Procédures modérées

1 140 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, environ 855 conservés comme reproducteurs et les autres tués faute de porter la modification génétique recherchée. Les adultes subissent une coupure de nageoire pour vérifier leur génotype, leurs embryons servant à modéliser des maladies génétiques humaines rares. Le porteur décrit l'imagerie sur embryon comme non invasive. Il affirme que la souris ou le xénope ne permettent pas de modéliser ces pathologies alors que le poisson zèbre le permet.

Objectifs

Notre projet vise à caractériser les mécanismes génétiques et physiologiques gouvernant le développement de ribosomopathies (pathologies génétiques humaines) en utilisant le poisson zèbre Danio Rerio comme organisme modèle. Afin de pouvoir étudier les cascades moléculaires et génétiques en action au cours de l'établissement de ces pathologies, il nous faut altérer ou visualiser l'activité de gènes d'intérêt et la synthèse des ribosomes dans des tissus cibles. Nous utilisons la transgénèse et la mutagenèse dirigée pour établir des lignées mutantes ou transgéniques stables. Nos recherches se focalisent les événements précoces de ces ribosomopathies qui interviennent avant 5 jours de développement embryonnaire. Nous génèrerons 11 Lignées pour ce projet : (A) 5 lignées transgéniques : 4 lignées transgéniques ciblant spécifiquement 4 tissus : Tg(crêtes neurales::CRE) ,Tg(sang::CRE), Tg(lignée germinale::CRE) et Tg(système neural::CRE) pour visualiser les étapes précoces de la mise en place des pathologies dans ces tissus, 1 lignée transgénique permettant de quantifier la synthèse des ribosomes in vivo : Tg(ribo:Tag) et (B) 6 lignées mutantes des génes humains et candidats impliqués dans les ribosomopathies: tsr2, rpsa, rpn1, hspa, et deux nouveaux génes (ribo1, ribo2) pour modéliser et analyser le rôle possible de ces gènes candidats dans le développement des ribosomopathies.

Bénéfices attendus

Le projet nous permettra d’établir des lignées transgéniques et mutantes qui nous servirons pour modéliser les ribosomopathies qui ne sont pas modélisables chez d'autres modèles vertébrés comme la souris ou le xénope. Ces outils seront alors largement accessibles à la communauté scientifique pour comprendre plus largement le rôle de ces gènes dans différents processus physiologiques.

Procédures

Afin de valider leur génotype les animaux subiront un coupure de la nageoire au stade adulte. Les animaux générés par la suite seront utilisés à des fins reproductives, seuls leurs embryons dans les phases de développement autonomes (avant 5 jours de développement) seront utilisés pour les expérimentations.

Impact sur les animaux

A ce jour, nos expériences n'indiquent pas d'effets indésirables pour les lignées transgéniques à l'état hétérozygote et homozygote. Enfin, le génotypage des adultes pourrait induire un stress qui sera surveillé attentivement.

Devenir

Idéalement, nous aimerions conserver la totalité des animaux mais tous les adultes ne seront pas porteurs de la mutation et nous choisirons les allèles mutants les plus facilement identifiables et les lignées transgéniques les plus robustes pour ne conserver en moyenne les 3/4 des animaux reproducteurs (1140 X3)/4 = 855 animaux. Les autres qui ne portent pas l'événement génétique requis seront mis à mort.

Remplacement

Nous développons actuellement des modèles théoriques mathématiques pour simuler numériquement les expérimentations et ne tester biologiquement que les expériences ayant un intérêt pré-validé.

Réduction

L'équipe s'intéresse uniquement à des processus embryonnaires. Par conséquent, les poissons adultes gardés au laboratoire sont consacrés uniquement à la reproduction et à l'observation ne sont soumis à aucune expérimentation. Le nombre d'individus hébergés correspond au nombre minimal nécessaire au maintien des lignées et à la production d'œufs nécessaires à notre expérimentation et observation. Nous prenons soin de faire évoluer nos protocoles expérimentaux afin de réduire le nombre d’individus hébergés dans l’animalerie. Notamment, l’amélioration récente de nos techniques de mutagénèse grâce au développement de protocoles utilisant le système CRISPR/Cas9, nous a permis de réduire drastiquement le nombre de fondateurs nécessaires à l’établissement de nouvelles lignées. Nous utilisons les individus hétérozygotes comme "contrôles équivalents" pour avoir dans un même croisement d'individus hétérozygotes tous les génotypes d'intérêt pour nos expérimentations. Enfin, nous pouvons générer des individus adultes porteurs de transgènes et de mutations pour réduire le nombre d'adultes utilisés dans nos expérimentations.

Raffinement

Tout est fait dans ce projet pour que nos adultes soient dans les meilleures conditions pour pouvoir se reproduire afin que nous obtenions nos précieux embryons. De plus, nous utilisons principalement des méthodes non invasives d'imagerie de l'embryon en temps réel sur du vivant pour modéliser les ribosomopathies.

Choix des espèces

Notre équipe s’intéresse à comprendre les mécanismes modélisant les ribosomopathies humaines affectant le développement cranio-facial et l’hématopoïèse. Une approche in vivo sur un animal vertébré est nécessaire pour comprendre ces processus dynamiques. Cependant, les modèles murins ne sont pas adaptés pour modéliser ces pathologies alors que le poisson zèbre le permet. Il présente de nombreux avantages dont la possibilité de procéder à de l'imagerie « in vivo » grâce à la transparence de ses embryons. Ce modèle, permet aisément et de façon non-invasive, le recourt à la transgénèse et la mutagénèse dirigée pour établir les lignées mutantes ou transgéniques stables nécessaires à la dissection des processus moléculaires impliqués. De plus, contrairement, aux autres modèles génétiques vertébrés, les poissons ont un développement embryonnaire externe permettant d'avoir accès à ses embryons facilement pour observer le développement précoce de ces pathologies (impossible chez un mammifère) et surtout sans sacrifier l'animal ni lui infliger de douleur. L'ensemble de nos processus développementaux d'intérêt et donc de nos expérimentations se déroulement entre le stade 1 cellule (oeuf) et 5 jours après la fécondation, stade auquel les larves de poissons zèbre ne sont pas encore autonomes. Les adultes sont utilisés uniquement à des fins reproductives et d'observation.

416 rats et 444 souris vont être utilisés, tous tués à l'issue par exposition au CO2, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les rats sont infectés par le parasite S. ratti pour entretenir la lignée parasitaire, les souris vaccinées jusqu'à quatre fois puis infectées à deux reprises, avec trois prélèvements sanguins. Le projet teste si des biothérapies anti-allergiques nuisent aux défenses contre les vers parasitaires. Le porteur affirme que cette immunité complexe ne peut être reproduite in vitro et que le maintien du parasite impose le recours aux rats.

Objectifs

Les infections par les vers parasitaires touchent actuellement près de 1/4 de la population mondiale. A l’heure actuelle, les mécanismes innés et adaptatifs de défense contre ces parasites ne sont pas complètement compris. L’immunité « de type 2 » impliquant les IgE, les cytokines IL-4 et IL-13 et les mastocytes joue un rôle très important dans les pathologies allergiques. De ce fait, de nombreuses biothérapies développées actuellement pour traiter les allergies ciblent cette immunité de type 2. Cependant, les mêmes acteurs cellulaires et moléculaires sont également impliqués dans la défense contre certains parasites. Il est donc très important de tester l’effet de ces nouvelles biothérapies anti-allergiques sur les réponses contre des parasites, afin de s’assurer de la sureté de ces approches.

Bénéfices attendus

L'immunité adaptative (principalement la réponse anticorps) joue un rôle fondamental lors d’une réinfection avec le même parasite. Les mastocytes jouent un rôle important lors des infections primaires et secondaires, permettant l’expulsion des parasites. Cependant, les sous-populations de mastocytes (connectifs versus mucosaux) et les mécanismes permettant aux mastocytes de jouer ce rôle de défense ne sont pas bien connus. Notre laboratoire développe des stratégies vaccinales et des biothérapies pour le traitement de l’asthme et des allergies, ciblant principalement les cytokines de type 2 (IL-4 et IL-13), les IgE et les mastocytes. Il est très important de vérifier que ces biothérapies n’auront qu’un effet limité sur les défenses anti-parasitaires afin de s’assurer de la sureté de ces nouvelles approches thérapeutiques.

Procédures

Un total de 416 rats sera infecté en sous-cutané avec le parasite S. ratti afin de collecter des larves dans leurs fèces. Les rats seront mis à mort par exposition au CO2 après 9 jours au plus tard (procédure 1). Un total de 192 souris sera immunisé un maximum de 4 fois aux jours 0, 7, 28 et 49 en intramusculaire dans la cuisse arrière avec une formulation de vaccin dirigé contre l’IL-4, l’IL-13 ou les IgE dans un volume de 50 µL (procédure 2). Un total de 96 souris sera injecté en intrapéritonéal deux fois par semaine pendant 3 semaines (6 injections au total) avec un conjugué SCF-doxorubicine (10mg/kg maximum dans 200 µL de PBS) (procédure 3). A l’issue des procédures 2 et 3, l’ensemble des souris ainsi que 156 souris additionnelles (soit un total de 444 souris) seront ensuite injectées en sous-cutané avec des larves de parasite S. ratti pour un total de deux fois à 28 jours d’intervalle. Nous réaliserons trois prélèvements sanguins à la veine mandibulaire sous anesthésie gazeuse (isoflurane 3%) aux jours 0, 7 et 21 (procédure 4).

Impact sur les animaux

D’après les données de la littérature et notre expérience antérieure avec ce modèle, l’infection avec le parasite S. ratti n’induit pas de signes visibles de douleur ou de comportement anormal chez les animaux.

Devenir

A l’issue de la procédure 1, tous les animaux seront mis à mort par exposition au CO2. L’ensemble des animaux des procédures 2 et 3 seront utilisés dans la procédure 4. Et à l’issue de la procédure 4, l’ensemble des animaux sera mis à mort par exposition au CO2.

Remplacement

Les mécanismes de défense contre les nématodes (parasites) sont complexes et nécessitent l’action concertée de plusieurs types de cellules immunitaires et d'anticorps. Ceci ne peut être reproduit in vitro. De plus, le maintien de ces nématodes ne peut être fait in vitro et nécessite donc l’utilisation de rats pour maintenir la lignée parasitaire.

Réduction

L'expérience du porteur du projet dans l'analyse de ces divers modèles de pathologies et la présence des données préliminaires nous permettent d'anticiper et d'optimiser le nombre d’animaux à analyser dans chaque modèle. Nous utiliserons une moyenne de 4 animaux par groupe de même âge et sexe pour chaque expérience. Les expériences seront répétées 3 fois de manière indépendante afin d’assurer la validité de nos résultats. Les tests statistiques seront effectués avec le logiciel Graph-Pad Prism. En fonction du type d’expérience, du nombre d’échantillons analysés et de la distribution des valeurs nous choisirons un des tests statistiques suivants : 1- way ou 2-way ANOVA, Mann-Whitney ou unpaired 2-tailed Student’s t test ; nous considèreront une valeur de P significative si elle est inférieure à 0.05.

Raffinement

Le bien-être de l’animal est un facteur de variabilité expérimentale que nous prenons en considération grâce au suivi quotidien des animaux. Ce suivi permet d'évaluer l'état général des animaux (prise de nourriture, toilettage, mouvements), l’enrichissement de leur environnement et le respect de l’aspect social du groupe (4 à 5 animaux par cage, pas d’isolement ni de changement de cage). De plus, un enrichissement sera rajouté aux animaux (carrés de coton pur ou du papier absorbant) permettant aux animaux de faire une nidation, selon la directive européenne 2010/63/UE. Pour chaque procédure des points limites ont été définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera euthanasié s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure. Enfin, les personnes responsables du projet ont été formées à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques ; elles garantissent de la formation et de l’encadrement des autres expérimentateurs impliqués dans les procédures expérimentales.

Choix des espèces

La souris représente le modèle animal le plus utilisé pour étudier la physiopathologie des maladies humaines. En effet, l’élevage de souris est très productif (avec une variation possible en fonction des fonds génétiques étudiés) et nécessite peu de place. Les connaissances et avancées technologiques actuelles permettent de disposer de nombreux modèles sophistiqués. D’ailleurs, la majorité des animaux transgéniques nécessaires à la réalisation de ce projet sont uniquement disponibles chez la souris et sous un fond génétique bien contrôlé. Enfin, la physiologie des différents organes chez la souris présente de nombreuses similarités avec celle des organes humains, ce qui permet l’induction de modèles pathologiques mimant les maladies humaines observées chez les patients. Les rats Wistar sont utilisés pour la conservation de la souche S.ratti. Comme le rat est l’hôte naturel de S.ratti, les rats de Wistar permettent d’obtenir facilement la quantité de vers nécessaires pour les expériences qui seront réalisées chez la souris. Pour la majorité des expériences, les souris seront utilisées entre 8 et 12 semaines, ce qui correspond à de jeunes adultes qui possèdent un système immunitaire bien développé et mature. Les animaux seront utilisés à 6 semaines uniquement pour les procédures 2 et 3 (vaccination anti-IL4, anti-IL13 ou anti-IgE et déplétion des mastocytes).

630 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit sous la peau une greffe de fragment de tumeur prélevé chez un patient, puis des traitements par voie orale ou sous-cutanée, la tumeur pouvant provoquer de la souffrance. Le porteur teste de nouveaux traitements de lymphomes T avant un éventuel passage à l'humain et affirme que les lignées cellulaires ont un "intérêt très limité". Sa rubrique sur le raffinement se réduit à l'annonce de points limites et d'une grille de surveillance.

Objectifs

Notre projet a pour objectif d’évaluer de nouveaux traitements des lymphomes chez la souris, avant un éventuel passage à l’Homme.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de sélectionner les traitements les plus efficaces (seuls ou en association) et les mieux tolérés chez la souris, puis de mettre en place un essai clinique chez l’Homme afin d’évaluer la tolérance et l’efficacité de ces nouveaux traitements.

Procédures

1) Greffe d'un fragment d'une tumeur humaine primaire, qui sera placée sous la peau des souris après courte incision sous anesthésie générale. 2) Administration des traitements : les souris recevront différents traitements, seuls ou en combinaison, par voie orale ou sous-cutanée. Au total, il y aura 4 expériences pour la procédure 1 et 3 pour la procédure 2. Chaque expérience durera 3 semaines maximum.

Impact sur les animaux

Le principal effet indésirable est lié au développement de la tumeur sous-cutanée, qui peut induire de la souffrance. Nous serons donc très attentifs au bien-être des animaux. Afin de ne pas causer de souffrance, la mise à mort sera pratiquée lorsque le volume de la tumeur atteindra un certain volume ou en cas de signes cliniques. Durant les protocoles expérimentaux, un suivi clinique minimal 2 fois/semaine sera mis en place afin de surveiller l’apparition de signes de souffrance. Le cas échéant, l’animal sera mis à mort. De cette manière, la souffrance liée au développement de la maladie sera réduite au minimum.

Devenir

Mise à mort de l'animal à l'issue de chaque procédure.

Remplacement

Les cellules tumorales des patients sont fragiles et ne peuvent être utilisées au laboratoire pour évaluer de nouveaux traitements. L’utilisation de lignées cellulaires de lymphomes a un intérêt très limité, car les cellules sont différentes des cellules tumorales des patients. Pour être au plus proche de la pathologie humaine, nous greffons directement un fragment de tumeur de patient sous la peau des souris. Ce modèle est difficile à mettre au point et très précieux. Il permet d’évaluer de nouveaux traitements chez les souris, avant leur évaluation chez l’Homme.

Réduction

Ce projet nécessitera 630 souris sur 5 ans. Le nombre d’animaux a été réduit au minimum, après estimation des effectifs, afin de garantir l’obtention de résultats statistiquement significatifs et cliniquement pertinents, à l’aide de simulations informatiques (invivostat).

Raffinement

Tout au long de ce projet, nous serons attentifs au bien-être des animaux et avons défini des points limites précoces, évaluables à l’aide d’une grille que nous avons établie, dans le but de ne pas causer de souffrance animale.

Choix des espèces

Les souris sont très utilisées dans la recherche en général, et spécifiquement dans la recherche contre le cancer. De nombreux modèles ont été développés, proches de la pathologie humaine, permettant d’évaluer de nouveaux traitements contre le cancer. Cela permet aussi de comprendre les mécanismes d’action de ces traitements, et de pouvoir les améliorer pour les rendre plus efficaces et mieux tolérés.

440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour reproduire une mutation liée à l'autisme, elles subissent une chirurgie cérébrale d'environ une heure avec pose de fibres optiques, puis des tests comportementaux courts ou un enregistrement électrique de six heures. Le porteur stimule des zones du cerveau par la lumière pour tenter de corriger le comportement et qualifie cette approche in vivo d'"indispensable". Il déclare des effets indésirables limités à un "léger stress" lié à la chirurgie.

Objectifs

Les Troubles du Spectre Autistique représentent un ensemble de pathologies neurodéveloppementales touchant 1 enfant sur 160 dans le monde. Les symptômes sont répartis en 2 grandes catégories : apparition de déficits dans l'interaction et la communication sociale et des comportements moteurs inappropriés, répétitifs et stéréotypés. Ils apparaissent à partir de 3 ans et se prolongent chez l’adulte. Bien que de nombreuses causes tant génétiques qu’environnementales, aient été mises en évidence grâce aux études actuelles, le mécanisme commun expliquant le développement de la pathologie reste encore à utiliser. Pour cela, l’utilisation de modèle animaux reste donc cruciale. Notre équipe étudie notamment l’influence d’un gène identifié chez les patients comme faisant partie des plus fréquemment muté (SCN2A). Il code pour une protéine impliquée dans l’activité électrique des neurones. Ce projet se base sur l’étude d’un modèle de souris portant une mutation du gène SCN2A entrainant une diminution de l’excitabilité neuronale et dont les troubles comportementaux reproduisent ceux retrouvés chez les patients. Ce projet se déroulera sur 5 ans et propose d’identifier les régions cérébrales impliqués dans différents comportements autistiques chez ces souris (communication sociale et anxiété). Pour cela, nous utiliserons une protéine (activable par la lumière) pour stimuler différentes zones cérébrales d’intérêt à l'aide d'un laser pendant les tests. Cela aura pour but de compenser la présence de la mutation et le manque d'excitabilité des neurones, ce qui rétablira le comportement si les zones cérébrales étudiées sont impliquées.

Bénéfices attendus

Une meilleure compréhension des mécanismes menant au développement de l'autisme et/ou de l'épilepsie chez le modèle animal est indispensable pour expliquer l'apparition des symptômes et leur développement au cours du temps chez l'Homme. La mise en évidence de zones cérébrales et de certaines connexions neuronales spécifiquement impliquées dans les différents troubles comportementaux observés permettent à la fois de comprendre le fonctionnement naturel des comportements étudiés (ex: communication dans un contexte social) et d'avoir des cibles précises sur lesquelles avoir une action thérapeutique précoce pour limiter ou empêcher l'apparition des symptômes.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale d'environ 1 heure (injection de l'outil permettant la production de la protéine activable par la lumière dans les zones cérébrales d'intérêt et pose de fibres optiques permettant de l'activer), puis à un test comportemental (de 3 ou 5 min) ou à un enregistrement de l'activité électrique des neurones = électrocorticogramme (6 heures).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables liés à ce projet sont peu nombreux. En effet, l'étape de chirurgie est la seule susceptible de causer un léger stress à l'animal. En outre, toutes les mesures seront prises pour éviter toute souffrance à l'animal lors de cette étape. Nos tests comportementaux sont peu stressants car ils sont basés sur des comportements naturels d'exploration, sont de courtes durées (3-5min) et se déroule avec une faible luminosité environnante contrôlée pour ne pas ajouter un stress supplémentaire.

Devenir

Tous les animaux utilisés lors des procédures seront mis à mort pour prélever les cerveaux dans le but de vérifier le bon positionnement des injections de l'outil, des fibres optiques et des électrodes.

Remplacement

Nous avons établi notre projet de recherche en tenant compte de la règle des 3R. Ainsi, afin de répondre au principe de remplacement, nous réaliserons, parallèlement aux expérimentations sur animal vivant, quand cela sera possible, des études sur culture de neurones ou tranches de cerveau. Cependant, les études fonctionnelles basées sur la stimulation des neurones et leur impact sur la réponse comportementale ne peuvent être réalisées que sur animal vigile. Cette approche in vivo est donc indispensable pour modéliser et étudier au mieux le phénotype clinique associé aux Troubles du Spectre Autistique.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés dans ce projet a été réduit au maximum tout en nous permettant d'obtenir des résultats interprétables. Nous comparerons pour chaque test 4 groupes d'animaux : souris sauvages et mutantes, avec ou sans stimulation lumineuse. Nous avons calculé nos besoins en animaux via une méthode statistique adaptée. Un maximum de 20 animaux seront donc utilisés par groupe pour les procédures. Les 2 sexes seront utilisés pour réduire la production nécessaire en termes de nombre d'animaux (mâles pour la communication sociale et femelles pour le test d'anxiété).

Raffinement

Toutes les mesures de raffinement appropriéees seront prises pour éviter toute souffrance ou inconfort à l’animal. Toutes les souris seront élevées dans un environnement enrichi (social et physique) et une manipulation régulière des animaux sera réalisée afin de réduire leur stress. Les procédures chirurgicales seront réalisées par des expérimentateurs habilités à pratiquer la chirurgie dans des conditons optimales pour le bien-être des animaux (prise en charge de la douleur, soins pré/post opératoire, suivi quotidien, etc.). Un autre exemple de mesure de raffinement sera l'administration d'un anti-inflammatoire dans l'eau de boisson pendant la période post-opératoire. Un suivi journalier permettra d’évaluer leur état de santé et ainsi d’intervenir rapidement par rapport aux points limites définis, par application d'une grille de critères. Exemples: Désinfection de plaies, administration d'antalgique, injection de solution saline glucosée pour l'hydratation, manipulation de l'animal, séparation de congénaire agressif ou euthanasie.

Choix des espèces

Nous utilisons une des rares lignées de souris génétiquement modifiées actuellement disponibles pour l'étude de notre mutation in vivo. Nous travaillerons sur des souris ayant une réduction de 50% de la production de notre protéine d'intérêt (espèce très largement utilisée pour les études comportementales) obtenues à partir de croisements de souris mutantes avec des souris sauvages. Les protocoles utilisés ont été choisis par rapport à la littérature basée sur la même espèce. Les animaux seront utilisés à 2 stades de développement : Jeunes et Adultes. Les Troubles du Spectre Autistiques apparaissant chez l'enfant autour de 3 ans et se maintenant à l'âge adulte, ces deux phases sont à étudier pour comprendre les circuits neuronaux impliqués dans l'apparition des comportements autistiques, leur développement ainsi que les possibles adaptations neuronales (changements physiologiques ou pathologiques) se mettant en place au cours du temps.

160 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par le SARS-CoV-2 par voie nasale ou orale, gavés chaque jour avec des probiotiques, et subissent une perte de poids progressive avant un prélèvement sanguin intracardiaque terminal sous anesthésie et une autopsie. Le porteur teste l'efficacité de bifidobactéries contre l'infection et présente le hamster doré comme un "modèle de choix" par sa sensibilité au virus. La perte de poids attendue reste sous le seuil de 15 % fixé comme point limite.

Objectifs

L’intestin héberge naturellement des milliards de microorganismes, constituant le microbiote intestinal. Outre sa fonction dans la digestion, le microbiote exerce un rôle important dans la protection de l’organisme contre les pathogènes. Lorsque le microbiote intestinal est perturbé dans sa composition et/ou son fonctionnement, on parle de dysbiose. La dysbiose peut être due à un traitement antibiotique par exemple mais aussi liée à une pathologie. Chez certains patients atteints de la Covid-19, outre les symptômes classiquement observés, on peut constater parfois un tel déséquilibre de la biodiversité de la flore intestinale, associé à des symptômes gastro-intestinaux incluant des diarrhées. Par ailleurs, les analyses des selles de ces patients démontrent que le virus SARS-CoV2 peut survivre dans le tractus gastro-intestinal suggérant ainsi que ce dernier peut constituer un site extra-pulmonaire pour la multiplication et l’activité virale. De plus, le récepteur utilisé par le SARS-CoV2 pour infecter les cellules de l’hôte (fortement exprimé dans les cellules pulmonaires) est aussi présent dans les cellules épithéliales du tractus GI et joue un rôle essentiel dans le contrôle de l’inflammation intestinale et l'équilibre microbien. L’apport de probiotiques pourrait constituer une approche de traitement à 2 niveaux : 1/En exerçant un blocage du processus de fusion du virus aux cellules de l’hôte 2/en exerçant une activité de modulation des molécules de l'immunité. Le présent projet se propose d’évaluer l’efficacité de bifidobactéries sur l’infection à SARS-CoV2 chez le hamster doré. Deux probiotiques candidats (bifidobactéries) ont été retenus pour l'essai d'efficacité in-vivo.

Bénéfices attendus

Une activité immunomodulatrice des bifidobactéries associée à une activité de perturbation de la mutiplication du SARS-CoV2 permettraient de limiter l'infection par le SARS-CoV2 chez le hamster. Le bénéfice attendu est donc l'apport de la preuve que les bifidobactéries peuvent constituer un potentiel traitement contre l'infection au SARS-CoV2.

Procédures

Les hamsters vigiles seront traités par gavage oral quotidien (sonde) avec un volume de 200µL, soit 11 ou 13 gavages (durée = 2/3 secondes/gavage) selon les groupes Les hamsters de la procédure 1 seront infectés une seule fois par voie intra-nasale (40µl - animaux anesthésiés - durée = 15 secondes environ) Les hamsters de la procédure 2 seront infectés une seule fois par voie orale (200µl - animaux vigiles - 2/3 secondes environ) Les hamsters seront manipulés quotidiennement pour une pesée (11 à 14 pesées selon les groupes - durée = 10 secondes) Les hamsters seront anesthésiés (J+4 ou J+7) à l'isoflurane puis par injection de kétamine/xylazine afin de réaliser une prise de sang intracardiaque terminale avant autopsie (prooédure terminale de 15 minutes au total)

Impact sur les animaux

Une perte de poids, progressive et s’étalant sur une période allant de J+1 à J+6 post-infection, est attendue chez les hamsters infectés avec du SARS-CoV2. Hormis cette perte de poids, il n’y a pas de symptômes cliniques attendus durant la période d’infection. L’infection n’aboutit jamais à des décès non désirés. La perte de poids prend généralement fin à J+6 et n'excède pas 15% du poids constaté le jour de l'infection.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort afin de réaliser une autopsie et une collecte d'organes/sang pour étudier différents paramètres de l'infection.

Remplacement

Des experimentations préliminaires in-vitro ont été réalisées en amont du projet afin de sélectionner les souches candidates et de valider leur activité anti-protéase et immunomodulatrice. Néanmoins, l'évaluation de l'efficacité des traitements par probiotique (évalution de multiplication virale, la distribution, lésions associées) ne peut se faire in-vitro et nécessite de passer par le modèle animal.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été fixé à 16 afin d'avoir 8 animaux par point de mise à mort (J+4 et J+7) afin d'obtenir des résultats d'infection virale statistiquement significatifs.

Raffinement

Ces hamsters seront hébergés en cage de 2 individus avec un enrichissement composé de nombreux tunnels, abris (afin de satisfaire leur besoin de cachette), cellulose, et de bâtonnets de bois à ronger. Un contrôle de leur état de santé sera assuré tous les jours. Des points limites précis et suffisamment précoces pour leur éviter toute souffrance prolongée et inutile ont par ailleurs été définis.

Choix des espèces

Les études scientifiques menées sur le SARS-CoV-2 ont maintenant largement démontré que le hamster doré était un modèle expérimental qui présentait une forte sensibilité au virus (atteintes respiratoires, perte de poids) ainsi qu'une forte réceptivité (multiplication du virus dans les poumons). Le hamster est donc le modèle de choix pour l'évaluation de l'efficacité de nouvelles thérapeutiques ou de nouveaux vaccins. Nos précédentes expérimentations nous ont permis de caractériser la réceptivité et la sensibilité des hamsters adultes vis à vis des souches SARS-CoV2 utilisées au laboratoire. Nous utiliserons donc des hamsters adultes de 8 à 10 semaines à réception.

10 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque porc subit une chirurgie de deux heures pour la pose d'une canule dans l'intestin et d'un cathéter veineux, qu'il garde vingt-trois jours en cage individuelle, avec un risque d'infection et de plaies. Le porteur teste la valeur nutritionnelle de trois protéines issues de coproduits carnés en vue de leur usage en alimentation humaine. Il tue les animaux à l'issue au motif que la canule les rend inutilisables et impossibles à placer.

Objectifs

Etudier in vivo chez le porc en croissance la qualité nutritionnelle des protéines issus de co-produits carnés en évaluant la digestibilité standardisée et la cinétique de mise à disposition des acides aminés plasmatiques, afin de développer l’utilisation de ces ingrédients en alimentation humaine.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but d’évaluer in vivo chez le porc en croissance la valeur nutritionnelle de trois ingrédients protéiques, afin de développer l’utilisation de ces ingrédients en alimentation humaine. Les trois ingrédients protéiques que nous étudions dans le cadre de ce projet sont actuellement une source non exploitée en alimentation humaine, bien qu’ils soient tout à fait conformes à la réglementation en la matière. Afin de favoriser leur utilisation en alimentation humaine, notamment pour l’enrichissement protéique, il est nécessaire au préalable d’évaluer leur qualité nutritionnelle. Cela permettra de les positionner par rapport à d’autres sources protéiques telles que les protéines de lait ou de soja, pour lesquelles des données sont disponibles dans la littérature. La valorisation de coproduits tels que ceux étudiés dans ce projet est une des voies permettant de limiter l’impact environnemental des productions agricoles et d’augmenter les ressources protéiques de bonne qualité nutritionnelle.

Procédures

Tous les animaux (n=10) subiront une opération chirurgicale d’environ 2 h sous anesthésie générale afin de leur poser une canule au niveau iléal et un cathéter veineux qu’ils garderont tout au long de l’étude (soit pendant 23 jours). Le cathéter et la canule sont nécessaires pour réaliser des prélèvements sanguins et digestifs sur une période de 9h après l’ingestion des repas, tout en limitant les interventions sur les animaux. Une attention particulière sera portée à la surveillance de l'état de santé des animaux pour limiter les effets indésirables suite à la pose de la canule et/ou du cathéter lors de la chirurgie.

Impact sur les animaux

Les animaux seront isolés individuellement dans des cages ce qui limitera leur interaction sociale. Cependant, la distanciation sociale sera réduite, car les contacts visuels, auditifs, olfactifs seront maintenus entre les animaux. De plus, les animaux sont susceptibles de subir des effets indésirables suite à la pose de la canule et/ou du cathéter lors de la chirurgie, tels que des infections, des plaies, blessures, inflammation, fièvre, diarrhées, sorties de cathéter et/ou de canule. Une attention particulière sur la surveillance de l'état de santé des animaux sera réalisée via le protocole chirurgical établi.

Devenir

Les animaux ne pourront pas être réutilisés dans le cadre d’autres protocoles expérimentaux, ni placés, du fait de la pose de canules maintenues sur une longue durée (23 jours). L’euthanasie à l’issue de l’expérimentation sera donc réalisée dans l’intérêt des animaux, dans des conditions permettant de leur éviter toute souffrance inutile.

Remplacement

Le projet s’intéressant à des réponses biologiques, l’utilisation d’un modèle animal vivant est indispensable. En effet, les modèles de digestion in vitro ne permettent pas à ce jour de reproduire à l’identique la complexité physiologique du vivant. Les mesures et indicateurs qui en sont extraits ne peuvent donc pas établir de manière certaine et indiscutable la qualité nutritionnelle des protéines alimentaires. Le porc en croissance a été choisi de par sa proximité physiologique avec l’Homme.

Réduction

Le nombre d’animaux inclus dans l’étude (n=10) a été choisi de manière à avoir suffisamment de puissance statistique pour évaluer la qualité nutritionnelle des aliments protéiques. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, un plan randomisé (carré latin ajusté) sera appliqué, dans lequel chaque animal sera son propre contrôle. Ainsi, chaque animal testera les trois repas test et un repas non-protéique.

Raffinement

Les compétences et expériences des expérimentateurs garantissent le respect du bien-être animal. Une attention particulière sera accordée à la gestion de la douleur pendant toute la durée de l’expérimentation. Les porcs pourront avoir un contact olfactif, sonore et visuel avec leurs congénères. Des observations quotidiennes de l’état de santé général des animaux seront réalisées tout au long de l’expérimentation. Les cages seront régulièrement enrichies par des objets de nature variable (jouets en plastique, tapis).

Choix des espèces

Le modèle « porc en croissance » est actuellement celui validé pour la mesure de la digestibilité iléale standardisée des acides aminés (AA). C’est donc ce modèle que nous proposons d’utiliser pour évaluer de manière aussi réaliste que possible la qualité nutritionnelle des trois ingrédients protéiques testés. La validité de ce modèle en substitution des études chez l’Homme est confirmée d’après un corpus d’études relativement nombreuses et concordantes.

1 518 porcs vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la quasi-totalité tués par exsanguination finale et 23 réutilisés. Ces porcs génétiquement modifiés sont immunisés de façon répétée contre le SARS-CoV-2 et subissent des prélèvements de sang dépassant 10 % de leur volume sanguin sur animal conscient, pendant onze mois. Le porteur produit ainsi des anticorps polyclonaux glyco-humanisés à usage thérapeutique et met en avant qu'un porc "peut produire autant de sérum que plus de 100 petits animaux". Les truies et les porcelets nés sur place sont élevés puis immunisés dès cinq mois.

Objectifs

L'objectif de ce programme est de produire des anticorps polyclonaux glyco-humanisés porcins ciblant le domaine de liaison au récepteur (RBD) de la protéine Spike SARS-CoV-2 (2019-nCoV).destinés à un usage thérapeutique.

Bénéfices attendus

Contrairement à d’autres espèces animales, l’être humain et certains primates non humains n’expriment pas les enzymes alpha-1,3-galactosyl-transférase (GGTA1) et cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase (CMAH), responsables respectivement de la synthèse de motifs alpha 1,3-galactose (Gal) et acide N-glycolyl-neuraminique (Neu5Gc) à la surface cellulaire. Il existe naturellement chez l’homme des anticorps dirigés contre ces xéno-antigènes Gal et Neu5Gc. Ainsi l’administration d’anticorps d’origine animale entraine habituellement l’apparition d’effets délétères (maladie sérique et allergie) du fait de la présence de ces xéno-antigènes. Nous avons développé une plate-forme de sérothérapie passive originale permettant la production d’anticorps polyclonaux glyco-humanisés (GH-pAb), issus d’animaux modifiés génétiquement, knock-out pour GGTA1 et CMAH. Nos anticorps polyclonaux glyco-humanisés présentent un certain nombre d’avantages : 1- une absence d’effets xénogéniques délétères (allergies et maladie sérique), 2- une efficacité lytique accrue, 3- une résistance au phénomène d’antibody-dependent enhancement (une activité contre-productive qui augmente le pouvoir infectieux de certains virus au lieu de l’inhiber), 4- une neutralisation de l’ensemble des variants connus, ceci état dû à la nature polyclonale des anticorps produits.

Procédures

Prélèvements de sang sous analgésie (animaux a moins de 120 kg de poids vif) sur 25% des animaux (catégorie des porcs entre 70- 120 kg de poids vif). La procédure de prélèvement sous analgésie a une durée de : - 5 minutes pour l’administration injectable en i.m. ; - 5 minutes pour le temps d’attente de l’effet de l’analgésie et - 5 minutes de prélèvements avec les préparations, soit un total de 15 minutes / porc. Prélèvements de sang sur des animaux sous analgésie et anesthésie gazeuse. Immunisations des animaux sous analgésie et anesthésie gazeuse sur 75% des animaux (catégorie des porcs entre 120 - 200 kg de poids vif). La procédure de prélèvement sous analgésie avec une anesthésie gazeuse a une durée de : - 5 minutes pour l’administration injectable en i.m. ; - 5 minutes pour le temps d’attente de l’effet de l’analgésie ; - 10 minutes pour l’administration injectable en i.m. de l’anesthésique et le branchement de masque pour l’anesthésie gazeuse - 5 minutes de prélèvements avec les préparations, - 10 minutes de réveil soit un total de 35 minutes / porc. *Voir que plusieurs animaux peuvent être manipulées en même temps (5 porcs par équipe de 3 techniciens) le temp des procédures vont s’intercaler ce qui permets aux operateurs de réduire le temps final des procédures.

Impact sur les animaux

Les nuisances provoquées par les prélèvements ou les vaccinations sont inclues dans la catégorie modérée selon la référence : Arrêté du 1er février 2013 relatif à l’évaluation éthique et à l’autorisation des projets impliquant l’utilisation d’animaux dans des procédures expérimentales - Exemples de différents types de procédures expérimentales définies selon chaque classe de gravité sur la base de facteurs liés au type de procédure expérimentale : a) Application fréquente de substances d’essai produisant des effets cliniques modérés et prélèvements d’échantillons sanguins (> 10 % du volume sanguin) chez un animal conscient pendant quelques jours, sans reconstitution du volume sanguin ;

Devenir

A la fin du programme d’immunisation, une exsanguination finale (euthanasie) sera effectuée sous anesthésie profonde afin de collecter le maximum de sérum hyper-immun qui sera ensuite utilisé pour la production de substance médicamenteuse. L'euthanasie des animaux sera effectuée à la fin du programme ou en cas de développement d’une non-réponse aux vaccinations par surdose d'anesthésie ou T 61.

Remplacement

Plusieurs laboratoires ont cherché à remplacer la production d’anticorps polyclonaux (pAbs) à partir d’animaux donneurs par une production in vitro, recréée en bioréacteur à partir de l’information génétique extraite des donneurs et triée par phage-display. Cependant, malgré plus d’une décennie de R&D, les systèmes de production de pAbs in vitro n’ont pas permis d’atteindre les rendements requis pour la production de lots cliniques. En outre, ce type d’anticorps n’est pas disponible actuellement en Europe et ne pourrait pas couvrir les besoins des patients européens, sans préjuger du prix de ce produit. De plus, le remplacement des pAbs rendant actuellement des services thérapeutiques essentiels par des produits obtenus in vitro nécessiterait un développement complet, passant par une nouvelle recherche pré-clinique (chez l’animal) et clinique, chez des patients qui pourraient être aussi privés du traitement incluant de nouvelles phases 1, 2 et 3. Il s’agit typiquement d’un travail prenant plusieurs années (de quelques années à 10 ans). Par conséquent, dans le contexte actuel d’urgence sanitaire, l’obtention d’immunoglobulines G (IgG) polyclonales démontrant une activité de neutralisation anti-SARS-CoV-2 n’est possible à ce jour que par l’immunisation d’animaux.

Réduction

Le choix du porc comme espèce pour l’immunisation nous permet de réduire le nombre d’animaux vaccinés par rapport à d’autres espèces habituellement utilisées (comme le lapin), du fait du volume important de sérum pouvant être collecté sur un animal dans le respect des règles éthique. 1 porc peut ainsi produire autant de sérum que plus de 100 petits animaux.

Raffinement

Les conditions d’hébergement, l’enrichissement, les procédures de renforcement positif (jus de pomme) et le suivi des animaux par les animaliers et le vétérinaire, ainsi que les procédures analgésiques sont mises en place pour prévenir la douleur, et respecter le bien-être animal. Les animaux vont profiter de plusieurs éléments de matériaux manipulables pour pouvoir manifester leur comportement naturel de fouissement, de recherche de nourriture et environnemental. Les animaux dans le bâtiment spécialisé porc doté d’une climatisation et chauffage spécifique pour chaque catégorie, vont bénéficier de l’accès à la paille dans des nourrisseurs spécifiques pour compléter l’apport des fibres nécessaires en plus de la nourriture et avoir la possibilité de manifester leur capacité de fouissement. Plusieurs jouets vont être rajoutés dans les cases de chaque catégorie : brosses pour les reproducteurs, chaines avec des balles, tasseaux de bois attachés des parois, objets en caoutchouc mâchonnables spécifiques pour le porc. Un arbuste dans un pot va compléter l’environnement de chaque salle des animaux en procédure. Au cours de la semaine de la mise-bas, les truies et les cochettes vont recevoir des matériaux de nidification en quantité suffisante (sacs de jute, journaux, sciure de bois) pour le calme des animaux et l’amélioration des mises bas. Les truies et les cochettes vont mettre bas dans des cages spécifiques « liberté » qui permettent de bloquer les truies pendant les 72 h autour de la mise bas. Ensuite les animaux vont être libérés et avoir la possibilité de bouger dans toute la case de 6.5 m² pour pouvoir s’occuper des leurs porcelets jusqu’au sevrage.

Choix des espèces

Le porc, de par son poids important, permettra de récolter un volume optimisé de sérum sur un nombre plus réduit d’animaux. Ainsi, un animal vacciné à l’âge de 5 mois, avec une vaccination itérative maintenue pour une période de 11 mois consécutifs, peut produire suffisamment d’IgG pour soigner plus de 1000 patients atteints de la COVID-19. De plus les anticorps porcins présentent une activité lytique directe contre le virus et une résistance au phénomène d’activation macrophagique, du fait de l’absence de reconnaissance des IgG porcines par les récepteurs Fc humains. Les truies et les verrats sont maintenus plus de 3 ans pour la reproduction. Les porcelets issus de ces animaux sont élevés puis immunisés à partir de 5 mois d’âge (> 70Kg). Les sérums hyper-immuns seront prélevés sur des porcs par prises de sang répétées 35 jours après la première vaccination dans le respect des normes éthiques de volume et de fréquence de prélèvement : Arrêté du 1er février 2013 relatif à l’évaluation éthique et à l’autorisation des projets impliquant l’utilisation d’animaux dans des procédures expérimentales - Exemples de différents types de procédures expérimentales définies selon chaque classe de gravité sur la base de facteurs liés au type de procédure expérimentale : a) Application fréquente de substances d’essai produisant des effets cliniques modérés et prélèvements d’échantillons sanguins (> 10 % du volume sanguin) chez un animal conscient pendant quelques jours, sans reconstitution du volume sanguin ;

304 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de plaquettes dans le sinus rétro-orbital et subissent des prélèvements sanguins répétés à la queue, puis un prélèvement terminal à l'aorte abdominale sous anesthésie. Le porteur étudie l'élimination des plaquettes transfusées chez un receveur devenu réfractaire et affirme que ces processus "ne peuvent être étudiés qu'in vivo". Il croise deux lignées de fonds génétiques différents pour reproduire la différence entre donneur et receveur.

Objectifs

Les plaquettes sanguines jouent un rôle fondamental dans les processus d’hémostase. C’est ce qui nous permet d’éviter les hémorragies en cas de blessures ou de lésions. Quand le taux de plaquettes circulantes chute en dessous de 10.000 plaquettes par μL de sang chez un patient, le risque d’hémorragie interne devient important et une transfusion peut être envisagée. Une complication post transfusionnelle connue est la production d’anticorps anti¬plaquettes par le receveur dirigés contre les plaquettes du donneur. Ainsi, si receveur développe de tels anticorps de nouvelles transfusions seront inefficaces sur un plan thérapeutique puisque les plaquettes du donneur seront détruites par ces anticorps et très rapidement éliminées de la circulation : on dit alors que le patient est en état réfractaire. Cette problématique est particulièrement importante chez des patients dont les pathologies nécessitent des transfusions plaquettaires récurrentes. Objectif : Des études préliminaires ont permis d'avancer dans la compréhension du mode d'action des anticorps produits par le receveur et responsables de l'élimination des plaquettes transfusées. Ce projet nous permettra d'évaluer une approche pharmacologique ayant pour but d'éviter que les plaquettes transfusées soient éliminées trop rapidement de la circulation du receveur.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont d'apporter des connaissances sur les mécanismes d'élimination des plaquettes transfusées lorsque le receveur rejette sa transfusion et qu'il y a donc une inefficacité thérapeutique transfusionnelle appelée également état réfractaire. Les perspectives de ce travail sont denvisager des solutions thérapeutiques chez l'homme et une meilleure prise en charge des patients multitransfusés.

Procédures

Les animaux subiront des prélèvements sanguins à l'aorte abdominale (prélèvement terminal sous anesthésie) ou des prélèvements sanguins à la queue (petits volumes prélevés, sous anesthésie ). Les prélèvements à l'aorte sont des prélèvement terminaux donc unique par définition. Prélèvements sanguins répétés sur animal anesthésié : Les prélèvements sanguins à la queue sont réalisés 5 min, 30min, 2h, 24h et 48h après la transfusion de plaquettes, soit 5 prélèvements de 10 µL sous anesthésie gazeuse sur le même animal.

Impact sur les animaux

Pour réaliser ce projet, 304 souris au maximum devront être utilisées et mis à mort à la fin du projet. Cependant, les procédures réalisées sont modérées et seront effectuées dans le strict respect des règles mises en place pour veiller au bien être des animaux. Les animaux subiront un stress au moment de l'anesthésie (contention de l'animal pour lui injecter l'anesthésiant) mais ce geste n'est pratiqué que par des expérimentateurs habilités à réaliser ce geste (donc rapidement). Une douleur peut être ressentie au niveau du site d'injection des plaquettes dans le sinus rétro-orbital d'où l'utilisation d'un collyre contenant de la tétracaine pour limiter la douleur.

Devenir

Les animaux de la PE n°1 seront soit mis à mort (lot n°1: prélèvement sanguin terminal à l'aorte abdominale) soit utilisés pour la PE n°2 (lot n°2) Les animaux utilisés dans les PE n°2 et n°3 seront mis à mort à la fin des procédures.

Remplacement

Les événements initiaux conduisant à la production d’anticorps anti-plaquettes et aux états réfractaires ne peuvent pas être étudiés chez des patients transfusés. Nous voulons évaluer l'effet d'une stratégie thérapeutique. Ces processus mettent en oeuvre simultanément des interactionsentre les vaisseaux, le sang et la circulation sanguine. Ces événements sont intégrés et ne peuvent être étudiés qu’in vivo.

Réduction

Les mises au point réalisées en amont pour vérifier que ce protocle d'alloimmunisaton conduit à un état réfractaire permettra de n’utiliser que le minimum de souris dans les groupes de souris immunisées. Les nombres d'animaux utilisés lors des expériences seront minimalisés avec la contrainte d'obtenir des observations suffisamment représentatives. Des expériences préliminaires au laboratoire nous ont permis de fixer à 5 le nombre de souris par conditions testées, ce chiffre tient compte de la variabilité inter-individus.

Raffinement

Les conditions d’environnement sont optimisées par l’enrichissement des cages avec du coton et de la frisure, ce qui leur permet de compartimenter leur environnement selon leurs besoins. Ils ont un accès permanent à l’eau de boisson et à la nourriture. Les individus sont hébergées par groupe de 6 par cage. Un soin particulier sera apporté afin de diminuer le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet : - Hébergement dans des cages munies de particules de bois et enrichie avec un carré en coton compressé afin de permettre aux animaux de réaliser un nid conformément à leurs besoins comportementaux.-Accès permanent à l’eau de boisson et à la nourriture -Anesthésie de l’animal afin de limiter l’angoisse, l’inconfort, le stress et la douleur associés. -Injection d’analgésique le cas échéant. -Mise en place d’une fiche de suivi pour suivre l’état des animaux et veiller à leur bien être tout au long de l’expérimentation. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé. Ils veilleront au bien être des animaux grâce à l'utilisation d'une grille de scoring et à la défintion de points limites permettant d'éviter toutes douleurs ou souffrances inutiles de l'animal. Ce projet nécessitera 304 souris au maximum

Choix des espèces

Puisque nous souhaitons mimer la différence qui existe entre un donneur et un receveur qui conduit à la production d'anticorps par le receveur, nous devons travailler avec des souris de fond génétique différents et très bien caractérisés au laboratoire (C57BL6/J et BALB/c). De plus, le modèle d’alloimmunisation post transfusionnelle est bien caractérisé et maîtrisé au laboratoire ce qui rend l’utilisation de la souris dans ce projet très pertinente. Les animaux sont utilisés au stade adulte, pubère âgé de 7 à 12 semaines afin de pouvoir étudier l'effet des anticorps sur un individu au système immunitaire mature.

60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris subit une chirurgie avec implantation d'une pompe de diffusion, puis huit jours d'isolement, et présente une perte de neurones et un déficit de mémoire évalué par un test de labyrinthe en Y. Le porteur utilise une lignée 5xFAD, qu'il décrit à la fois comme modèle d'Alzheimer et de la maladie de Lafora, pour tester une molécule enzymatique. Les souris sont expédiées vers une société privée qui les tue à réception, et le bénéfice annoncé se limite à une "meilleure compréhension" de la maladie.

Objectifs

La maladie de Lafora (ML) représente une forme fréquente et particulièrement grave d’épilepsie myoclonique progressive. Ses premières manifestations surviennent à l’adolescence : la personne perd soudainement conscience et tombe avant de présenter des contractions musculaires généralisées. Cette première phase est suivie d’une seconde période durant laquelle le patient présente des spasmes rapides des quatre membres suivie d’une décontraction généralisée des muscles. Après un délai variable d’inconscience, la personne se réveille. L’évolution est dominée par une détérioration cognitive majeure et rapide, dont les premiers symptômes peuvent précéder les troubles moteurs. Le décès survient généralement 4 à 10 ans après les premiers symptômes dans les formes typiques. L’utilisation d’un modèle rongeur, vertébré présentant des structures cérébrales comparables à l’Humain, permet l’étude de ces dernières et des circuits neuromusculaires associés afin de développer de nouvelles cibles thérapeutiques pour la maladie de Lafora. L’objectif de ce projet est de tester une molécule enzymatique thérapeutique (VAL) sur ce modèle murin. Pour le modèle murin utilisé (souris 5xFAD : MMRRC Strain #034840-JAX) : Ces souris transgéniques 5xFAD surexpriment la protéine mutante humaine précurseur bêta-amyloïde (A4) 695 (APP) avec les mutations suédoises (K670N, M671L), de Floride (I716V) et de Londres (V717I) de la maladie d'Alzheimer familiale (FAD) avec la préséniline humaine 1 (PS1) hébergeant deux mutations FAD, M146L et L286V. Les deux transgènes sont régulés par le promoteur Thy1 de la souris pour entraîner une surexpression dans le cerveau. Les souris 5XFAD récapitulent les principales caractéristiques de la pathologie amyloïde de la maladie d'Alzheimer et peuvent constituer un modèle utile de neurodégénérescence intraneuronale induite par Abeta-42 et de formation de plaque amyloïde. De plus ces animaux présentent des formes d’épilepsie similaires à la maladie de Lafora, ce pourquoi nous les utilisons.

Bénéfices attendus

Meilleure compréhension de la maladie de Lafora.

Procédures

Tous les animaux subiront une opération chirurgicale sous anesthésie de 20 minutes.

Impact sur les animaux

Pour l’étude de la maladie de Lafora, le modèle murin utilisé est le modèle 5xFAD. Ces souris lorsque reproduites en hémizygotes (un organisme est dit hémizygote pour un gène particulier si ce dernier n'est présent qu'à une seule copie) sont viables et fertiles et présentent des déficits cognitifs et de mémoire ainsi que des épisodes d’épilepsie. Ces animaux subissent une chirurgie avec implantation d’une pompe de diffusion et sont isolés pendant 8 jours à la suite de cette chirurgie. Ces animaux présentent une perte de neurones et une déficience de la mémoire dans le test du Y-maze (test du labyrinthe en Y). Les souris transgéniques 5xFAD possèdent les principales caractéristiques de la pathologie amyloïde de la maladie d'Alzheimer et peuvent être des modèles utiles de la neurodégénérescence intraneuronale induite par l'Abeta-42 et de la formation de plaques amyloïdes. Pour limiter la souffrance, un analgésique [Meloxicam (Metacam™), 0.03 ml, 5mg/kg] est administré par voie intrapéritonéale avant la chirurgie et pendant les 3 jours (si nécessaire) suivant les actes chirurgicaux qui sont réalisés sous anesthésie gazeuse. Concernant le stress et l’anxiété, les animaux voient et sentent leurs congénères même s’ils sont isolés. La cage est enrichie avec un nid végétal. Les animaux sont manipulés avant et après la chirurgie pour minimiser le stress et l’anxiété.

Devenir

A la suite des opérations de chirurgie, les animaux seront envoyés à la société Neuroservices Alliance localisé à Aix en Provence. Les animaux seront envoyés à cette société avant l’apparition du phénotype dommageable. Cette société s’occupera de l’euthanasie des animaux dès leur réception ainsi que des prélèvements.

Remplacement

Ce protocole nécessite l’utilisation d’animaux. En effet, l’identification des structures cérébrales et des circuits neuromusculaires impliqués dans la maladie de Lafora nécessite l’utilisation d’un cerveau intact chez l’animal vigile. Des méthodes in vitro telles que la culture cellulaire ou bien les coupes de cerveau ne contiennent pas les connections neurones qui sont le sujet de nos travaux. Il n’existe donc pas de méthodes alternatives.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé par l’estimation de la variance observée avec ce type de données permettant d’atteindre une signification statistique. Ce nombre est de 15 souris par groupe mais par expérience 10 animaux par groupe sont suffisant et seront utilisés, soit un total de 60 animaux pour la réalisation de ce protocole.

Raffinement

Afin de réduire au minimum la souffrance des animaux, nous appliquons systématiquement un traitement antalgique avant et trois jours suivant les actes chirurgicaux qui sont réalisés sous anesthésie gazeuse. L’évaluation du poids de l’animal est effectuée de façon journalière à partir du moment où il est isolé en cage individuelle et rentre dans la phase expérimentale. Ces mesures ont lieu lors de la manipulation journalière des animaux en même temps que la vérification de l’état général de l’animal. Ces mesures sont consignées dans un cahier d’expérience prévu à cet effet. Pour identifier les dommages et contraintes subis par l’animal, nous avons définis des points limites au nombre de 5. Ces cinq aspects évalués au cours de nos expériences nous aident à déterminer un point final à l’expérimentation. Chaque critère est évalué de 0 à 3 et si un critère obtient le score maximal, ceci induit un arrêt immédiat de l’expérience.

Choix des espèces

La souris est un bon modèle pour les études comportementales. Son utilisation est généralisée dans le domaine des neurosciences et en particulier pour l’étude des circuits neuronaux impliqués dans diverses maladies myocérébrales. De plus, nous utilisons ici un modèle transgénique présentant un fort intérêt scientifique. Les animaux seront utilisés entre 4 et 9 mois post natal fin de permettre une comparaison avec des résultats précédemment publiés.