Procédures modérées

1 376 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une greffe de cellules tumorales sous la peau, des injections du composé et des prélèvements sanguins, la tumeur étant tolérée jusqu'à un volume de 1 500 mm3, pour tester un nanomédicament censé affamer les cancers. Le porteur précise qu'aucun traitement antidouleur n'est prévu pour ne pas fausser les résultats de l'expérimentation. Sur le remplacement, il affirme qu'il n'existe pas de système alternatif et que ces expériences ont une valeur prédictive supérieure aux tests de laboratoire.

Objectifs

Il s’agit d’un projet visant à évaluer l’efficacité d’un nouveau traitement contre le cancer. Les cellules cancéreuses ont besoin d’un apport continu en nutriments pour leur croissance rapide. Les acides aminés sont essentiels à la survie des cellules cancéreuses. Le traitement que nous développons exploite cette vulnérabilité et a pour but d’affamer les tumeurs en les privant de ces ressources essentielles. En effet, la molécule active de notre médicament est une enzyme, une molécule qui détruit les nutriments en les découpant. Le développement de ces nouveaux médicaments s’appuie sur une technologie novatrice qui permet 1) d’améliorer le temps d’action de l’enzyme (pour affamer la tumeur) et 2) d’être invisible par le système immunitaire, dont le rôle est de préserver l’organisme en détruisant les corps étrangers (pour éviter le rejet du traitement par l’organisme). Des tests réalisés en laboratoire sur des cellules cancéreuses ont montré que notre médicament peut les affamer et donc les éliminer. Cependant une caractérisation plus approfondie de l’efficacité de notre médicament est nécessaire afin de développer un traitement sûr et efficace. Pour ce faire, l’utilisation de modèles animaux est indispensable. Dans ce cadre, les objectifs de ce projet sont : 1) De confirmer l’efficacité anti-tumorale du médicament chez des souris porteuses de tumeur. 2) D’évaluer la capacité du médicament à se localiser dans la tumeur (à trouver son site d’action). 3) De démontrer la capacité de notre médicament à échapper à sa destruction par le système immunitaire.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans le processus de développement de nouveaux médicaments. Les études précliniques (tests en laboratoire et sur animaux) sont des étapes fondamentales avant de pouvoir administrer un nouveau médicament à l’Homme. Les résultats attendus lors de ces expériences devraient confirmer l’efficacité anti-tumorale de nos nouveaux médicaments et nous permettre de sélectionner le type de cancer pour lequel le traitement sera le plus efficace. De plus, en démontrant que nos médicaments sont efficaces et échappent à la surveillance du système immunitaire, nous validerons notre procédé de production de nouveaux médicaments. Cette validation permettra d’ouvrir de nombreuses possibilités quant au développement de futures thérapies utilisant cette stratégie.

Procédures

Ce projet requiert l’utilisation de deux modèles murins : des souris sans système immunitaire (1-3, 5) et des souris avec système immunitaire (4-7). Les gestes réalisés seront les suivant : 1) Greffe sous-cutanée de cellules tumorales (10-15 secondes / souris). Ce geste sera réalisé sur des animaux vigiles, 1 seule fois durant le temps de l’étude. Le nombre d’animaux concernés est entre 672 et 1104 (min-max). 2) Injection intra-tumoral d’un agent antinéoplasique (5-10 secondes / souris). Ce geste sera réalisé sur des animaux vigiles lorsque le volume tumoral aura atteint la taille souhaitée. Ce geste sera réalisé une seule fois durant le temps de l’étude. Le nombre d’animaux concernés est entre 480 et 768 (min-max). 3) Mesure de la taille des tumeurs (20 - 30 secondes). La croissance des tumeurs sera suivie par mesure au pied à coulisse sur les animaux vigiles. Ces mesures seront réalisées 2 fois par semaines pendant la durée de l’étude. Le nombre d’animaux concernés est entre 672 et 1104 (min-max). 4) Injection intra-péritonéale de l’enzyme (3 secondes). Ce geste sera réalisé sur des animaux vigiles. Deux injections seront réalisées par souris, espacées de 14 jours. . Le nombre d’animaux concernés est entre 120 et 264 (min-max). 5) Injection intraveineuse d’un agent anti-tumoral (20-30 secondes). Ce geste sera réalisé sur des animaux vigiles. Une seule injection par souris sera réalisée sur la durée de l’étude. Les deux modèles murins utilisés dans notre étude sont concernés. Le nombre de souris sans système immunitaire nécessaire est entre 96 et 240 (min-Max), et celui avec système immunitaire entre 120 et 264 (min-max). 6) Prélèvements sanguins dans la veine caudale (30 secondes). Ce geste sera réalisé sur des animaux vigiles. Un maximum de trois prélèvements par souris sera effectué sur l’ensemble de la durée de l’étude. Les volume et fréquence de prélèvements sanguins ont été établis de manière à ne pas prélever plus de 20% du volume sanguin total de la souris sur une durée de 2 semaines. Le nombre d’animaux concernés est entre 128 et 272(min-max). 7) Imagerie par SPECT/CT (20 minutes). Ce geste sera réalisé sur des animaux préalablement anesthésiées par inhalation de 4% d’isoflurane dans une boite à induction puis de 2,5% au masque. L’acquisition des images sera réalisée à différents temps après injection du nanomédicaments : 4h, 24h, 3 jours, 7 jours, 10 jours et 15 jours. Le nombre d’animaux concernés est entre 96 et 240 (min-max).

Impact sur les animaux

Tout au long du déroulement des expériences précédemment décrites, une observation systématique de l’état clinique des animaux sera réalisée par les animaliers ou l’expérimentateur. L’évolution de la taille des tumeurs sera notamment suivie. Le volume tumoral maximal toléré de 1500 mm3 n’induit pas de problèmes de locomotion ou de contrainte mécanique chez la souris. La tumeur est située en sous-cutanée sur le flanc de l’animal. La manipulation de l’animal n’implique pas de palpation de la tumeur mais simplement une mesure au pied à coulisse, minimisant ainsi la douleur. On détermine la longueur (L, en mm) puis la largeur de la tumeur (l, en mm), le volume tumoral et alors calculé selon la formule suivante : volume en mm3 = Lx(lxl)x0,52. Au-delà d'un volume tumoral de 1500 mm3, l’expérience sera arrêtée. Il n'y a pas de douleur prévisible associée à ce protocole expérimental d'injection de lignées cellulaires en sous-cutanée. Concernant les études d’immunisation des souris, nous appliquerons des protocoles établis et décrit dans la littérature. Il n’y a pas de douleur prévisible associée à cette procédure expérimentale d’immunisation.

Devenir

Lorsque les expériences seront terminées, les animaux ne pourront pas être gardés. Dans le respect de la réglementation, la fin de vie des animaux sera induite de manière réglementaire par insufflation progressive de CO2 ou par dislocation cervicale à la suite d’une anesthésie/analgésie chimique.

Remplacement

Dans les processus de développement des médicaments, les études de validation d’un nouveau composé jouent un rôle fondamental. Elles font généralement appel à des expérimentations animales. C’est un pré requis obligatoire pour justifier l’investigation et la première administration chez l’Homme. Ces expériences sur les animaux ont une valeur prédictive supérieure à celles réalisées en laboratoire. Les processus de développement des cancers ainsi que les interactions du système immunitaire avec les médicaments sont des processus complexes qui résultent de l’action concertée de plusieurs acteurs cellulaires. De fait, ceux-ci sont difficilement modélisables en laboratoire. Ainsi, même si des expériences préliminaires ont été réalisées au laboratoire les réponses obtenues ne sont qu’indicatives. Il n’existe pas à l’heure actuelle de systèmes alternatifs de remplacement.

Réduction

Nous avons planifié les expériences dans l’optique de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Dans ce but, le nombre de souris à inclure par groupe est limité 8. La significativité statistique de ces différences sera déterminée. Au-delà d’une différence significative entre les différents groupes de souris au sein d’une même expérience, ce qui est important c’est la reproductibilité de l’expérience. Donc on prévoit de reproduire une fois chaque étape. S’il n’y a pas trop d’hétérogénéité au sein des groupes lors de la première expérience on réduira le nombre de souris par groupe de 8 à 6. S’il y contradiction entre la première et la seconde expérience on prévoit une troisième expérience avec 6 souris par groupe.

Raffinement

Une fois les animaux réceptionnés, un délai de 7 jours sera respecté avant le début du protocole expérimental. Les souris seront hébergées au maximum par 5 dans des cages d’une superficie de 500cm2 à 20-24°C et 30- 50% d’hygrométrie, en portoirs ventilés, avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le milieu sera enrichi à l’aide de litière mélangée à des copeaux (sciure de peuplier, copeaux, briques de peuplier). Les animaux seront surveillés quotidiennement tout au long des expériences. En cas de signes comportementaux, physiologiques, d’une perte de poids de 20% du poids total de l'animal (critère non applicable pour les souris porteuses de tumeurs), d'une difficulté à se mouvoir ou d’une détérioration générale de l'état sanitaire de l'animal reflétant une douleur associée à l'expérimentation, celle-ci sera terminée prématurément et les animaux seront euthanasiés. Il n’y a pas de traitement antidouleur prévu pour ne pas biaiser les résultats de l'expérimentation en cours.

Choix des espèces

Notre projet nécessite l’utilisation de deux modèles murins : - Modèle de souris dépourvue de système immunitaire : ces souris sont les modèles animaux les plus utilisés pour les études concernant le développement tumoral car le taux de prise de greffe est le plus élevé. Ces souris sont couramment utilisées puisque l’absence de système immunitaire empêche le rejet des cellules humaines et favorise leur développement de la tumeur. - Modèle de souris avec système immunitaire : ces souris sont des modèles animaux qui ont la capacité de développer une réponse immunitaire rapide et efficace 14 à 21 jours après immunisation. Dans le cas de notre étude, des travaux ont été publiés utilisant ce modèle de souris avec une immunisation avec notre enzyme d’intérêt . Les souris utilisées seront des souris adultes de 6 à 8 semaines. Ce choix est motivé par les nombreuses études utilisant des modèles murins semblables à ceux utilisés dans notre étude.

32 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit des séries d'injections intrapéritonéales et subit un protocole d'électrostimulation des muscles du mollet sous anesthésie, censé imiter une déchirure musculaire, avant d'être tué pour analyser le tissu musculaire. Le porteur attribue le niveau modéré au cumul des injections, des électrostimulations et des anesthésies. Sur le remplacement, il affirme que l'électrostimulation est impossible à reproduire in vitro et que seule l'analyse du tissu entier révèle l'effet recherché.

Objectifs

Le maintien de la quantité et de la qualité des muscles est crucial pour une bonne qualité de vie, et est facilité par la remarquable capacité de ce tissu à se réparer après une lésion musculaire (par exemple un claquage ou contusion musculaire). Les muscles possèdent des cellules de réserve, appelées cellules souches, qui ont une contribution importante à cette capacité de réparation du tissu musculaire grâce à leur capacité de différenciation et de fusion avec les fibres musculaires lésées. Il a été démontré qu’une protéine X impliquée dans l’activation des cellules de réserve joue un rôle clé dans la réparation du muscle in vitro et in vivo dans un modèle murin de lésion toxique (i.e., injection d’un venin de serpent). Toutefois le rôle de la protéine X dans la réparation du muscle lésé en réponse à un exercice n’est à ce jour pas connu. Le projet étudie le rôle de la protéine X dans l’activation des cellules de réserve et ses conséquences fonctionnelles en utilisant un modèle d’exercice mimant une déchirure musculaire chez la souris.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche fondamentale permet de mieux comprendre le rôle d’une protéine régulant l’activation des cellules de réserve en réponse à une blessure musculaire. L’amélioration des connaissances sur la réparation du muscle après une lésion permettra à termes de proposer des stratégies thérapeutiques efficaces aussi bien pour le muscle sain (par exemple, athlètes de haut niveau) que pour le muscle pathologique (par exemple, arthroplastie totale de hanche, patients atteints de dystrophie, personne âgée). Une meilleure réparation du muscle est essentielle pour les performances des sportifs mais également pour la qualité de vie des patients.

Procédures

Les animaux recevront des injections en intra péritonéales (lot n°1 : 4 injections sur 4 jours, puis 2 semaines plus tard 3 injections en 3 jours. Lot n°2 ; 4 injections sur 4 jours). La durée de chaque injection est inférieure à 30 secondes. Les animaux sont soumis à un protocole d’exercice réalisé sous anesthésie générale (électrostimulations des muscles du mollet). La durée d’anesthésie générale est inférieure à 15 minutes. La durée du protocole d’exercice est de 5 minutes

Impact sur les animaux

Des nuisances et effets indésirables "modérés" sont attendus du fait d’un cumul d’actes (injections ip, électrostimulation, anesthésies). Les données de la littérature ne rapportent pas d’effets indésirables des différentes substances injectées. Après le protocole d'exercice, qui concerne un seul muscle de la patte arrière, les animaux ne présentent aucun signe de souffrance et sont en mesure de se mouvoir, de s’alimenter et de s’hydrater dès leur réveil. Aussi, il a été démontré que les anesthésies à l’isoflurane liées au protocole d’exercice et à la mesure de force n’induisent pas de troubles anxieux ou de modifications du comportement, de l’activité et de la mobilité des animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort car le projet nécessite une analyse du tissu musculaire qui ne peut pas être réalisée sur animal entier vivant.

Remplacement

Ce projet est l'aboutissement des études in vitro et ex vivo qui ont été menées auparavant. Pour ce projet, les modèles animaux sont indispensables car la procédure implique un exercice d’électrostimulation qui est impossible à reproduire in vitro. Aussi, les études de physiologie nécessitent l'utilisation de modèles animaux car seule l'analyse du tissu, voire de l'organisme entier permet d'identifier le réel impact de ces interactions moléculaires et cellulaires sur la fonction de l'organe.

Réduction

Le modèle d'exercice utilisé est totalement non-invasif et permet de mesurer la force musculaire de manière concomitante sur les mêmes animaux, et réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Nous proposons d’établir des banques biologiques informatisées issues des expérimentations qui pourront à terme limiter l'utilisation de nouveaux animaux. Des prélèvements multiples sont réalisés après euthanasie sur le même individu pour des tests parallèles. L'utilisation des animaux est strictement réduite au nombre nécessaire pour l'établissement des données expérimentales, à l'aide des analyses statistiques effectués précédemment pour ces procédures.

Raffinement

Les protocoles les moins invasifs et les moins douloureux possibles sont privilégiés. Les procédures expérimentales incluent un recours à l'anesthésie générale profonde. Des mesures sont prises pour améliorer les conditions d'élevage afin d'enrichir l'environnement des souris. Aussi, un suivi quotidien des animaux permet d’éviter toute souffrance inutile et de prendre les mesures adéquates dans le cas d’un éventuel phénotype dommageable, bien que non attendu.

Choix des espèces

Le tissu musculaire de la souris est très proche de celui de l'homme dans sa structure et son fonctionnement. Les processus physiologiques impliqués dans la régénération du muscle squelettique ont été largement décrits chez des animaux adultes. Les animaux sont donc utilisés entre 8 et 12 semaines d'âge.

8 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie intracérébrale d'environ quatre heures pour l'injection d'un vecteur viral, puis six mois de suivi avec huit prélèvements sanguins, sept ponctions lombaires, six IRM et quatre électromyogrammes, avant d'être tué pour analyse histologique. Le porteur destine ces données de toxicologie à une demande d'essai clinique auprès de la FDA et de l'ANSM. Sur le remplacement, il affirme que le cerveau du primate est le plus proche de celui de l'humain et que le recours au "gros animal" est exigé par l'agence réglementaire.

Objectifs

Les vecteurs adeno associés (AAV) sont parmi les vecteurs les plus efficaces pour transporter et intégrer des gènes d’intérêt dans des parties précises du système nerveux central, en particulier, le cerveau . Les AAV constituent une voie de thérapie pour des maladies neurodégénératives, notamment la maladie de Huntington. Le but de cette étude est de completer les données de toxicologie d’évaluer la faisabilité/efficacité de l’administration par voie chirurgicale intracérébrale (IC) dans la région du cerveau qui concerne la pathologie en question, de façon à choisir le type d’AAV le plus adéquat pour une pathologie donnée.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus pour ce projet sont l'obtention de toutes les données de tolérance à long terme pour l'application immédiate en recherche clinique à la fin de cette étude afin de répondre aux demande de la FDA (Food and Drug Administration) afin d'obtenir l'autorisation pour un essai de phase I/II et ainsi traiter les patients Huntington.

Procédures

- Une procédure chirurgicale (environ 4h) - 8 prelevements sanguins, 7 prelevements de Liquide céphalo rachidien (LCR) (sang + LCR maximum 15min), - 6 Imagerie par résonance magnétique (IRM) (environ 1h30) - 4 Electromyogramme (EMG) (maximum 45min). Dans ce projet, comme decrit precedemment, une meme anesthésie permet la réalisation de plusieurs gestes (prise de sang + Ponction lombaire + EMG ou IRM selon le timepoint d'étude).

Impact sur les animaux

Les 5 effets indesirables possibles sont: - un risque anesthésique - un risque infectieux pour l'administration intracerebrale - un risque chirurgical lié à l'administration intracérébrale via des catheters - un risque de fuite de LCR - la formation d'hématomes lors des prises de sang

Devenir

A la fin du projet soit 6 mois apres l'injection, l'ensemble des animaux (n=8) sera euthanasié pour permettre les etudes histologiques et de biodistribution composant l'etude Tox GLP permettant la soumission aux agences reglementaires (FDA et ANSM).

Remplacement

Toutes les études in vitro possibles ont été effectuées en amont de ce projet, en particulier la démonstration de la fonctionnalité des AAV. L’objectif de ce projet ne permet pas d’envisager de méthode évitant ou remplaçant l'utilisation des animaux. En effet, le développement de cette approche thérapeutique chez l’Homme fait l'obligation d'une étude de scale-up (efficacité, biodistribution, toxicité, etc) chez le gros animal (NHP). Ces étapes sont requises par l’ANSM pour toute demande d’autorisation d’étude clinique afin d'autoriser l'essai clinique chez l'Homme.

Réduction

8 animaux au total: 3 animaux par dose d'AAV et 2 animaux vehicule est le minimum statistique pour repondre à l'objectif du projet. L'etude statistique etant assez limité en terme de tox, prinicpalement T test ou Anova. La majeure partie des analyses etant une étude histologique par un anatomopathologiste certifié.

Raffinement

Les procédures utilisées sont adaptées pour éviter tout inconfort de l'animal, les procédures sont réalisées par du personnel formé et experimenté notamment l'administration intracérébraleréalisée par un neurochirurgien expert de la technique. Enfin, le nombre d'anesthesie est minimisé en regroupant les procédures (prise de sang (volume adapté à la taille des animaux et validé par le vétérinaire), ponction lombaire) au sein de la meme anesthesie. Les animaux sont hebergés en groupe et recevront un enrichissement adapté.. Les animaux auront un suivi quotidien par les techniciens du projet, un suivi de poids à chaque anesthesie, l'utilisation de buprecare pour les ponctions lombaires pour eviter tout inconfort et enfin des antibiotiques (amoxicilline) lors de la chirurgie. L'administration intracérébrale d'AAV est parfaitement tolérée (expérience passée sur 20). Les prises de sang et ponctions lombaires (avec les memes volumes et frequence que decrite dans ce projet) sont menée en routine sur tous les animaux suivis par l'equipe et ne generent pas d'effets néfastes sur les animaux. Une observation journalière sera faite tout au long du projet. A la moindre anomalie un avis vétérinaire sera demandé et un traitement mis en place si necessaire. Si un animal ne presentait pas d'amelioration dans le suiv, il sera euthanasié avec avis vétériaire.

Choix des espèces

La capacité des vecteurs adeno associés (AAV) à pénétrer dans un organe donné et y faire exprimer un gène thérapeutique est dépendante de l'espèce. Dans les maladies que nous ciblons, il existe un modèle murin de la maladie, utilisé dans une première étape, déjà réalisée. Les organes du primate non humain (NHP) en particulier le cerveau, se rapprochent le plus de celui chez l’homme en terme de structure anatomique et connectivité fonctionnelle. L’administration du vecteur dans un cerveau proche du cerveau humain permet de définir au mieux les paramètres du protocole clinique (nombre de sites, volumes, débit, nombre de particules). L'injection de vecteurs AAV chez le NHP est le seul moyen d'évaluer au mieux la faisabilité, l'efficacité et la tolérance d'une telle approche thérapeutique réalisée préalablement chez les rongeurs. Les animaux seront utilisés entre 3 ans et 15 ans selon la disponibilité en elevage, nous avons besoin d'individus avec un cerveau completement developpé.

Une injection de collagénase dans le tendon patellaire déclenche l'inflammation d'un genou, puis, sous anesthésie générale, les nouveaux vaisseaux formés autour du tendon sont bouchés par voie artérielle, avec un risque d'ischémie lié aux agents testés. 60 cochons âgés de deux à trois mois vont être utilisés pour tester les matériaux d'embolisation de "différentes équipes", dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur affirme qu'"aucune nuisance supplémentaire n'est attendue", l'étude précédente n'ayant selon lui montré aucun signe de douleur, et prévoit pourtant un morphinique pour "quelques gestes possiblement douloureux". Tous sont tués à l'issue, deux semaines après l'injection, pour prélever leurs tendons.

Objectifs

Les inflammations chroniques des tendons et des articulations sont fréquentes et difficiles à soigner. C'est un problème de santé publique avec un coût médico-économique important et des arrêts de travail prolongés (douleur épaule, coude, poigner, genou) et arrêt de sport.. Dans cette pathologie, des nouvelles artères (néovaisseaux) se forment et entretiennent cette inflammation. Une équipe de chercheurs rapporte que le fait de boucher ces néovaisseaux, c'est à dire de réaliser une embolisation, permet d'améliorer les patients souffrant de ces maladies chroniques. L’agent utilisé pour boucher les vaisseaux est un antibiotique, et n’a pas l’autorisation en France pour être utilisé dans les artères. Cette approche doit être validée sur un modèle animal avant de pouvoir faire des tests chez l'Homme notamment pour prouver qu'il n'existe pas de risque à priver de sang les tendons ou les articulations inflammatoires et d’étudier les différents agents d’embolisation possibles. Dans une étude précédente, notre équipe a mis au point un modèle porcin reproductible d’inflammation du tendon du genou qui associe une inflammation du tendon et le développement de vaisseaux pathologiques. Il a été utilisé pour tester l'embolisation avec des microbilles définitives, montrant l’absence de complication sévère chez l’animal. Cependant l’embolisation avec ces petites billes semble avoir des résultats nettement moins bons sur la douleur que les publications utilisant l’antibiotique comme agent d’embolisation. Dès lors, il est nécessaire d’étudier l'efficacité de cet antibiotique sur notre modèle animal, ainsi que celle de nouveau agents d’embolisation pour orienter la prise en charge future de ces patients. L’objectif de ce projet est donc de proposer notre modèle validé, reproductible et maîtrisé par les radiologues interventionnels, à différentes équipes pour tester la sécurité et l'efficacité de leurs matériaux d'embolisation.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes d’action de l’embolisation dans la pathologie tendineuse. Ceci permettra de mieux comprendre les douleurs des patients et ainsi de leur apporter un nouveau traitement antalgique qui permettra de limiter le recours aux médicaments, soins de kinésithérapie, d’accélérer la reprise du travail et la reprise du sport.

Procédures

Les animaux seront impliqués dans une seule procédure opératoire qui se déroulera en plusieurs étapes : - J0 : induction d'une inflammation au niveau du tendon patellaire du porc (un genou) par injection intra-tendineuse de collagénase de type 1 (25 mg/ 0,5 ml / genou). L'autre genou ne sera pas injecté, l'animal sera son propre témoin. - J7 : réalisation d'une angiographie afin de valider la présence de néovaisseaux et embolisation le cas échéant (comparaison avec le coté controlatéral sain). - J14 : Réalisation d'une angiographie pour vérifier la réussite de l’embolisation des différents pédicules vasculaires avec néovaisseaux par les matériels d'embolisation testés, évaluation de la perméabilité artérielle, et quantification des néovaisseaux. Puis mise à mort des animaux et prélèvement des tissus pour étude anatomopathologique de la destruction tendineuse, des thromboses vasculaires, des néovaisseaux.

Impact sur les animaux

L’étude précédente ayant permis la validation de la dose de collagénase n’a montré aucun signe d’apparition d’inconfort ou de douleur, ni de changement de comportement chez les animaux. Ainsi, le modèle étant désormais maîtrisé, aucune nuisance supplémentaire n'est attendue. Concernant les effets indésirables, devant le risque ischémique lié à l’utilisation des agents embolisants testés, il conviendra de s'assurer de l'absence de complication locale visible au niveau des cuisses de l’animal.

Devenir

Tous les animaux seront seront mis à mort en fin de procédure afin d'effectuer le prélèvement des tendons.

Remplacement

Il s’agit d’une étude ayant pour objectif de vérifier l'efficacité et la précision d'une technique interventionnelle. Il n’existe pas de méthode alternative permettant d’atteindre cet objectif dans des conditions le plus proches possibles des cas cliniques.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit en veillant toutefois de travailler sur un nombre suffisant pour obtenir une différence significative entre les groupes en cas de comparaison, ou un groupe suffisamment important pour valider un groupe pilote sur un nouvel agent.

Raffinement

Nous attacherons une importance majeure au raffinement des conditions d’hébergement et d'enrichissement pendant la période d'acclimatation d'une semaine et tout au long de la procédure. Afin de limiter leur stress, les animaux seront hébergés en groupe. L'enrichissement est réalisé en créant une zone de repos couverte de litière, leur permetant de s'allonger tous ensemble et de répondre à leur comportement de fouissement. Ils disposent également de jouets suspendus à mordiller. Ce modèle ayant été mis au point dans les mêmes conditions, toutes les techniques expérimentales ont été optimisées. Pour la phase d'injection dans le tendon, une anesthésie légère serait réalisée par injection intramusculaire de kétamine (10mg/kg) + azapérone (5 mg/kg). Les gestes interventionnels (angiographie) seront toujours réalisés sous anesthésie générale afin de prévenir la souffrance et l’angoisse de l’animal, de même que la mise à mort. Lors des quelques gestes possiblement douloureux, un morphinique sera utilisé (sufentanil 10 μg/h). La mise en place des cathéters sera réalisée sous échographie, évitant l'ouverture cutanée à l'exception de la ponction à l'aiguille.

Choix des espèces

De manière générale, le porc est un bon modèle d'étude proche de la physiologie humaine, notamment au niveau de la vascularisation, ce qui permet de se former sur l'animal avant l'usage chez l'Homme. Nous profiterons également de la mise en place de ce projet pour réaliser des formations aux radiologues interventionnels sur cette nouvelle technique d’embolisation. Les animaux sont choisis au terme du post-sevrage à l'âge de 2-3 mois, pour des raisons techniques d'une part (poids entre 25 et 35 kg, permettant des groupes homogènes) et pour des raisons de coût d'autre part.

628 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit, par chirurgie stéréotaxique, une lésion chimique des neurones dopaminergiques reproduisant la maladie de Parkinson et l'implantation de fibres optiques, d'électrodes et d'un implant miniaturisé, avant une perfusion intracardiaque terminale. Le porteur nomme les tests comportementaux imposés, activité locomotrice, coordination sur tige tournante et épreuve en milieu aquatique, et reconnaît des déficits moteurs induits par la lésion. Sur le remplacement, il affirme que ces déficits ne peuvent être étudiés ni sur des organismes moins évolués ni in vitro et juge le recours à la souris nécessaire.

Objectifs

L’objectif du projet est de tester in vivo l’efficacité d’un implant miniaturisé (de quelques μm3) permettant à la fois de moduler par optogénétique l'activité des neurones d’intérêt au niveau des circuits des ganglions de la base, d’enregistrer les activités neuronales et de libérer des nanovolumes de différentes substances (L-DOPA, anti-inflammatoire) chez les souris vigiles sans contention et de valider ses effets bénétifiques sur les symptômes moteurs de la maladie de Parkinson.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche devrait permettre une meilleure compréhension de la pathophysiologie de la maladie de Parkinson et à terme permettre de développer un outil technologique innovant pour traiter les troubles moteurs des patients parkinsoniens et probablement d’autres pathologies du système nerveux central.

Procédures

Les animaux seront soumis à 1) une stéréotaxie sous anesthésie générale réalisée une seule fois (durée 30-45 min selon le type d’implantation, grade de séverité: modérée) pour induire la lésion unilatérale des neurones dopaminergique et implantater en même temps des fibres optiques, des électrodes d’enregistrement et/ou un implant miniaturisé, suivit, 2) d'un exemen neurologique (series de 6 tests comportmentaux, grade de séverité: légère) ) pour évaluer les effets bénéfiques de la stimulation optogéntique sur les fonctions motrices et motivationnelles (3-5 semaines d’analyses avec 1 à 2 jours séparant deux tests comportmentaux successifs durant 30 sec-30 min en fonction du test), 4) une perfusion intracardiaque pour mener des analyses complémentaires au niveau cellulaire.puis 3) une perfusion intracardiaque (5 min) pour effectuer des analyses complémentaires au niveau cellulaire.

Impact sur les animaux

1) Les animaux seront soumis à la lésion des neurones dopaminergique qui induit certains déficits moteurs. La lésion 6-OHDA a été largement caractérisée par la communauté scientifique et induit certains symptômes moteurs (ralentissement moteur, déficit d’initiation du mouvement et asymétries posturales) de la maladie de Parkinson. 2) Une manipulation lors de la connexion des fibres optiques ou des électrodes d’enregistrent. 3) une exposition à des tests comportementaux évaluant les effets bénéfiques des divers modulations optogénétiques sur les fonctions motrices et motivationnelles. Ces tests impliquent une mesure de l’activité locomotrice exploratoire spontanée dans differents environnements et une évaluation des capacités de coordination motrice sur une tige tournante et dans un milieu aquatique. L’inconfort généré par chacun de ces tests est réduit au minimum en habituant les animaux au préalable et en raccourcissant la durée d’exposition. 4) une perfusion intracardiaque pour mener des analyses complémentaires au niveau cellulaire.

Devenir

Mise à mort à la fin de la procédure pour les analyses au niveau cellulaires

Remplacement

Ce projet de recherche repose sur la modélisation de déficits comportementaux chez la souris qui ne peuvent être abordés via l’étude d’organismes modèles phylogénétiquement moins évolués, ou à fortiori des outils moléculaires in-vitro. La maladie de Parkinson fait intervenir des mécanismes complexes nécessitant l'utilisation d'animaux pour créer un modèle pouvant reproduire les symptômes de cette maladie. La dégénérescence progressive des neurones dopaminergiques induite par la neurotoxine sélective des neurones catécholaminergiques (6-OHDA) s’accompagne d’une réorganisation fonctionnelle des circuits neuronaux des ganglions de la base qui sous-tend le développement et l’expression des symptômes de la maladie de Parkinson. De fait, il est nécessaire de prélever le cerveau entier pour les analyses immunohistochimiques et biochimiques. Les cultures cellulaires ou organotypiques ne peuvent répondre à ce type de recherche. L'implant prototype doit également être caractérisé chez l’animal vigile avant l’approche chez l’homme.

Réduction

Ce projet, d'une durée de cinq ans, nécessitera l'utilisation de 628 souris mâles et femelles adultes, réparties en plusieurs groupes (n= 6 à 14/groupe en fonction du type d’expérience). Cet effectif tient compte de notre expérience de nombreuses années dans ce type d’expérimentation et il est basé sur une approche statistique permettant de vérifier notre hypothèse à 80% de chances pour un seuil de significativité de 5%. Cependant, il pourra être réduit en fonction des résultats marquants obtenus dans les tests comportementaux et du nombre de dispositifs à tester. En effet, au vu de la difficulté technique du projet, nous pourrons être amenés à tester moins de prototypes qu’anticipés. En fonction de leur taille finale, ils pourront être implantés dans d’autres structures telles que le cortex moteur ou le striatum également impliquées dans le contrôle du mouvement. Ce projet de recherche devrait permettre une meilleure compréhension de la pathophysiologie de la maladie de Parkinson et permettre à terme de développer une technologie nouvelle pour traiter les troubles moteurs des patients parkinsoniens et probablement d’autres pathologies du système nerveux central.

Raffinement

La chirurgie stéréotaxique pour effectuer la lésion dopaminergique, l’implantation les fibres optiques, et les optrodes a été optimisée pour réduire la durée de l’opération et minimiser la souffrance grâce à notre expérience depuis de nombreuse années dans ce type d’expérimentation. La souffrance est modérée car la chirurgie est réalisée sous anesthésie profonde. Les principaux paramètres vitaux (température, fréquence respiratoire) sont également contrôlés tout au long de la chirurgie. Afin de diminuer la douleur, un analgésique morphinique puissant à action prolongée (buprénorphine), est administré en préopératoire. En complément, un analgésique anti-inflammatoire (Rimadyl dilué dans 1ml de NaCl) est administré par précaution en début et fin d'opération pour anticiper l’apparition d’éventuelles douleurs et hydrater l’animal puis en postopératoire pendant au moins 3 jours, la durée de traitement dépendant de la réponse observée. Les animaux ne présentent pas de signes de souffrance ni stress après réveil de l’anesthésie. Le personnel animalier et expérimentateurs s’assurent d’une bonne récupération postopératoire des animaux. Une grille d’évaluation clinique (Annexe 1) est mise en place pour évaluer des signes de souffrance ou mal-être potentiels des animaux. Pendant la période post-opératoire des trois semaines, les animaux sont hébergés dans la pièce de post-chirurgie chauffée à 25°C, et le rythme des visites est augmenté (2 visites par jour). Après la période de récupération post-opératoire, les animaux sont remis dans leur pièce d’hébergement habituelle à l’animalerie et ne sont manipulés par l’expérimentateur en charge qu’après une période de réhabituation d’une à deux semaines. Ils sont hébergés en petits groupes (2 à 4) dans des cages individuellement ventilées (Techniplast), avec eau et nourriture à volonté. Ils ont à leur disposition de la litière foisonnante (diminuant le stress de l’animal et facilitant sa thermorégulation) ainsi que des bûchettes en peuplier et des tubes en PVC pour favoriser le bien-être et l’interaction sociale. L’analyse comportementale est réalisée chez les animaux vigiles qui ne doivent pas être stressés pour ne pas compromettre leurs performances. Pour cela, ils sont manipulés quotidiennement 3 à 4 jours avant le début des tests comportementaux et familiarisés à la connexion des fibres optiques ou des électrodes pour s’habituer à se mouvoir dans les différents environnements sans stress.

Choix des espèces

Le modèle de Parkinson chez le rongeur (injections 6-OHDA) est le plus utilisé au niveau international et considéré comme un bon modèle. L’expérimentation animale utilisant des souris sauvages et génétiquement modifiées est indispensable à la réalisation de notre projet et permet de cibler slectivement des propulations neuronales d'intêret et elucider leurs contributions dans le developpment des déficits moteurs de la maladie de Parkinson. L'ensemble des études est mené sur des animaux adultes à partir de12 semaines. Ce temps est nécessaire pour que le système nerveux soit mature et est classiquement utilisé pour mesurer les performances comportementales de souris adultes. Ceci nous permet de comparer les résultats obtenus avec nos données antérieures et ceux de la litterature.

884 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, réutilisées d'une étape à l'autre puis mises à mort pour prélever leurs organes. 52 femelles gestantes sont immobilisées dans un tube de contention sous lumière vive trente minutes, trois fois par jour pendant six jours, pour induire un stress prénatal, et leur descendance subit des tests de tolérance au glucose avec gavage et prises de sang à la queue. Le porteur décrit ce protocole comme un modèle de stress psychologique humain transposé à la souris. Sur le remplacement, il affirme que les méthodes alternatives sont peu représentatives des pathologies humaines et rend le recours à l'animal "incontournable", le stress et les désordres métaboliques étant des réactions de l'"organisme entier".

Objectifs

La prévalence mondiale du développement de maladies métaboliques est en perpétuelle augmentation à travers le monde. L’objectif de notre projet est d'étudier les mécanismes du stress sur le développement de ces pathologies dans la descendance.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre l'impact d'un stress prénatal se rapprochant d'un modèle de stress psychologique chez l'humain, chez la souris. Ce projet apportera des connaissances sur la physiopathologie des désordres métaboliques altérés par le stress au niveau cellulaire et moléculaire afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Procédures

Pour générer des souris F1 issues de mères stressées, 52 femelles seront placées dans un tube de contention sous une lumière vive durant 30 min, 3 fois par jour, pendant 6 jours, du 13ème jour au 18ème jour de gestation. L'ensemble des souris F1, soit 624 sera soumis à un test de tolérance oral au glucose avec gavage sur animaux vigiles et avec prélèvement de sang à la queue. Parmi ces animaux, la moitié, soit 312 animaux seront soumis à deux tests de tolérance oral au glucose avec prélèvement de sang à la queue 3 mois après. Ces expériences seront réalisées sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Ce modèle n'induit pas de douleur spontanée chez la souris. Nous attendons le premier jour de la procédure de stress une stabilisation du poids ou une perte de moins de 3.5% du poids des mères gestantes en comparaison avec les mères gestantes non stréssées. Dès le deuxième jour de la procédure de stress les mères gestantes doivent reprendre du poids. Le stress réalisé sur les mères gestantes ne comporte pas d'effet visible comportemental. Nous attendons un stress léger sur la génération F1 qui pourrait se manifester sur les différents paramètres mesurés, notamment une augmentation de la glycémie à jeun ou en réponse à l'administration de glucose.

Devenir

Les animaux ayant servi à générer la descendance F1 seront mis à mort et des prelèvements d'organes seront réalisés. Les souris F1 sous régime normal ou sous régime particulier seront euthanasiées à différents âges : adulte jeune ou adulte mature après la procédure du test de tolérance oral au glucose. Différentes expériences seront réalisées ex-vivo et des prélèvements tissulaires seront collectés pour différentes études au niveau cellulaire et moléculaire.

Remplacement

Les méthodes alternatives, permettant une évaluation du statut métabolique au cours du temps de la descendance suite à un stress gestationnel sont peu représentatives des pathologies humaines. Ainsi, ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale afin d'étudier les mécanismes engagés entre l'effet du stress in utéro et les désordres métaboliques observés chez la descendance. De plus, le stress et les désordres métaboliques sont des réactions intégrées de l'organisme entier impossible à reproduire in vitro dans leur intégralité.

Réduction

Le nombre de 8 animaux par groupe expérimental est le minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs, principalement due à la variabilité interindividuelle des réponses étudiées. L'ensemble des procédures seront réalisé lors de 3 expériences indépendantes.

Raffinement

Le suivi expérimental repose sur des techniques non-invasives : suivi du poids, observation du bien etre animal. L’utilisation de ces techniques non-invasives permet d’observer au cours du temps un seul animal, là où l’information devait être obtenue par euthanasie et autopsie de multiples individus à chaque stade permettant ainsi de réduire sensiblement le nombre d’animaux.

Choix des espèces

La souris présente des caractéristiques physiopathologiques proches de l'espèce humaine.

24 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit l'ablation des deux glandes surrénales et la pose d'une mini-pompe, puis une injection d'aldostérone et une perfusion du rein sous anesthésie avant d'être tué par dislocation cervicale pour prélever les tubules rénaux. Le porteur indique que l'ablation surrénalienne peut provoquer léthargie, perte de poids et déshydratation, et que la ligature de l'aorte peut être douloureuse, avec des points limites prévus. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode ne reproduit in vitro la complexité cellulaire du rein et juge le modèle animal "indispensable".

Objectifs

L’hypertension artérielle est un facteur de risque cardiovasculaire qui affecte entre 10 et 40% de la population en fonction de l’âge. Les reins sont indispensables pour la régulation de la pression artérielle. L'acteur majeur de cette régulation est l’hormone aldostérone, qui agit au niveau d'une portion spécifique du rein appelée tubule distal. Des dysfonctionnements de la production ou de l’action de l’aldostérone sont responsables de maladies entrainant une hypertension artérielle ou une perte rénale de sel associée avec une baisse de la pression artérielle. L’objectif du projet consiste à mieux comprendre les mécanismes d’action de l'aldostérone sur le tubule distal. Nous allons prélever les tubules distaux des reins de souris traitées ou non avec de l’aldostérone afin de réaliser une « carte d’identité cellulaire » de ces cellules et ainsi comprendre les effets de l’aldostérone sur ces cellules. Les résultats obtenus permettront de mieux comprendre les mécanismes de l’action de l’aldostérone sur la régulation du sodium et du potassium par les reins et sur le contrôle de la pression artérielle. Ils seront également utiles pour le développement de nouvelles options thérapeutiques pour le traitement de l’hypertension artérielle et des maladies héréditaires touchant les tubules rénaux.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet devraient permettre d'établir une cartographie moléculaire du néphron distal et de définir de nouvelles cibles cellulaires et fonctionnelles du MR impliquées dans la réponse à l'aldostérone. L’identification de nouveaux mécanismes moléculaires de régulation de la balance hydro-sodée dépendante de l’aldostérone pourrait ouvrir des perspectives nouvelles dans la compréhension de la régulation de la pression artérielle et le développement d’hypertension dans la population générale, mais aussi une meilleure compréhension des bases mécanistiques de certaines pathologies touchant le néphron distal.

Procédures

Afin d’évaluer la réponse aigüe des cellules du néphron distal à l’aldostérone, nous devons nous affranchir de la production endogène de cette hormone par les glandes surrénales. Pour cela nous allons procéder à une surrénalectomie bilatérale ; il est cependant nécessaire de compenser la perte en glucocorticoïdes produits par cette glande par un apport exogène en glucocorticoïdes. L’établissement de ce modèle se décompose en trois étapes principales : 1) La surrénalectomie bilatérale qui permet l’arrêt de la production endogène d’aldostérone et la pose de mini-pompes osmotiques ALZET délivrant de la dexaméthasone (1ug/100g de poids corporel/jour) pour prévenir la chute du débit de filtration glomérulaire et assurer la survie des souris Durée de l'intervention 30 minutes. 2) Après 7 jours, une injection unique d’aldostérone (0,002 mg/kg de poids corporel) ou l’équivalent en volume de serum physiologique 0,9% est réalisée par la veine caudale pour évaluer les mécanismes moléculaires de la réponse aigue à l’aldostérone dans les cellules individuelles du néphron distal. 3) Une heure après l’administration d’aldostérone, les souris sont anesthésiées et le rein gauche est perfusé avec une solution contenant de la libérase afin de permettre une digestion partielle du rein et permettre la microdissection des tubules d’intérêt. Le rein est ensuite aussitôt prélevé. Durée de l'intervention 45 minutes. Les animaux sont ensuite mis à mort par dislocation cervicale. Dans la même procédure, le rein droit, le cœur, l’aorte abdominale, du tissu adipeux viscéral et le cerveau seront prélevés et stockés à -80oC pour des possibles études futures sur l’action de l’aldostérone sur autres tissus cibles.

Impact sur les animaux

Les manques en aldostérone ou en corticostérone endogènes suivant la surrénalectomie bilatérale peuvent être responsables d’une léthargie importante des souris, d’une perte de poids et d’une déshydratation. Ces effets indésirables sont prévenus par la supplémentation en dexaméthasone. La ligature de l’aorte avant la perfusion du rein avec la solution de libérase peut entrainer de la douleur aux souris. La procédure ne commence que lorsque l’animal est profondément anesthésié (immobilité, rythme cardio respiratoire lent, pas de réaction à la stimulation interdigitale). Une dose d'analgésie (Metacam 5 mg/Kg, soit 10 ml/KG SC) juste avant l’intervention est également administrée, si besoin une demi-dose supplémentaire de Kétamine seule à 10mg/kg (0,02 ml/kg) sera réinjectée. Des points limites en rapport avec ces nuisances éventuelles sont prévus.

Devenir

Il s’agit d’une procédure sans réveil qui concerne tous les animaux.

Remplacement

Il n'existe pas de méthode de remplacement permettant de reproduire in vitro la complexité de la composition cellulaire du rein en vue d’une analyse de l’impact de l’action de l’aldostérone sur cellule unique. L’utilisation d’un modèle animal est donc indispensable à la réalisation de ce projet. Une approche in vitro sera ensuite développée pour étudier l’impact des gènes et voies de signalisation identifiés dans les tubules distaux de ces animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au nombre minimum nécessaire et suffisant pour permettre l’analyse statistique des données.

Raffinement

Les animaux seront surveillés quotidiennement et nous avons établi des points-limites bien défini à chaque étape des procédures entrainant la mise à mort des animaux si nécessaire. Nous réduirons au maximum la souffrance animale, notamment en utilisant de l’analgésie et de l’anesthésie adaptée dès que cela sera nécessaire.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris (Mus Musculus) comme le modèle de choix, en raison de ses similarités génétiques et physiologiques proches de l’homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. Ce raisonnement s’applique tout particulièrement à l’étude de l’hyperaldostéronisme primaire, maladie complexe et impossible à analyser in vitro mais aussi aux syndromes de perte de sel. Tous les animaux utilisés seront âgés de 12 à 14 semaines au début de la procédure. Nous avons choisi d’étudier des souris adultes post pubères afin de nous affranchir de possibles différences (souris âgées) ou d’absences (souris non matures) de réponse de la fonction rénale.

364 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur crée deux plaies dorsales par chirurgie sous anesthésie, on leur pose une puce télémétrique et on les traite au plasma froid une à deux fois par jour, pour mettre au point un modèle de plaie chronique infectée par des bactéries résistantes. Le porteur reconnaît une douleur et une gêne aux déplacements au réveil, et prévoit des prélèvements de peau et de rate après la mise à mort. Sur le remplacement, il affirme qu'il n'existe pas d'alternative non animale et qu'aucun modèle in vitro ne représenterait un cas clinique.

Objectifs

L’objectif est à la fois d’optimiser les technologies plasmatiques existantes et de développer de nouvelles technologies pour éliminer les bactéries résistantes responsables d’infections nosocomiales. Les sources de plasma sont testées dans différents contextes pour leur efficacité antimicrobienne in vitro et in vivo en utilisant un modèle murin de plaie infectée. Des études mécanistiques sur la destruction bactérienne médiée par le plasma froid sont effectuées tandis que des échantillons de plaies provenant de patients facilement disponibles sont utilisés pour fournir du matériel réaliste pour étudier l’efficacité de cette nouvelle approche. Enfin, le traitement de plaies colonisées par des bactéries résistantes aux antibiotiques fourniront les données d’une preuve de concept. Les résultats du projet ne serviront pas uniquement à rendre prometteur l’utilisation du plasma froid contre les plaies infectées, mais également d’améliorer la cicatrisation de plaies afin de lutter contre le développement de l’antibiorésistance résistantes en médecine humaine et vétérinaire.

Bénéfices attendus

Au sein du projet global, il est attendu que l’utilisation du kINPen ou du Multijet avec un nouveau mélange de gaz soi efficace pour lutter contre l’infection par des bactéries résistantes aux antibiotiques et pour améliorer la cicatrisation des plaies d'animaux présentant un déficit cicatriciel. Cela se traduira notamment par une baisse significative de la colonisation bactérienne sur la plaie, et une éventuelle accélération de la cicatrisation des plaies. Un nouveau dispositif à plasma, le multijet, sera également utilisé. Il est attendu que ce nouvel outil soit aussi efficace , sinon plus, que le premier quant à la désinfection et la cicatrisation des plaies, permettant ainsi de traiter une surface de plaie plus importante et d’augmenter l’efficacité de la réponse immunitaire. A plus long terme, cela pourrait permettre de généraliser l’utilisation de divers dispositifs à plasma à l'être humain, chez des patients souffrant de troubles de la cicatrisation (diabète, immunodépression, etc.) ; mais aussi de lutter contre l’antibiorésistance s’installant notamment sur ces plaies dans le cas d’infections nosocomiales. Cela pourrait également offrir des opportunités de traitement dans divers domaines (chirurgie, ophtalmologie, oncologie, etc.). La généralisation de l’utilisation de ce système pour entièrement décontaminer du matérial médical en milieu hospitalier pourrait être envisagée.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie sous anesthésie général, suivi d'un protocole de gestion de la douleur post-opératoire (injection en intra-péritonéale des immunostimulants (introduction aiguille) une à deux fois par jour durant 3 jours. Les animaux auront une prise de sang à veine sub-mandibullaire (introduction aiguille) une fois tous les 5 à 7 jours pendant quelques secondes. Les animaux seront équipés d'une puce télémétrique (introduction aiguille) en début d'expérimentation (1 fois) pendant quelques secondes. Les animaux seront traités par le plasma à froid 1 ou 2 fois par jour pendant quelques minutes (non invasif).

Impact sur les animaux

Suite à la création des deux plaies dorsales, une douleur et une gêne possible dans les déplacements sont attendues au reveil de l’animal sans analgésie. Une légère douleur localisée et un léger mal-être pendant quelques secondes après la prise de sang pourrait être observés.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort soit les 364 souris. Des prélèvements de tissus seront effectués post-morterm pour la partie histologie (zone de biospsie et rate) popur l'analyse biologique de la reconstruction de l'épiderme cutané. La décision est prise par les responsables scientifiques et concepteurs.

Remplacement

Il n’existe pas d’alternatives non animales puisque l’objectif est d’évaluer l’efficacité des plasmas à gaz sur la cicatrisation d’une plaie en vue d’une standardisation de son utilisation chez l’être humain. Ainsi, il n’est pas possible de remplacer les animaux par un modèle in vitro qui permettrait de représenter au mieux un cas clinique.

Réduction

Les volumes de sang à prélever par animal et leur fréquence étant contraints, les volumes prélevés à chaque prise de sang seront « poolés » par 2 (animaux du même groupe et de même sexe pour limiter la variabilité). Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques garantissant une puissance de test de 80% minimum en s’appuyant sur les données de la littérature et l’expérience des différents partenaires de ce projet. L’étude statistique sera faite sur la base d’un test non paramétrique : Kruskall-Wallis pour l’étude de la réponse immunitaire d’animaux et cicatricielle.

Raffinement

Dès l'arrivée des animaux à l’animalerie, une semaine d’acclimatation sera effectuée pour limiter au maximum les perturbations liées à un nouvel environnement. Les animaux seront surveillés 2 fois par jour (télémétrie, signes cliniques tels que le poids, l’apparence et le comportement général). L’eau et la nourriture seront ad libitum. Les souris bénéficient d'un enrichissement social et physique (objets en cellulose pour faire un nid ou à ronger). Les souris sont hébergées dans une animalerie A2 en portoirs ventilés. La pose des puces est faite sous anéthésie générale à l'isoflurane. Afin de diminuer la douleur de l'injection de la puce, un dépôt de Tronothane® 1 % (pramocaïne, gel). Pour la partie chirurgie et le suivi post-opératoire : Période préopératoire : injection pré-opératoire de buprénorphine (0,1 mg/kg, SC), au moins 20 minutes avant le début de la chirurgie Période opératoire : anesthésie gazeuse à l'isoflurane. Période postopératoire : injection post-opératoire immédiate de méloxicam (20 mg/kg, SC). Suivi Injection de buprénorphine (même dose) le soir. Injection de méloxicam (20 mg/kg SC, 1 fois/jour, à J1 et J2). Injection de buprénorphine (même dose) à la demande (2 fois/jour, à J1, J2 et J3) en fonction du résultat de l'évaluation de la douleur, si elle n'est pas contrôlée par le méloxicam. Visite animalier matin et soir.

Choix des espèces

Il n’existe pas d’alternatives non animales puisque l’objectif est d’évaluer l’efficacité des plasmas à gaz sur la cicatrisation d’une plaie en vue d’une standardisation de son utilisation chez l’être humain. Ainsi, il n’est pas possible de remplacer les animaux par un modèle in vitro qui permettrait de représenter au mieux un cas clinique. Age des souris = 6-7 semaines. Les souris doivent être de jeunes adultes pour pouvoir faire les biopsies (décrits dans les modèles publiés) et avoir un système immunitaire mature.

3 132 souris transgéniques humanisées pour des molécules HLA vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections vaccinales sous-cutanées répétées et des prélèvements de sang à la veine sous-maxillaire, avant d'être tuées pour prélever la rate et d'autres organes. Le porteur vise un vaccin peptidique dit universel censé couvrir plus de 80 % de la population mondiale, un bénéfice renvoyé au développement futur. Sur le remplacement, il affirme que la réponse immunitaire après vaccination ne peut être reconstituée hors d'un "organisme entier" et juge "indispensable" le recours aux souris transgéniques.

Objectifs

Une avancée majeure dans le traitement des cancers a été réalisée au cours de ces dernières années grâce à l’utilisation de l’immunothérapie. L’immunothérapie consiste à réactiver les cellules du système immunitaire contre les cellules cancéreuses. Bien que très efficace chez certains patients, une large proportion de personnes atteintes par le cancer ne répond pas à ces nouvelles thérapies (environ 80% des patients). De nombreuses études montrent à présent, que chez les patients traités par certaines immunothérapies, l’ajout d’une vaccination dirigée contre des cibles appelées «antigènes» présentes à la surface des cellules tumorales peut améliorer la destruction de la tumeur et induire une rémission ou une stabilisation des patients. Dans ce cas, l’efficacité de la réponse vaccinale dépend directement de la nature des antigènes sélectionnés pour cibler les tumeurs et de la capacité du système immunitaire à reconnaitre efficacement ces cibles tumorales. On appelle antigène toute substance capable de déclencher une réponse immunitaire visant à l'éliminer. Dans le cas des cancers, il s'agit le plus souvent de peptides (fragments de protéines) qui sont reconnus de manière spécifique par certains globules blancs, les lymphocytes T CD8 (étudiés dans le cadre de ce projet). Nous avons développé une méthode pour identifier des cibles tumorales très efficace pour détruire les tumeurs, consistant à activer le système immunitaire avec des antigènes bactériens très semblables à certains antigènes tumoraux. L’utilisation d’antigènes bactériens permet de réactiver une réponse immune similaire à celle pouvant exister lors d’une infection bactérienne et d’induire une réponse contre les tumeurs similaires à celle observée contre un pathogène étranger. Utilisés pour la vaccination des patients, ces antigènes bactériens semblables aux antigènes tumoraux pourraient devenir un nouvel outil pour le traitement des cancers. L’objectif de notre projet est de développer un vaccin thérapeutique efficace qui ciblerait la grande majorité de la population mondiale.

Bénéfices attendus

Les objectifs pour ce projet sont d'étendre nos connaissances scientifiques sur le mimétisme moléculaire peptidique à d'autres HLA et de développer un vaccin peptidique universel (pour tous).

Procédures

Les interventions auxquelles les souris seront soumises sont les suivantes pour la 1e procédure expérimentale (Immunisation par méthode prime-boost): • Vaccination par injection sous-cutanée : 2 injections à 14 jours d’intervalle • Prélèvement sanguins sur animaux vigiles : 3 prélèvements (le premier 4 jours avant la vaccination, puis 10 et 17 jours après la vaccination). Pour la procédure expérimentale n°2 (Cinétique de vaccination) : • Vaccination par injection sous-cutanée : 5 injections à 7 jours d’intervalle • Prélèvement sanguins sur animaux vigiles : 4 prélèvements (le premier 4 jours avant la vaccination, puis 10, 17 et 31 jours après vaccination)

Impact sur les animaux

Lors de l’immunisation des animaux et du suivi des cinétiques de vaccination, douleurs légères associées à une injection sous-cutanée et à des prélèvements de sang par voie sous-maxillaire (plaie réduite au point d’injection ou de prélèvement, œdème).

Devenir

Tous les animaux de cette procédure seront euthanasiés en fin d'expérience afin de pouvoir prélever leur rate et autres organes pour effectuer les analyses in vitro.

Remplacement

La mise en place d’une réponse immunitaire après vaccination est un phénomène complexe. Cela implique la reconnaissance des antigènes par des cellules spécifiques et la collaboration de différents types cellulaires (lymphocytes T, B et cellules présentatrices d’antigène). L’efficacité de la réponse immunitaire est favorisée par de nombreux facteurs solubles provenant du microenvironnement dans lequel l’antigène est présenté. Ces particularités (collaboration de différents types cellulaires et microenvironnement) ne peuvent pas actuellement être reconstituées en dehors d’un organisme vivant. L’étude d’une réponse immunitaire après vaccination sur organisme entier ne peut donc être remplacée et n’a pas d’équivalent expérimental n’utilisant pas d’animaux. Il est donc indispensable d’avoir recours aux modèles animaux transgéniques pour le HLA humain pour récapituler ces interactions complexes antre cellules et microenvironnement afin de démontrer la mise en place d’une réponse immunitaire après vaccination. Ce projet ne vise pas à l’évaluation directe d’une réponse anti-tumorale chez l’animal. La vaccination sera réalisée chez des animaux non porteurs de tumeur.

Réduction

En amont, 2 étapes ont permis de réduire le nombre de peptide et d’animaux qui seront utilisés : 1/ Une analyse in silico et la réalisation de tests in vitro ont permis de sélectionner un nombre restreint de peptides vaccinaux immunogènes et de forte affinité pour les HLA ciblés. 2/ L’analyse in silico via l’outil en ligne tools.iedb.org/population/ a permis de déterminer que le ciblage de 3 HLA-A (parmi les 68 possibles) et 2 HLA-B (parmi les 125 possibles) permet une couverture de 80% de la population mondiale. La réduction du nombre d’animaux a été réalisée pour permettre d’obtenir un nombre suffisant de données pour répondre à la problématique. L’utilisation d’outils statistiques du calcul de puissance de test et de taille d’échantillons (https://biostatgv.sentiweb.fr/?module=etudes/sujets#), permet de définir un nombre minimal d’animaux de 12 par groupe, en considérant un seuil de significativité à p

Raffinement

Le bien-être des animaux étant primordial, les souris sont acclimatées au moins 7 jours avant le début de la procédure expérimentale. A réception, les souris sont hébergées par 7 maximum par cage pour les femelles et 6 maximum par cage pour les mâles. Les animaux seront maintenus dans des conditions environnementales contrôlées (température, humidité, cycle jour/nuit), dans un espace suffisant, en groupe pour maintenir les interactions sociales, et avec un enrichissement environnemental permettant de répondre aux besoins physiologiques et comportementaux des souris (présence de petite maison permettant aux animaux de se cacher). Toutes les manipulations seront réalisées dans le respect de l’animal. Le temps de manipulation des animaux sera de plus réduit au maximum afin de réduire le stress des animaux et l’impact possible sur la réponse immunitaire. La procédure expérimentale (vaccination) est de classe de gravité légère et ne nécessite pas d’y associer un protocole d’anesthésie. Les prises de sang régulières seront effectuées afin de suivre l’évolution dans la circulation sanguine la reponse immunitaire, ce qui élève le niveau de la procédure à une classe modérée. Ces prélèvements de sang seront effectués à la veine sous-maxillaire, 1 fois par semaine (ou tous les 15jours), selon le chronogramme prédéfini (cf annexe). Un volume total prélevé inférieur à 10% du volume sanguin de l’animal (soit au total environ 100µL/semaine ou 200µL/15jours, pour une souris de 25g) sera effectué afin de ne pas causer de dommage aux animaux. Toujours pour le bien-être de l’animal, le prélèvement sera effectué par alternance sur les 2 côtés.

Choix des espèces

Le principe de la vaccination repose sur la présentation des antigènes par le système HLA chez l’Homme. Le système de présentation antigénique est différent d’une espèce à l’autre. Ainsi les antigènes reconnus chez la souris peuvent être très différents de ceux reconnus chez l’homme car présentés par des molécules CMH (complexe majeur d’histocompatibilité) différents. Le vaccin final développé dans le cadre de ce projet représente un mélange de plusieurs peptides restreints par le HLA. Ce vaccin sera un vaccin HLA universel qui traitera une grande majorité des patients cancéreux (prédiction >80%) car ciblant les HLA du locus A et B les plus représentés chez l’homme (HLA-A1, HLA-A3, HLA-A24, HLA-B7, HLA-B35 et HLA-A2). Ce projet nécessite donc l’utilisation de souris dites humanisées transgéniques pour les différents HLA humains et parfaitement caractérisées pour leurs réponses aux vaccins peptidiques humains (HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A24, HLA-B7 ou HLA-B35 restreint). Le modèle de souris transgéniques humanisées pour les différents HLA-A et HLA-B sont des modèles existants et relevant pour étudier l’immunogénicité de ces vaccins destinés à l’homme. Les études pourront être réalisées sur des souris adultes âgées au début de l’expérimentation de 7 jusqu’à 15 semaines, âge où le système immunitaire est mature et donc à partir duquel une réponse immunitaire peut être correctement évaluable. Pour chaque étude, des souris d’âges similaires seront utilisées (plus ou moins une semaine). En cas de variation de plus d’une semaine, les animaux seront répartis de façon équilibrée dans chacun des groupes afin d’assurer l’homogénéité des groupes.

1 010 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyse de leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une chirurgie stéréotaxique détruit leurs neurones dopaminergiques à la 6-OHDA et implante fibres optiques et électrodes, avant des tests comportementaux sur plusieurs semaines, une restriction alimentaire pour les tests de Skinner et une perfusion intracardiaque terminale. Le porteur étudie le rôle du zinc synaptique dans la maladie de Parkinson et renvoie d'éventuelles stratégies thérapeutiques au conditionnel. Il affirme que le recours aux souris génétiquement modifiées est "indispensable" faute d'outil pharmacologique ciblant le zinc synaptique.

Objectifs

Ce projet vise a élucider le rôle du zinc synaptique dans le développement des symptômes moteurs et non-moteurs de la maladie de Parkinson. Nous utilisons une panoplie d'outils de pointes de génétiques et d'optogénétiques pour cibler les neurones libérant le zinc synaptique et révéler la mise en jeu du zinc synaptique dans le development des symptôme de la maldie. Ce projet de recherche devrait aboutir à une meilleure compréhension de la physiopathologie de la maladie de Parkinson.

Bénéfices attendus

La chélation du zinc a été proposée comme piste thérapeutique pour la prise en charge des maladies neurovégétatives comme la maladie d’Alzheimer. Ce projet de recherche devrait permettre une meilleure compréhension du rôle physiopathlogique du zinc synaptique dans la maladie de Parkinson et pourrait aboutir à de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant les neurones gluzinergiques dans le contexte de la maladie de Parkinson et d'autres maladies aparentées.

Procédures

Les animaux seront soumis à 1) une stéréotaxique sous anesthésie générale profonde réalisée une seule fois (durée 30-90 min selon le type d’intervention) combinant la lésion des neurones dopaminergique avec une implantation des fibres optiques et/ou des électrodes d’enregistrement, 2) des tests comportementaux pour évaluer les effets bénéfiques des divers modulations optogénétiques sur les fonctions motrices et cognitifs (3-6 semaines d’analyse avec 1 à 5 jours séparant deux test comportementaux successifs durant 5-30 min chacun), 3) une restriction alimentaire légère et temporaire lors des tests cognitifs de Skinner et 4) une perfusion intracardiaque (5-6 min) pour mener des analyses complémentaires au niveau cellulaire.

Impact sur les animaux

La procédure lésionnelle utilisée (lésion unilatérale complète ou lésion bilatérale partielle à la 6-OHDA) a été largement caractérisée par la communauté scientifique et elle est considéré comme l’outil de choix pour modéliser certains symptômes moteurs (ralentissement moteur, déficit d’initiation du mouvement et asymétries posturales) et non-moteurs (déficits cognitifs, comportement anxieux et dépressifs).

Devenir

Mise à mort à la fin de la procédure pour mener des analyses au niveau cellulaires. Les marquages immunohistochimiques sont indispensables pour vérifier l'étendue des lésions dopaminergiques, l'expression des opsines, les localisations des fibres optiques et des microélectrodes au niveau des structures ciblées.

Remplacement

Ce projet de recherche repose sur la modélisation de déficits comportementaux chez la souris qui ne peuvent être abordés via l’étude d’organismes modèles phylogénétiquement moins évolués, ou à fortiori des outils moléculaires in-vitro. La maladie de Parkinson fait intervenir des mécanismes complexes nécessitant l'utilisation d'animaux pour créer un modèle pouvant reproduire les symptômes de cette maladie. La dégénérescence progressive des neurones dopaminergiques induite par la neurotoxine sélective des neurones catécholaminergiques (6-OHDA) s’accompagne d’une réorganisation fonctionnelle des circuits neuronaux des GB qui sous-tend le développement et l’expression des symptômes de la maladie de Parkinson. De fait, il est nécessaire de prélever le cerveau entier pour les analyses immunohistochimiques et biochimiques. Les cultures cellulaires ou organotypiques ne peuvent répondre à ce type de recherche.

Réduction

Ce projet, d'une durée de cinq ans, nécessitera l'utilisation de 1010 souris mâles et femelles adultes, réparties en plusieurs groupes (n= 10 à 14/groupe en fonction du type d’expérience). Il repose sur l’utilisation d’une procédure lésionnelle et tests comportementaux robuste et largement validés par la communauté scientifique internationale, ce qui permet d’utiliser le minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des données fiables. L’estimation du nombre est basée sur une approche statistique permettant de vérifier notre hypothèse à 80% de chances pour un seuil de significativité de 5% . Cependant, l’effectif des groupes pourra être réduit en fonction des résultats marquants obtenus dans les tests comportementaux.

Raffinement

La chirurgie stéréotaxique pour effectuer la lésion dopaminergique, l’implantation les fibres optiques, et les optrodes a été optimisée pour réduire la durée de l’opération et minimiser la souffrance grâce à notre expérience depuis de nombreuse années dans ce type d’expérimentation. La souffrance est modérée car la chirurgie est réalisée sous anesthésie profonde. Les principaux paramètres vitaux (température, fréquence respiratoire) sont également contrôlés tout au long de la chirurgie. Afin de diminuer la douleur, un analgésique morphinique puissant à action prolongée (buprénorphine), est administré en préopératoire. En complément, un analgésique anti-inflammatoire (Caprofène dilué dans 1ml de NaCl) est administré par précaution en début et fin d'opération pour anticiper l’apparition d’éventuelles douleurs et hydrater l’animal puis en postopératoire pendant au moins 3 jours, la durée de traitement dépendant de la réponse observée. Les animaux ne présentent pas de signes de souffrance ni stress après réveil de l’anesthésie. Le personnel animalier et expérimentateurs s’assurent d’une bonne récupération postopératoire des animaux. Une grille d’évaluation clinique est mise ne place pour évaluer des signes de souffrance ou mal-être potentiels des animaux. Pendant la période post-opératoire des trois semaines, les animaux sont hébergés dans la pièce de post-chirurgie chauffée à 25°C, et le rythme des visites est augmenté (2 visites par jour). Après la période de récupération post-opératoire, les animaux sont remis dans leur pièce d’hébergement habituelle à l’animalerie et ne sont manipulés par l’expérimentateur en charge qu’après une période de réhabituation d’une à deux semaines. Ils sont hébergés en petits groupes (2 à 4) dans des cages individuellement ventilées (Techniplast), avec eau et nourriture à volonté. Ils ont à leur disposition de la litière foisonnante (diminuant le stress de l’animal et facilitant sa thermorégulation) ainsi que des bûchettes en peuplier et des tubes en PVC pour favoriser le bien-être et l’interaction sociale. L’analyse comportementale est réalisée chez les animaux vigiles qui ne doivent pas être stressés pour ne pas compromettre leurs performances. Pour celà, ils sont manipulés quotidiennement 3 à 4 jours avant le début des tests comportementaux et familiarisés à la connexion des fibres optiques ou des électrodes pour s’habituer à se mouvoir dans les différents environnements sans stress.

Choix des espèces

L’utilisation de la souris est justifiée car elles représentent le modèle expérimental de choix pour étudier à travers des approches génétiques et optogénétiques les mécanismes physiopathologiques des maladies mentales liées à l’atteinte des ganglions de la base. Le recours aux souris génétiquement modifiées est indispensable dans le contexte de ce projet à cause de l’absence d’outils pharmacologiques permettant de cibler sélectivement le zinc synaptique ou empêcher son action sélectivement au niveau d’un type de récepteurs glutamatergiques. Comme pour tous nos travaux précédents, nous utiliserons des animaux adultes âgés à partir de 12 semaines. Ce temps est nécessaire pour que le système nerveux soit mature et est classiquement utilisé pour mesurer les performances comportementales de souris adultes. Ceci nous permet de comparer les résultats obtenus avec nos données antérieures et celle de la littérature.