Procédures modérées

4 680 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Il s'agit d'élever et de faire se reproduire par fécondation in vitro une lignée porteuse d'une forme de nanisme, les femelles recevant des hormones de superovulation puis étant tuées pour prélever leurs ovocytes, les mâles étant tués pour leur sperme. Les animaux porteurs de la mutation expriment eux-mêmes un phénotype pathologique avant d'être sacrifiés. Le porteur affirme que le projet "ne peut pas se faire sans modèle animal" pour valider un futur traitement, et décrit le choix du rongeur par son faible coût de reproduction.

Objectifs

Le but de ce projet est de produire des lots par fécondation In Vitro (FIV), après maintien et superovulation d'un modèle murin de dysplasie spondyloépiphysaire congénitale (lignée SEDc). la collagénopathie de type 2 la plus fréquente. Ces lots seront utilisés afin de développer un traitement contre cette maladie. La SEDc est une dysplasie osseuse génétique qui cause une forme rare de nanisme chez l'être humain (1 naissance sur 100 000). Elle est caractérisée phénotypiquement par une petite taille avec un raccourcissement du tronc et du cou, induisant un risque important d'instabilité au niveau des vertèbres cervicales pouvant provoquer une paralysie. Les patients souffrent également d'anomalies au niveau de la rétine et d’une perte d'audition. Cette pathologie est due à des mutations perte de fonction dans le gène du collagène de type 2.

Bénéfices attendus

Ce projet aura des bénéfices pour l’homme à plusieurs niveaux. Actuellement, il n’existe pas pour cette maladie de traitements qui restaurent une croissance osseuse et qui permette donc aux patients de grandir mais surtout qui élimine les complications dues à cette pathologie. Ce projet pourra donc offrir à long terme des solutions thérapeutiques pour soigner cette maladie. De plus, cette maladie étant encore peu connue, ce projet permettra à court terme de mieux comprendre sa physiopathologie grâce au modèle de souris malades.

Procédures

Les femelles seront injectées avec des hormones qui vont stimuler leurs production d’ovocytes. Ces femelles seront ensuite euthanasiées pour récupérer les ovocytes. Ils seront utilisés pour une FIV avec du sperme récolté à partir d'un mâle qu'il est nécessaire de mette à mort également.

Impact sur les animaux

Avant de réaliser les injections d'hormones et de sacrifier les animaux pour prélever les ovocytes et le sperme, les souris SEDc seront hébergés pendant une à deux semaines et pourront exprimés un phénotype plus ou moins modéré. Ensuite, les femelles de ce projet seront injectées avec des hormones puis seront euthanasiées afin de prélever les ovocytes qui serviront pour les FIV. Les mâles seront également sacrifiés pour prélever le sperme. Avant le prélèvement de sperme et d’ovocytes, une attention particulière sera apportée à chacun des animaux qui seront surveillés quotidiennement. Les animaux seront évalués sur leur aspect physique, leur comportement et leur poids selon une grille d’observation spécifique à ce projet.

Devenir

Tous les animaux seront sacrifiés pour prélever les ovocytes et le sperme afin de réaliser des fécondations in vitro.

Remplacement

Ce projet ne peut pas se faire sans modèle animal car avant de pouvoir envisager un traitement, et de commencer une étude clinique sur les patients souffrant de SEDc, il est nécessaire de démontrer que les molécules choisies ont l'effet attendu au niveau du modèle animal de la maladie et qu'elles ne présentent pas d'effets toxiques majeurs.

Réduction

Les protocoles sont réalisés en fonction des besoins finaux. Le nombre d’animaux est calculé selon les protocoles expérimentaux de manière à obtenir le minimum d’animaux par groupe permettant des résultats significatifs et homogènes. Des analyses statistiques ont pour cela été utilisées. De plus, et afin d'optimiser les rendements de la superovulation et des FIV, la dose optimale et l'âge des femelles ont préalablement étés définis pour chaque souche en effectuant des injections préliminaires dose-réponse et par expérience.

Raffinement

Les points limites sont observés pendant toute la durée du projet. Une surveillance des animaux est faite quotidiennement pour déceler tout signe clinique anormal. L’observation est basée sur l’utilisation d’une grille d’évaluation spécifique au modéle. Les animaux sont hébergés en groupe dans des cages contenant un enrichissement minimum (bâtons de bois et matériel de nidification).

Choix des espèces

Le répertoire comportemental des rongeurs correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système moins développé. De plus, les rongeurs sont des modèles animaux simples à élever, relativement peu coûteux à reproduire et à entretenir en grand nombre ainsi qu’à manipuler et modifier génétiquement comparativement à d’autres espèces. Ils sont un modèle de choix pour les études précliniques en raison de leur petite taille, de leur courte gestation, de leur durée de vie et de la disponibilité en réactifs expérimentaux. Le génome des souris est largement bien caractérisé et très comparable au génome humain. Enfin, la proximité clinique entre les modèles de rongeurs génétiquement modifiés et les maladies humaines fait de celui-ci un modèle de choix fiable pour extrapoler les résultats et en tirer des résultats valables pour la pathologie humaine. L’âge des animaux est conditionné par les demandes et les objectifs scientifiques du projet. Nous utiliserons pour ce projet des femelles âgées de minimum 3 semaines pour les donneuses d'ovocytes (idéalement de 3 à 6 semaines) et des mâles de plus de 10 semaines pour les donneurs de sperme.

640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent du lithium et diverses molécules par gavage, injection intrapéritonéale, croquettes enrichies ou minipompe implantée sous la peau, avec passages en cage à métabolisme et injection rétro-orbitaire, avant d'être tuées pour analyse des reins. Le projet cherche à comprendre la toxicité rénale du lithium, que le porteur qualifie de traitement "incontournable" du trouble bipolaire. Les atteintes possibles décrites vont de la soif intense à la douleur liée aux injections et aux implantations chirurgicales.

Objectifs

Le trouble bipolaire est une affection à la fois fréquente, touchant 1 à 4% de la population mondiale, et grave, puisque les accès maniaques et dépressifs engagent le pronostic vital en raison du risque suicidaire. Le traitement le plus efficace à ce jour est le Carbonate de Lithium. Cette efficacité incontestée est contrebalancée par des effets secondaires à long terme, et en particulier rénaux. Ceux-ci se manifestent d’abord par une incapacité à concentrer les urines et donc une soif intense, puis à plus long terme par une insuffisance rénale avec l'apparition de microkystes rénaux, pouvant évoluer vers l’insuffisance rénale terminale. Le mécanisme impliquerait un type de cellules particulières du rein, les cellules principales du canal collecteur responsables de l'équilibre de l'eau et du sel, et donc du milieu intérieur, dans l'organisme. Les données de la littérature ont montré une prolifération de ces cellules suite à une exposition à doses thérapeutiques au lithium. Cette prolifération semble médiée par le GDF15, facteur de croissance précédemment connu du laboratoire pour son effet en situation d’acidose. Notre projet vise à déterminer in vitro (sur des cultures cellulaires, dont sphéroïdes 3D) et in vivo sur un modèle d’exposition à long terme (jusqu’à 6 mois) le rôle et les mécanismes de la prolifération de ces cellules dans la progression vers l’insuffisance rénale. L’objectif de ce projet est ainsi de mieux comprendre la toxicité rénale du lithium et de mettre en évidence des pistes thérapeutiques préventives et curatives sur un modèle expérimental avant le développement d’essais cliniques.

Bénéfices attendus

Il s’agit d’un projet original de recherche fondamentale dans le domaine de la physiopathologie. Il vise à élucider certains mécanismes qui sous-tendent la toxicité rénale d’un traitement incontournable de la maladie bipolaire et de proposer des traitements préventifs.

Procédures

Un groupe de 80 souris sera soumis à une mise en cage métabolique pendant une durée de 4heures, chez un animal vigile, à 15 jours, 1 mois, 3 mois et 6 mois du début de la procédure : soit 4 fois par souris. Ces mêmes souris seront soumises à une mesure de DFG : injection rétro-orbitaire de FITC-inuline sous anesthésie à l'isoflurane, puis prélèvements microcapillaires à la queue à 3, 7, 10, 15, 20, 40 et 60 minutes, qui seront réalisées à 1 mois, 3 mois et 6 mois, soit 3 fois par souris. Un groupe de 40 souris sera soumis à un gavage gastrique de mubritinib sur animal vigile quotidien pendant 4 semaines. Un groupe de 40 souris sera soumis à une injection intrapéritonéale de canertinib sur animal vigile quotidienne pendant 4 semaines. Enfin, un groupe de 80 souris sera soumis à une intervention chirurgicale consistant à la pose de minipompes osmotiques sous-cutanées sous anesthésie générale (réalisée par injection intrapéritonéale) : une pose par souris. Les minipompes seront laissées pendant une durée de 4 semaines. Enfin, 400 souris seront nourries par des croquettes enrichies en médicaments données au long cours aux humains (amiloride et lithium) sans autre intervention que le prélèvement d'urines par simple contention et la surveillance de la prise de boissons, d'aliments et du poids.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables des interventions sont connus car déjà testés chez l'animal et utilisés chez l'homme. Le traitement par carbonate de lithium induit une augmentation de la consommation d'eau et de la diurèse ; le traitement par mubritinib peut être responsable d'un inconfort lié au gavage gastrique, il est par ailleurs bien toléré ; le traitement par canertinib peut entraîner du fait de sa voie d'administration des douleurs liées à l'injection intrapéritonéale, il est bien toléré par ailleurs. Le traitement par tolvaptan peut entraîner des douleurs liées à l'implantation sous-cutanée des minipompes. Il est responsable également d'une augmentation de la diurèse et d'une augmentation de la consommation d'eau. La mise en cages métaboliques peut entrainer un stress chez la souris. La mesure du débit de filtration glomérulaire peut entraîner des douleurs au point d'injection du produit.

Devenir

Les souris sont euthanasiées car les prélèvements et analyses sont nécessaires sur les tissus afin d'évaluer l'efficacité des traitements sur l'architecture des reins, la présence de microkystes et de fibrose, et ceci n'est pas possible avec le maintien en vie.

Remplacement

Le projet vise élucider des mécanismes responsables de l’homéostasie cellulaire du rein en réponse à des stimuli physiopathologiques. Ces stimuli sont transduits au niveau de différents tissus/organes en messages hormonaux, humoraux et/ou physiques qui sont perçus par le rein. La réponse rénale quant à elle intègre plusieurs types cellulaires, avec des interactions para et endocrines entre elles. L’analyse d’une telle complexité nécessite de travailler sur des organismes entiers.

Réduction

Pour toutes les procédures expérimentales qui seront mises en oeuvre, le nombre de souris par groupe sera de 10, avec un nombre total de 640 animaux. Ce chiffre correspond à la taille des effectifs établis grâce au calcul du nombre d'animaux nécessaires pour que les tests statistiques soient interprétables.

Raffinement

Afin de réduire au maximum la souffrance des animaux, nous prévoyons de mettre en place des critères d’interruption des procédures expérimentales basés sur des paramètres non invasifs représentatifs de l’évolution de la pathologie tels que la mesure de la variation du poids corporel (Perte de poids de plus de 10 % par rapport à la dernière pesée), la pression artérielle et la surveillance quotidienne du comportement des animaux (paralysie des membres postérieurs, epistaxis, animal prostré, ne bougeant plus). La procédure en cage métabolique concernant la plus faible proportion de souris possible, et sera réalisée après habituation des souris à la procédure sur une très courte période (6h). Enfin, pour limiter la douleur dans la procédure de mesure du débit de filtration glomérulaire (procédure 6), la sédation à l’isoflurane est privilégiée.

Choix des espèces

L’intérêt d’utiliser des souris pour cette procédure est que nous maîtrisons la transgénèse chez ces animaux, et que les modèles transgéniques sont déjà disponibles, sans nécessité de nouveaux élevages et croisement dans une autre espèce. Les expériences sont réalisées chez des souris adultes de 8 semaines pesant 25-30g au début de l’expérimentation. L’âge adulte est nécessaire pour que la néphrogénèse soit totalement terminée. Les animaux sont étudiés jeunes car une exposition longue (6 mois) est prévue dans un groupe d’étude.

2 300 xénopes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Un centre de ressources les produit et les élève pour approvisionner des laboratoires, injectant des hormones à 1 900 femelles pour stimuler la ponte et pratiquant sur 400 autres jusqu'à quatre laparotomies pour prélever des fragments d'ovaire. Les femelles hormonées peuvent être réutilisées, celles opérées à répétition étant ensuite réutilisées pour l'enseignement ou tuées. Le porteur revendique le xénope comme "organisme modèle de choix" et met en avant sa longévité, jusqu'à trente ans, comme argument de réutilisation.

Objectifs

La plateforme est au service de la communauté scientifique travaillant avec le modèle xénope. Elle reprend les activités du Centre de Ressources Biologiques Xénopes qui servait près de 60 équipes de recherche en France depuis 20 ans. Notre unité d’appui à la recherche a pour mission de fournir des animaux à différents stades de développement (œufs, têtards, juvéniles ou adultes) à la communauté de chercheurs utilisant les modèles xénopes. Pour cela, le centre devra produire, maintenir et élever des animaux propres à la vente. Aucun apport extérieur ne sera réalisé, nous maintiendrons le cheptel minimum nécessaire aux besoins de la communauté. Les animaux pourront être produits par reproduction semi-naturelle ou par fécondation in vitro, pour lesquelles des injections d'hormones chez la femelle sont nécessaires. Ces hormones stimulent la ponte et permettent d'obtenir un grand nombre d'oeufs. Par ailleurs, pour répondre aux besoins de certains laboratoires utilisateurs concernant les fragments d'ovaires, il est nécessaire de pratiquer sur les femelles une laparotomie (ouverture de l'abdomen par une incision) sous anesthésie générale. Une fois suturée, les femelles feront l'objet d'une surveillance post-opératoire afin de détecter un éventuel signe de souffance.

Bénéfices attendus

Notre unité d’appui à la recherche a pour mission de fournir des animaux à différents stades de développement (œufs, têtards, juvéniles ou adultes) à la communauté de chercheurs utilisant les modèles xénopes.

Procédures

Puçage (tous) Injection d'hormones (1900) ou prélèvement de fragment d'ovaire par laparotomie (ouverture de l'abdomen par une incision) (400)

Impact sur les animaux

La présence d’un stress est tout de suite visible par l’émission de venin par les glandes épithéliales. Dans ce cas l’expérience est arrêtée immédiatement et l’animal est mis en observation. Après manipulation, les femelles retournent en stabulation dans les animaleries. Le personnel animalier s’assure que l’animal a pleinement recouvré son état de santé et de bien-être général. En cas de comportement anormal (perte de poids rapide ou progressive de au moins 20%, état de choc associé à de la prostration, nage anormale, lésions ou changement de couleur de la peau entraine la mise à mort de l'animal), le responsable du bien-être des animaux fait intervenir le vétérinaire référent pour décider de la marche à suivre (administration d’analgésiques pour soulager la douleur, ou décision d’euthanasie si l’état ne s’améliore pas au bout de 4 jours).

Devenir

Les femelles xénopes issues de la procédure 1 pourront être réutilisées dans un autre projet ou à des fins d'enseignement : en effet, la durée de vie de ces animaux est très longue (jusqu'à 30 ans) Les femelles issues de la procédure pourront, après avoir subi 4 laparotomies, être réutilisées à des fins d'enseignement ou seront euthanasiées.

Remplacement

les applications des recherches réalisées sur les xénopes nécessitent des observations sur un tissu ou individu entier. Il n’existe pas de modèle mathématique ou in vitro et pour certaines investigations, le xénope s’avère être le modèle le plus adapté (biotechnologies spécifiques disponibles uniquement chez ce modèle).

Réduction

Pour réduire le cheptel nécessaire aux différents besoins de nos utilisateurs, nous pourrons : 1) mutualiser les commandes pour que cela ne nécessite qu’une seule manipulation 2) opérer 3 à 4 fois maximum un seul individu (opérations espacées de quelques mois) et ensuite le destiner à des fins d’enseignement. 3) faire correspondre les pontes demandées par nos utilisateurs au renouvellement des stocks d’individus dans l’animalerie.

Raffinement

Les animaux seront hébergés et élevés dans une animalerie agréée et les procédures seront optimisées. Tout est mis en œuvre pour enrichir le milieu et améliorer le bien-être animal (ne pas isoler longtemps un animal, cacher des aliments “bonus” pour satisfaire leur instinct de recherche de nourriture, installation de cachette). Lors des chirurgies, la douleur sera prise en charge par l'utilisation d'anesthésiques et d'analgésiques appropriés.

Choix des espèces

Le xénope est un organisme modèle de choix pour l’étude des processus biologiques. Il a par exemple contribué de manière déterminante à la compréhension des mécanismes qui sous-tendent le développement embryonnaire. Il fait partie d’une sélection de modèles pour lesquels les approches de génomique fonctionnelle sont réalisables. Par ailleurs, pour l’étude fonctionnelle de canaux ioniques, de récepteurs ou transporteurs, le modèle xénope est très intéressant car les ovocytes sont capables d’exprimer de nombreuses protéines qu’il est ensuite aisé de caractériser grâce, entre autre, à des méthodes d’électrophysiologie. Outre ces caractéristiques, il est facile à élever et à maintenir en laboratoire et des pontes peuvent être obtenues à demande. Les embryons sont nombreux et robustes. Le développement externe permet des analyses non invasives dès la fécondation et à tous les stades. Pour pouvoir obtenir des pontes les animaux utilisés sont des animaux matures sexuellement âgés de 2 ans environ pour X. laevis et 6 mois pour X. tropicalis (le temps de développement de cette espèce est plus rapide).

Livrées "supposées gestantes" au deuxième jour de gestation, 4 664 rates vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour provoquer chez elles une prééclampsie, une hypertension de la grossesse, et tester sur elles des traitements. Elles subissent une chirurgie, la pose d'une pompe osmotique sous la peau ou la ligature des artères utérines, 18 heures en cage à urine, douze jours de mesures quotidiennes de la pression par brassard à la queue, une méthode que le porteur dit "légèrement stressante", et des injections sous-cutanées quotidiennes pendant quatre à douze jours ou une injection intraveineuse. Toutes sont tuées au CO2 dans le dernier tiers de leur gestation, pour récupérer leur sang par ponction cardiaque, leurs fœtus, leurs placentas et leurs reins. Le porteur affirme qu'il est "indispensable de mener cette étude in vivo au niveau d'un organisme entier", aucune méthode in vitro ne reproduisant selon lui la prééclampsie.

Objectifs

La prééclampsie est une maladie qui survient pendant la grossesse et qui provoque une hypertension artérielle chez la mère. Les complications pouvant être graves pour la mère et le fœtus, la prééclampsie peut nécessiter le déclenchement prématuré de l’accouchement, entraînant des risques potentiels pour le nouveau-né. Les femmes ayant souffert de prééclampsie et les adultes nés prématurément ont un risque augmenté de maladies cardiovasculaires. Il n’existe pas de traitement spécifique de la prééclampsie. Des études cliniques ont mis en évidence une augmentation (avant même le diagnostic) de la vasopressine (ou AVP) et une diminution de l’apeline circulant dans le sang des mères atteintes de prééclampsie, suggérant fortement que l'AVP et l'apeline jouent un rôle dans le développement de la maladie. De plus, des études chez le rongeur suggèrent un rôle spécifique d’un récepteur, le V2R, dans la maladie et montrent que l'administration préventive d'apeline améliore les symptômes liés à la prééclampsie. Le premier objectif sera donc de comprendre le rôle de l'AVP et de l'apeline dans la physiopathologie de la prééclampsie chez le rat. Pour cela, i) nous évaluerons le rôle de chacun des récepteurs de l'AVP dans la prééclampsie en comparant le modèle préexistant par infusion d'AVP (qui active les trois récepteurs de l'AVP) à un nouveau modèle par infusion de dDAVP (qui a une affinité très élevée pour le V2R), et ii) nous étudierons le rôle du récepteur de l'apeline dans la prééclampsie en utilisant l'antagoniste MM 54, et nous décrirons le rôle de chaque ligand endogène du récepteur de l'apeline. Le second objectif sera d'évaluer le potentiel impact thérapeutique d’un antagoniste du V2R ou/et d’un agoniste du récepteur de l'apeline chez le rongeur atteint de prééclampsie. Pour ce faire, nous utiliserons des peptides qui ne traversent pas la barrière placentaire, c’est-à-dire sans risque pour le fœtus, et qui présentent une haute affinité et une sélectivité absolue pour le V2R ou le récepteur de l'apeline.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de mieux comprendre la physiopathologie de la prééclampsie qui demeure, à ce jour, incertaine. En particulier, ce projet va clarifier le rôle des récepteurs de la vasopressine et l’apeline dans la prééclampsie. Malheureusement, il n’existe pas de traitement spécifique de la prééclampsie, ce qui nécessite le déclenchement prématuré de l’accouchement, entraînant des risques potentiels pour le nouveau-né. Ce projet va donc chercher à développer une stratégie thérapeutique contre la prééclampsie.

Procédures

Les animaux seront soumis à une seule intervention chirurgicale qui consistera soit en une intervention courte de 5-10 minutes de pose d’une pompe osmotique sous-cutanée soit en une intervention plus longue de 20 minutes de ligature des artères utérines. Les animaux seront également soumis à un seul prélèvement urinaire qui aura lieu durant 18 heures dans des cages spéciales permettant de recueillir les urines. Les animaux seront aussi soumis à un enregistrement de la pression artérielle par une méthode non-invasive (une fois par jour pendant 30 minutes maximum) durant une période de 12 jours consécutifs. Enfin les animaux seront soumis soit à des injections sous-cutanées répétées (une fois par jour) s’étalant sur 4 à 12 jours maximum, soit à une seule injection intraveineuse.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables relatifs aux chirurgies (implantation d’une pompe osmotique sous-cutanée ou ligature des artères utérines) sont potentiellement une douleur relative à la chirurgie, une infection et/ou une mauvaise cicatrisation au niveau du site chirurgical. Ces effets débuteront lors de la chirurgie, soit 7 jours après la livraison des rates gestantes, et ne devront pas s’étendre au-delà de 72h après la chirurgie. Pour éviter ces effets indésirables la zone sera désinfectée abondamment avec de la Vétidine, un analgésique local injectable sera appliqué au niveau du site chirurgical (Lidocaïne/Laocaïne) et un antidouleur global à action diffuse par voie sous-cutanée (Buprénorphine) sera injecté. Cependant, si une infection est décelée et perdure au-delà de 72h, l’animal sera exclu de l’étude et pris en charge par le vétérinaire de l’installation. Les effets indésirables relatifs au geste quotidien d’injections sous-cutanées sont potentiellement une douleur au niveau du site d’injection et un stress lié à la contention des animaux. Ces effets débuteront 7 jours après la livraison des rates gestantes jusqu’au dernier tiers de leur gestation. Pour éviter ces effets indésirables i) une pommade analgésique local sera appliquée, au préalable, sur le site d’injection, ii) la localisation du site d’injection variera quotidiennement et iii) les injections seront faites dans une pièce au calme sans passage. Les effets indésirables liés aux molécules administrées (inhibiteur de nitrique oxyde synthase, antagoniste du récepteur de l’apeline, AVP, dDAVP, antagoniste du récepteur de l’AVP, agoniste du récepteur de l’apeline) sont décrits dans la littérature et dans nos précédentes études « preuve de concept » et de « toxicité ». Les doses sélectionnées dans ce projet ont été choisies afin de ne pas induire d’effets indésirables chez les animaux.

Devenir

Les rates seront mises à mort durant le dernier tiers de leur gestation par euthanasie gazeuse au CO2 à la fin de chacune des procédures expérimentales afin de récupérer du sang par ponction cardiaque et des tissus d’intérêts (fœtus, placentas, reins) pour des analyses complémentaires.

Remplacement

Nous avons étudié in vitro des molécules d’intérêts pour traiter la prééclampsie (antagonistes du récepteur de l’AVP de type 2 et agonistes du récepteur de l’apeline) afin de sélectionner le plus petit nombre possible de molécules à tester in vivo. Il est indispensable de mener cette étude in vivo au niveau d’un organisme entier car il n’existe pas de modèle in vitro de prééclampsie et car cette étude s’inscrit dans le cadre d’une phase préclinique d’un nouveau traitement d’une pathologie chez l'Homme.

Réduction

Le projet s’intéresse au développement de la préécleampsie dont le paramètre caractéristique est la pression artérielle. Or, la pression artérielle est un paramètre très variable. De ce fait, le nombre minimum d’animaux par groupe calculé afin d’obtenir la puissance statistique nécessaire s’élève à 8 rongeurs par condition différentes. Une des procédures expérimentales a pour but de mesurer la capacité des molécules d’intérêt à passer la barrière materno-fœtale et donc de sélectionner les molécules non-toxiques pour l’embryon, c’est-à-dire celles ne franchissant pas cette barrière. Les résultats sont considérés comme statistiquement significatifs à partir de 5 rongeurs par type d’analyse pour cette procédure. Pour réduire le nombre d’animaux, les doses de molécules thérapeutiques qui vont être étudiées ont été sélectionnées grâce à des études in vitro et in vivo antérieures afin d’être réduites à leur stricte minimum. De plus, nous allons essentiellement réaliser notre étude sur des modèles déjà publiés et bien décrits dans la littérature de prééclampsie, ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux à utiliser pour la mise au point de modèles. Enfin, si une des doses de molécule étudiée parait adéquate, toutes les doses indiquées ne seront pas nécessairement testées afin de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Dès leur arrivée, les animaux seront hébergés en groupe dans un milieu enrichi pendant 7 jours. Une surveillance quotidienne des animaux par des personnes habilitées et formées sera effectuée. Pour réduire ou supprimer la douleur et le stress relatifs aux administrations sous-cutanées quotidiennes, une pommade analgésique sera appliquée localement sur le site d’injection, la localisation du site d’injection variera quotidiennement et les injections seront réalisées dans une pièce au calme sans passage. Afin de diminuer la douleur occasionnée par les chirurgies, une analgésie locale injectable par voie sous-cutanée (laocaïne) sera utilisée accompagnée par un analgésique global à action diffuse par voie sous-cutanée (buprénorphine). Pendant toute chirurgie, les animaux seront placés sur une plaque chauffante à 37°C, leur rythme respiratoire sera observé avec attention, et ils seront réhydratés avec du sérum physiologique. À leur réveil, les animaux seront remis dans une cage propre en groupe dans un milieu enrichi et étroitement surveillés. Pour réduire ou supprimer la douleur relative aux enregistrements de pression artérielle, nous utiliserons une méthode non-invasive qui consiste à mesurer la pression artérielle et le rythme cardiaque des rongeurs à l’aide d’un brassard placé au niveau de la queue des rongeurs. Cette méthode non-invasive est toutefois légèrement stressante pour l’animal. Pour réduire ou supprimer le stress relatif à cette méthode nous entrainerons donc les animaux quotidiennement entre le treizième jour et le vingtième jour de gestation pendant un temps n’excédant pas 30 minutes par jour. Enfin, bien qu’il n’y ait pas, à priori, de douleur, de souffrance et d’angoisse associées à l’administration des composés, une étroite surveillance quotidienne des animaux sera réalisée à l’aide d’une grille de scoring associée.

Choix des espèces

Le rat est une espèce pertinente pour l’étude de la prééclampsie car plusieurs modèles préexistants ont déjà été publiés et sont largement décrits. De plus, nous avons déjà étudié chez le rat dans des études « preuve de concept » et dans des études de « toxicité » les molécules d’intérêts que nous souhaitons utiliser pour traiter la prééclampsie. Les animaux utilisés seront des rates gestantes. Les rates seront commandées et livrées supposées gestantes au deuxième jour de gestation. Les rates seront ensuite utilisées 7 jours après leur livraison, soit entre le neuvième jour et le vingtième jour de gestation, c’est-à-dire jusqu’au dernier tiers de leur gestation.

7 440 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent des composés candidats et des agents inducteurs par diverses voies pendant deux semaines, avec des prélèvements sanguins sous anesthésie, avant d'être tués pour prélever des tissus. Le projet vise à cribler de nouvelles molécules anti-inflammatoires dans le cadre d'un programme de recherche pharmaceutique. Le porteur annonce peu de signes cliniques hormis des inflammations locales, et affirme que le recours au modèle animal est "indispensable" une fois les molécules validées in vitro.

Objectifs

On dénombre environ 80 maladies immuno-inflammatoires telles que le psoriasis, la sclérose en plaques, la polyarthrite rhumatoïde, le lupus et les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. On estime que 5 à 8% de la population mondiale est touchée par une maladie auto-immune, caractérisée par une réponse inadaptée du système immunitaire qui se retourne contre les propres tissus du patient. Notre programme de recherche vise à découvrir des molécules qui agissent via des mécanismes d’action innovants et qui peuvent ainsi représenter des options thérapeutiques pour tous les patients.

Bénéfices attendus

L’objectif ultime est de pouvoir supprimer spécifiquement le mécanisme à l’origine d’une maladie auto-immune, sans impacter le bon fonctionnement du système immunitaire. Ces nouvelles molécules fourniront aux patients des thérapies anti-inflammatoires et immunomodulatrices ciblées qui pourront grandement améliorer leur qualité de vie.

Procédures

Dans ce projet, les animaux recevront des agents biologiques et composés par diffrentes voies d'administration définies par la réglementation. L'administration des composés (durée = 1 min/animal) se fera 1 à 2 fois par jour sur une durée de maximale de 2 semaines. L'induction avec des agents biologiques (durée = 1 min/animal) se ferra 1 à 2 fois au cours de l'étude de 2 semaines. Un à deux prélèvements sanguins seront également effectués sur animaux préalalement anesthésiés (durée = 2-3 min/animal) pour suivre la pharmacocinétique des composés testés sur l'ensemble de l'étude de 2 semaines.

Impact sur les animaux

Les animaux ne développeront pas de signes cliniques notoires hormis des inflammations locales légères.

Devenir

Les animaux seront anesthésiés puis euthanasiés pour collecte de tissus

Remplacement

L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes pathogéniques, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, tester l’efficacité et la toxicité de thérapies anti-inflammatoires et immunomodulatrices innovantes. L’ensemble de nos molécules ont préalablement été testées et validées in vitro.

Réduction

Nous utilisons des modèles établis dans la littérature que nous utilisons en routine dans notre établissement utilisateur depuis 5 ans. Une analyse statistique rétrospective a permis de calculer le nombre nécessaire et suffisant d'animaux par groupe pour obtenir une distribution normale et présentent une variabilité acceptable. Afin de générer des résultats reproductibles et de limiter la variabilité intergroupe au seul effet du paramètre testé, nous veillerons à travailler sur des groupes les plus homogènes possibles au moment de leur inclusion dans l’étude.

Raffinement

Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 5 jours sera réalisée avant l'entrée en étude et leur environnement sera enrichi avec du materiels de nidification. Afin de pallier l'inconfort lié aux procédures, un programme d'anesthésie sera envisagé. Des analgésiques seront utilisées en cas de signes de douleur. Afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, une surveillance journalière et des points limites précoces et spécifiques aux modèles ont été établis conduisant à l’arrêt temporaire des traitements ou au sacrifice anticipé de l’animal

Choix des espèces

Les espèces animales utilisées dans le cadre de ces recherches sont la souris et le rat. Les différents modèles seront mis au point, sur la base de la littérature et sur des modèles déjà bien documentés afin d’éviter l’utilisation d’un nombre excessif d'animaux pour les mises au point. En accord avec la littérature pour les différents modèles, les animaux seront utilisés au stade adulte afin d’évaluer les composés à visée anti-inflammatoire, sur un système immunitaire mature.

5 000 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent dans leur alimentation des mycotoxines puis des additifs censés en neutraliser les effets, avec une prise de sang en fin d'étude et une mise à mort pour prélever sang, contenus intestinaux et organes. Le porteur décrit des atteintes possibles aux yeux, au système digestif, au foie et aux reins, une nage anormale et une perte de poids. Il affirme qu'il est "indispensable" de tester ces additifs sur l'espèce destinataire pour en démontrer l'efficacité auprès de l'autorité européenne, la finalité restant la performance des élevages.

Objectifs

Le projet s'étend sur 5 années dans le but de réaliser des études d'efficacité avec des additifs alimentaires considérés comme bénéfiques pour atténuer les effets négatifs des mycotoxines retrouvées dans les régimes alimentaires, afin de permettre aux animaux d'exprimer au mieux leur potentiel de croissance et de maintenir leur immunité et leur bien-être. Les mycotoxines sont produites sur une large variété de denrées alimentaires avant, pendant et après la récolte. Lorsqu’elles sont présentes en trop grande quantité dans l'alimentation des animaux, une fois ingérées par l’animal, elles peuvent s'avérer toxiques, notamment chez les poissons d’élevage et peuvent avoir des conséquences sur leur santé et leurs performances. Les mycotoxines peuvent affecter très négativement les performances zootechniques et la rentabilité économique des élevages. Les mycotoxines, contaminants courants de l'alimentation humaine et animale affectant la santé et le bien-être, sont des métabolites secondaires de faible poids moléculaire secrétés par des moisissures appartenant principalement aux genres Aspergillus, Penicillium et Fusarium. Parmi les centaines de mycotoxines connues, les plus préoccupantes sont les aflatoxines, l’ochratoxine A, les trichothécènes (DON, T-2 toxin), la zéaralénone et les fumonisines. Une des stratégies de prévention aux mycotoxines est l’utilisation d’additifs fixateurs de toxines pouvant être ajoutés à l’aliment afin de réduire l’absorption intestinale des toxines en les liant ou en les transformant en produits moins toxiques. Les enzymes constituent un fixateur de toxines permettant de transformer les mycotoxines en composés moins toxiques conduisant à une amélioration des performances des animaux. Les études in vivo vont faire appel à des procédures expérimentales entrainant notamment l’utilisation de régimes alimentaires contenant des mycotoxines à des teneurs contrôlées afin d’être représentatifs des régimes alimentaires distribués en élevage aquacole. De ce fait, aucun effet négatif supplémentaire sur le bien-être des poissons ne sera engendré. Ces régimes seront distribués afin d’induire des changements sur la performance, l’ingestion, la réponse immune, l’état de santé intestinale, l’utilisation et le métabolisme des nutriments qui serviront à évaluer l’impact des additifs sur les changements induits par les mycotoxines.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront d’identifier et de mieux appréhender le fonctionnement et l’efficacité de molécules à détoxifier des contaminants courants de l’alimentation des animaux et par conséquent à améliorer la nutrition et la santé animale. En effet, l'un des principaux défis de la détoxification des denrées alimentaires et des aliments pour animaux, et en particulier des mycotoxines, est la spécificité de l’additif détoxifiant à éliminer ou à neutraliser efficacement l'effet toxique du contaminant de l'aliment sans produire d'autres métabolites dangereux et, d'autre part, à ne pas altérer et, idéalement, améliorer les valeurs nutritionnelles de l'aliment. Une diversité de réponses physiologiques peut être observée en fonction de la nature des mycotoxines, de leur concentration et des espèces de poissons qui les ingèrent. Ce projet contribuera à caractériser l’efficacité de chaque additif utilisé en prévention aux mycotoxines sur les changements induits an niveau des performances, de l’ingestion, de la réponse immune, de l’état de santé intestinale, et de l’utilisation des nutriments.

Procédures

Prises de sang unitaires au niveau de la veine caudale en fin d’étude (pas plus de 10% du volume sanguin circulant estimé à 40 ml/kg de poids corporel est prélevé en une seule fois, soit 100 µl pour un poids estimé à 250 g)

Impact sur les animaux

Changement comportementaux (nage anormale), morphologqiues et de couleur de la peau. Perte de poids, ralentissement de la croissance en cas de réduction de l'ingestion alimentaire (refus alimentaire) pendant toute la durée de l'étude. Dommages aux niveaux des yeux, du système digestif, hépathique et rénal.

Devenir

A la fin de chaque procédure expérimentale, les animaux sont mis à mort pour le prélèvement d'échantillons biologiques (sang, contenu intestinaux,organes).

Remplacement

La recherche expérimentale mise en oeuvre pour étudier la réponse aux mycotoxines, du groupe des fumonisines ou d'autres groupes, susceptibles d’être présentes dans les rations alimentaires des poissons, nécessite le développement de détoxifiants spécifiques comme les enzymes qui vont entrer dans la composition des aliments afin de réduire ou d’éliminer les effets négatifs des toxines chez les espèces aquatiques. Lors du processus de développement et d’enregistrements de ces additifs alimentaires, il est indispensable de tester l’efficacité des additifs développés sur l’animal auquel il est destiné, cela afin d’en démontrer l’efficacité et l’innocuité auprès de l'autorité européenne de sécurité des aliments (EFSA) qui autorisera la mise sur le marché pour l’alimentation animale dans la catégorie des substances pour la réduction de la contamination des aliments par les mycotoxines pour animaux (code EFSA 1m03). En outre, les données recueillies dans le cadre de cet essai seront utilisées pour développer des stratégies de réduction toxicologique pour les espèces aquatiques.

Réduction

Une analyse statistique, spécifique du produit à tester est réalisée en amont sur la base d’études antérieures afin de déterminer le nombre minimum d’échantillons permettant d’obtenir cette différence significative (puissance de l’expérience) et donc de réduire le nombre d’animaux à utiliser dans les différentes études à venir. De plus, le raffinement appliqué aux études limitera le nombre et la diversité des échantillons prélevés à la seule finalité de l’étude. Selon, le protocole de l’étude, le nombre de traitements, et la distribution normale ou non de la population, un test paramétrique (Fischer ; t-test, etc.), non paramétrique (Kruskal-Walli, etc.) ou une analyse de variance à un ou plusieurs facteurs seront réalisés et suivis d’un test de comparaison multiple (Newman-Keuls, Bonferonni, Duncan, etc.) permettant de classer les moyennes des différents traitements. D’autres méthodes de test statistique sont susceptibles d’être utilisées, en fonction des paramètres étudiés.

Raffinement

Avant toute manipulation (pesée ou prélèvement) au cours d’une étude, les truites arc en ciel sont sédatées à raison de 40 mg de MS-222/L ou/et anesthésiées à raison de 80 mg de MS-222/L et tamponné avec la double quantité de bicarbonate de sodium (BS) Les densités restent inférieures à 80 kg de poissons/m3. La capture et le stress dus à la sortie des bassins pour la pesée par groupe des animaux et pour les prises de sang (approche ventrale) sont réduits par une manipulation délicate des animaux par les applicateurs, un séchage modéré des poissons, le port de gants, l’utilisation d’une mousse humide pour poser l’animal sur le support de contention et d’un point de pression sur le site de prélèvement comme décrit dans le procédure interne « Geste technique sur animaux vivants : prises de sang » qui définit le volume limite de prélèvement sanguin et les périodes de récupération nécessaires. Les conditions d’hébergement des animaux sont définies de telle sorte que la densité des animaux par bassin, les paramètres environnementaux (température…) ou encore la qualité d’eau procurent le maximum de confort aux animaux, et restent supérieurs ou égaux à la législation en vigueur (Arrêté du 01/02/2013). Aucun animal ne reste isolé sans contact visuel ou tactile avec ses congénères.

Choix des espèces

Les additifs alimentaires développés sont destinés à être incorporés dans les aliments destinés aux poissons. Il peut s’agir de la truite qui fait partie de la famille des salmonidés, utilisée comme modèle pour les poissons d’eau froide. Truites : tous les stades du cycle de vie peuvent être utilisés et généralement entre 50 g et 250 g.