Procédures modérées

280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris immunodéficientes reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau, puis des médicaments deux fois par semaine pendant sept à neuf semaines, avant d'être tuées par dislocation cervicale pour prélever les tumeurs. Le porteur teste une trithérapie contre l'hépatoblastome, cancer du foie de l'enfant, et prévoit de répéter voire de refaire l'ensemble de l'étude, ce qui porte l'effectif à 280. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit la complexité de la tumeur in vivo.

Objectifs

L’hépatoblastome est le cancer primaire du foie le plus fréquent chez l’enfant de moins de 5 ans. Le traitement de référence par chimiothérapie est inefficace dans 20 % des cas. Nos données en laboratoire montrent que l’action combinée de 2 drogues en sus de cette chimiothérapie de réfèrence permet d’éliminer très efficacement les cellules tumorales du foie en laboratoire. Dans ce projet, nous souhaitons tester l’efficacité de cette trithérapie chez l’animal. Ces travaux de recherche nous permettrons aussi d’étudier pourquoi certaines drogues sont efficaces et pas d’autres et comment les cellules tumorales arrivent à résister à chacune de ces drogues lorsqu’elles sont utilisées seules. En effet, ces informations sont cruciales pour comprendre comment fonctionnent ces molécules et quelles propriétés les rendent efficaces. La découverte et la validation de nouveaux traitements des tumeurs du foie chez l’enfant permettront de faire un pas important pour soigner les enfants souffrant de ce cancer, en particulier ceux en rechute ou en échec thérapeutique.

Bénéfices attendus

Démontrer que l’association de ces trois médicaments bloque la formation de tumeur d’hépatoblastome chez la souris plus efficacement que chaque drogue utilisée seule ou combinée deux à deux.

Procédures

Implantation de cellules tumorales en sous-cutanée sur 280 animaux. Suivi des animaux pendant 7 à 9 semaines. Administration de médicaments 2 fois par semaine. Mesure de la tumeur au pied à coulisse 3 fois par semaine. Pesée des souris deux fois par semaine.

Impact sur les animaux

Les principaux effets indésirables attendus sur les animaux sont l’injection de cellules tumorales en sous-cutanée et la pousse de la tumeur pendant plusieurs semaines.

Devenir

Les 280 souris de ce projet seront euthanasiées par dislocation des vertèbres cervicales afin de procéder au prélèvement des tissus tumoraux et à leur analyse pas des approches moléculaires et histologiques.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative à la réalisation de ce projet, c’est-à-dire un système biologique qui reproduit partiellement ou entièrement les conditions cliniques, analytique et/ou moléculaire de notre objet d'étude. II est impossible d'obtenir les informations fournies dans cette étude sans l'utilisation de cette souche de souris (souris immunodéficience, NOD/LtSz-scid IL2R gamma, NSG). Sources bibliographiques consultées (PubMed, CEVMA). Les conclusions recherchées ne peuvent être obtenues par des modèles alternatifs d'étude in vitro, qui ne reconstituent pas de manière optimale la complexité, l’interactivité et la diversité des compartiment stromales et tumorales en action in vivo chez la souris.

Réduction

Le test statistique utilisé sera le test l’ANOVA (test très généralement utilisé pour ces études). Le nombre d’animaux nécessaire par lot pour détecter 50% de différence interlots avec 50% d’écart type intra lots est de 10. Pour renforcer la puissance statistique de nos données, nous prévoyons de réaliser l’expérience deux fois. Si la dose d’utilisation d’une des drogues doit être réajusté, l’étude sera refaite une fois. Nous prévoyons d’utiliser 280 souris dans ce projet du fait que nous avons 7 groupes de 10 souris (7 conditions de traitements), que l’expérience sera refaite deux fois et que l’étude globale sera refaite une fois si la dose d’une drogue doit être réajustée. Nous allons bien sûr tout faire pour que les doses choisies des trois drogues soient les bonnes dès la première série d’analyses et que l’étude ne soit pas refaite, ce qui aurait comme conséquence une réduction de moitié du nombre de souris.

Raffinement

Concernant l’objectif de réduction de la souffrance, la douleur et l’angoisse infligées aux animaux. Les souris seront hébergées en animalerie A2, suivies quotidiennement pour détecter d’éventuels signes cliniques par du personnel qualifié. Ces animaux sont hébergés en cages de type 2L à raison de 5 souris par cage. Les conditions d’hébergements sont adaptées à la forte immunodépression de ces animaux : cages, nourritures et litières sont stérilisées. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu en l’occurrence des nids de « woodwoll ». En ce qui concerne les données de comportement et de physiologie, l’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Les critères utilisés sont ceux définis par un chercheur référent en 1998. Le score limite est de 12. Au-delà, l’animal sera euthanasié sans attendre. En tenant compte de ces points limites adaptés et conformément à la directive européenne 2010/63 CE, nous proposons comme classement pour l’ensemble de nos procédures le degré modéré. Les critères prépondérants ainsi que les mesures conservatoires en fonction du score de cette grille sont détaillés dans les procédures.

Choix des espèces

1. La souche de souris NSG est appliquée dans la recherche sur le cancer en raison de sa capacité à développer le processus étudié du fait de sa forte immunodépression. 2. La capacité d’extrapoler les résultats. 3. L’expérience d’utilisation des chercheurs demandeurs. 4. L’existence des équipements nécessaires à l’étude. 5. La pertinence des installations de l’Animalerie. Les souris seront utilisées à l'âge adulte de 8 semaines à 12 semaines de vie. À cet âge la taille de la souris facilite la manipulation expérimentale et l’inoculation de cellules. Les souris seront utilisées à l'âge adulte de 8 semaines à 12 semaines de vie. À cet âge la taille de la souris facilite la manipulation expérimentale et l’inoculation de cellules. Les points limites adaptés pour le modèle de souris utilisé sont décrits dans l’annexe 1.

170 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour développer un mélanome, elles reçoivent des injections intrapéritonéales jusqu'à trois fois par semaine et portent une tumeur dorsale qui peut s'ulcérer ou se nécroser. Le porteur étudie les mécanismes de résistance à une immunothérapie anti-PD1 et affirme que seul un modèle in vivo reproduit les interactions entre tumeur et système immunitaire. Toutes sont tuées faute d'entrer dans une nouvelle procédure.

Objectifs

Le mélanome métastatique est le cancer de la peau le plus agressif. Malgré l’essor récent des immunothérapies dans le traitement du mélanome, des problèmes de résistance sont observés. Identifier de nouveaux acteurs impliqués dans la résistance permettra de développer de nouvelles approches de combinaison thérapeutique. La plasticité des cellules cancéreuses, c’est-à-dire leur capacité à s’adapter notamment aux traitements anti-cancéreux, est régulée par un ensemble de facteurs dont l’expression est fréquemment dérégulée dans le mélanome. Les objectifs de ce projet sont d’étudier dans des modèles murins de mélanome, les caractéristiques des cellules tumorales et du microenvironnement immunitaire au cours du traitement par immunothérapie.

Bénéfices attendus

Le mélanome métastatique est le cancer de la peau le plus agressif. Malgré l’essor récent des immunothérapies dans le traitement du mélanome, des problèmes de résistance sont observés. Identifier de nouveaux acteurs impliqués dans la résistance permettra de développer de nouvelles approches de combinaison thérapeutique.

Procédures

Les animaux seront soumis à des niveaux de douleur modérés. Des injections en intra-péritonéal seront réalisées maximum 3 fois/semaine dans des zones différentes du péritoine.

Impact sur les animaux

Ces modèles de mélanomes n’étant pas métastatiques, les nuisances attendues sur les animaux sont l'apparition de tumeur localisée sur le dos mais qui n'entravera pas le déplacement de l'animal. Dans de rare cas, il peut y avoir apparition de plaie ou de nécrose au niveau de la tumeur.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort car ils ne rentreront pas dans une nouvelle procédure.

Remplacement

Seul un modèle in vivo chez l’animal peut permettre d’étudier les interactions complexes entre les cellules tumorales et les cellules immunitaires présentes au sein du stroma. En effet, les interactions entre les différentes cellules du système immunitaire et les cellules tumorales présentent un fort niveau de complexité qui ne peut être reproduit in vitro. De plus, l'efficacité de traitement par immunothérapies ne peut être évaluée in vitro. Pour cela, la souris est l’espèce animale la plus pertinente du fait de l’existence de modèles murins de mélanomes qui reproduisent la pathogenèse chez l’homme et les caractéristiques histologiques. En parallèle des analyses complémentaires seront réalisées in vitro dans des lignées de mélanome, et sur des prélèvements tumoraux de patients, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Réduction

Le nombre maximal de souris utilisées dans ce projet (n=170) a été réduit au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et reproductibles. Pour chacune des procédures expérimentales présentées, le nombre de souris par groupe a été défini a minima afin de permettre une analyse statistique des résultats adaptée selon le cas.

Raffinement

Une définition précise des points limites permettra de limiter au maximum toute souffrance animale. De plus, la bonne connaissance des modèles expérimentaux, le suivi adapté des points limites précoces et prédictifs et la manipulation des animaux sans stress par des personnes compétentes en expérimentation animale permettent de limiter au maximum toute douleur ou souffrance des souris. Nous évaluerons l'état de bien-être ou de souffrance des animaux au minimum 2x/semaine. L'environnement sera enrichi avec du coton cardé.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus pertinente pour l’étude du mélanome. Bien qu'il existe certaines différences entre l'immunologie murine et humaine, d'innombrables découvertes chez la souris sont transposables chez l'homme. Les modèles murins de mélanome que nous utilisons représentent la majorité des mutations retrouvées chez l'Homme et miment bien la pathologie humaine. D'autre part, la richesse des réactifs disponibles (notamment immunothérapie) permet une compréhension très approfondie des phénomènes mis en jeu du niveau moléculaire au niveau de l'organisme, un atout déterminant dans notre projet.

216 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent une tumeur, reçoivent des injections de cisplatine et, pour 72 d'entre elles, subissent sous anesthésie une lésion musculaire provoquée par le froid. Le projet se présente comme une contribution aux 3R, censé vérifier si des cultures cellulaires pourraient un jour remplacer la souris, mais le porteur précise que les souris ne seront pas remplacées ici et que la comparaison avec le modèle animal reste "nécessaire". Toutes sont tuées pour prélever leurs tissus.

Objectifs

Il est évident que les cellules tumorales sont dans un environnement tridimensionnel dans les organismes vivants, recréer l’architecture correcte de tissu in vitro pour imiter l’effet du microenvironnement tumoral (TME) n’est pas une entreprise simple. Malgrès d'importants efforts qui ont été fait dans la création de modèle 2D et 3D dans ces analyses, ces methodes montrent encore d'importantes limitations. Les lignes directrices actuelles recommandent que les chercheurs qui utilisent l’expérimentation animale doivent se demander si et par quelle configuration alternative les animaux qu’ils envisagent d’utiliser pourraient être remplacés, si et comment leur nombre peut être réduit, et si et comment l’expérimentation animale pourrait être raffinée, c’est-à-dire être plus fiable avec la réduction du stress animale tout en obtenant une meilleure information avec un nombre inférieur d’animaux. Dans le but de fournir des bases empiriques à la recherche épistémologique, nous allons utiliser en parallèle des modèles animaux et cellulaires pour étudier la même question, c.a.d. comment le TME peut influencer la réponse tumorale aux agents chimiothérapiques. Nos resultats permettront de savoir si l'etude du TME des cellules cancereuses fait chez l'animale peut etre remplacer par des études in vitro.

Bénéfices attendus

La pertinence du TME pour les études cliniques et biologiques sur la pathophysiologie tumorale est maintenant établie, bien qu’étant une réalisation récente. En effet, le comportement des tumeurs et leur interaction avec l’hôte, allant de la réponse immunitaire à la cachexie induite par le cancer, sont si profondément affectés par le TME, que les études actuelles sur la progression du cancer et la réponse à la chimiothérapie ne peuvent plus ignorer cette question. Afin d'étudier la reproductibilité des modèles par des cultures cellulaires et tirer des conclusions de la comparaison de résultats issus de modèles in vitro et in vivo, nous avons la nécessité de l’utilisation des modèles animaux. Le but majeur de notre étude est de vérifier si les effets de la cisplatine sur la tumeur sont reproductible d'un modèle in vivo à un modèle in vitro, même en présence d’un microenvironnement tumoral assai réduit ou simplifié in vitro. La comparaison avec le modèle in vivo joue un rôle central dans les conclusions de l’étude et cela est le but premier de notre projet. Cela permettra d'établir des critères plus précis et spécifiques suivant les modalités des 3r, cad le remplacement (total avec le modèle in vitro), la reduction (nombre de souris), et le raffinement.

Procédures

Les souris seront soumis à differents types d'interventions: 1 injection de solution en SC sur animaux vigiles, elle durera 10 secondes. Elle concerne l'ensemble des 216 animaux. 4 injections en IP (à jours 7,11, 14 et 17) sur animaux vigiles, elle durera 10 secondes. Elle concerne l'ensemble des 216 animaux. 1 chirurgie, une blessure par le froid sous anesthesie à jours 14, la chirurgie est estimée à 6 min et le reveil entre 30 et 40 min. Elle concerne 72 animaux.

Impact sur les animaux

Les nuissances attendus chez les souris sont: masse tumorale dans la region dorsale des souris, fatigue et un stress, toxicité de la cisplatine, douleur musulaire suite à la blessure par le froid dans les premiers jour suivant l'intervention. Ces effets indésirables seront surveillés quotidiennement selon nos critères de point limite afin de mieux gérer le bien-etre des animaux.

Devenir

Toute le souris sont mises à mort à la fin de la procédure 1. La mise à mort se fera selon la réglementions européenne en vigueur. Afin de valider l'hypothèse qui est de savoir si les études fait chez l'animale peut être remplacer par des études in vitro dans l’analyse du microenvironnement tumorale(TME) des cellules cancéreuses, l'analyse des diffèrent tissus post mortem obtenu sur ces animaux est nécessaire afin de les comparer aux résultats que nous obtiendrons sur les études de culture cellulaire.

Remplacement

L'objectif général du projet est d'étudier la reproductibilité du modèles souris par rapport au modèle de cultures cellulaire. Nos objectifs spécifiques sont de voir si on peut mesurer les mêmes effets d’un puissant agent chimio thérapeutique, la cisplatine, sur les cellules tumorales in vivo et in vivo, en comparant les résultats obtenus sur un modèle souris porteur de tumeur aux résultats sur une culture de cellules isolées. Pour cela, nous allons développer un système de cultures cellulaires C26 en 2D ainsi que 3D lesquelles permettront de se rapprocher le plus possible au microenvironnement tumoral in vivo. Les souris ne seront pas remplacées dans cette étude. En revanche, les résultats nous dirons si et jusqu’à quel point dans le future nous pourrons remplacer le modele animal, dans des études similaires futures

Réduction

Pour estimer le nombre minimum d'animaux nécessaire, nous avons effectué un calcul statistique réitératif. De plus, nous disposons de l’expérience préalable formalisé dans l’appréciation rétrospective avec ce même modèle animal. De cette approche, nous avions prévu que 18 souris pour chaque condition expérimentale pour un totale de 216 souris, avec un niveau de confiance du 95% et une puissance de 80. Les outils statistiques et informatiques que nous mettons en place sur la base de notre expérience avec ce type de modèle permettront de réduire le nombre de manipulations en exploitant au mieux les données obtenus par chaque expérience.

Raffinement

Pour améliorer les conditions de vie des souris et leur éviter le stress, les pratiques suivantes seront mises en place. Nous avons défini les variables et la méthode d’évaluation quantitative du point limite au-delà duquel les animaux recevront un analgésique ou seront euthanasiés : des intervention différentes (de l’administration d’analgésique jusqu’au l’euthanasie) seront mises en place selon le score obtenue. A savoir que ce modèle expérimental a une cinétique de développent de la pathologie très bien connue, permettant de programmer les expériences de maniere à ne pas arriver aux points limites. Pour des pratiques plus invasives, tel que la génération d’un dommage musculaire afin d’étudier la régénération , l’anesthésie totale sera pratiquée, suivie d’un traitement analgésique. L’expérimentation animale sera effectuée par une équipe entrainée à cette technique. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (5 par cage maximum) et l'isolement est évité (3 souris par cage minimum). L’enrichissement du milieu consiste en l’ajout de lanières de papier Kraft afin que les souris puissent faire un nid. Afin de diminuer le stress des animaux, une maison en carton sera ajoutée dans la cage. Enfin, les animaux seront manipulés quotidiennement afin de les habituer aux manipulations et ainsi diminuer leurs stress le jour des experimentations.

Choix des espèces

La souche BALB/c est la seule compatible avec la tumeur 26, qui a été sélectionné car non métastatique, et sur cette base nous avons privilégié cette souche.. La connaissance détaillée du modèle nous permet d’une part d’exploiter au maximum les informations expérimentales obtenues et d’autre parte d’avoir une sensibilité particulaire pour évaluer tout signe de souffrance ou malaise de ces souris en présence de tumeur.

300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit une injection intrapéritonéale de la forme larvaire d'Echinococcus multilocularis, puis développe dans l'abdomen une masse parasitaire qui entraîne une prise de poids et des difficultés de locomotion, avec un risque d'ulcération de la peau par frottement contre la cage. Toutes sont tuées pour récolter cette masse parasitaire, l'objectif étant de maintenir la souche au laboratoire et de produire du matériel pour des outils de diagnostic. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro n'existe et conclut qu'il est "nécessaire" d'utiliser la souris.

Objectifs

L’objectif du projet est de maintenir au laboratoire un isolat d’Echinococcus multilocularis sur hôtes intermédiaires. E. multilocularis est l’agent causal chez l’Homme de l’échinococcose alvéolaire, maladie rare mais mortelle si non traitée. La transmission à l’Homme se fait exclusivement par voie orale, suite à l’ingestion d’œufs de parasites présents dans l’environnement sur des végétaux souillés, au contact du sol contaminé mais aussi de manière indirecte par ingestion d’œufs manuportés après contact avec le pelage souillé de carnivores porteurs du parasite. Le nombre de cas humains diagnostiqués chaque année en France reste faible, cependant on note une augmentation au cours des dix dernières années de ce nombre qui est passé de 15 à 30 cas en moyenne par an. Le maintien en laboratoire d’isolats d’Echinococcus multilocularis sur hôtes intermédiaires nous permettra de disposer facilement d’un matériel parasitaire de bonne qualité. La maîtrise de l’infection des hôtes intermédiaires en captivité permettra : 1/ De fournir du matériel larvaire de référence pour la mise au point de nouveaux outils diagnostiques. 2/ De produire au niveau de la masse larvaire des protoscolex (forme initiale du futur ver qui se développera dans l’intestin des hôtes principaux).

Bénéfices attendus

L’ensemble des prélèvements récoltés permettra de produire du matériel de référence pour le développement d’outils de diagnostic qui contribueront à une meilleure connaissance de la répartition/ circulation des pathogènes étudiés et à une meilleure compréhension des mécanismes qui aboutissent à l’exposition de l’homme à ce parasite. Les protoscolex produits permettront de reproduire sur des renards en captivité le cycle parasitaire d’ Echinococcus multilocularis pour obtenir des vers adultes et des œufs de parasite.

Procédures

Les souris vigiles ne recevront qu'une seule injection intrapéritonéale (intervention ne prenant que quelques secondes) de la forme larvaire du parasite (0,5 ml) sans anesthésie préalable.

Impact sur les animaux

L'infestation par le parasite, entraine une prise de poids progressive des souris, en raison du développement de la masse parasitaire dans l’abdomen, qui à terme entraine des difficultés de mobilité/locomotion. Exceptionnellement, des cas d’ulcération cutanée liés aux frottements de l’abdomen sur les parois de la cage peuvent être constatés lors de la surveillance journalière. Dans ce cas, les animaux seront immédiatement mis a mort.

Devenir

L'ensemble des animaux sont mis à mort afin de récolter la massse paraistaire.

Remplacement

Il n'existe actuellement pas de méthode alternative in vitro pour produire des protoscolex en dehors de l’infection des hôtes intermédiaires.

Réduction

Le projet utilisera environ 60 souris par an, soit 300 sur 5 ans. Cela se justifie par un temps de developpement de la forme larvaire qui est de 5 mois minimum et par un succès du maintien de la forme productrice de protoscolex qui est de 66%. Ces paramètres nous obligent pour assurer le maintien des souches de répéter l’infestation tous les deux/trois mois sur des lots d’environ 10 souris. Les souris sont issues pour une part importante d'animaux commandés dans le cadre d'un projet concernant la détection d’agents de la menace dans des échantillons d’eau potable contaminée accidentellement ou intentionnellement. Ce type de projet n'étant mis en oeuvre que lors d'évènements de contamination, les souris commandées pour ce projet ne sont donc pas systématiquement utilisées.

Raffinement

Les souris seront surveillées tous les jours et bénéficieront d’un enrichissement (carton, abris plastique et cellulose, bâton de bois,..) dans les cages. Les animaux seront pesés mensuellement jusqu’à 4 mois puis à partir du 5eme mois les pesées seront hebdomadaires afin de contrôler si les animaux atteignent le poids limite de 80 gr. De la nourriture sera diposée au sein même de la cage en cas de problème d’accès à la mangeoire située sur la grille. Si toutefois, les souris montrent des signes de mal-être, des problèmes locomoteurs trop importants, alors les animaux seront mis à mort. L'observation d'une pathologie intercurrente qui ne peut être soignée (ou entraînant une douleur qui ne peut être contrôlée) entraîne la mise à mort compassionnelle de l'animal. De même, un point limite de temps a été fixé à 6 mois, point au-delà du quel les animaux sont mis à mort même si le poids limite n'a pas été atteint.

Choix des espèces

Les hôtes intermédiaires d'Echinococcus multilocularis sont les rongeurs sauvages et plus particulièrement Arvicola terrestris, communément appelé Campagnol terrestre ou encore Rat taupier. Comme il n'existe pas de méthode alternative in-vitro pour produire des protoscolex, il est nécessaire d'utiliser le modèle souris, pour obtenir du matériel parasitaire larvaire facilement utilisable pour le développement des outils diagnostiques et pour l’infestation des hôtes définitifs en captivité. Notre expérience a montré que le stade de développement n'avait pas d'influence sur la sensibilité du parasite et le developement de la forme larvaire. Les souris sont issues pour une part importante d'animaux commandés dans le cadre d'autres projets concernant la détection d’agents de la menace dans des échantillons d’eau potable contaminée accidentellement ou intentionnellement. Ce type de projet n'étant mis en oeuvre que lors d'évènements de contamination, les souris commandées pour ce projet ne sont donc pas systématiquement utilisées et ne sont donc entrées dans aucune procédure. Les animaux utilisés peuvent donc avoir des poids compris entre 20 et 30 grammes.

27 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour évaluer une souche atténuée de peste porcine africaine à visée vaccinale. Les animaux immunisés puis éprouvés avec une souche virulente subissent jusqu'à 22 prélèvements de sang sur huit à quatorze semaines, tandis que les cochons non immunisés développent une infection décrite comme "inexorablement fatale" et sont tués à six jours avant d'en mourir. Le porteur indique un épisode de fièvre et une baisse de croissance après inoculation de la souche atténuée. Il affirme qu'aucune méthode in vitro n'évalue la réponse du porc à l'infection et que seuls les suidés y sont sensibles.

Objectifs

Le laboratoire a découvert et breveté une souche atténuée de virus de la Peste Porcine Africaine (PPA) à potentiel vaccinal. Cette souche (ASFV-989) a été produite initialement sur cellules prélevées sur porcs (macrophages alvéolaires). En vue du développement de la souche ASFV-989 comme vaccin contre le PPA, il est indispensable de pouvoir produire cette souche sur lignée cellulaire (cellules se multipliant de manière continue). Nous avons donc entrepris l’adaptation de la souche ASFV-989 sur cellules de lignée immortalisées à partir de cellules de testicules de porcs (Swine-Testis ,ST). Après 20 passages sur cellules ST, la souche ASF-989 a montré une bonne adaptation sur ce support cellulaire. L’adaptation à ces nouvelles cellules a cependant conduit à des modifications génétiques de la souche. Les objectifs de ce projet sont donc d’évaluer si l’adaptation de la souche ASFV-989 aux cellules ST n’a pas modifié ses caractéristiques en termes de sécurité et de protection vaccinale en étudiant : (i) d’une part les réponses cliniques et immunovirologiques induites par l’inoculation de la souche ASFV-989-ST chez le porc, par voie intramusculaire (IM) ou oronasale (ON), et la persistance à long terme de la souche atténuée chez les animaux inoculés, et d’autre part (ii) la protection vaccinale vis-à-vis d’un challenge infectieux avec la souche virulente Georgia 2007/1

Bénéfices attendus

La peste porcine africaine est une maladie virale qui se caractérise par des signes cliniques tels qu’une perte d’appétit rapide et un abattement des porcs en lien avec une forte fièvre, ainsi que des hémorragies cutanées, diarrhées, etc…, qui vont induire une forte mortalité chez les porcs domestiques comme chez les sangliers européens. Pour le moment, il n’existe pas de vaccin commercialisé contre la PPA. De ce fait, la gestion des foyers de PPA repose chez les porcs domestiques sur des mesures de restriction de mouvement des animaux et des abatta ges massifs. Chez les sangliers sauvages, la gestion des foyers est complexe et repose sur la mise en place de clôtures, de piégeages et d'abattages. D’un point de vue sociétal, ces mesures de gestion sont de plus en plus critiquées. La disponibilité d’un vaccin pourrait offrir une alternative plus acceptable. Si les résultats de notre projet sont conformes aux attendus en termes de sécurité et d’efficacité vaccinale, la souche ASFV-989ST pourrait être utilisée à terme comme vaccin, à la fois chez les porcs domestiques (après immunisation IM), mais aussi chez le sanglier (vaccination par voie orale par appâts).

Procédures

Au cours de la procédure 1, les animaux seront inoculés par voie intramusculaire ou oronasale par la souche ASFV-989ST puis seront challengés, 1 mois plus tard, par la même voie par la souche virulente Georgia. Le groupe de porc non-immunisé sera seulement inoculé par la souche Georgia par voie IM. Les inoculations intramusculaire ou oronasale sont des actes rapides qui prennent moins d'une minute. Les animaux immunisés seront soumis à un toltal de 15 prélèvements sanguins au cours des 8 semaines de l’étude. Les animaux non-immunisés seront soumis 4 prélèvements sanguins au cours de la période qui précède et suit le challenge par la souche Georgia. Les prises de sang sont réalisées par des animaliers pratiquant ces prélèvements très régulièrement, la durée des prises de sang n'excède donc pas 1 à 2 minutes Au cours de la procédure 2, le groupe immunisé sera inoculé avec la souche ASFV-989ST par voie IM (durée des inoculations de moins d'1 minute). Les animaux de ce groupe seront soumis à un total de 18 prélèvements sanguins au cours des 14 semaines de suivi. Les animaux non immunisés seront soumis quant à eux à 22 prélèvements sanguins au cours des 14 semaines de suivi (durée des prises de sang d'1 à 2 minutes).

Impact sur les animaux

Suite à l’inoculation de la souche ASFV-989ST (par voie IM ou ON), les porcs devraient présenter un épisode fébrile de quelques jours pendant lesquels leur consommation alimentaire et leur croissance devraient être diminuées. Chez les animaux non immunisés, le challenge avec la souche virulente Georgia conduit à des hyperthermies et à des sypmptômes cliniques caractéristiques de la maladie. L’issue de cette infection étant inexorablement fatale chez les animaux non-immunisés, ceux-ci seront mis à mort à J6 post-challenge avant que les animaux ne meurent de l’infection ou plus précocement si nécessité, en cas d’atteinte d’un point limite.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet. Des prélèvements de tissus (pour recherche virologique) sont prévus à la fin de chaque procédure, la mise à mort des animaux est donc indispensable.

Remplacement

Aucune méthode in vitro d’évaluation directe de la réponse du porc à l’infection ou à la vaccination par le virus de la PPA n’est disponible.

Réduction

Les lots immunisés / challengés seront constitués chacun de 6 porcs et les lots témoins et contrôle positif de 3-4 porcs. Cet effectif est le minimum nécessaire par groupe pour des analyses statistiques robustes compte tenu de la variabilité individuelle attendue sur les paramètres mesurés (croissance, virémie, réponses immunes, etc.). Les tests statistiques utilisés seront, pour une distribution normale : les tests ANOVA et de Student ; et pour une distribution ne suivant pas la loi normale : les tests de Kruskall-Wallis et Kolmogorov-Smirnov.

Raffinement

Hébergement des animaux en groupes stables et sociaux avec enrichissement du milieu. Pour les prélèvements sanguins : contention sans lasso tant que la taille des animaux le permet. Récompense (grenadine) distribuée après chaque prise de sang. Après inoculation par la souche ASFV-989ST et challenge avec la souche virulente Georgia : suivi clinique renforcé selon la grille de score clinique définie pour la PPA.

Choix des espèces

Etant donné que seuls les suidés sont sensibles à l’infection par le virus de la PPA, il est indispensable d’avoir recours aux porcs pour cette étude (=espèce cible). Les animaux sont sevrés à 4 semaines d’âge. Les animaux auront 6 semaines d’âge au moment de la première inoculation. A 6 semaines, le porc présente d’un point de vue physiologique un système immunitaire mature.

5 500 animaux non-humains vont être utilisés, 3 000 rats, 2 000 cobayes et 500 souris, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est placé plusieurs heures dans une chambre de pléthysmographie, reçoit une substance à tester, parfois après pose chirurgicale d'un cathéter dans la veine jugulaire, avant un prélèvement de sang terminal. Le porteur mène ces tests de pharmacologie de sécurité respiratoire comme prérequis réglementaire à la mise sur le marché de médicaments, et prévoit de tuer les animaux prélevés ou exposés à des substances mal connues, les autres cobayes étant remis en stock. Il affirme que ces effets sur la fonction respiratoire de l'animal vigile ne peuvent être observés par des méthodes alternatives.

Objectifs

Ce projet permet l'évaluation de l'effet des substances sur le système respiratoire: effet secondaire dans le contexte de la pharmacologie de sécurité ou modèle d'efficacité tel que des modèles d'asthme par exemple. L’objectif du projet est d’étudier les effets pharmacologiques principaux des substances étudiées, par rapport aux cibles thérapeutiques visées et d’établir le profil de sécurité de nouvelles substances médicamenteuses avant leur passage chez l’homme, et ce dans le cadre des recommandations européennes, américaines ou japonaises en vue de l’obtention des autorisations de mise sur le marché. Les tests utilisés dans ce cas sont des modèles prédictifs pour l’évaluation des risques au niveau du système respiratoire chez l’animal conscient et non restreint. La substance est généralement administrée à dose unique. Les études des effets de substances sur la fonction respiratoire sont réalisées par pléthysmographie, principalement chez le Rat, le Cobaye ou la Souris. Les tests décrits dans l’ensemble des procédures utilisées dans ce projet ont été caractérisés de façon extensive dans la littérature scientifique et sont mis en œuvre au sein du laboratoire. Par ailleurs, la méthode de pléthysmographie peut également être un outil de choix pour l’étude de la fonction respiratoire sur des modèles animaux physiopathologiques tels que les souris transgéniques ou des modèles de bronchoconstriction ou d'asthme chez le Rat, le Cobaye ou la Souris. L’intérêt sociétal est évident puisqu’il s’agit de prérequis réglementaires pour l’enregistrement de nouveaux médicaments. Les documents réglementaires (CPMP, FDA et MHW) s’accordent pour considérer le système respiratoire comme une des fonctions vitales à explorer dans le cadre des études de pharmacologie de sécurité (ICH S7A guideline, 2001).

Bénéfices attendus

Ces modèles seront mis en place et utilisés afin de tester l’efficacité des médicaments et de s’assurer qu’ils n’induisent pas d’effets secondaires ou inattendus. Ils entrent comme prérequis règlementaires pour obtenir les autorisations de commercialisation des nouveaux médicaments. Avant les tests sur l’animal, les produits sont généralement testés et présélectionnées avec attention in vitro. Néanmoins, les procédures utilisées dans ce projet ont été étudiées attentivement et caractérisées de façon extensive par une bibliographie approfondie. Ainsi, les techniques utilisées dans ce projet ont été optimisées, afin d’assurer un maximum de bien- être pour l’animal dans le strict respect des 3Rs.

Procédures

Lors l'expérience, les animaux sont pesés puis installés dans la chambre de pléthysmographie (un animal par chambre) pendant une durée de 3 heures (temps d'habituation et de stabilisation). Ils sont ensuite sortis de la chambre, administrés puis remis dans la chambre. Pour certaines administrations en intraveineuse, les animaux subissent une chirurgie de courte durée pour la pose d'un cathéter au niveau de la veine jugulaire. Cette intervention est réalisée quelques jours avant le test. A la fin de l'expérience, les animaux sont observés. Un prélèvement de sang terminal est réalisé soit au niveau de la veine sublinguale sur animaux vigiles, soit en intracardiaque sur animaux anesthésiés de façon à pouvoir effectuer les analyses nécessaires sur les mêmes lots. Cela permet de ne pas inclure des animaux satellites pour la vérification de paramètres complémentaires.

Impact sur les animaux

Il est possible de choisir des doses efficaces qui ne présentent pas d’effet sur l’animal. Il est également à noter que des effets toxiques majeurs ne sont pas attendus. A ce stade du développement du médicament, il est usuel d’avoir déjà des notions de toxicité des composés. Il n’est donc pas attendu de sévérité forte liée au médicament. Une procédure spécifique est toutefois présente dans ce dossier pour prendre en compte ce cas rare ou lorsque les prélèvements vivo sont importants. La pléthysmographie corps entier permet de suivre les paramètres respiratoires sur plusieurs heures sur l’animal vigile en leur laissant une liberté de mouvements.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, s’il y a un prélèvement, les animaux sont tous sacrifiés. S’il n’y a pas de prélèvement les animaux ayant reçu des substances dont l’effet à long terme n’est pas connu sont sacrifiés. Les animaux n’ayant pas reçu de substances dont l’effet à long terme n’est pas connu sont remis en stock.

Remplacement

L’impact de substances pharmacologiques sur les paramètres respiratoires des espèces choisies est prédictif de leurs effets chez l’Homme. De plus, le choix des espèces est basé sur la bibliographie scientifique, les modèles expérimentaux étant largement décrits chez le rat, la souris et le cobaye. Les tests/modèles que nous souhaitons développer et valider dans ce projet ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car ils impliquent l’observation des effets de substances pharmacologiques sur la fonction respiratoire des animaux vigiles. Les techniques, décrites et validées dans ce projet, sont utilisées dans divers modèles animaux qui ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car ils impliquent l’observation des effets de substances pharmacologiques sur le comportement, le système immunitaire, les paramètres physiologiques, le métabolisme ou l’interaction entre différents organes ou systèmes.

Réduction

Huit animaux par groupe sont classiquement inclus dans ces expériences. Les analyses de puissance ne sont pas réalisées car il serait nécessaire de générer de nombreuses études. Si cela est pertinent et afin de réduire le nombre d’animaux, tous les prélèvements d’échantillons biologiques seront réalisées à la fin des évaluations pharmacologiques (et non sur des animaux surnuméraires satellites). Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des mesures. Dans le but de réduire le nombre d’animaux (dans l’application de la règle des 3R), certains animaux peuvent être réutilisés à la stricte condition qu’ils n’aient pas subis de procédures sévères et après accord du vétérinaire.

Raffinement

Un soin particulier dans le raffinement des méthodes est assuré et garantit l’utilisation systématique du modèle apportant le maximum de réponses scientifiques et le minimum de souffrance pour l’animal. Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites permettant de sacrifier précocement tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids, des yeux, la posture, les réactions de l'animal quand il est approché ou stimulé, la respiration, l'appétit, l'état d'hydratation, les tremblements ou convulsions), afin d’assurer d’une part, un bon suivi des animaux et d’autre part, une fin sans souffrance ou angoisse lorsque nécessaire. Les méthodes d’euthanasie choisies, le cas échéant, sont sélectionnées pour supprimer toute forme d’angoisse, de stress ou de douleur. .). De plus, les animaux sont manipulés fréquemment et il est mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objet de nidification, objet à ronger ou à mastiquer, présence de congénères. Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des mesures.

Choix des espèces

Principalement rongeurs (rats, souris, cobayes) sevrés, âge variant entre 3 semaines et 2 ans, conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique Les études des effets de substances sur la fonction respiratoire sont réalisées par pléthysmographie, principalement chez le Rat, le Cobaye ou la Souris. Les documents réglementaires (CPMP, FDA et MHW) s’accordent pour considérer le système respiratoire comme une des fonctions vitales à explorer dans le cadre des études de pharmacologie de sécurité (Touvay et le Mosquet, 2000 ; ICH S7A guideline, 2001). Cette technique a montré toute sa pertinence pour détecter les effets broncho-stimulants de nouvelles substances qui augmentent la fréquence respiratoire et la ventilation/minute (De Sanctis et al., 1991) ou bien des effets broncho-constricteurs allergiques ou non-allergiques en augmentant le paramètre de pause augmentée, pris comme index d'obstruction des voies aériennes chez le Rat (Kirschvink et al., 2005), la Souris (Delorme and Moss, 2002; Hamelmann et al., 1997) et le Cobaye (Chong et al., 1998) ou d'asthme chez le Rat, le Cobaye ou la Souris (Murphy, 2003)..

672 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont soumises à une restriction alimentaire chronique à la moitié de leur ration pendant deux à six semaines, parfois avec une roue d'activité, ainsi qu'à des prélèvements de sang et des injections répétées, pour modéliser l'anorexie mentale. Le porteur présente la perte de poids comme le principal effet indésirable et indique la corriger en 24 heures si elle dépasse le seuil prévu. Il affirme qu'une approche intégrée chez l'animal est "indispensable" et ne peut être remplacée par des méthodes in vitro ou in silico.

Objectifs

L’anorexie mentale (AM) est un trouble des conduites alimentaires qui se caractérise par une restriction alimentaire et une activité physique compulsives aboutissant à une dénutrition chronique et des complications somatiques et psychiatriques sévères. Parmi les troubles psychiatriques, l’AM a le taux de mortalité le plus élevé et un taux de rechute important. La compréhension des mécanismes qui sous-tendent l’AM et son évolution est donc essentielle et représente un enjeu de santé publique. L’objectif de ce projet, mené chez des souris, est de montrer l’impact d’une restriction alimentaire chronique associée ou non à de l’activité physique volontaire sur l’évolution de biomarqueurs du métabolisme. En clinique, les patients qui souffrent d’AM de type restrictif présentent de manière surprenante une adaptation efficace de la glycémie qui reste relativement stable sur la durée. Nous nous intéressons à une hormone produite en réponse à l'état de dénutrition et dont les concentrations plasmatiques sont élevées chez les patientes souffrant d'AM. Nous nous intéressons notamment à deux isoformes de cette hormone et leur implication dans la modulation de la prise alimentaire, la glycémie et de la motivation à l’activité physique. Nous évaluerons donc comment un modèle murin conçu pour s'approcher au mieux du contexte de survenue et de chronicisation des symptômes de l'AM peut permettre la mise en évidence de biomarqueurs pertinents qui seront utilisés en clinique comme potentiels facteurs de diagnostic et surtout de pronostic de l’évolution de la maladie.

Bénéfices attendus

Ce projet, en parallèle des études menées en clinique, nous permettra de préciser les adaptations métaboliques observées en situation de restriction alimentaire et/ou de renutrition et de valider des biomarqueurs prédictifs de l’évolution de la maladie.

Procédures

Restriction alimentaire chronique (50% de la quantité délivrée en ad libitum) entre deux et six semaines. Prélévements sur animaux vigiles : prélévements d'une goutte de sang à la queue pour vérifier l'état glycémique de l'animal au cours de la restriction alimentaire, tous les 2-3 jours. Injection unique en intrapéritonéal : glucose, glycérol, pyruvate, glutamine, insuline (évaluation de la régulation glucidique). Injection en sous-cutané (sub-scapulaire) en aigu (injection unique) : isoformes de la ghréline (implication dans la régulation de la prise alimentaire et de la glycémie)

Impact sur les animaux

Nous utilisons ce modèle de restriction alimentaire depuis plusieurs années. La perte de poids induite par la restriction alimentaire est le principal effet indésirable. Toutefois, le protocole permet une perte de poids progressive et contrôlée, et l'état général des animaux est surveillé de manière quotidienne. Aussi, une perte de poids plus importante que celle habituellement observée sera régularisée dans les 24h en ajoutant une quantité de nourriture plus importante, permettant une reprise rapide de poids. Afin d'obtenir l'activité physique individuelle, certaines souris seront temporairement maintenues en cage individuelle équipée d'une roue d'activité, et ce pendant 4 jours.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à chaque fin de procédure.

Remplacement

Ce projet ayant pour objectif d’étudier des altérations cérébrales et comportementales (émotions, cognition et physiologie glucidique) complexes mimant la pathologie humaine, une approche intégrée chez l’animal est indispensable qui ne peut absolument pas être substituée par des approches in vitro ou in silico

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés (réduction) lors des explorations in vivo, nous répéterons différentes procédures sur le même animal lorsque cela se justifie sur le plan expérimental. Les animaux seront ensuite mis à mort pour les analyses biochimiques et/ou moléculaires.

Raffinement

Pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux, l’état général des animaux seront suivis quotidiennement par le personnel qualifié de l'animalerie (apparence physique, changement de comportement). Tout état anormal, évalué à l’aide de points limites bien définis, sera communiqué au responsable de projet et les mesures pour remédier à la souffrance seront mises en œuvre en cas de points limites atteints (utilisation d’un analgésique, arrêt du protocole ou mise à mort). Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés.

Choix des espèces

Le modèle murin est ici un modèle de choix pour l'exploration du comportement alimentaire dans des conditions particulières de restriction chronique, des processus addictifs et du métabolisme énergétique. Les régulations métaboliques, hormonales et neurobiologiques mises en jeu ont été bien caractérisées dans cette espèce et une littérature abondante existe montrant de très nombreuses similitudes avec les observations chez l’Homme. L’organisation anatomique et fonctionnelle du cerveau est relativement proche de celle de l’Homme, ce qui permet une investigation anatomique et fonctionnelle plus élaborée que ce que peuvent nous procurer les approches par imagerie chez l’humain. De plus, ces modèles bien décrits par les expériences ultérieures menées dans notre laboratoire permettent de réaliser des études phénotypiques comparatives pour caractériser les voies moléculaires ou mimer certains aspects de pathologies humaines. Les troubles alimentaires et en particulier l’AM font partie des pathologies neuropsychiatriques qui touchent principalement des sujets jeunes adultes et des adolescents. Dans notre projet, la majorité des procédures sera réalisée chez de jeunes souris adolescentes, sexuellement matures, à partir de l’âge de 5-7 semaines. Comme l’AM est une maladie chronique, les paradigmes expérimentaux que nous avons choisis nécessitent un suivi longitudinal de plusieurs semaines, ainsi certaines souris pourront être utilisées jusqu’à l’âge de 15-20 semaines.

143 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie d'implantation d'un biomatériau, soit sous la peau, soit dans un défaut osseux du crâne créé au préalable, pour tester l'activité de vésicules extracellulaires sur la repousse osseuse. Le porteur annonce une analgésie péri et post-opératoire et n'attend que des douleurs légères, avant une mise à mort par élongation cervicale pour prélever les implants et les crânes. Il affirme qu'il n'existe pas de solution de remplacement pour une étude portant sur le tissu osseux et retient la souris, dont sont issues les vésicules étudiées.

Objectifs

En vieillissant, la communication intercellulaire entre les cellules osseuses est modifiée, et par conséquent l’équilibre entre la formation et la résorption osseuse est altéré conduisant à la perte osseuse. Récemment, des vésicules extracellulaires ont été identifiées comme un nouveau mode de communication entre les cellules osseuses, permettant la régulation du remodelage osseux. Notre hypothèse de travail est que ces vésicules extracellulaires sont impliquées dans la communication entre les cellules osseuses et qu’elles participent au processus de régénération tissulaire et au vieillissement osseux. Les vésicules extracellulaires osseuses sont obtenues par centrifugation différentielle à partir d’un broyat d’os long de souris (tibias et fémurs) prélevés sur des animaux morts (ces animaux ne sont donc pas pris en compte dans le nombre d’animaux nécessaires à la réalisation de ce projet). A l’issu des premières centrifugations permettant d’éliminer les débris d’os et les corps apoptotiques, la fraction obtenue est « l’extrait total ». L’ultracentrifugation de « l’extrait total » permet d’isoler la « fraction vésiculaire » et la « fraction soluble » (contenant l’ensemble des protéines solubles : cytokines et facteurs de croissance par exemple). Nous avons observé in vitro que l’extrait total permet de stimuler la différenciation des ostéoblastes, les cellules formant l’os. Nos résultats indiquent que c’est la fraction vésiculaire qui est à l’origine de cet effet in vitro. L’objectif de notre projet est de valider in vivo que l’activité ostéogéniques de l’extrait total est bien associée à la fraction vésiculaire, et non à la fraction soluble. Ainsi pour l’ensemble de cette étude, nous allons comparer l’effet de ces trois fractions entre elles. De plus, nous allons comparer l’effet de ces fractions avec celui du gold-standard, la Moelle Osseuse Totale (MOT) qui sera le contrôle positif de l’ensemble de notre étude. Afin de maintenir le matériel biologique dans les défauts osseux, les fractions seront associées à un biomatériau composé d’un mélange d’hydrogel et de granules de Phosphate de Calcium Biphasique (BCP) utilisé ici pour leurs propriétés ostéoconductrices. Ce biomatériau est déjà utilisé dans le laboratoire avec succès pour la régénération osseuse. Cette étude sera menée chez la souris dans deux contextes : en site ectopique (implantation en sous-cutané) et en site orthotopique (implantation dans des défauts osseux de calvaria).

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra pour la première fois de valider in vivo la capacité ostéogénique des vésicules extracellulaires extraites d’os dans le cadre de la régénération osseuse. Les perspectives de cette étude pourront nous apporter de nouvelles connaissances des phénomènes impliqués dans la régénération osseuse grâce aux vésicules extracellulaires dérivées d’os. A plus long terme, l’utilisation de vésicules extracellulaire pourra permettre de remplacer les thérapies cellulaires classiques et pourront être appliquées à l’Homme.

Procédures

Deux procédures chirurgicales seront réalisées. Les animaux seront soumis soit à l’implantation sous-cutanée d’un biomatériau chargé en fraction biologique (temps opératoire max : 10 minutes) soit à l’implantation d’un biomatériau chargé en fraction biologique au niveau d’un défaut osseux critique de calvaria de souris réalisé au préalable (temps opératoire max : 20 minutes). Ces procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale et une analgésie adaptée sera appliquée. Aucun prélèvement sur animaux vigiles ne sera réalisé.

Impact sur les animaux

En se basant sur nos connaissances et nos études antérieures, nous n’attendons aucune gêne fonctionnelle, perte de poids, stress ou comportement anormal des animaux au cours de cette expérimentation. Les souris Swiss/CD1 sont décrites comme ayant une susceptibilité faible de développer les réactions inflammatoires sévères. Des douleurs post chirurgicales légères pourraient être observées. Pour cela, les animaux seront soumis à une analgésie péri-opératoire et post-opératoire par injection sous-cutanée de buprénorphine (0.05 mg/kg).

Devenir

En fin d’expérimentation, tous les animaux seront tués par élongation cervicale puis les implants sous-cutanés (procédure 1) ou les calvarias (procédure 2) seront prélevés et fixés pour les analyses radiologiques et histologiques mises en œuvre pour évaluer la repousse osseuse.

Remplacement

L’utilisation de rongeurs reste nécessaire afin de valider les propriétés des biomatériaux chargés en termes de biocompatibilité, d’ostéoinduction et d’ostéoconduction. Il n’existe malheureusement pas de solution de remplacement complet ou par des invertébrés en raison de l’étude menée sur le tissu osseux.

Réduction

Dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, le biomatériau utilisé a été sélectionné en amont et déjà testé pour sa biocompatibilité et sa capacité d’ostéoconduction in vitro et in vivo. Pour la première procédure utilisant des implants sous-cutanés, plusieurs implantation (jusqu’à 4) seront réalisées sur le même animal pour réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Pour la deuxième procédure réalisée en site orthotopique, les défauts osseux seront réalisés sur chaque os pariétal qui compose la calvaria de souris, soit 2 défauts par animaux, réduisant de fait le nombre d’animaux tout en préservant la puissance statistique. Par ailleurs une approche statistique (software GPower), nous a aidé à calculer le nombre d’implants nécessaires à l’obtention de résultats significatifs afin de constituer des groupes avec un nombre d’animaux nécessaires et suffisants à l’obtention de résultats significatifs et à la valorisation des résultats de cette étude. Les tests statistiques utilisés dépendront de la distribution des données. Pour chaque paramètre, la normalité et la distribution seront évaluées. En fonction de ces évaluations, un test de variance paramétrique (Anova) ou non paramétrique (Kruskall-Wallis) sera réalisé. Si P

Raffinement

Afin de raffiner la méthodologie, les procédures de manipulation et de surveillance régulière sont élaborées avec l’objectif d’éliminer toute forme de souffrance animale. Les animaux seront anesthésiés et recevront une analgésie adaptée en prémédication et jusqu’à 48 heures après la chirurgie. La surveillance régulière des animaux permettra d’évaluer des points limites selon une grille d’évaluation détaillé (Annexe). Selon les points limites identifiés, les animaux pourront recevoir une analgésie adaptée ou seront retirés de l’étude. Chaque étape de l’étude tiendra compte du bien-être de l’animal, de son arrivée dans l’animalerie spécialisée à son sacrifice en fin d’étude. Les animaux seront hébergés en groupe sociaux de 5 individus par cage avec enrichissement sous forme de frisottis et recevront une nourriture standard et de l’eau de boisson ad libitum.

Choix des espèces

Le modèle de défaut osseux critique de calvaria chez le rongeur est couramment utilisé dans la littérature pour l’étude de la régénération osseuse et est parfaitement validé. De plus, les vésicules extracellulaires que nous étudions étant issues de souris, nous avons décidé de rester chez la même espèce pour la validation expérimentale in vivo de notre hypothèse d’étude. Les animaux inclus dans cette étude seront des souris mâles âgées de 12 semaines au début de la procédure. Ceci permet d’avoir des animaux matures sans pathologies associées au vieillissement tout en limitant les biais liés à la croissance osseuse physiologique.

5 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal sain subit six séances sous un dispositif d'assistance respiratoire avec des acquisitions tomodensitométriques avant, pendant et après, sous anesthésie générale. Le porteur cherche à vérifier l'absence de lésions pulmonaires comme des atélectasies avant de proposer le dispositif à des patients, et prévoit la mise à mort des cinq animaux pour confirmer les images par histologie des poumons. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit des conditions cliniques et retient le porc pour la taille de ses poumons proche de celle de l'humain, jugeant leur prélèvement "indispensable".

Objectifs

De nombreuses pathologies respiratoires, telles que la mucoviscidose, la broncho-pneumapathie chronique obstructive ou les dilatations de bronches nécessitent une prise en charge pluridisciplinaire. La physiothérapie respiratoire est proposée aux patients souffrant d’affections respiratoires dans le but de gérer la dyspnée, contrôler les symptômes, améliorer la mobilité et la fonction, dégager les voies respiratoires et optimiser la toux. Un nouveau dispositif d’assistance en physiothérapie respiratoire a été développé. Avant de pouvoir le tester chez les patients, une étude sur l’effet du dispositif en utilisation intensive grâce à des données tomodensitométriques thoraciques avant, pendant et après traitement sur un modèle animal sain est nécessaire afin de s’assurer de l’absence de dommage sur le poumon notamment d’atélectasies, qui correspondent à un collapsus du tissu pulmonaire avec perte de volume.

Bénéfices attendus

Ce projet d'étude de la tolérance d'un dispositif d'assistance en physiothérapie respiratoire permettra de s'assurer de l'absence d'effets délétères sur le poumon malgré une utilisation intensive. Les résultats de cette étude permettront de proposer sereinement ce dispositifs aux patients souffrant de pathologies pulmonaires chroniques.

Procédures

Ce projet se déroule sur 5 jours après la semaine d'cclimatation des animaux. Chaque animal sera soumis à 6 sessions de 15 minutes de mise sous dispositif d'assistance en physiothérapie respiratoire avec des acquisitions tomodensitométriques avant, pendant et après l'utilisation du dispositif. Les 6 sessions seront réparties sur 3 jours (à J0, J2 et J4): une session en début de matinée et une en fin d'après-midi pour chaque journée expérimentale. La durée de chaque session sera d'environ 40minutes: 20 min de préparation de l'animal et 15 min de mise sous dispositif.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables qui pourraient survenir sont des lésions pulmonaires dont des atélectasies (collapsus du tissu pulmonaire avec perte de volume respiratoire). L'étude est menée pour s'assurer de leur absence. Les animaux seront imagés avant, pendant et après les sessions de physiothérapie respiratoire, ce paramètre sera évaluer tout au long de l'étude.

Devenir

Tous les animaux du projet (n=5) seront mis à mort à la fin de la procédure. Le prélèvement des poumons est indispensable afin de pouvoir confirmer les données d'imagerie par les analyses histologiques.

Remplacement

Ce projet a pour objectif d'évaluer les effets sur le poumon d'un dispositif d'assistance en physiothérapie respiratoire. Il n’existe pas de méthode alternative permettant d’atteindre cet objectif dans des conditions le plus proches possibles des cas cliniques, le recours à l'animal est donc nécessaire pour atteindre cet objectif. Le modèle animal choisi est le Porc qui présente l’avantage d'avoir des poumons et des bronches de taille comparable à ceux de l'Homme. Le dispositif médical testé ne serait pas compatible avec un animal de plus petite taille.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit en veillant toutefois de travailler sur un nombre suffisant pour obtenir des résultats fiables. Les sessions d'assistance respiratoire seront de 6 par animal, ce qui permettra d'avoir 30 sessions au total. La plupart des analyses dépendront de données qualitatives, par expérience, un nombre de 30 permettra d'obtenir des résultats interprétables, en tenant compte de la variabilité interindividuelle et de l'effet de répétition sur chaque individu.

Raffinement

Toutes les procédures expérimentales ainsi que l’environnement d’hébergement ont été optimisées. Les gestes interventionnels seront toujours réalisés sous anesthésie générale, par du personnel formé, permettant un temps interventionnel réduit au maximun, afin de prévenir la souffrance et l’angoisse de l’animal. Le bien-être de l'animal sera contrôlé en veillant aux conditions d'hébergement et au comportement des animaux. L'acclimatation des animaux sera d'une semaine avant d'entrer dans le protocole. Des observations quotidiennes seront réalisées par une personne compétente basées sur l'apparence physique externe, le comportement (sociabilité, appétit) et les réponses comportementales aux stimuli externes (peu enclins aux manipulations, tentative de fuite). Ces contrôles sont enregistrés et permettent de repérer tout animal malade ou blessé pour prendre des mesures appropriées. Des controles biquotidiens en postopératoire sur toute la durée de la procédure (5 jours) seront réalisés par une personne compétente avec évaluation du bien-être et de la douleur. L'évolution du score permet de noter l'amélioration ou l'aggravation de l'état de l'animal et de prendre des mesures appropriées (points limites). Chaque paramètre est ainsi quantifiable, les scores sont additionnés et l'atteinte d'un score supérieur ou égal à 6 définit un point limite et engendre la sortie de l'animal du programme et sa mise à mort après consultation du vétérinaire référent si nécessaire. Tout constat d'un mal-être est remonté au responsable du bien-être des animaux pour examen approfondis, traitements adaptés et/ou consultation du vétérinaire référent.

Choix des espèces

Il n’existe pas de méthode alternative permettant d’atteindre cet objectif dans des conditions le plus proches possibles des cas cliniques, le recours à l'animal est donc nécessaire pour atteindre cet objectif. Le modèle animal choisi est le Porc qui présente l’avantage d'avoir des poumons et des bronches de taille comparable à ceux de l'Homme. Le dispositif médical testé ne serait pas compatible avec un animal de plus petite taille. De plus, l'anatomie et la physiologie de l'appareil respiratoire du Porc présentent de grandes similitudes avec l'Homme.