une infection virale, les T-CD8s naïfs et spécifiques des antigènes viraux sont activés dans les ganglions drainant l’organe infecté. Suite à leur activation, les T-CD8s prolifèrent et se différencient en cellules effectrices qui migrent vers l’organe infecté et éliminent les cellules infectées. En parallèle, pendant la phase effectrice, un petit nombre de T-CD8 mémoires se développent, qui vont persister sur le long terme. Les T-CD8s mémoires sont capables de réagir de manière plus rapide et plus efficace en cas de nouvelle rencontre avec le même virus. La fonction des T-CD8s et la génération de T-CD8s mémoires fonctionnels sont largement dépendantes d’une succession de changements métaboliques et reposent sur une communication étroite entre la respiration mitochondriale et la glycolyse. En effet, alors que les T-CD8 naïfs (qui n'ont jamais été activés) acquièrent leurs besoins énergétiques de la respiration mitochondriale, leur activation mène à un remodelage métabolique en faveur de la glycolyse, leur permettant d’assurer leurs fonctions effectrices. Enfin, les T-CD8 mémoires possèdent un métabolisme respiratoire, accompagné d’une augmentation de la masse mitochondriale leur permettant de répondre rapidement lors d’une réponse secondaire. Bien que ces changements métaboliques soient à présent bien admis, les mécanismes sous-jacents qui les contrôlent restent peu, voire pas, connus. De manière intéressante, la respiration mitochondriale repose sur la traduction d’ARNs spécifiques et exclusivement exprimés dans les mitochondries, un processus nommé la traduction mitochondriale. L'émergence d’études sur ce sujet suggèrent ainsi un rôle spécifique de la traduction mitochondriale, dans l’établissement des réponses immunes innées et adaptatives. Ainsi, ce projet vise à disséquer, au niveau moléculaire, la contribution relative des traductions mitochondriale et cytosolique, dans le contrôle de la respiration mitochondriale et de la glycolyse, au cours des réponses T-CD8 anti-virales. Pour cela, des souris C57Bl/6J seront infectées par voie intranasale, avec le virus de la Vaccine. La traduction mitochondriale sera spécifiquement inhibée, grâce à l’utilisation de Chloramphenicol, injecté par voie intra-péritonéale. Différents temps après infection, l'analyse du nombre, du phénotype, et des fonctions des T-CD8s, sera effectuée ex vivo sur un prélèvement de sang et des organes lymphoïdes.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus permettront de combler le manque de connaissances mécanistiques concernant les besoins métaboliques des T-CD8, et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour moduler les fonctions cytotoxiques des T-CD8 et la génération/maintenance des cellules mémoires.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Injection Intraveineuse (sous brève anesthésie Isoflurane) – uniquement pour la procédure 2 : 1 fois par animal – durée 30 secondes - Injection intrapéritonéale (pour anesthésie Kétamine/Xylazine) : 1 fois par animal– durée 30 secondes - Infection intranasale (sous anesthésie Kétamine/Xylazine) : 1 fois par animal – durée 30 secondes par narine - Injections Intra-péritonéales (pour traitements chloramphénicol): 1 fois par jour pendant 4 à 10 jours en fonction des groupes – durée 30 secondes par injection - Prélèvements sanguins au sinus retro-orbital (sous brève anesthésie Isoflurane) : 1 fois par animal, juste avant la mise à mort – durée 30 secondes

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles sont une légère douleur générée par les injections intra-péritonéales et le stress généré par l’anesthésie et la procédure d’inoculation du virus par voie intranasale. L'infection par le virus de la Vaccine est une procédure utilisée en routine dans le laboratoire dont les conséquences ne génèrent pas de souffrance sur les animaux. Le chloramphenicol utilisé dans ce projet (50mg/Kg, en IP) est un antibiotique largement utilisé chez l'humain et dans des modèles animaux. Les doses utilisées sont basées sur la littérature qui ne décrit aucune nuisance ou effet indésirable sur l’état général des animaux. De plus le chloramphénicol (qui inhibe la traduction mitochondriale) devrait, selon la littérature, avoir un impact surtout dans la génération et la survie des cellules T CD8 mémoires, et seulement un impact négligeable sur la réponse effectrice (et donc sur la capacité des animaux à contrôler l'infection). Cependant, étant donné que cette drogue sera testée pour la première fois dans le cadre d'une infection virale in vivo, un point limite de 20% de perte de poids est fixé.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de pouvoir prélever les organes (ganglions lymphatiques, poumons, rate etc) et effectuer ex vivo: - des analyses cellulaires pour déterminer le phenotype et la fonctionalité des lymphocytes T CD8 - des analyses moléculaires et les mecanismes impliqués dans la traduction mitochondriale, au cours de la réponse T-CD8

Remplacement

La réponse immunitaire anti-virale est un phénomène biologique complexe faisant intervenir de multiples types cellulaires et une organisation spatiale qui rend impossible son étude dans des tests in vitro.

Réduction

Pour chacune des procédures, nous utiliserons 15 animaux par groupe expérimental, analysés individuellement. Nous utiliserons des tests de comparaison de moyennes de Student et des tests non-paramétriques pour comparer les groupes. Le calcul de la puissance des tests statistiques et nos expériences antérieures ont montré que ces nombres d'animaux par point expérimental étaient nécessaires et suffisants pour l’interprétation de nos résultats.

Raffinement

Afin de réduire la souffrance, le stress et la douleur de l’animal, i) les infections intra-nasales seront réalisées sous anesthésie profonde et la température corporelle des animaux sera maintenue lors de l'anesthésie; ii) nous effectuerons une brève anesthésie à l'isfluorane (3% dans une chambre à oxygène) pour les prélèvements de sang en rétro-orbital; iii) les injections I.V. au sinus rétro-orbital seront réalisée sous anesthésie à Isoflurane (3% dans une chambre à oxygène); iv) nous maintiendrons les animaux en groupes sociaux au sein de chaque cagée (en moyenne 5 animaux par cagée) ; v) assurerons une surveillance adaptée à chacune des procédures ou étape au sein d'une procédure, comme décrit au sein de chaque procédure.

Choix des espèces

Le choix du modèle souris est imposé par la nécessité de pouvoir utiliser, à terme, des animaux génétiquement modifiés. Dans ce projet, des souris sauvages (fond C57Bl/6J) seront utilisés.

48 souris saines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un composé par gavage pendant 22 jours puis passent trois tests de mémoire, dont la piscine de Morris où l'animal nage jusqu'à 90 secondes pour rejoindre une plateforme. Le porteur teste sur des souris saines une molécule déjà évaluée dans des modèles d'Alzheimer et de trisomie 21 et renvoie les bénéfices cliniques au long terme. Il indique que l'évaluation du rapport sécurité-efficacité impose des tests comportementaux sur rongeurs.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de déterminer le ratio sécurité/efficacité sur l’apprentissage de souris saine d’une molécule ayant déjà démontré des propriétés pro-mnésiques et neuroprotectrices chez des souris ayant développé une maladie de type Alzheimer ou de trisomie 21.

Bénéfices attendus

Les bénéfices à court terme (pendant la durée du projet) sont de déterminer le ratio sécurité/efficacité sur la cognition des souris saines d’un produit ayant déjà montré des effets bénéfiques dans des études pré-cliniques basées des modèles murins de trisomie 21 ou de la maladie d’Alzheimer. Les bénéfices à plus long-terme sont de permettre le lancement d’essais cliniques évaluant l’efficacité de ce produit à protéger les patients atteints de trisomie 21 ou de la maladie d’Alzheimer de l’apparition de déficit cognitifs

Procédures

48 animaux seront soumis à une administration quotidienne du produit de traitement par gavage pendant 22 jours. Après 10 jours de traitement avec le produit testé, les animaux effectueront 3 tests comportementaux pour évaluer les différents types de mémoires. Le lendemain du dernier test (au 23ème jour), les animaux seront mis à mort pour pouvoir effectuer le prélèvement du cerveau afin d'évaluer les quantités et mécanismes d'actions du produit testé.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables peuvent venir de l’administration des fortes doses de traitement dans la procédure n°1 mais les études de toxicologies n’ont pas révélées d’effet toxique à ces doses. Cependant les animaux seront observés quotidiennement afin d’évaluer les effets potentiellement indésirables. L’inconfort lié au traitement peut provenir de l’administration du produit de traitement par gavage pendant 22 jours. Afin d’éviter ces effets indésirables, cette administration sera effectuée par du personnel technique qualifié. Le test de la piscine de Morris va induire un important stress lors de la première nage mais l’animal sachant instinctivement nager ne tardera pas à trouver la plateforme pour être retiré de l’eau par l’expérimentateur avec un temps de nage maximum de 90 secondes ce qui est bien en deça de l’épuisement de l’animal. L’observation quotidienne des animaux permettra de déceler toute souffrance animale dès son apparition et d’intervenir le plus rapidement possible pour minimiser au maximum l’inconfort observé.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour un prélèvement de structures cérébrales à l’issue de chaque procédure.

Remplacement

L'objectif de ce projet est de déterminer le ratio sécurité/efficacité sur la cognition d’une molécule ayant déjà démontré des propriétés pro-mnésiques et neuroprotectrices in vivo chez des souris développant une maladie de type Alzheimer ou de trisomie 21. L'évaluation de ce ratio nécessite de réaliser des tests de comportement sur des rongeurs.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans chaque expérience a été défini à l’aide de tests de puissance G Power (logiciel G*Power 3.1) réalisés avec des données internes ou issues de publications. Ces analyses ont révélé qu’il était nécessaire d’avoir 12 animaux par groupe. De plus, nous réutiliserons les animaux qui ont fait les tests comportementaux pour les prélèvements de structures cérébrales.

Raffinement

Les souris sont livrées par groupes d’individus qui se connaissent afin d’éviter les bagarres. Des cabanes en carton sont ajoutées en plus de l’enrichissement réglementaire. Les animaux seront habitués aux expérimentateurs en étant manipulés doucement une minute par jour la semaine précédent les expériences. L’administration orale sera réalisée par du personnel formé avec du matériel adapté. L’état clinique des animaux est vérifié chaque jour et dès qu’une détérioration est constatée, le responsable du projet et le vétérinaire sont informés pour la prise de décision. Si un animal est prostré ou a les yeux mi-clos ou présente des difficultés pour se déplacer/respirer il sera euthanasié pour mettre fin à ses souffrances. Le poids des animaux est relevé 2 fois par semaine et toute diminution de 15% du poids de l’animal entre 2 pesées traduit une souffrance et une euthanasie sera pratiquée.

Choix des espèces

Les études pré-cliniques précédantes ayant démontré les propriétés pro-mnésiques et neuroprotectrices de ce produit ont été réalisées chez des souris adultes ayant développé une maladie de type Alzheimer ou de trisomie 21. Nous gardons donc la même espèce pour cette étude..

402 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une dermatite atopique leur est provoquée par micropores au laser dans la peau puis application d'un allergène, une partie étant ensuite exposée à l'allergène par voie respiratoire pour déclencher une réaction de type asthme, et 104 recevant en plus de la toxine diphtérique pour détruire une sous-population de lymphocytes. Le porteur indique attendre une inflammation cutanée et pulmonaire légère et prévoit l'euthanasie selon des points limites. Il décrit la complexité de la réponse immunitaire comme rendant l'expérimentation in vivo nécessaire.

Objectifs

Les allergies (ou maladies atopiques), incluant la dermatite atopique (eczéma), l’asthme, la rhinite allergique et les allergies alimentaires sont des maladies inflammatoires complexes avec des caractéristiques communes, impliquant différents organes du corps. La dermatite atopique précède souvent le développement d’autres allergies, et sa sévérité aggrave le cours de l’allergie respiratoire. Cette évolution de la dermatite atopique vers d’autres maladies atopiques, et en particulier l’asthme, est appelée « marche atopique ». Une meilleure compréhension des mécanismes immunitaires impliqués dans la mise en place de la dermatite atopique est cruciale dans le but de développer de nouveaux traitements ou de nouvelles stratégies de prévention. Les lymphocytes T sont des cellules clés du système immunitaire permettant de se défendre contre les pathogènes. Cependant ces lymphocytes peuvent entraîner différentes maladies s’ils sont dérégulés, comme par exemple les allergies. Plus spécifiquement, deux sous-populations de lymphocytes T sont dérégulées dans la dermatite atopique et la marche atopique. Ces deux populations restent cependant mal définies à ce jour. C’est pourquoi nous nous intéressons au rôle et aux mécanismes impliqués dans la génération de ces populations de cellules immunitaires au cours de la dermatite atopique et de la marche atopique. Pour ce faire, nous utilisons un modèle mimant les caractéristiques de la dermatite atopique chez la souris. Dans ce modèle, nous utilisons une technologie permettant de générer des micropores dans la peau à l’aide d’un laser (technique également utilisée chez l’Homme dans la sphère médicale) puis nous appliquons un allergène sur la peau des souris. Cette étape engendre une dermatite atopique menant une sensibilisation de la souris à l’allergène. Pour étudier la marche atopique, nous appliquons ce même protocole pour induire la dermatite atopique, puis nous allons réexposer les souris à l’allergène au niveau des poumons, ce qui entrainera une réponse allergique similaire à un phénomène asthmatique. Ceci permettra d'étudier l'asthme.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre la pathogenèse de la dermatite atopique et de la marche atopique. Plus précisément, ceci nous permettra de déterminer les signaux induisant les différentes populations de lymphocytes dérégulés dans ces maladies, ainsi que le rôle de ces cellules. Elucider le fonctionnement de ces cellules pourrait permettre d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques dans la dermatite atopique et la marche atopique. De plus, comprendre les signaux et cellules impliqués dans la génération des lymphocytes régulateurs pourrait permettre de trouver un traitement pour booster leur production et leur fonctionnement, ceux-ci ayant normalement pour rôle de contrôler les réponses immunitaires et donc par exemple les réponses allergiques.

Procédures

Pour étudier la dermatite atopique, 252 animaux seront anesthésiés au jour 0 pour la sensibilisation à un allergène au niveau de l'oreille (durée de la procédure : 20 minutes). Cette procédure est effectuée deux fois par semaine pendant deux semaines (durée totale de la procédure : 4x20 minutes = 1h20). Parmi ces 252 animaux, 74 seront également injectés avec de la toxine diphtérique (durée de la procédure : 10 secondes) pour éliminer une sous population de lymphocytes dans le but de déterminer leur rôle dans la dermatite atopique. Le nombre et les dates d'injections seront déterminé dans une expérience pilote. Tous les animaux seront euthanasiés au jour 13 pour collecter les différents organes pour analyses. Pour étudier la marche atopique, 150 animaux seront anesthésiés au jour 0 pour la sensibilisation à un allergène au niveau de l'oreille (durée de la procédure : 20 minutes). Cette procédure est effectuée deux fois par semaine pendant deux semaines (durée totale de la procédure : 4x20 minutes = 1h20). Ces animaux seront ensuite exposés à l'allergène au niveau des voies respiratoires (durée de la procédure : 30 minutes). Cette procédure est effectuée tous les jours du jour 9 au jour 12 (durée totale de la procédure : 4x30 minutes = 2 heures). De plus, les fluides bronchoalvéolaires seront collectés (procédure sans réveil) au jour 13 pour étudier l'inflammation des poumons. Parmi ces 150 animaux, 30 seront également injectés avec de la toxine diphtérique (durée de la procédure : 10 secondes) pour éliminer une sous population de lymphocytes dans le but de déterminer leur rôle dans la marche atopique. Le nombre et les dates d'injections seront déterminé dans une expérience pilote.

Impact sur les animaux

La sensibilisation à l'allergène au niveau de l'oreille des animaux conduira à une légère inflammation de type dermatite atopique sur l'oreille, se traduisant par une rougeur. Par le passé, nous n'avons pas observé d'autres effets avec ce traitement. De plus, nous avons déjà fait des injections de toxine diphtérique sur d'autres modèles, et n'avons observé aucun changement de comportement de la part des animaux traités, cependant une rougeur pourrait survenir au point d'injection. Les animaux traités par instillations intranasales d'allergène développeront une légère inflammation des poumons. Tous les animaux seront surveillés et tout effet indésirable sera traité selon les points limites énoncés dans le but de limiter la souffrance des animaux.

Devenir

Après la procédure "Modèle de dermatite atopique" et "Modèle de dermatite atopique + injection de toxine diphtérique" , les 178 et 74 animaux (respectivement) seront euthanasiés selon la procédure autorisée pour étudier les ganglions lymphatiques et la peau. Le dernier jour de la procédure "Modèle de marche atopique" et "Modèle de marche atopique + injection de toxine diphtérique", les 120 et 30 animaux (respectivement) seront euthanasiés pour analyser les voies respiratoires.

Remplacement

L'étude de la réponse immunitaire, et en particulier au cours de la dermatite atopique et la marche atopique, met en jeu différents organes et réseaux impliquant plusieurs types cellulaires. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre cette réponse immunitaire et le rôle de chaque cellule impliquée.

Réduction

Ce protocole sera appliqué à un maximum de 402 souris, permettant de caractériser le rôle des lymphocytes Treg et Tfh dans les allergies, et en particulier au cours de la dermatite atopique et la marche atopique. Selon les expériences, les groupes comporterons 8 souris (modèle de dermatite atopique) ou 15 souris (modèle de marche atopique), ce qui permettra d'avoir des résultats statistiquement interprétables pour les différents paramètres étudiés, à l'aide d'un test de Student (t-test). Dans la partie 4 du projet, dans un but de réduction, l'oreille droite et l'oreille gauche des souris seront traitées différement et seront comparées entre elles. Trois études pilotes seront effectuées lors de ce projet, avec un nombre réduit d'animaux, dans le but de déterminer 1) l'allergène le plus approprié, 2) quand commencer les injections de DT en fonction de l'apparition des lymphocytes Tfh, 3) quand faire les injections de DT et leur nombre.

Raffinement

Les animaux seront gardés en groupe dans leur cage pour préserver les interactions sociales. La sensibilisation est réalisée sous anesthésie gazeuse pour limiter la souffrance / stress des animaux. Après ces traitements, les animaux seront placés sur une plaque chauffante et surveillés jusqu'à leur réveil. Tout au long du protocole, les animaux seront surveillés de manière visuelle avec un suivi de l'aspect général des animaux (et en particulier des oreilles), de leur posture et de leur comportement. Une grille d'évaluation de la douleur sera utilisée. Si celle-ci est importante, ils seront retirés de l'étude et pourront bénéficier de soins. Si le cas est plus grave, les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

La souris est le modèle choisi pour étudier la dermatite atopique et la marche atopique car le système immunitaire des souris est proche de celui de l'Homme avec une immunité innée mais également une immunité adaptative, ce qui permet l'étude de la réponse immunitaire spécifique d'un allergène et de la réponse mémoire. De plus, la peau des souris présente des similitudes (épiderme, derme, présence de cellules immunitaires) avec la peau humaine, rendant ce modèle pertinent pour l'étude de la sensibilisation cutanée. Les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines de vie afin d'étudier le système immunitaire à l'âge adulte.

75 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Maintenus sous anesthésie gazeuse jusqu'à deux heures et demie, ils reçoivent un candidat-médicament par cathéter dans la veine caudale et subissent jusqu'à dix micro-prélèvements de sang sur 24 heures avant d'être tués pour récolter les échantillons. Le porteur décrit ces micro-prélèvements comme indolores mais reconnaît un stress possible, et signale un risque d'hypothermie ou d'arythmie en cas de défaillance du matériel. Il affirme qu'aucun modèle alternatif ne reproduit l'ensemble des phénomènes d'absorption et d'élimination et juge l'approche animale "indispensable".

Objectifs

Le développement de nouveaux médicaments requiert d'étudier le devenir de la substance active dans l’organisme afin de déterminer sa distribution, son métabolisme et son élimination. Ces propriétés influencent la posologie du médicament : dose et fréquence d'administration. L’objectif de ce projet est de mesurer la concentration sanguine de candidats-médicaments en fonction du temps afin de déterminer le volume de distribution, la concentration maximale observée, le temps de demi-vie, la clairance et la valeur d’exposition des candidats-médicaments chez le rat.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de sélectionner les candidats présentant une concentration élevée et durable dans le sang, alliée à un métabolisme lent et une faible élimination. Ces caractéristiques sont indispensables pour garantir la distribution du candidat-médicament à sa cible et une bonne efficacité. Ce projet s'inscrit pleinement dans les étapes indispensables au développement des candidats-médicaments. Cela permettra de réduire drastiquement le nombre d'études nécessaires pour ne mesurer ensuite que l’activité des candidats-médicaments les plus prometteurs et épargnera la vie de centaine d'animaux, tout en augmentant les probabilités d'obtenir un médicament efficace pour le traitement des patients.

Procédures

Les animaux seront soumis à une anesthésie gazeuse durant plusieurs dizaines de minutes (maximum de 2h30), l'insertion d'un cathéter avec aiguille dans la veine caudale (sous anesthésie, l’aiguille est ensuite éliminée) et des micro-prélèvements de sang répétés à l'extrémité de la queue (maximum 10 prélèvements). La procédure durera un maximum de 24h puis les animaux seront mis à mort afin de recueillir les échantillons nécessaires aux analyses.

Impact sur les animaux

Les animaux seront maintenus sous anesthésie gazeuse durant la perfusion intraveineuse des candidats-médicaments dans la veine caudale et les premiers prélèvements de sang (maximum de 2h30). En cas de défaillance du matériel, une hypothermie ou une arythmie pourrait survenir si elles ne sont pas détectées à temps. Les derniers micro-prélèvements de sang sont réalisés dans la veine caudale, à l’extrémité de la queue, sur les animaux vigiles et non contraints. Ces micro-prélèvements, d’une durée de 1 à 2min, sont indolores mais peuvent être stressant pour quelques animaux qui peuvent manifester leur impatience ou inconfort. Un maximum de 10 micro-prélèvements de sang seront réalisés sur une durée maximum de 24h. D’autre part, une toxicité imprévue d’un candidat-médicament pourrait être mise en évidence et entrainer l’arrêt immédiat de la procédure.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale afin de recueillir les échantillons nécessaires aux analyses.

Remplacement

Les candidats médicaments auront été sélectionnés préalablement lors des tests in vitro pour leur activité et leur innocuité sur les modèles cellulaires, ainsi que pour leur caractéristiques pharmacochimiques (solubilité, stabilité plasmatique et microsomale…). Cependant, tous les essais réalisés ne peuvent prédire avec exactitude l'activité d'un médicament car aucun modèle alternatif (bio-informatique, moléculaire et/ou cellulaire) n’est suffisamment intégré et complexe pour reproduire l’ensemble des phénomènes biologiques impliqués dans l’absorption, distribution, la dégradation et l’élimination des médicaments. Ces phénomènes biologiques sont liés à la circulation sanguine, aux barrières biologiques et aux voies d'élimination (dégradation par le foie, élimination biliaire et rénale...) et régulent l’activité des médicaments. Pour ces raisons, une approche chez l’animal reste indispensable pour sélectionner les candidats-médicaments les plus prometteurs avant de poursuivre leur développement. La mesure de la concentration sanguine en fonction du temps sera réalisée chez le rat, car c’est l’espèce la plus utilisée pour cette approche dans le cadre du développement des candidats-médicaments.

Réduction

La procédure développée et validée permet la réalisation de micro-prélèvements de sang répétés chez un même animal. Cela permet de réduire drastiquement le nombre d’animaux utilisés pour la détermination de la pharmacocinétique. Elle est effectuée par un technicien rompu à ces manipulations, ce qui garantit une excellente reproductibilité et de limiter encore le nombre d’animaux engager dans les études. Nous avons montré que la procédure expérimentale parfaitement maîtrisée permet une mesure efficace de la pharmacocinétique d’un candidat-médicament à l’aide de trois animaux pour un candidat médicament.

Raffinement

La procédure expérimentale est conçue pour garantir le bien-être de l’animal et réduire au maximum l’inconfort, le stress et la souffrance de l’animal. Le rat étant un animal social, les rats seront maintenues par groupes sociaux dans des cages enrichies de tubes en carton et de bâtonnets à ronger. Une période d'aclimatation et d'habituation d'une semaine sera respéctée. Les rats seront anesthésiés le temps de la perfusion pour éviter tous risque de blessure et assurer une perfusion efficace et parfaitement repoductible. Le rat sera placée sur un tapis chauffant afin de prévenir une hypothermie durant l’anesthésie. Les micro-prélèvements de sang sont indolores et réalisés sur les animaux vigiles et non contraints a même de signifier librement tout manquement à leur bien-être. Les animaux seront particulièrement surveillés après l’administration des candidats-médicaments pour visualiser tous signes de toxicité imprévue qui seraient immédiatement suivi de l’arrêt de la procédure.

Choix des espèces

Les rats permettent l’étude des cibles thérapeutiques et des candidats-médicaments et sont suffisamment gros pour qu'une perfusion soit réalisée avec des volumes et des débits comparables à ceux utilisés chez les patients en clinique (0,25 à 2ml/kg/h). Les rats auront minimum 6 semaines, stade adulte, pour débuter les protocoles, car les systèmes immunitaires, nerveux et circulatoires sont matures.