Procédures modérées

40 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est sédaté puis reçoit une injection intramusculaire unique d'un produit vétérinaire au fer, avant mise à mort et prélèvement du muscle pour mesurer l'absorption. Le porteur précise que ce test in vivo est exigé par la Pharmacopée Chinoise pour l'autorisation de produits déjà commercialisés en France, et qu'un de ses objectifs est de démontrer que les contrôles physico-chimiques français suffiraient pour s'en affranchir. Il conclut qu'aucune méthode substitutive n'existe et que le recours au lapin reste "nécessaire", tout en reconnaissant travailler à le rendre inutile.

Objectifs

Les injections de fer sont très souvent utilisées chez les jeunes animaux de rente (porcins, ovins, caprins, bovins…) dans le cadre de la prévention et du traitement de l’anémie ferriprive après la naissance. Dans le cadre de l’élevage porcin, les injections de fer sont presque systématiquement réalisées dans les 3 jours suivant la naissance. La Chine est le 1er producteur de porcs au monde et un marché important pour les industries pharmaceutiques vétérinaires. Ce projet est réalisé dans le cadre de demande d’Autorisation de Mise sur le Marché (AMM) en Chine de produits vétérinaires injectables composés de fer, possédant déjà des AMM en France. A chaque libération d’un nouveau lot de ces produits en France, un contrôle qualité est réalisé à l’aide de différents tests physico-chimiques décrits dans la Pharmacopée Européenne. Pour la commercialisation sur le marché chinois, les autorités chinoises demandent la réalisation d’un test in vivo d’absorption du fer au point d’injection chez le lapin. Ce test fait partie des tests de contrôle qualité réalisés lors de la libération de lots de produits contenant du fer en Chine. Il permet de valider la qualité du lot en analysant l’absorption du fer après une injection unique et de s’assurer que la quantité de fer non absorbée au niveau du point d’injection ne dépasse pas 20% de la quantité injectée. Le but de cette vérification est de s’assurer que chaque lot commercialisé est conforme, et que le produit est sûr, aussi bien pour la santé animale que pour la consommation humaine. Ce projet a donc 2 objectifs : 1) la réalisation du test d’absorption de fer au point d’injection demandé par les autorités chinoises dans le cadre d’une demande d’AMM. 2) démontrer que les contrôles physico-chimiques réalisés en France sont suffisants pour pouvoir s’affranchir de l’utilisation de lapins lors de la libération de chaque lot de produit commercialisé sur le marché chinois.

Bénéfices attendus

1) Obtenir l’autorisation de mise sur le marché en Chine des produits testés. Ainsi, chaque lot commercialisé et autorisé sera conforme et sûr, aussi bien pour la santé animale que pour la consommation humaine. En effet, ce projet va permettre de valider en Chine des produits permettant de lutter contre l’anémie ferriprive rencontrée dans les élevages. 2) Prouver que les contrôles physico-chimiques réalisés en France sont suffisants pour pouvoir s’affranchir de l’utilisation de lapin lors de la libération de chaque lot de produit commercialisé sur le marché chinois.

Procédures

Les animaux utilisés seront sédatés avant de recevoir une injection unique de produit testé. La sédation va permettre de diminuer le stress de l’animal et faciliter sa contention. Ceci facilitera également l’injection qui doit être réalisée précisément dans le muscle vaste médial. Après euthanasie des animaux, des prélèvements du muscle étudié seront réalisés afin d’analyser ce muscle et obtenir les résultats du test d’absorption. Les interventions seront de courte durée et ne seront réalisées qu'une seule fois par animal puisqu'ils seront in fine euthanasiés.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux sont les suivants : stress dû à la mise à jeun la veille de la sédation et stress dû à la contention pour la réalisation de la sédation.

Devenir

Les animaux inclus dans ce projet seront mis à mort afin de pouvoir prélever et analyser le muscle injecté étudié. Ces prélèvements de muscle sont primordiaux pour répondre aux objectifs de ce projet.

Remplacement

Le test d’absorption du fer au point d’injection est une procédure expérimentale in vivo demandée par la réglementation chinoise, dans le cadre de la commercialisation sur le marché chinois de produits vétérinaires composés de fer. L’absorption de fer est un processus dynamique nécessitant le passage de la molécule étudiée du site d’absorption vers le sang pour pénétrer dans la circulation systémique. Ce type d’étude doit se réaliser sur animaux. Cependant, l’un des buts de ces études est de démontrer que les contrôles qualité réalisés en France sont suffisants pour permettre à terme de s’affranchir de l’utilisation d’animaux pour chaque nouvelle libération de lot. Afin de démontrer ceci, l’utilisation d’animaux est ici nécessaire et aucune méthode substitutive n’existe. En effet, l’utilisation des animaux dans le cadre de ce projet, ne peut pas être remplacée par des méthodes alternatives n’impliquant pas l’utilisation d’animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu pour ce projet a été calculé à partir des directives mentionnées dans la Pharmacopée Chinoise, dans laquelle il est stipulé qu’il faut utiliser 2 animaux par lot testé, et à partir des besoins pour le projet (estimation du nombre de lots à tester sur la durée du projet). Sur deux ans, il a été estimé que 20 lots seraient testés soit 40 lapins au total.

Raffinement

Méthodes de raffinement: 1) Tout au long de leur hébergement, les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Afin de les maintenir, les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, afin d’augmenter leur bien-être, les animaux seront hébergés collectivement dès que possible et disposeront d’un environnement enrichi (foin/paille, bois à ronger, chaînette, de quoi se cacher et grimper...). Si, selon les besoins, les animaux doivent être hébergés individuellement, ils auront un contact visuel et/ou olfactif avec leurs congénères. 2) Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal. L’administration du traitement prescrit devra être réalisée par une personne habilitée. 3) Pour diminuer le stress de l’animal et faciliter la contention pour l’injection, l’animal sera sédaté avec un produit adapté. Il est primordial dans ce projet que l’injection soit réalisée précisément au niveau du muscle vaste médial et pour cela l’animal ne doit pas bouger durant l’injection. 4) Surveillance accrue de l’animal durant la sédation et l’injection. Grâce à ces différentes méthodes, le bien-être de l’animal sera respecté et sa douleur, souffrance et angoisse seront d’abord réduites puis supprimées. Ainsi, la manipulation sera réalisée dans les meilleures conditions possibles.

Choix des espèces

Le lapin a été choisi pour ce projet car c’est cet animal qui est demandé et décrit dans la Pharmacopée Chinoise pour la réalisation de tests d’absorption du fer au site d’injection. Conformément à la Pharmacopée Chinoise, les animaux utilisés seront des adultes pesants entre 1,5 et 2,5 kg.

685 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection urétrale d'entérobactéries sous anesthésie pour reproduire une infection urinaire, afin de tester trois nouvelles molécules antibiotiques. Le porteur indique que l'infection peut provoquer poil hérissé, dos voûté, perte de poids, écoulements oculaires et comportement apathique, et prévoit la mise à mort de tous les animaux pour mesurer la charge bactérienne dans les reins. Il affirme que les techniques in vitro ne donnent pas de données fiables sur l'activité in vivo d'un antibiotique et juge le recours au modèle animal "indispensable".

Objectifs

Les entérobactéries sont fréquemment responsables d’infections communautaires ou nosocomiales. Elles sont généralement traitées par des bêta-lactamines, mais au cours des deux dernières décennies, on observe une augmentation importante de la résistance des entérobactéries à ces antibiotiques ce qui pose aujourd’hui un problème majeur de santé publique. Le but de notre étude est d’évaluer l’activité de trois nouvelles molécules dans un modèle d’infection urinaire expérimentale chez la souris.

Bénéfices attendus

Développement de nouvelles molécules qui pourraient être actives sur les souches bactériennes multi résistantes, l'antibiorésistance étant devenue un problème majeur, avec l'émergence et la diffusion croissante de souches bactériennes de plus en plus résistantes aux antibiotiques.

Procédures

Tous les animaux infectés recevront une injection par voie urétrale de la souche bactérienne sous anesthésie générale à l’isoflurane. Cette procédure dure 5-7min. Ils recevront également une injection sous cutanée d’une molécule anti-douleur avant infection, en vigile.

Impact sur les animaux

Les animaux pourraient présenter, un ou plusieurs effets indésirables parmi les suivants : Poil hérissé, dos vouté, perte de poids, larmes, yeux collés, isolement, comportement apathique, respiration ralentie ou difficile.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans la procédure 1 seront euthanasiés à la fin de la procédure 1 afin d’étudier la charge bactérienne dans les reins. Tous les animaux utilisés dans la procédure 2 seront euthanasiés à la fin de la procédure 2 après l’évaluation d’une potentielle modification du comportement suite à l’injection des nouvelles molécules. Tous les animaux utilisés dans la procédure 3 seront euthanasiés à la fin de la procédure 3 afin d’évaluer l’efficacité des nouvelles molécules sur la charge bactérienne dans les reins.

Remplacement

Les techniques in vitro ne permettent pas d’obtenir des données fiables sur l’activité in vivo d’un antibiotique. La corrélation in vitro - in vivo n’étant pas satisfaisante, le recours à l’utilisation de modèles animaux est indispensable.

Réduction

Les premiers temps de l’expérimentation consistent à la validation du modèle avec les souches à étudier, ce qui permet d’utiliser le moins d’animaux possible lors de l’évaluation thérapeutique proprement dite. Pour les évaluations thérapeutiques, le nombre de souris par groupe a été réduit au minimum afin de garder une analyse statistique fiable.

Raffinement

Avant l’expérimentation : - Détermination des points limites Pendant l’expérimentation : - Soins pré et post intervention : Les souris recevront une injection d’une molécule anti douleur avant infection. Puis mise en place d’une grille de score de points limites - Infection : utilisation de tapis chauffant pendant l’anesthésie - Application des points limites - Euthanasie : sous anesthésie générale

Choix des espèces

Le modèle murin d’infection urinaire est un modèle bien caractérisé et parfaitement adapté pour tous les types d’analyses prévus pour cette étude. Cinq semaines de vie permettant une manipulation simple sur un animal robuste.

400 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, environ trois quarts conservés comme reproducteurs et le reste tué faute de porter la mutation recherchée. Le porteur crée six lignées transgéniques et mutantes pour étudier la formation du système olfactif à partir des embryons, prélevés avant cinq jours de développement. Il indique que les formes homozygotes peuvent provoquer stérilité, stress et agressivité, et prévoit de ne maintenir que des adultes hétérozygotes pour éviter ces atteintes. Sur le remplacement, il décrit des modèles mathématiques en développement mais conclut qu'une approche in vivo sur un vertébré reste "nécessaire".

Objectifs

Notre projet vise à caractériser les mécanismes génétiques et morphométriques gouvernant la mise en place du système olfactif en utilisant le poisson zèbre Danio Rerio comme organisme modèle. Afin de pouvoir étudier les cascades moléculaires et génétiques en action au cours du développement de cette structure, il nous faut altérer ou visualiser l'activité de gènes d'intérêt. Nous utilisons la transgénèse et la mutagenèse dirigée pour établir des lignées mutantes ou transgéniques stables. Nos recherches se focalisent sur la mise en place précoce du système olfactif dont les évènements interviennent avant 5 jours de développement embryonnaire. Nous génèrerons 6 Lignées pour ce projet : A. 2 lignées transgéniques : Tg(fa2h::eGFP) et Tg(8.4neurog1::nls-EOS) pour visualiser les étapes précoces de la formation de notre structure d'intérêt et B. 4 lignées mutantes : pitx3 , f11r.1, fa2h et oclna pour analyser le rôle de ces gènes candidats dans la mise en place précoce du système olfactif.

Bénéfices attendus

Le projet nous permettra d’établir des lignées transgéniques et mutantes qui nous servirons pour mieux comprendre la mise en place de l’organe sensoriel olfactif. Ces outils seront alors largement accessibles à la communauté scientifique pour comprendre plus largement le rôle des molécules d’adhésion jonctionnelle, des enzymes et pour établir un modèle poisson zèbre de développement des neurones dopaminergiques (maladie de Parkinson et développement du cristallin).

Procédures

Les animaux générés par ce projet seront utilisés à des fins reproductives, seuls leurs embryons dans les phases de développement autonomes (avant 5 jours de développement) seront utilisés pour les expérimentations.

Impact sur les animaux

Nous ne prévoyons pas d'effets indésirables pour les lignées transgéniques et mutantes à l'état hétérozygote. Cependant, nous pouvons anticiper que pour les lignées mutantes le développement des placodes craniales antérieures (cristallin, adénohypophyse et olfaction) soit perturbé. Les données bibliographiques de mutants qui perturbent le développement de l'adénohypophyse, du cristallin et de l'olfaction peuvent indiquer des effets indésirables chez les adultes homozygotes : risques de stérilité, de stress et d’agressivité. Il est important de noter que chez le poisson zèbre, ces pathologies se développent lorsque la mutation est présente à l'état homozygote et que nous maintiendrons les lignées avec des adultes hétérozygotes dans ce projet.

Devenir

Idéalement, nous aimerions conserver la totalité des animaux mais tous les adultes ne seront pas porteurs de la mutation et nous choisirons les allèles mutants les plus facilement identifiables et les lignées transgéniques les plus robustes pour ne conserver en moyenne les 3/4 des animaux reproducteurs. Les autres qui ne portent pas l'évébement génétique requis seront mis à mort.

Remplacement

Nous développons actuellement des modèles théoriques mathématiques pour simuler numériquement les expérimentations et ne tester biologiquement que les expériences ayant un intérêt pré-validé.

Réduction

L'équipe s'intéresse uniquement à des processus embryonnaires. Par conséquent, les poissons adultes gardés au laboratoire sont consacrés uniquement à la reproduction et ne sont soumis à aucune expérimentation. Le nombre d'individus hébergés correspond au nombre minimal nécessaire au maintien des lignées et à la production d'œufs nécessaires à notre expérimentation. Nous prenons soin de faire évoluer nos protocoles expérimentaux afin de réduire le nombre d’individus hébergés dans l’animalerie. Notamment, l’amélioration récente de nos techniques de mutagénèse grâce au développement de protocoles utilisant le système CRIPR/Cas9, nous a permis de réduire drastiquement le nombre de fondateurs nécessaires à l’établissement de nouvelles lignées.

Raffinement

Tout est fait dans ce projet pour que nos adultes soient dans les meilleures conditions pour pouvoir se reproduire afin que nous obtenions nos précieux embryons. De plus, nous utilisons principalement dans notre projet des méthodes d'imagerie de l'embryon en temps réel sur du vivant pour comprendte la formation de l'organe sensoriel olfactif à l'aide de lignées transgéniques fluorescentes qui marquent le territoire olfactif et les différentes populations cellulaires qui le composent.

Choix des espèces

Notre équipe s’intéresse à comprendre les mécanismes génétiques et morphomètriques régissant la mise en place du système olfactif. La perturbation de ces processus peut conduire chez l’homme à de nombreuses pathologies allant de la stérilité à l’anosmie. L’utilisation d’une approche in vivo sur un animal vertébré, comme le poisson zèbre est donc nécessaire à la compréhension de ces processus dynamiques et complexes. Dans ce projet, nous générerons des poissons zèbres transgéniques ou mutants qui seront utilisés adultes à des fins reproductives.

3 328 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Le porteur les rend immunodéficientes puis leur greffe, pour chaque patient, ses cellules immunitaires et sa tumeur, afin de constituer des cohortes dites "avatars" servant à tester des traitements. Il indique que l'injection de cellules humaines provoque invariablement une réaction contre les cellules de la souris, avec perte de poids, de poils et de mobilité sur un à deux mois, les animaux étant mis à mort à un stade avancé pour récupérer les tumeurs. Sur la réduction, il se contente d'écrire que le nombre d'animaux "sera à évaluer au cours des expériences", justification sommaire pour un effectif de plus de trois mille souris.

Objectifs

Il est proposé d’utiliser un modèle de souris immunodéficiente afin de constituer, pour chaque patient atteint d’une tumeur, une cohorte de souris doublement humanisée/greffée (système immunitaire et tumeur) qui sera utilisée pour évaluer l’activité de thérapies, dans un délai compatible avec les contraintes cliniques, typiquement 1 mois. Les souris présentent des mutations entrainant une déficience en cellules immunitaires murines. Ces souris ont montré être des bons modèles de greffe de cellules tumorales humaines ainsi qu’un bon réservoir pour une reconstitution de système immunitaire humain. La mise en place d’une cohorte de souris porteuse de tumeur dérivée de patient (PDX) est un projet ambitieux à forte valeur ajoutée pour la recherche sur les cancers permettant d’évaluer l’activité des traitements les ciblant. Ces souris sont greffées avec des fragments de tumeur fraiche et la tumeur peut se développer dans l’environnement murin en absence de système immunitaire pouvant le reconnaitre comme étranger. Cependant, des obstacles sont présents pour optimiser l’établissement de cette cohorte : taux de prise de greffe des PDX très faible et/ou variable, temps avant apparition de la PDX (plusieurs semaines, voire mois), instabilité génétique amplifiée au cours des passages successifs des PDX dans une souris à l’autre et absence d’un système immunitaire autologue. Afin de palier à ces obstacles, les cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC) du patient ainsi que des fragments tumoraux, du même patient seront greffés, dans les souris sans passer par l’étape d’établissement d’une tumeur macroscopique de type PDX classique. La détection précoce de ces cellules, par les techniques d’imagerie, permettrait d’évaluer l’efficacité des traitements afin de comprendre notamment les mécanismes de résistance mais aussi d’évaluer le traitement le plus efficace parmi le choix possible actuellement et dans un futur proche.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but d’évaluer la pertinence et la corrélation clinique des réponses aux traitements chez le patient au regard de de la réponse observable dans la cohorte avatar aux patients. En cas, de corrélation positive, cela permettre d’obtenir une preuve de concept de la pertinence d’une méthodologie comme outil de diagnostic afin de proposer aux cliniciens le traitement le plus adéquat pour chaque patient, dans des contraintes temporelles acceptables pour les cliniciens et les patients.

Procédures

Injection de thérapie deux à trois fois par semaine sur animaux vigiles ou endormis, chaque injection demande une contention de 15 à 30 secondes ; Echographie une à deux fois par semaine sur animaux endormis, le temps d'acquisition par échographie (et donc de l'anesthésie) est compris entre 10 et 20 min par souris ; Prélèvement de sang une fois au cours de la procédure sur animaux endormis, le prélévement dure entre 15 et 30 secondes (l'anesthésie environ 3 minutes). La durée pendant laquelle les animaux subiront ces interventions sera de 5 semaines à 2 mois.

Impact sur les animaux

L’injection de PBMC humain dans une souris immunodéficiente entraine, invariablement, une réaction des cellules immunitaires humaines injectées contre les cellules murines reconnues comme étant étrangères. Cette réaction entraine une perte de poids des animaux, une perte de poil et une perte de mobilité des animaux dans un délai pouvant aller d’un mois à deux mois. A un stade avancé de la maladie, les animaux doivent être sacrifiés. Aucun autre effet indésirable n’est attendu notamment par l’injection des traitements.

Devenir

Les animaux doivent être mis à mort car les tumeurs doivent être récupérées

Remplacement

Les méthodes actuelles permettant d’évaluer l’efficacité de thérapie personnalisé sont inefficaces, actuellement, par absence de biomarqueur fiable, permettant de choisir le traitement le plus adapté à chaque patient.

Réduction

Le nombre de souris par groupe de traitement est évalué, en fonction de la variabilité des modèles animaux. Ce nombre sera à évaluer au cours des expériences en fonction de cette variabilité.

Raffinement

Le raffinement de l’étude est : surveiller les animaux pour l’apparition de la réaction immunitaire des cellules immunitaires humaines injectées vis-à-vis des cellules murines de l’hôte qui sera monitoré deux fois par semaine.

Choix des espèces

Les souris immunodéficientes sont les seules modèles animaux correctement validés ayant montrés une prise de greffe de tumeurs humaines et de système immunitaire humain. Les animaux seront des adultes à partir de 6 semaines, stade qui a montré de bons résultats pour prise de greffe tumorale et immunitaire.

90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Le porteur les rend immunodéficientes et leur greffe des cellules tumorales marquées par fluorescence, par injection sous-cutanée ou intraveineuse, pour suivre la croissance des tumeurs et leur capacité à métastaser. Il indique que les tumeurs peuvent gêner les déplacements, que la peau peut s'ulcérer en provoquant une douleur modérée et que des métastases au foie ou aux poumons peuvent dégrader l'état des animaux, tous mis à mort en fin de procédure. Il affirme que ces cellules doivent être implantées dans un "organisme entier" et que le modèle souris est "nécessaire".

Objectifs

Le but du projet est de réaliser des expériences de suivi de pousse tumorale chez la souris immunodéficiente à partir de cellules cancéreuses modifiées pour qu'elles expriment plus ou moins une protéine au niveau de leur noyau. La quantité présente de cette protéine dans les cellules jouerait un rôle dans le comportement des cellules cancéreuses. Ces cellules cancéreuses seront également marquées par fluorescence en fonction de la quantité de la protéine exprimée. Ainsi cette fluorescence nous permettra de visualiser les différents types de cellules cancéreuse et d'observer leur évolution dans les tumeurs. Nous nous intéresserons à la corrélation entre le type de cellules retrouvées dans les tumeurs, la vitesse de croissance des tumeurs et l'agressivité des cellules cancéreuses à travers leur capacité à métastaser.

Bénéfices attendus

Nous serons en mesure d’analyser l'impact du niveau d’expression de TRa1 sur la croissance des tumeurs. Nous pourrons étudier si ce niveau d'expression module la capacité de croissance, de migration ou de mort cellulaire ainsi que l’agressivité du développement tumoral. A terme, une meilleure compréhension des mécanismes du développement des cancers permettra de mieux adapter les traitements et/ou d'envisager de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Les souris du projet seront greffées avec des cellules tumorales marquées par fluorescence, soit par injection ou implantation sous-cutanée soit par injection intra-veineuse. Ces greffes se dérouleront sous anesthésie, l'opération ne durant que quelques minutes.

Impact sur les animaux

Nous utiliserons des souris immunodéprimées. Ces animaux, par leur système immunitaire défaillant, sont hébergés dans une pièce dédiée avec toutes les barrières sanitaires permettant de garantir leur bon état de santé pendant toute la durée de leur vie. Les souris subiront chacune une unique injection ou implantation de cellules tumorales. Les souris seront donc amenées à développer des tumeurs. Ces tumeurs pourraient éventuellement les gêner dans leurs déplacements. Si la peau venait à s’ulcérer au niveau d’une tumeur, cela provoquerait une douleur modérée à l’animal. Des métastases pourraient également apparaître, notamment sur le foie ou dans les poumons. L’état des souris pourraient alors se dégrader : amaigrissement, difficultés à respirer, troubles moteurs… Il y a 3 types possible d’injection dans ce projet ; une injection sous-cutanée au niveau du flanc, une injection intra-veineuse à la veine de la queue et une implantation sous-cutanée.

Devenir

Tous les animaux, des souris, seront mis à mort en fin de procédure. En effet, ils développeront des tumeurs sur le flanc et potentiellement des métastases. De plus, des analyses doivent être menées sur plusieurs de leurs tissus afin d'étudier la distribution des différents types cellulaires dans les tumeurs et d'analyses les organes.

Remplacement

Ce projet vise à étudier la capacité de plusieurs types de cellules cancéreuses à former des tumeurs et à métastaser. Pour cela, ces cellules doivent être implantées dans un organisme entier afin de reproduire au mieux les conditions physiologiques dans lesquelles elles se développent habituellement. Il nous faut donc avoir recours à un système intégré et mature, dans notre cas le modèle souris.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire à ce projet est de 90 souris. Ce nombre a été réduit au maximum tout en restant suffisant et statistiquement robuste pour apporter des réponses claires à notre projet. Nous mesurerons pour chaque animal engagé le nombre de tumeurs primaires et métastases ainsi que leur taille.

Raffinement

Une surveillance quotidienne des animaux sera effectuée afin d'identifier au plus tôt toute douleur ou souffrance éventuelle. De plus, les procédures se feront sous anesthésie générale. Les souris seront maintenues sur tapis chauffant toute la durée de l'anesthésie. Une couverture analgésique est mise en place afin de prendre en charge toute douleur potentielle qu'impliquerait l'implantation des cellules tumorales. Un développement tumoral est attendu, un suivi de poids et de taille des tumeurs sera réalisé 3 fois par semaine. Des points limite qui auront pour effet l'arrêt de la procédure ont été déterminés.

Choix des espèces

Nous utilisons la souris comme organisme modèle pour reproduire chez l'animal des pathologies (inflammation et cancer du côlon). Nous avons l'expertise au laboratoire sur ce modèle animal et nos données précédentes sur le rôle de TRa1 dans des études in vivo ont été générées chez la souris. L'animal est absolument nécessaire par son côté physiologique intégratif. En effet, dans notre projet, les études de pousse tumorale ne peuvent se faire que dans des organismes complets prenant en compte l’influence de la physiologie de l’animal et du microenvironnement. Les animaux seront âgés d'au moins 8 semaines afin de mener notre projet sur un stade adulte jeune.

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Le porteur leur greffe des cellules tumorales directement dans le pancréas, ce qui provoque un adénocarcinome, puis les euthanasie cinq semaines plus tard alors que toutes ont développé un cancer avancé. Il indique que ce stade terminal, marqué par une ascite et des changements de comportement, entraînerait une grande souffrance si la mort n'était pas donnée, une grille de score pouvant avancer la mise à mort. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou ex vivo ne rend compte de la relation entre système immunitaire et tumeur.

Objectifs

Cette étude permettra de déterminer le rôle exact du TNFR2 sur l’activation du système immunitaire au sein du microenvironnement tumoral et ainsi en voir l'effet sur la croissance tumorale. Cette étude fait partie d’un projet de recherche translationnelle pour la détermination des meilleurs protocoles de traitement des tumeurs du pancréas.

Bénéfices attendus

Le TNFR2 participe à l'activation et au maintien de l'activité des lymphocytes T régulateurs. Son absence permettrait de diminuer, voir d'abroger, l'inhibition de la réponse immunitaire antitumorale au sein du micro-envonnement immunitaire. Le bénéfice potentiel est que la réponse immunitaire anti-tumorale soit plus efficace, et permette un ralentissement, voir un arrêt de la croissance tumorale.

Procédures

Il n'y a qu'une intervention effectuée. Les animaux vont subir une opération chirurgicale afin d'effectuer une greffe orthotopique. Ce type de greffe vise à introduire des cellules au sein d’un tissu de même nature. Ainsi les cellules tumorales pancréatiques sont directement injectées dans le pancréas. Cette intervention dure 5 minutes sur un animal sous anesthésie gazeuse (Isoflurane). Cette intervention est accompagnée par l'administration d'analgésiques, Rimadyl et Vetergesic, ceci le jour (Rimadyl et Vetergesic) et le lendemain (Vetergesic) de l'opération. Cette administration est faite par injections intra-péritonéales pour le Rimadyl et en sous-cutanée pour le Vetergesic.

Impact sur les animaux

La greffe des cellules tumorales dans le pancréas va générer l'apparition d'un adénocarinome pancréatique canalaire. Les animaux ont dans les stades terminaux de l'expérimention une déficience pancréatique associée à diiférents autres symptômes (apparition d'ascites, changements comportementaux,...). Les symptômes sont bien sur suivis via une grille de suivi, nous servant à dertiminer quand le point limite de l'expérimentation est atteint.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure par dislocation cervicale (ou par asphyxie au dioxyde de carbone le cas échéant), 5 semaines après la greffe des cellules tumorales. A cette date, la mort est donnée car l'ensemble des animaux a developpé un cancer du pancréas avancé. Ce stade peut entrainer une grande souffrance dans les jours qui suivent si la mort n'est pas donnée. Il s'agit d'un point limite de la procédure. Cependant les souris peuvent être sacrifiées avant suivant la grille de suivi de souffrances décrite auparavant et rattachée en annexe 2. En effet si le score de souffrance atteint 4 avant la ciquième semaine, la ou les souris sont mises à mort.

Remplacement

Sur la question du « Remplacement », les expérimentations in vitro ne rendent pas compte de toute la complexité rencontrée dans la relation entre le systeme immunitaire et la tumeur, notamment à cause de differents types cellulaires impliqués. A l’heure actuelle il n’existe pas des modèles experimentaux in vitro ou ex vivo qui permettent de suivre la réponse anti-tumorale. L’expérimentation animale reste dans ce cas la meilleure solution pour étudier l’effet de l’absence du TNFR2 sur les cellules immunitaires, nous ne pouvons donc pas élaborer une stratégie de remplacement efficace.

Réduction

Dans le cadre de la « Réduction », nous avons calculé le nombre minimal de souris nécessaires pour que les résultats soient signifiants. Ce nombre, impliquant les 2 groupes, est estimé à 40 souris et est calculé sur la base d’une formule statistique couramment utilisée dans ce cadre. Ce calcul est détaillé sur un document rattaché à ce projet nommé annexe 1

Raffinement

Pour les strategie de « Raffinement », nous allons donner tous les produits nécessaires au bien-être animal, réduisant au maximum la souffrance animale, qu’elle soit physique ou psychique. Au niveau de l’hébergement au cours de l’expérimentation, des produits d’enrichissement sont utilisés comme différents types de neslets, des tubes de carton et des dômes de carton. Au cas où la souffrance animale apparait sans que nous puissions la résoudre, nous avons créé une grille regroupant les symptômes caractéristiques de notre modèle. Cette grille nous permet d’évaluer la souffrance de l’animal, et ainsi de définir des points limites. Si ces points limites sont atteints, nous sacrifions l’animal. L’animal sera surveillé sur la base de cette grille qu’à partir du jour 10 après la greffe tumorale sachant que les symptômes décrits dans la grille n’apparaissent qu’à partir du jour 18 après la greffe tumorale. La surveillance se fera tous les 2-3 jours, jusqu’à la mise à mort. Nous donnons également deux produits analgésiques différents, dispensés avant, pendant et après l’opération pour réduire au maximum la souffrance physique

Choix des espèces

La souris est l’espèce majoritairement utilisée pour les modèles du cancer du pancréas décrit dans la littérature, et ces modèles se prêtent généralement aisément à un transfert de technologie chez l’homme. De plus les modèles murins ont cet avantage d’avoir un catalogue de modifications génétiques et de lignées cellulaires important qui permettent un meilleur décryptage des voies de signalisation impliquées. Ainsi les souris sélectionnées pour cette étude qui sont immunocompétentes et donc présentent une réponse immunitaire complète, pourront être comparées dans leurs réponses immunitaires aux souris ayant des modifications génétiques. Les souris sont âgées de 8-10 semaines, afin de limiter la variabilité liée à l’âge qui nécessiterait d’utiliser plus d’animaux.

28 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Le porteur pratique sur chacun une chirurgie d'une heure, avec dissection des vaisseaux fémoraux et implantation d'un greffon osseux entouré de membrane amniotique dans une poche sous-cutanée, pour tester une méthode de régénération osseuse. Le champ structuré du résumé indique les 28 lapins comme retournés à l'élevage, mais la justification écrite précise qu'ils subissent tous une euthanasie par injection intracardiaque en raison des douleurs et gênes motrices attendues, ce qui confirme leur mise à mort. Il affirme que le projet "ne peut être remplacé" par un modèle in vitro faute d'axe vasculaire fonctionnel.

Objectifs

Les pertes de substances osseuses peuvent résulter de : -traumatisme, résection tumorale, infection, malformation. Le choix des reconstructions dépend de : -la taille de la perte de substance -état du site receveur (infection, irradiation) -perte de tissus mous associée -état général du patient. Ces paramètres déterminent des techniques de reconstruction de complexité variable. Les reconstructions par autogreffe présentent plusieurs avantages : ostéo-conduction, ostéo-induction et ostéogénèse(en cas de greffe vascularisée) avec une ostéo-intégration plus rapide permettant le retour à une fonctionnalité plus rapide. Cependant les inconvénients ne sont pas négligeables avec la quantité limitée d’os à prélever, les morbidités liées au site donneur (cicatrice, infection, douleur, fracture) et l’ostéo-intégration plus longue lors d’autogreffe non vascularisée. Ces inconvénients amènent à l’utilisation de substituts osseux synthétiques. Ces substituts ostéoconducteurs, ne sont pas ostéo-inducteurs ni ostéogéniques par apport nutritionnel sanguin insuffisant. Leur intégration plus lente favorise les échecs. Le greffon idéal doit donc combiner les avantages d’une autogreffe vascularisée en limitant les inconvénients. Les progrès de l'ingénierie tissulaire font des thérapies cellulaires une solution potentielle pour la régénération des tissus. Trois éléments lui sont essentiels: -le type d’échafaudage -les facteurs bioactifs -les cellules souches. L’enjeu est de trouver une combinaison optimale. Son application aux tissus osseux pourrait permettre d’obtenir une nouvelle méthode de traitement. Parmi les facteurs bioactifs, on trouve la membrane amniotique qui est une matrice extracellulaire acellulaire, non immunogène, biodégradable. Elle est fréquemment utilisée sur la surface oculaire pour améliorer sa régénération par ses propriétés cicatrisantes, antibactériennes et anti-inflammatoires. Malgré un potentiel de différenciation des cellules souches le long de la lignée ostéogénique, son application dans l’ingénierie osseuse a été peu étudiée. Notamment en association avec de l’os de banque. La problématique est : l’association d’un os de banque, d’une vascularisation et d’une membrane amniotique peut-il donner naissance à une régénération osseuse comportant une partie minérale et cellulaire ? Le but est d’obtenir un os ayant les caractéristiques les plus proches d’un os natif. Cela augmenterait le taux de succès des reconstructions osseuses en conditions difficiles

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre de simplifier et/ou d’améliorer les réparations des pertes de substance osseuse dans les cas complexes ou chez les patients fragiles. Les avantages de cette technique sont: la facilité d’accès et l’abondance de l’os de banque et des membranes amniotiques, la limitation des comorbidités liées au site donneur et la limitation théorique des risques d'échec par une ostéointégration plus rapide. Les résultats attendus sont : - l’obtention d’un greffon osseux colonisé par des cellules osseuses - l’obtention d’un greffon vascularisé par angiogenèse à partir de la vascularisation axiale - le choix du greffon et la période optimale d’utilisation du greffon (J30, J60, J90 ou 120)

Procédures

Les animaux subiront une intervention sous anesthésie générale qui durera 1h. Tout d’abord une prémédication par Midazolam (0.5-1mg/kg) et Morphine (1-2mg/kg) intra-musculaire sera réalisée. Après 10 minutes de délai l’anesthésie générale sera réalisée en intra-musculaire par un mélange de Kétamine (25-50mg/kg) et Xylazine (5mg/kg). L’anesthésie générale sera complétée par une anesthésie locale de Lidocaïne (0,2mL/kg) au niveau de la cuisse. Le lapin sera placé en décubitus dorsal, rasé et désinfecté au niveau de la face supéro-interne de la cuisse gauche ou droite. Les conditions d’asepsie seront respectées (badigeon de bétadine dermique au niveau de la cuisse puis champage stérile). Une incision cutanée d’environ 3 cm de long du point médian de l'aine en direction du genou sera réalisée d’un côté. Après dissection aux ciseaux l'artère et la veine fémorale seront exposées sur 20mm de long. Une hémostase rigoureuse sera effectuée. L’artère et la veine seront enveloppées d'une HAM cryoconservée, puis insérées dans le cylindre de substitut osseux grâce à une fente longitudinale. L’ensemble ainsi décrit sera enfin enveloppé avec une seconde HAM cryoconservée. Chaque greffon (substitut osseux/HAM) sera dissimulé dans une poche sous-cutanée afin d’éviter une gêne fonctionnelle motrice. Le site opératoire sera suturé en 2 plans: un plan sous cutané puis un plan cutané. Une antibioprophylaxie intramusculaire par Duplocilline (0,3mL/kg) administrée en fin d’intervention, couvrira l’animal pendant 4 jours. Le traitement antalgique post-opératoire comprendra des AINS (Méloxicam 1mg/kg) toutes les 12h en per os pendant 5 jours. Il pourra être associé à une dose de Buprénorphine (0.05mg/kg) sous-cutané toutes les 8h pendant les 48 premières heures. En cas de non contrôle de la douleur, la Buprénorphine sera remplacée par de la Morphine (1-2mg/kg)La douleur sera régulièrement évaluée selon une échelle d’évaluation de la douleur comprenant 3 catégories : appréciation globale subjective évalué de 0 (pas de douleur) à 3 (douleur intense) observation à distance comprenant le niveau d’activité le comportement la posture au repos l’apparence et l’alimentation une réaction à la manipulation comprenant le mouvement à la sollicitation et la manipulation de la zone douloureuse Chaque sous catégorie sera évaluée de 0 à 3, un score de 1 à 7douleur légère de 8 à 14 modérée et 15 à 22 sévère. Le traitement antalgique sera instauré en fonction de la douleur

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables sont : - douleurs mécaniques : douleur rythmée par les mouvements et s’atténuant au repos - gène motrice - infection (désunion de la cicatrice, écoulement purulent, sepsis) - complications hémorragiques - allergie ou effet indésirable à certains produits médicamenteux - décès précoce de l’animal

Devenir

A l’issue de la procédure les lapins subiront une euthanasie par injection intracardiaque d’euthasol (pentobarbital) du fait de la procédure chirurgicale importante pouvant impliquer des douleurs et gènes motrices ultérieures.

Remplacement

Ce projet expérimental ne peut être remplacé par un modèle in vitro puisqu’un axe vasculaire avec un débit sanguin est nécessaire.

Réduction

Ce protocole expérimental n’a jamais été effectué et paraît indispensable à réaliser pour prouver son objectif. 24 lapins sont nécessaires pour apporter une preuve expérimentale. Augmenter ce chiffre n’apporterait aucun avantage scientifique. Le diminuer ne nous permettrait d’apporter aucune preuve scientifique supplémentaire. Le protocole d’anesthésie générale a déjà été effectué chez des lapins et a montré son efficacité avec un bon contrôle de leur analgésie.

Raffinement

Nous avons choisi le lapin en prenant en compte l’état actuel des connaissances. Ils proviendront d’un système d’élevage au sein même du laboratoire (aucun transport ne sera effectué). L’hébergement ainsi que le personnel sera le même de leur naissance jusqu’à leur mort (cage spacieuse, propre) afin d’augmenter autant que possible leur bien-être. Ils seront de même habitués à la présence humaine et au portage. La planification du protocole nous permet d'évaluer et d’éviter de potentiels obstacles. Pendant le protocole des soins pré, per et post opératoires adéquats seront instaurés. Le recours à l’anesthésie générale est nécessaire compte tenu de l’intervention chirurgicale importante. Une procédure d’euthanasie appropriée sera utilisée en cas souffrance, sepsis non contrôlés ou d’éventuelle situation entrainant une souffrance animale incontrôlable.

Choix des espèces

Nous utiliserons des lapins car c’est l’animal le plus utilisé dans l’étude de l’ingénierie tissulaire osseuse dans la littérature: cela nous permettra de comparer nos résultats avec ceux des travaux disponibles. De plus c’est un animal de moyenne corpulence, où il est possible de disséquer un axe vasculaire de taille convenable. La corpulence des lapins nous permettra aussi d’introduire un substitut osseux de taille adéquate pour les analyses anatomopathologiques tout en minimisant leur gêne fonctionnelle motrice. La génération osseuse est comparable chez le lapin et chez l’homme, ce qui permettra de transposer les résultats obtenus chez l’homme. La population cible pour la reconstruction osseuse est une population adulte. Nous avons besoin d’étudier la régénération osseuse sur un os mature. Nous utiliserons donc des lapins adultes de 16 semaines, ayant un poids d’environ 2.5-3 kg.

20 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Le porteur leur pose un cathéter dans la veine jugulaire par chirurgie sous anesthésie, puis pratique des gavages et des prélèvements sanguins répétés, pour mesurer la concentration sanguine d'une association d'antibiotiques et en optimiser la posologie en élevage porcin. Il précise que dix animaux proviennent d'une étude précédente et que chaque porc est mis à mort après trois semaines pour prélever muscle, foie et reins. Il affirme qu'aucune alternative non animale ne reproduit la cinétique plasmatique avec sa variabilité, préalable qu'il juge "indispensable".

Objectifs

L'association d'antibiotiques sulfamides/triméthoprime est classiquement utilisée en médecine vétérinaire, notamment dans la filière porcine, pour traiter certaines infections. Le ratio de doses sulfamides/triméthoprime dans la quasi-totalité des spécialités vétérinaires mises sur le marché est de 5:1. Or, ce ratio n’a pas été établi à partir de données animales, mais est une transposition directe du ratio correspondant à l’association sulfaméthoxazole/ triméthoprime (SDMX/TMP) utilisée chez l’Homme. Un biais majeur de cette transposition réside dans le fait que les vitesses d’élimination des sulfamides (illustrées par leurs temps de demi-vie plasmatiques, t1/2) peuvent être très variables selon l’espèce animale. Chez l’Homme, le SDMX et le triméthoprime ont des t1/2 assez proches, permettant de maintenir un rapport de concentrations entre les deux antibiotiques constant au cours du temps et de conserver ainsi l’effet synergique entre eux. A l’inverse, chez les animaux de rente par exemple, certains sulfamides ont des t1/2 beaucoup plus longs que celui du triméthoprime. Les sulfamides seront alors présents beaucoup plus longtemps chez l’animal, d’où une perte probable de l’effet synergique recherché et par voie de conséquence de l’efficacité de l’association. L’ensemble de ces facteurs questionne la pertinence du ratio 5:1 des formulations vétérinaires, mais aussi les posologies recommandées (doses et/ou intervalles d’administration). L’objectif principal de cette procédure expérimentale est de générer des données pharmacocinétiques (= suivi des concentrations sanguines au cours du temps) in vivo de l’association sulfadiazine(SDZ)/TMP et de SDMX/TMP chez le porc pour contribuer, par la suite, à déterminer les modalités optimales d’administration de SDZ/TMP et de SDMX/TMP par une approche de modélisation pharmacocinetique/pharmacodynamique (PKPD) (= technique permettant de relier les concentrations sanguines et l'effet observé qui est la diminution des bactéries pathogènes). Les deux sulfamides ont été sélectionnés en raison de leur différence pharmacocinétique majeure, avec un sulfamide à courte durée d’action (SDZ) et un sulfamide à longue durée d’action (SDMX). Le porc a été choisi car c’est l’une des filières les plus utilisatrices de cette association d’antibiotiques (en termes de tonnage et d’exposition).

Bénéfices attendus

La promotion de solutions thérapeutiques à base d’associations – entre antibiotiques ou entre antibiotiques et nonantibiotiques – tient une place importante dans les stratégies de lutte contre l’antibiorésistance. Lorsqu’elles associent 2 antibiotiques, ces solutions doivent viser à limiter l’émergence de résistances et non à élargir le spectre d’activité. Les formulations associant le TMP avec un sulfamide peuvent entrer dans la première catégorie, ce qui en fait une exception « vertueuse » parmi les associations disponibles en médecine vétérinaire dont la plupart ont été développées avec un objectif d’élargissement du spectre. Malheureusement, les formulations TMP/sulfamides destinées aux animaux ont été développées par transfert « aveugle » des données de la médecine humaine relatives à l’établissement d’une synergie, sans tenir compte des spécificités des espèces animales, ou des bactéries pathogènes. En outre, les données pharmacocinétiques et les études cliniques requises au moment des dépôts de demande d’autorisation de mise sur le marché (AMM) dans les années 1990 étaient minimes. Aussi, une analyse pharmacocinétique (PK) complète incluant des études pharmacocinétiques chez les espèces cibles (objectif de ce projet avec le porc) et des études pharmacodynamiques (PD) d’efficacité in vitro sur des bactéries pathogènes d’intérêt vétérinaire (futur projet) permettra de proposer de nouveaux ratios de doses et/ou de nouvelles posologies en s’appuyant sur les approches les plus modernes de la pharmacologie des antibiotiques (modèles in vitro, pharmacocinétique de population, modélisation PK/PD).

Procédures

Pour réaliser la cinétique plasmatique, un cathéter central sera posé au niveau de la veine jugulaire externe grâce à un acte chirurgical réalisé sous anesthésie générale d'une durée moyenne d'1h30 . Cet acte chirurgical peut être source de stress et de douleur mais une contention maitrisée suivi d’une anesthésie/analgésie adaptée permettra de réduire au maximum ces désagréments. Il est prévu l'acquisition d'un échographe afin de permettre le placement du cathéter central de façon écho-guidée, permettant ainsi de réduire la durée de l'intervention chirurgicale (de 1h 30 à 45 minutes par animaux) et de minimiser le risque infectieux (acte moins invasif). Une fois le catéther posé (avec une rallonge du connecteur), les prélèvements de sang seront totalement indolores, sans contention particulière et réalisé en moins d'une minute. Durant l'expérimentation une source de stress viendra des gavages qui nécessitent une contention ferme (2 gavages par animal au total espacés de 10 jours au minimum) mais la contention sera effectuée par des opérateurs formés, assurant la sécurité des animaux et des opérateurs et minimisant les sources d’inconfort pour les animaux. Chaque manipulation de contention+gavage ne dure pas plus de quelques minutes (entre 3 et 4 minutes)

Impact sur les animaux

Pour réaliser la cinétique plasmatique, un cathéter central sera posé de façon chirurgicale au niveau de la jugulaire externe. Cet acte chirurgicale est source de stress et de douleur mais une contention maitrisée suivi d’une anesthésie/analgésie adaptée permettra de réduire au maximum ces désagréments. Une fois le catéther posé (avec une rallonge du connecteur), les prélèvements de sang seront totalement indolores. Le plus gros stress se fera lors des gavages qui nécessitent une contention ferme (2 gavages par animal au total) mais La contention sera effectuée par des opérateurs formés, assurant la sécurité des animaux et des opérateurs et minimisant les sources d’inconfort pour les animaux.

Devenir

Chaque porc sera mis à mort à l’issue des 3 semaines d’expérimentation dans des conditions éthiques, et les tissus d’intérêt (muscle, foie reins) seront récoltés pour dosage des antibiotiques.

Remplacement

Il n’y a pas d’alternative non-animale robuste et pertinente actuellement permettant de reproduire la cinétique plasmatique (avec la variabilité inter-individuelle existante) des molécules chez des animaux vivants, préliminaire indispensable à l’approche PKPD.

Réduction

L’utilisation de 5 animaux par groupe (soit 10 au total) est un minimum pour pouvoir correctement estimer la varabilité inter-individuelle des paramètres pharmacocinétiques (clairance, etc) par une approche de population (modèle non-liéaire à effet mixte). En outre, le design en cross-over permet d’utiliser les mêmes animaux entre 2 administrations, en garantissant la fiabilité des données grâce à l’instauration d’un wash-out. Enfin, une fois le modèle PK développé, l’extrapolation à d’autres posologies se fera par des simulations numériques sans l’utilisation d’animaux supplémentaires. Une partie des animaux (n=10) provient d'une étude précédente car il n'a pas été nécéssaire de les mettre à mort, les 10 autres seront achetés.

Raffinement

Les porcs seront hébergés par 2 lors de la phase d'acclimatation (7 jours) puis seront seuls par case (sur caillebotis) après la pose du cathéter afin de limiter les risques d'arrachement. Cependant, les barrières entre cases permettent un contact visuel, olfactif et tactile (groin à groin) entre porc voisin. Des jouets seront mis à disposition : balle et/ou rouleau et/ou jouets à macher suspendus. Les prises de sang répétées seront effectuées après la pose chirurgicale de cathéters (avec recours à une anesthésie et une analgésie suffisante pour les animaux), permettant ainsi une récolte de sang non-douloureuse et limitant le stress. Les cathéters seront protégés avec un bandage adéquat qui sera vérifié régulièrement et changé s'il est trop souillé. Un suivi-post opératoire individuel des animaux sera effectué et une analgésie sera mise en place si nécessaire (AINS +/- analgésique de type morphinique), et le début de la cinétique ne se fera que au minimum 24h après la pose du catéther. La contention sera effectuée par des opérateurs formés, assurant la sécurité des animaux et des opérateurs et minimisant les sources d’inconfort pour les animaux. Cependant, des points limites et critères d’arrêt ont été définis afin de permettre une intervention rapide sur les animaux.

Choix des espèces

Il s’agit de l’espèce cible des molécules étudiées Porc sevrés, avant la puberté (~30kg)

342 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Le porteur leur fait subir cinq injections intrapéritonéales, puis une castration chirurgicale par ablation des testicules, suivie d'un gavage cinq jours sur sept pendant quatre semaines, pour étudier la résistance aux androgènes dans le cancer de la prostate. Il indique des risques d'infection ou d'hémorragie postopératoires et des points limites déclenchant la mise à mort, la privation d'androgènes faisant partie du protocole. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit la complexité des lésions précancéreuses et que le recours à l'animal est "nécessaire".

Objectifs

Afin de mieux comprendre la résistance aux androgènes dans le cancer de la prostate (CaP), ce projet vise à étudier les effets de la castration chirurgicale dans plusieurs modèles murins de cancers prostatiques. Les résultats préliminaires obtenus au laboratoire mettent en évidence l'implication forte du facteur de transcription HIF1a induit par l'hypoxie. L'objectif est donc de conduire une étude dans laquelle les souris seront traitées par un composé inhibiteur de HIF1a, disponible commercialement, en combinaison avec une castration chirurgicale.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer si HIF1a est impliqué dans la résistance aux androgènes dans le cancer de la prostate et par quels mécanismes.

Procédures

Les souris subiront 5 injections intra-péritonéales sur 5 jours, soit une manipulation de 3 minutes par jour, puis une intervention chirurgicale (castration/sham) d'une durée de 30 minutes 3 mois plus tard et le gavage ( 3 minutes d'intervention) 5 jours sur 7 pendant 4 semaines. Aucune autre intervention n'est prévue.

Impact sur les animaux

En post-opératoire, nous surveillerons les animaux par inspection et palpation abdominale, en cas de rougeur ou de voussure, une infection post-opératoire pourra être supposée et une surveillance rapprochée sera effectuée. En cas de signe de douleur (dos vouté, un pelage hérissé ou inactivité après stimulation, l'animal sera retiré de l'étude et pourra bénéficier de soins après l'avis du vétérinaire. Les effets secondaires post chirurgicaux sont principalement une infection post-opératoire. L'orchiectomie bilatérale n'entraine pas d'effet secondaire à proprement parler. En cas de mauvaise ligature des artères, une hémorragie peut avoir lieu. Cette complication est très rare et facilement visible du fait du gonflement important de la zone et d'effets secondaires généraux sur l'animal. Le Px-478 est un médicament qui a déjà été utilisé en essai clinique chez l'homme avec une bonne tolérance. Cette drogue peut entrainer une perte d'appétit.L'apparition des tumeurs de la prostate se manifeste par un gonflement intra abdominal et sera surveillé par palpation.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de procédure 3. La procédure1 permettant d'induire l'inactivation des gènes. La procédure 2 est une castration chirugicale dont le but est de limiter la circulation des androgènes. Dans ce contexte, la privation en androgène fait partie du traitement et il est donc nécessaire de garder les animaux en vie après l'intervention et pendant toute la durée du traitement qui correspond à la procédure expérimentale 3.

Remplacement

Aucun modèle cellulaire récapitule la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans la formation de lésions précancéreuses. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'animaux pour avoir un système qui reproduit la maladie chez l'homme afin de comprendre les mécanismes impliqués et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques.

Réduction

Afin de différencier les rôles de différentes molécules pouvant être impliquées dans le développement du cancer de la prostate, l’ensemble du projet va nécessiter l'utilisation de 3 lignées de souris différentes. Par ailleurs, des études préliminaires in vitro et des études pilotes sur un très petit nombre de souris vont être faites pour identifier le protocole efficace et pour mieux définir les expériences à effectuer sur les grands groupes de souris. Afin d'obtenir des résultats signicatifs, de comprendre les mécanismes moléculaires impliqués et en raison de l'hétérogénéité des souris, nous avons réduit au maximum le nombre de souris nécessaires et nous étudierons à la fois les tissus (histologie), les gènes exprimés et les différents sous types de cellules qui composent les tumeurs. Nous comparerons systématiquement les souris mutants versus les contrôles et au sein d'un génotype donné nous comparerons les sham versus castrés véhicule et les sham versus castré + traitement. Nous comparons des paramètres quantitatif (expression de gènes, nombre de cellules positives pour certains marqueurs histologiques, taux de prolifération cellulaires, poids des tumeurs, pourcentage de glandes atteinte des tumeurs) et également quantitatifs (expression ou non d'un marqueur au niveau histologique).

Raffinement

Les souris subiront une anesthésie générale et recevront des médicaments antalgiques afin de prévenir l'apparition de douleurs. Elles seront surveillées de manière très rapprochée durant les jours qui suivront la chirurgie. Une attention particulière sera accordée au niveau de la zone d'incision avec surveillance des points de suture, palpation abdominale et inspection à la recherche de signe d'infection locale. Si un point limite est atteint, l'animal sera mis à mort. Pour le bien-être social des animaux, les groupes seront respectés et les animaux seront remis en cage avec leurs partenaires préalables. Aucun animal ne sera laissé isolé dans sa cage.

Choix des espèces

La souris est un animal qui a un système immunitaire largement décrit dans la littérature et qui est proche de l’humain avec une immunité innée et adaptative, ce qui est crucial pour la mise en œuvre de notre projet d’étude sur l’interaction des cellules épithéliales de la prostate avec le microenvironnement tumoral. De plus, les souris qui seront utilisées expriment les mêmes protéines que l’homme, ce qui permet de générer les mutations les plus fréquemment identifiées dans le CaP humain. L’ensemble de ces résultats nous permettra d’étudier au plus près l’évolution des lésions de CaP afin de développer des stratégies personnalisées de prévention, de surveillance active et/ou de traitement précoce. Les animaux utilisés seront adultes, de 8 semaines à plus d'un an afin de faire une cinétique en fonction de l'âge.

Une partie des souris de ce projet appartient à la lignée NSG, dépourvue de système immunitaire, pour qu'elles acceptent une greffe de cellules humaines. 450 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes irradiées puis soumises sous anesthésie à une injection dans le fémur d'une molécule à tester, une injection que le porteur dit lui-même "douloureuse". 90 d'entre elles reçoivent ensuite des cellules souches sanguines humaines par voie intraveineuse. Toutes sont tuées au plus tard deux jours après l'irradiation, pour mesurer la molécule et la part de cellules humaines dans leur moelle et leur sang.

Objectifs

L’utilisation des cellules souches hématopoïétiques (CSH) suscite un fort intérêt médical du fait de leur potentiel de régénération et de différenciation. Elles sont présentes dans la moelle osseuse et sont à l’origine des cellules sanguines. Elles sont utilisées au cours des transplantations hématopoïétiques dans le but de traiter les patients atteints de leucémies ou de maladies génétiques affectant les cellules du sang (leucocytes, globules rouges, plaquettes). L’une des limites de la greffe cependant, provient de la faible proportion de CSH capables de migrer vers les niches hématopoïétiques localisées dans la moelle osseuse et de s’y implanter. La grande majorité des CSHs est en réalité perdue ou détruite avant d’atteindre la moelle osseuse. Ainsi, une proportion importante des greffons, notamment ceux issus des sangs de cordons ombilicaux présentant de faibles quantités de CSHs, ne peut pas être utilisée pour la greffe. Une solution permettant d’augmenter le nombre de greffons disponibles consiste à augmenter la proportion des CSHs « utiles », c’est à dire capables de s’implanter dans la moelle osseuse. Cette amélioration permettrait en outre de limiter les risques d’échec de greffe chez les patients transplantés. Dans ce contexte l’objectif de notre projet est d’évaluer l’effet de l’injection de molécules impliquées dans le guidage des cellules vers les niches hématopoïétiques médullaires, en association ou non avec des complexes stabilisateurs, préalablement à l’injection des CSHs, sur l’efficacité de l’implantation des CSHs humaines dans la moelle osseuse. Les expériences de transplantations seront réalisées dans un modèle de souris n’ayant pas de système immunitaire, ne rejetant donc pas la greffe de cellules humaines.

Bénéfices attendus

Cette étude permettrait d’établir la preuve de concept que l’injection de molécules (sélectionnées sur la base de leur effet sur les CSHs) augmente la prise de greffe des cellules souches hématopoïétiques (CSHs) lors d’expérience de transplantation. A terme, ces résultats concourront à l’optimisation des protocoles de transplantation de cellules hématopoïétiques chez l’humain, dans le but d’augmenter les chances de réussite thérapeutique et le nombre de patients pouvant bénéficier d’une greffe de moelle osseuse.

Procédures

Chaque animal (450 au total) sera soumis à une irradiation, étape nécessaire à une bonne prise de greffe (3Gy soit 3min environ pour les souris NSG et de 2 fois 5.5Gy soit 2 fois 5 min environ pour les souris C57) et à l’injection intrafémorale d’une molécule sélectionnée sur la base de son activité sur les CSHs. Cette injection qui dure quelques minutes sera réalisée sous anesthésie (1h environ) avec une prise en charge analgésique. Certains animaux (90 au total) seront également transplantés avec des CSHs humaines par voie intra veineuse. L’injection de CSHs qui ne dure que quelques secondes, est réalisée sous anesthésie et analgésie. Ces procédures permettront de tester 5 molécules différentes en association ou non avec des complexes stabilisateurs La durée maximale de chacune des procédures est de 2 jours et aucun prélèvement n’est réalisé sur animal vivant.

Impact sur les animaux

Compte tenu du délai très court entre l’irradiation (3Gy pour les NSG et 2x5.5Gy pour lesC57/Bl6) et l’euthanasie précose des animaux (2 jours maximum) aucune altération significative de leur santé n’est attendue. L’infusion intra-veineuse de cellules hématopoïétiques humaines ne provoquent pas de douleur et se fait sous anesthésie générale. L’injection dans l’os est douloureuse. Elle sera effectuée sous anesthésie et sera accompagnée d’une prise en charge analgésique.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure afin de quantifier, dans la moelle et dans le sang, la concentration de la molécule étudiée pour les études de pharmacocinétique ainsi que la proportion de CSH humaines présente dans la moelle des souris pour l’expérience de transplantation.

Remplacement

La prise de la greffe au cours des transplantations de CSH est un phénomène complexe et il n’existe actuellement aucune méthode alternative permettant de mimer ce processus in vitro. Le passage par une expérience de transplantation chez l’animal est le seul outil permettant d’évaluer la capacité des CSHs à se loger au niveau de la moelle osseuse et ainsi d’identifier des molécules capables d’améliorer cette étape.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux, nous déterminerons sur un petit nombre de souris les conditions expérimentales optimales de transplantation en fonction de chaque molécule testée. L’effet de cinq molécules différentes en association ou non avec des complexes stabilisateurs sera évalué. Notre expérience ainsi que la littérature dans le domaine nous montrent que le nombre minimal d’animaux requis par groupe et par expérience est de 6 animaux afin que nous puissions rendre des résultats statistiquement significatifs sur le plan hématologique. Nos expériences préliminaires par étapes successives nous permettront d’optimiser les paramètres expérimentaux et de vérifier que ce nombre d’animaux est valide lorsque l’on combine injection intra-fémorale d’une molécule à tester et injection intra-veineuse de cellules hématopoïétiques.

Raffinement

Pour limiter au maximum l’impact sur le bien-être des animaux, toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie générale grâce à un mélange anesthésique/analgésique. Par ailleurs, une prise en charge analgésique sera effectuée si besoin au site de l’injection intra-fémorale. Enfin une surveillance accrue (minimum 2 fois par jours) sera réalisée entre le moment de l’irradiation et l’euthanasie de l’animal (soit 2 jours maximum) afin de pouvoir intervenir rapidement en cas d’effet inattendu.

Choix des espèces

Les souris sont des animaux de petite taille, qui montrent de grandes similarités en termes de mécanismes moléculaires et cellulaires avec l'humain. Elles sont couramment utilisées pour l’étude de l’hématopoïèse après transplantation de CSHs. Nous utiliserons 2 lignées de souris, les C57BL6 et les NSG La comparaison des résultats obtenus entre ces deux lignées nous permettra de déterminer le dosage optimal de la molécule injecté et le modèle murin qui sera utilisé pour l’étude pharmacocinétique. Les souris NSG seront utilisées pour les expériences de transplantation car ces souris sont immunodéficiences et acceptent par conséquent la greffe de cellules humaines. Ces animaux seront maintenus et manipulés stérilement. Les souris sont hébergées en groupe de 6 dans des cages stériles en portoir ventilé et un enrichissement (coton) est ajouté à leur environnement.

180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Le porteur leur greffe des cellules cancéreuses en sous-cutané puis administre un traitement par voie intrapéritonéale chaque jour pendant vingt jours, pour étudier le rôle d'une enzyme dans la réponse immunitaire anti-tumorale. Comme pour un projet voisin du même laboratoire, il indique que les souris sont maintenues sans antalgique afin de ne pas modifier la croissance tumorale, tout signe de souffrance entraînant la mise à mort. Il affirme que l'effet du système immunitaire sur la tumeur ne peut être évalué qu'in vivo et que le modèle murin est "nécessaire".

Objectifs

Ce projet vise à démontrer l’importance de l’enzyme scd1 dans la régulation de la réponse immunitaire anti-cancéreuse et l’importance de cette enzyme dans la résistance à l’immunothérapie.

Bénéfices attendus

L’inhibition de l’activité Scd1 a montré une efficacité contre la progression tumorale. Cependant, cette réponse demeure limitée et la recherche de thérapies combinées à une thérapie anti-Scd1 pourrait améliorer la réponse. Nous attendons une réactivation bénéfique du système immunitaire anti-tumorale avec une immunothérapie anti-PDL1 à la suite d’une thérapie anti-Scd1 conduisant à une régression tumorale complète.

Procédures

Les souris seront soumises à une unique injection sous-cutanée de cellules cancéreuses et à des injections intrapéritonéales quotidiennes pendant 20 jours. Chaque contention et injection ne dureront pas plus de 30 secondes.

Impact sur les animaux

Les injections IP répétées peuvent entraîner un stress chez les souris vigiles au moment de la contention. La transplantation des cellules quant à elle, se fera sur souris anesthésiée à l’isoflurane. Les souris KO scd1 seront produites par le croisement de souris hétérozygotes scd1+/- sans phénotypes délétères pour les seules études expérimentales et ne seront jamais maintenues en colonies car elles présentent ont un phénotype délétère inflammatoire avec une adiposité réduite, une augmentation de la sensibilité à l’insuline et des lésions de la peau à un âge avancé. Tout autre effet indésirable conduira également à la mise à mort de la souris (nécrose tumorale, changement de comportement ou d’apparence). Les animaux seront suivis quotidiennement et une prise de poids hebdomadaire sera effectuée.

Devenir

Après transfert des cellules cancéreuses par transplantation sous-cutanée, les souris seront maintenues 20 jours en cage à l’animalerie avec un suivi quotidien. Elles seront ensuite mises à mort.

Remplacement

L'utilisation de ce modèle murin de cancer est nécessaire car l’effet du système immunitaire sur la tumeur ne peut être modélisé in vitro et ne peut donc être évalué que chez l’animal. De plus, les similarités physiologiques et métaboliques entre la souris et l'Homme permettront de transposer les résultats obtenus à la situation des patients atteints de cancer.

Réduction

Pour limiter le nombre d'animaux utilisés, nous avons déterminé l'effectif nécessaire par groupe en s'appuyant sur notre expérience antérieure en prenant en compte la variabilité interindividuelle et à l'aide d'un outil statistique prédictif permettant d’obtenir un résultat fiable et analysable.

Raffinement

Les souris soumises à cette procédure expérimentale seront maintenues en groupe pour favoriser la socialisation et placées dans un environnement calme avec enrichissement structural du milieu permettant la construction de nid. Les souris seront maintenues sans traitement antalgique pour ne pas interférer avec la réponse inflammatoire et éviter des modifications de croissance tumorale. Elles seront surveillées quotidiennement et tout signe de douleur ou souffrance conduira à leur mise à mort. Au total, 180 souris femelles seront utilisées.

Choix des espèces

Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans l’étude de la carcinogenèse par sa proximité avec la physiopathologie chez l’Homme. En outre, les souches consanguines de souris, telle que la souche C57Bl6 a un phénotype homogène, ce qui permet d’identifier plus facilement les effets induits par les manipulations expérimentales. D’un point de vue technique, le taux de reproduction élevé de la souris permettront la création des groupes d’animaux Scd1 KO et WT requis sur une période de courte durée. Des souris femelles âgées d’au moins 8 semaines seront utilisées pour une prise tumorale homogène et faciliter l’injection des cellules cancéreuses.