Procédures sans réveil
Rôle du GLP-1 dans la fonction barrière de l’intestin.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
592 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 96 opérées sous anesthésie sans réveil et 496 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur provoque une ischémie de l'intestin par chirurgie, avec ou sans reperfusion, et des injections répétées, pour étudier le rôle du GLP-1 dans la barrière intestinale et l'infarctus de l'intestin. Le porteur indique que les molécules testées réduisent la prise alimentaire et prévoit une mise à mort au-delà de 20 % de perte de poids, une partie des animaux étant tués par décapitation. Il affirme que le remplacement est "impossible" et le recours au modèle animal "indispensable" pour une approche intégrée, un biomarqueur diagnostique restant à valider.
Objectifs
L'intestin, au-delà de sa fonction d'absorption des nutriments, constitue une formidable barrière entre le milieu externe et le milieu interne. Une perturbation de cette fonction barrière entraîne une altération de la perméabilité intestinale qui a été associée à des pathologies inflammatoires chroniques et aiguës telles que l'ischémie mésentérique aiguë (IMA). L'infarctus de l'intestin est une urgence médicale qui ne peut être diagnostiquée précocement. Il s'agit de l'évolution de l'IMA, provoquée par un apport sanguin insuffisant à l'intestin, entraînant la mort intestinale. Son taux de mortalité est de 60 à 90 % en raison de la gravité de la maladie et de l'échec d'un diagnostic rapide. Au cours des dernières années, d’importants efforts cliniques et précliniques ont été déployés pour trouver des biomarqueurs capables de prédire les dommages gastro-intestinaux avant qu’ils ne deviennent irréversibles et ne se propagent au reste du corps. A ce jour il n’existe pas de biomarqueur permettant un diagnostic précoce de l’IMA. Or un diagnostic précoce permettrait des interventions plus rapides, pouvant aboutir à : 1) éviter une intervention chirurgicale ; 2) moins de morbidité postopératoire et une survie améliorée si la chirurgie était indiquée. Cela aurait également un impact direct sur l'utilisation des ressources de santé postopératoires, tant au niveau des soins aux patients que de la prestation des services de santé. Identifier un biomarqueur spécifique de l’IMA utilisable en cas d'urgence clinique, constituerait une avancée majeure. Dans notre équipe nous avons identifié un nouveau biomarqueur sérique putatif pour l'AMI.
Bénéfices attendus
Ce travail devrait permettre de répondre aux questions suivantes : 1. Le biomarqueur sécrété lors d’une perturbation de la fonction barrière intestinale a-t-il un rôle dans cette fonction barrière. ? Si oui est-il bénéfique ou non ? 2. La sécrétion de ce biomarqueur vient il protéger les organes à distance de par ses propriétés anti-inflammatoires ? 3. Des médicaments, actuellement utilisés en clinique humaine, pourraient-ils être utilisés ou non lors de perturbation de la fonction barrière ?
Procédures
L’ensemble des procédures décrites dans ce projet repose principalement sur des procédures chirurgicales dont l’objectif est d’induire une perturbation de la fonction barrière en réalisant des ischémies mésentériques suivies ou non d’une reperfusion. La durée minimale de la chirurgie est de 30 minutes lors d’une ischémie et 50 minutes si elle est suivie d’une reperfusion. Certaines procédures vont nécessités des injections intra-péritonéales (IP), ou des prélèvements de microgoutte de sang pour mesurer la glycémie. Ces manipulations se font soit sous anesthésie locale (prélèvement sanguin) soit sur animaux vigiles (injections IP) et ne prennent que quelques secondes quand réalisées par un opérateur maitrisant les gestes techniques ce qui sera le cas.
Impact sur les animaux
Les expérimentations d’ischémie et ou ischémie/reperfusion de ce projet se feront sur des animaux anesthésiés et il n’y aura aucun réveil de l’animal. Les seules manipulations sur animaux non anesthésiés seront les injections intrapéritonéales des molécules pharmacologiques ou les prélèvements de micro gouttes de sang par la queue. Nous serons plus particulièrement attentifs lors des traitements chroniques de 2 semaines car il est parfaitement décrit dans la littérature que les molécules pharmacologiques utilisées réduisent la prise alimentaire. Ainsi un suivi de la masse corporelle toutes les 48h sera réalisé. Si aucun effet négatif ne sont décrits dans la littérature concernant les effets de ces molécules pharmacologiques nous seront également vigilant à tous signes susceptibles de traduire un inconfort voir une souffrance des animaux
Devenir
A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés sous anesthésie afin de réaliser des prélèvements sanguins et tissulaires.
Remplacement
Le remplacement est impossible car il s’agit d’étudier des processus physiologiques mettant en jeu une sécrétion hormonale (GLP-1) dont les effets peuvent avoir lieu localement au niveau de l’intestin lui-même mais également au niveau d’autres organes distants. Il est donc indispensable de recourir au modèle animal pour une approche intégrée.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires et le nombre d’expériences réalisées sur chaque animal, nous avons adopté la stratégie suivante : - Réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire à une analyse statistique robuste de ces expériences à l’aide de tests statistiques adéquats. En fonction de la distribution normale ou non des données, nous utiliserons des tests paramétriques ou non paramétriques sachant qu’il y a des variations individuelles des animaux, que ce soit dans les phases d’ischémie, de reperfusion ou bien lors de l’utilisation des chambres de Ussing. . Ne sachant pas dans quel sens iront nos résultats (exemple augmentation ou diminution des paramètres étudiés) nous seront dans l’obligation de réaliser des tests bilatéraux. - L’utilisation de la décapitation par guillotine, qui nous réduit considérablement la variabilité individuelle de tous les paramètres mesurés (Sanguins : cytokines ; Perméabilité etc) et nous permet ainsi de réduire le nombre d’animaux
Raffinement
Les animaux seront hébergés avec un enrichissement de leur milieu adapté (exemple : petit abris style tunnel, matériaux de type « Sizzle dri, pour s’isoler se cacher etc). Lors des traitements chroniques (2 semaines), ils bénéficieront d’un suivi de leur état général avec mesure de la masse corporelle toutes les 48h. Toutes les procédures expérimentales, les actes susceptibles d’entrainer une souffrance ou une douleur (exemple : injections IP) seront réalisés soit sous anesthésie générale. En cas de perte de poids des animaux supérieure à 20% en 7 jours, ou tout autre signe suggérant une souffrance de l’animal (posture, absence de toilettage, craintif, etc) l’animal concerné sera retiré du projet (euthanasie par dislocation cervicale sous anesthésie à l’isoflurane). Aucun animal ayant subi une ischémie avec ou sans reperfusion ne sera réveillé et seront tous euthanasiés encore endormis. Enfin, un nombre restreint d’expérimentateurs disposant d’une formation et d’une qualification adéquate à l’expérimentation animale interviendra dans ce projet.
Choix des espèces
La souris est utilisée car son métabolisme présente de nombreuses similarités avec celui de l’Homme, en particulier au niveau intestinal. Elle exprime les mêmes protéines. En particulier le GLP-1 suit le même comportement chez l’Homme et la Souris. De plus nous avons vérifié que ce GLP-1 était également sécrété lors des ischémies expérimentales réalisées chez l’Homme (ref). Ce modèle est largement documenté dans la bibliographie scientifique. Dans ce projet, nous travaillons sur des lignées de souris OGM présentant une délétion spécifique du gène codant pour le glucagon, Elles sont issues du fond génétique C57BL6/J. Ces souris n’ont pas un phénotype dommageable, elles se portent et se comportent bien et ont un état de santé général identique à des souris C57BL6/J non génétiquement modifiées. Les animaux seront utilisés au stade adulte à partir de 8 semaines afin de s’affranchir des effets de la puberté dans les résultats obtenus. De plus il est documenté que la fonction barrière de l’intestin évolue défavorablement avec l’âge il est donc parfaitement obligatoire de maintenir une homogénéité stricte sur ce paramètre.
Suivi fonctionnel et biologique de souris Apc pré-cachectiques et cachectiques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
208 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la moitié dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil et l'autre dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles portent une mutation qui provoque un cancer de l'intestin et une fonte musculaire, avec sang dans les selles et prolapsus, subissent des tests fonctionnels et des prélèvements de tissus, pour étudier l'activation de l'axe hormonal du stress lors de la cachexie cancéreuse. Le porteur classe le maintien de cette lignée en gravité sévère à cause de la souffrance liée à l'avancée de la maladie et prévoit une mise à mort dès l'apparition de ces signes. Il affirme qu'un système in vitro ne reproduit pas la complexité de ce processus et que seul le modèle murin le permet, les stratégies thérapeutiques restant à proposer.
Objectifs
Le déconditionnement musculaire désigne une perte de masse et de force musculaire qui peut être observé dans différentes situations pathologiques (cancer, myopathie, insuffisances cardiaque, rénale ou respiratoire). Dans le cas du cancer, ce déconditionnement musculaire est extrêmement marqué (on parle de cachexie associée au cancer) et constitue un facteur majeur contribuant à la réduction de l'état de santé et de la qualité de vie des patients. Connaitre les mécanismes responsables du déconditionnement musculaire associé au cancer et développer des stratégies thérapeutiques pour lutter contre ce déconditionnement constituent un des enjeux actuels majeurs de la recherche en cancérologie. Les travaux antérieurs conduits par notre équipe de recherche chez un modèle murin de cancer de l'intestin, ont mis en évidence une activation de l'axe corticotrope (axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien) associée à une augmentation de la concentration en glucocorticoïdes dans le compartiment sanguin, le muscle et le foie, ainsi qu'à la mise en place d'une réponse transcriptionnelle dépendante des glucocorticoïdes dans le muscle et le foie. Dans ce contexte, l'objectif de ce projet est de déterminer la nature des mécanismes, qui au niveau central, sont à l'origine de l'activation de l'axe corticotrope chez ces souris.
Bénéfices attendus
En déterminant les mécanismes potentiels à l'origine de l'activation de l'axe corticotrope, ce projet permettra de développer notre compréhension des mécanismes mis en jeu lors de la cachexie associée au cancer, et de proposer des stratégies d'intervention visant à limiter l'activation de l'axe corticotrope dans un modèle pré-clinique de cachexie associée au cancer.
Procédures
Les animaux subiront : 2 tests fonctionnels non invasifs et indolores d'environ 5 à 10 min chacun en fonction de la participation volontaire de l'animal, soit un prelèvement sous anesthésie gazeuse d'une durée de 5 min, soit 1 procédure invasive sous anesthésie générale et sans réveil d'une durée de 1h30; enfin les prélèvements tissulaires seront réalisés sous anesthésie chimique sans réveil.
Impact sur les animaux
Concernant les souris contrôles, aucune nuisance n'est attendue à l'exception du prélèvement sanguin sous anesthésie gazeuse. Concernant les souris spécifiques (s'agissant d'un génotype dommageable : suivi et entretien de la lignée), certaines nuisances peuvent apparaitre (sang dans les fèces, prolapsus). Compte tenu des risques de souffrance pouvant apparaitre en lien avec l'avancée de la maladie, le maintien et l'entretien de la lignée implose une classification de gravité sévère. Dans les cas où ces symptômes évocateurs d'une souffrance animale seraient atteints, les animaux seront immédiatement sortis du protocole et une mise à mort éthique sera effectuée sous anesthésie générale.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de procéder aux différentes analyses et prélèvements de tissus.
Remplacement
Le déconditionnement musculaire associé au cancer est un processus catabolique multifactoriel sollicitant de nombreux tissus (muscle, foie, tissu adipeux, tissus endocriniens, système immunitaire, système nerveux central). Un système expérimental in vitro ne permettrait pas de reproduire la complexité de ces régulations. Seul un modèle animal murin permet de reproduire la complexité des mécanismes biologiques mis en oeuvre.
Réduction
Nous avons calculé l'effectif par groupe sur la base du critère d'évaluation principal : surface de section transversale des fibres musculaires qui permet d'apprécier l'ampleur de la perte de masse musculaire Après avoir intégré différents paramètres statistiques, il ressort que 12 animaux/groupe seront nécessaires. Afin d'anticiper le cas rare où une interruption précoce de la procédure serait nécessaire pour certains animaux, nous prévoyons des lots de 14 animaux par groupe. Ces animaux supplémentaires ne seront utilisés qu’en cas de besoin afin d’obtenir au final les 12 animaux par groupe nécessaires à la significativité des résultats. Cette stratégie expérimentale permet le meilleur respect possible de la règle des 3R et nous permettra d’évaluer les différences significatives pour l'analyse des données.
Raffinement
Le bien-être animal est une préoccupation majeure lors de la réalisation de nos expérimentations. Dans ce projet, nous veillerons à ce que l'hébergement des animaux leur permettent d'avoir un enrichissement (paille, bois et coton) suffisant et stimulant pour réaliser leur nid. Les animaux seront hébergés à 3 individus par cage dans un local à température contrôlée avec un cycle lumière/obscurité de 12H00. Les souris auront libres accès à l'eau et à la nourriture. Afin de réduire le stress des animaux, les souris seront habituées aux expérimentateurs qui les manipuleront de façon bi-hebdomadaire (suivi de poids). Nous serons aussi particulièrement vigilants à l'apparition de tout signe évocateur d'une souffrance animale. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée afin de déceler l'apparition des signes généraux évocateurs de souffrance. Les animaux seront scorés sur 3 critères : le changement de poids corporel, l'apparence physique, et le comportement.
Choix des espèces
L'essentiel des études expérimentales consacrées à la cachexie associée au cancer a été réalisé en utilisant des modèles souris de cancer. En travaillant sur le modèle souris nous pourront donc comparer nos données à celles de la littérature scientifique. Par ailleurs notre expertise scientifique et technique sur le modèle souris, nous permettra de réaliser ce projet sans étape de mise au point préalable. Afin d'étudier la régulation de l'axe corticotrope lors de la cachexie associée au cancer, les souris seront analysées à un stade pré-cachectique (absence de perte de masse musculaire) à l’âge de 11 semaines et à un stade cachectique (présence d'une perte de masse musculaire) à l'âge de 15 semaines. Nos travaux antérieurs ont permis de valider ces 2 points d'analyse. Des souris de type sauvage issues des mêmes portées que les souris mutées seront utilisées comme animaux contrôles.
Etude de la distribution de canaux endo-lysosomaux dans le cerveau de souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
1 440 souris vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie profonde, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque souris reçoit un analgésique puis un anesthésique avant une perfusion de fixateur dans le cœur, qui permet de prélever le cerveau pour étudier un canal calcique impliqué dans les échanges entre neurones et astrocytes. Le porteur ne signale comme effet indésirable que le stress possible lié à la contention et aux injections. Il affirme qu'une étude sur système in vitro ne serait "pas pertinente" et que la modification génétique requise n'est disponible que chez la souris.
Objectifs
Les interactions neuro-gliales sont essentielles aux activités cérébrales, en particulier dans les régions telles que l’hypothalamus, fortement liées au flux sanguin et régulant des fonctions physiologiques vitales. Les astrocytes contactent à la fois les vaisseaux et les neurones, pour détecter et intégrer les changements sanguins et des activités neuronales. En réponse, les astrocytes génèrent des élévations de calcium qui modulent l'activité des neurones adjacents en sécrétant des modulateurs. Cependant l'origine des élévations locales de calcium restent obscures. Une source de calcium peu explorée est une nouvelle famille de canaux calciques (CC) qui, dans plusieurs systèmes, contrôlent les processus de sécrétion. Les astrocytes présentant des niveaux élevés de ce CC, nous émettons donc l'hypothèse que, dans les astrocytes, ce CC participe aux signaux calciques déclenchant les voies de régulations neurone-astrocytes. En particulier, ces régulations contrôlent l'activité des neurones hypothalamiques modulant ainsi la sécrétion de neurohormones par ces neurones. Ces dernières sont notamment essentielles à la régulation de fonctions vitales telles que la parturition et la lactation. Nos données récentes indiquent que la délétion du CC que nous étudions réduit drastiquement la sécrétion de neurohormones. Nous proposons donc d'étudier si ce CC astrocytaire participent au contrôle des astrocytes sur les fonctions hypothalamiques en se focalisant sur ces régulations neurohormonales.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de comprendre par quels mécanismes les hormones sont libérés par l'hypothalamus et l'hypophyse. Ce projet permettra d'apporter de nouvelles bases expérimentales et conceptuelles qui permettront d'identifier une nouvelle cible pour une stimulation pharmacologique de la libération de neurohormones pour une intervention thérapeutique dans des pathologies neurodéveloppementales où des déficits de neurohormones ont été incriminées.
Procédures
Une perfusion intracardiaque de paraformaldéhyde sera réalisée sur les animaux pour un prélèvement du cerveau afin de réaliser une étude d'immunomarquage sur le cerveau ainsi fixé. Pour cela, les animaux seront injectés avec un analgésique puis après 30 minutes, les animaux seront injectés avec un anesthésiant pour obtenir une anesthésie profonde avant la réalisation de la perfusion intracardiaque.
Impact sur les animaux
Les seuls effets indésirables potentiels sont lié au stress possible lors de la contention de l'anima l'injection de l'analgésique et de l'anesthésique.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés car nous prélevons le cerveau pour des études d'immunomarquages
Remplacement
Le but du projet est de comprendre le rôle du canal CC dans les interactions neurogliales et la sécrétion de l'ocytocine et de vasopressine qui régissent de nombreuses fonctions physiologiques. Dans ce contexte il est nécessaire d'utiliser un tissu nerveux intact afin de déceler les processus physiologiques impliqués. Effectuer cette étude sur un système in vitro aboutirait à une étude de processus non-physiologiques et ne serait donc pas pertinent
Réduction
Pour réduire autant que possible le nombre d'animaux nécessaires, nous avons calculé la taille de chaque échantillon nécessaire pour une analyse statistique.
Raffinement
Les animaux seront injectés par voie intrapéritonéale avec un analgésique puis un anesthésique pour une anesthésie profonde pour que l'animal ne manifeste plus de réflexes aux stimulations avant la réalisation d'une perfusion intracardiaque. Des points limites précoces ont été défini pour prendre en charge un mal être constaté de l'animal
Choix des espèces
La souris est un petit mammifère dont le système nerveux central présente de nombreuses analogies avec les mammifères supérieur (dont l'humain). La grande maitrise des méthodes d'élevages, des conditions de bien-être animal et la haute standardisation des lignées en fait un organisme de choix pour une étude physiologique des interactions neurogliales. De plus, la modification génétique indispensable à la réalisation de ce projet est seulement disponible chez la souris (délétion des CCs). Les animaux seront utilisés de p21 à p60, afin de pouvoir comparer nos résultats avec la tranche d'âge pour laquelle la plupart des expériences d'électrophysiologie et d'imagerie calcique sur des tranches d'hypothalamus sont conduites. A ce stade les tranches ex vivo présentent un meilleur taux de survie des neurones et permet une plus grande reproductibilité des résultats.
Etudes des causes du développement de symptômes de douleur dans un modèle de rats parkinsoniens – Approche par imagerie cérébrale
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
80 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie opérée puis tuée sans réveil. Chaque rat subit des neurochirurgies pour induire un modèle de maladie de Parkinson et, pour la moitié, la destruction d'une structure cérébrale, avant une séance d'imagerie où des stimulations douloureuses sont appliquées, les animaux étant tués à l'issue pour éviter qu'ils ne ressentent cette douleur au réveil. Le porteur indique une perte de poids modérée après la chirurgie et un comportement de grignotement des pattes avant, prévenu par des pansements. Il affirme qu'il n'existe "aucune alternative" à l'usage d'animaux vivants pour étudier la transmission des signaux dans le cerveau.
Objectifs
Les sensations de douleur sont des symptômes communs dans la maladie de Parkinson, négativement associées avec la qualité de vie des patients, et ayant un impact plus fort que les symptômes moteurs. Ces symptômes restent cependant peu pris en compte cliniquement et les raisons de leur développement sont peu étudiés et compris. Ce projet a ainsi pour but d’approfondir nos connaissances sur l’état fonctionnel des réseaux impliqués dans le traitement de la douleur dans des modèles animaux de la maladie de Parkinson à l’aide d’une technique d'imagerie par résonnance mgnatique.
Bénéfices attendus
La maladie de Parkinson se caractérise par de nombreux symptômes incluant des douleurs qui ont un fort impact sur la qualité de vie des patients. Nous cherchons à comprendre certains mécanismes dans le cerveau qui induisent le développement de ces douleurs chez le patient car ce n’est pas connu à l’heure actuelle. Comprendre les causes du développement de ces symptômes est une première étape essentielle pour pouvoir ensuite développer des stratégies thérapeutiques ciblées et efficaces.
Procédures
Les rats vont subir des neurochirurgies pour une durée d’une heure, anesthésie incluse, pour induire le modèle de rats parkinsoniens et pour supprimer l'activité d'une structure du cerveau qui serait à l'origine du développement des symptômes de douleur. Tous les animaux auront un examen pour enregistrer l'activité des neurones d’une durée de 2 heures.
Impact sur les animaux
Ce projet implique l’utilisation d’un modèle de rats parkinsoniens qui induit une perte de poids modérée lors de la première semaine post-chirurgicale. La moitié des animaux aura également une suppression de l'activité d'une structure du cerveau qui serait à l'origine du développement des symptômes de douleur dans la maladie de Parkinson. Ce type de lésion peut occasionnellement entrainer un comportement de grignottement des pattes avant durant les premières heures post-chirurgicales.
Devenir
Les animaux ayant suivi l'ensemble des expériences auxquels ils sont destinés seront tous mis à mort afin de prélever les cerveaux pour analyses histologiques.
Remplacement
Il n’existe aucune alternative expérimentale nous permettant d’éviter l’utilisation d’animaux vivants pour évaluer les transmissions de signaux naturels dans le cerveau tel que dans ce projet ou des stimulation électriques juste suffisante pour provoquer une réaction nerveuse sont appliquées au niveau de la patte arrière du rat.
Réduction
Plusieurs mesures sont appliquées pour permettre la réduction du nombre d'animaux utilisés dans ce projet. Des études préliminaires permettent la mise au point des expériences. Grâce à une approche statistique, le nombre d'animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe sans compromettre les objectifs du projet. Les animaux seront testés en deux lots successifs incluant la moitié des rats par groupe. Le nombre de rats nécessaire pour le deuxième lot pourra être réduit en accord avec les résultats exploitables obtenus avec le premier lot.
Raffinement
Une semaine d’acclimatation est prévue à l’arrivée des rats avant l’expérience. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience. Cela permettra une intervention immédiate et appropriée dès le moindre signe de souffrance. Le projet implique la mise en place d’un état pathologique chez le rongeur avec de la chirurgie lésionnelle de classe modéré effectuée sous anesthésie générale. Afin de prévenir toute douleur post-opératoire, une injection d’un anesthésique local sera effectuée sur le crâne des animaux avant incision ainsi qu’une injection d'un analgésique avant la procédure chirurgicale puis toutes les 24 heures si l’état de l’animal le requiert. Ce modèle implique une perte de poids modérée lors de la première semaine post-chirurgicale. Les animaux auront accès à une nourriture adaptée fournie par l’animalerie. Des injections sous-cutanée d’eau saline seront également réalisées pour favoriser l’hydratation et la récupération. La suppression de l'activité de la structure du cerveau qui serait à l'origine du développement des symptômes de douleur, peut occasionnellement entrainer un comportement de grignottement des pattes avant durant les trois premières heures post-chirurgicales. Pour prévenir cette éventualité, les pattes avant des rats seront protégées par des pansements, qui seront retirés le lendemain de la chirurgie. La procédure d’imagerie sera faite sous anesthésie générale. Durant ce test, des séries de stimulations douloureuses seront effectuées, c’est pourquoi, les animaux seront mis à mort à la fin de ce test afin d’éviter la conscience de la douleur induite par ces stimulations au réveil. Une échelle de cotation de douleur basées sur des signes indicatifs de gêne sera utilisée afin d'évaluer l'état général de chaque animal et de définir des points limites, permettant ainsi de prendre le plus rapidement possible des mesures nécessaires pour préserver le bien-être de l'animal.
Choix des espèces
Le rat est l’espèce adéquate car il existe un degré de similitude important avec le cerveau humain, notamment au niveau des réseaux de neurones sur lesquels portent notre étude, tant du point de vue anatomique que physiologique. Des rats jeunes adultes seront utilisés pour ce projet (à partir de 8 semaines en début d’expérience) afin de travailler sur des systèmes cérébraux matures et stables qui resteront stables tout au long de la procédure.
Implication de l’hypothalamus dans l’altération de l’homéostasie glucidique induite par l’action centrale des triglycérides inter-estérifiés.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
820 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère pour 720 d'entre elles. Elles reçoivent des injections d'huile de palme inter-estérifiée dans la carotide, des tests de tolérance au glucose et à l'insuline avec prélèvements sanguins répétés, et pour certaines des chirurgies dans le cerveau suivies de perfusions et d'un isolement de un à deux mois. Le porteur indique que ces chirurgies peuvent entraîner perte de poids, prostration ou agressivité, et vise à préciser les conditions de sécurité alimentaire de ces graisses utilisées par l'industrie agroalimentaire. Il décrit des études sur cultures cellulaires menées en parallèle mais juge l'usage de la souris "encore nécessaire" faute de pouvoir reproduire in vitro les échanges entre organes.
Objectifs
La consommation d’aliments ultra-transformés riches en huile végétale hydrogénée est néfaste pour la santé des individus puisqu’elle contribue à l’obésité et au diabète de type 2 (DT2). Afin de remplacer les huiles végétales hydrogénées, l’industrie agroalimentaire commence à utiliser l’inter-estérification des graisses végétales. Des études récentes suggèrent que la consommation de ces graisses inter-estérifiés peuvent altérer l’homéostasie glucidique et donc favoriser le DT2. Il est donc important de comprendre les effets moléculaires de ces graisses inter-estérifiées sur la régulation de l'homéostasie glucidique. Des résultats préliminaires suggèrent que la consommation d’un régime contenant des graisses inter-estérifiées conduit à l’accumulation dans le foie, le tissu adipeux et l’hypothalamus de dérivés lipidiques comme les céramides. les céramides sont connus pour induire une résistance à l’insuline qui favorise l'installation d'un DT2. L'objectif de ce projet sera de déterminer l’implication du métabolisme des céramides dans la dérégulation de l’homéostasie glucidique induite par la consommation de graisses inter-estérifiées. Pour cela, la synthèse des céramides sera inhibée chez des souris (pharmacologiquement ou génétiquement) qui seront soumises à un régime contenant de l’huile de palme inter-estérifiées. Les taux de céramides seront analysés par une approche lipidomique. La régulation de l'homéostasie glucidique sera étudiée chez ces souris soumises à un régime contenant de l’huile de palme inter-estérifiées. Une analyse transcriptomique des tissus sera réalisée afin d’identifier les gènes dérégulés par les graisses inter-estérifiées. Cette analyses permettra également de caractériser les cibles moléculaires des céramides dans la dérégulation de l'homéostasie glucidique induite par les graisses inter-estérifiées. Ce projet devrait permettre de mieux comprendre l'implication des graisses inter-estérifiées dans le développement du DT2 et ainsi d’affiner les conditions de sécurité alimentaire nécessaire à leur utilisation par l’industrie agro-alimentaire.
Bénéfices attendus
Ce projet identifiera l’implication des graisses inter-estérifiées dans le développement du diabète de type 2 et permettra d’affiner les conditions de sécurité alimentaire nécessaire à leur utilisation par l’industrie agro-alimentaire.
Procédures
Les souris de la procédure 1 recevront des injections aigues intra-carotidienne d’huile de palme inter-estérifié pendant 30sec. Les souris de la procédure 2 recevront des injections aigues intra-carotidienne d’huile de palme inter-estérifié pendant 30sec. La moitié des souris de la procédure 2 subiront un test de tolérance au glucose (IP-GTT) (120min/souris) à la fin de l’expérimentation, avant le sacrifice. Aux temps 0, 15, 30, 60, 90 et 120 min : prélèvements à la queue d'une goutte de sang afin de mesurer la glycémie et aux temps 0, 15, 30 et 120 min : prélèvements à la queue de sang afin de mesurer l'insulinémie. L’autre moitié des souris de la procédure 2 subiront un test de tolérance à l’insuline (ITT) (120min/souris) à la fin de l’expérimentation, avant le sacrifice. Aux temps 0, 15, 30, 60, 90 et 120 min : prélèvements à la queue d'une goutte de sang afin de mesurer la glycémie. Les souris de la procédure 3 subiront des chirurgies d'injections stéréotaxiques intracérébroventriculaires (30min/souris) afin d'injecter des adénovirus dans le troisième ventricule. Pour les souris de la procédure 3, il s'en suivra, 28 jours plus tard d'une deuxième chirurgie pour poser un système de pompe et de canule pour réaliser des perfusions intracérébroventriculaires pendant 28 jours d'émulsions contenant les lipides inter-estérifiés d’intérêt. Les souris de la procédure 4 subiront des chirurgies d'injections stéréotaxiques intracérébroventriculaires (30min/souris) afin d'injecter des adénovirus dans le troisième ventricule. Pour les procédures 3 et 4, à la fin des expérimentations nous réalisons un test de tolérance à l’insuline (ITT) (120min/souris). Aux temps 0, 15, 30, 60, 90 et 120 min : prélèvements à la queue d'une goutte de sang afin de mesurer la glycémie. 3 jours plus tard nous réalisons un test de tolérance au glucose (IP-GTT) (120min/souris) à la fin de l’expérimentation, avant le sacrifice. Aux temps 0, 15, 30, 60, 90 et 120 min : prélèvements à la queue d'une goutte de sang afin de mesurer la glycémie et aux temps 0, 15, 30 et 120 min : prélèvements à la queue de sang afin de mesurer l'insulinémie. S'ajoutent aux nuisances expérimentales, l'isolement des souris des procédures 3 (28 jours pour 360 souris) et 4 (2 mois pour 360 souris).
Impact sur les animaux
Les procédures font intervenir des injections stéréotaxiques dans le troisième ventricule et des perfusions dans le ventricule latéral, chirurgies qui peuvent entrainer des effets indésirables sur les animaux tels qu'une perte de poids, des troubles alimentaires, un manque de toilettage, de la prostration, une agressivité lors de la manipulation, des douleurs ou gêne au niveau du crane.
Devenir
A l'issue de la procédure 1, les souris seront mises à mort afin d'évaluer l'incorporation des triglycérides inter-estérifiés depuis la périphérie vers le cerveau. A l'issue des procédures 2, 3 et 4, les souris seront mises à mort afin de collecter les tissus pour réaliser des RTqPCR, des immunohistochomies et des analyses lipidomiques.
Remplacement
Le contrôle du métabolisme fait intervenir de nombreux organes (foie, intestin, cerveau, muscles, tissus adipeux) qui communiquent entre eux en permanence pour informer l'organisme des besoins énergétiques et contrôles les flux d'énergie en fonction des besoins. Il est très difficile de mimer in vitro toutes ces interactions et c'est pour cela que l'utilisation des modèles animaux vivants est encore nécessaire. De plus, nous allons effectuer en parallèle de nos études in vivo des études in vitro sur des cultures cellulaires pour disséquer les effets de l'huile de palme interérifiée et identifier les mécanismes moléculaires les relayant.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux, nous avons commencé des études in vitro sur des cultures cellulaires pour tester les concentrations d'huile de palme que nous pourrons utiliser in vivo. Nous avons aussi réalisé une étude in vivo pour tester les concentrations d'huile de palme inter-estérifiée à utiliser pendant les expériences. Ainsi nous utiliserons le nombre minimum de souris nécessaire à générer des données interprétables. Les échantillons prélevés sur chaque animal permettront de générer un grand nombre d'informations sur des marqueurs moléculaires (métabolites, transcripts, protéines inflammatoires). De plus, grâce aux données de la littérature et aux nombreux résultats obtenus lors de projets précédents (nous travaillons depuis plus de 20 ans sur des modèles murins d'obésité), nous avons estimé la taille des échantillons permettant une analyse statistique efficace. En effet les groupes de souris sont générallement très homogènes en terme de tolérance au glucose, données physiologiques ou biochimiques.
Raffinement
Les souris des procédures 3 (360 souris, pendant 28j) et 4 (360 souris, pendant 2 mois) seront exceptionnellement maintenus en cage individuelle afin de contrôler individuellement la prise alimentaire et le poids corporel de chaque individu. Ils seront maintenus dans des milieux enrichis (nid, batons de bois, cotons) ce qui améliorera leur bien-être. Pour les procédures chirurgicales que nous utiliserons, nous avons instauré une médication et un suivi post-opératoire approprié permettant de réduire les possibles douleurs à leur minimum. Nous avons également mis en place une grille d'évaluation permettant au chercheur de suivre les signes de souffrance des animaux.
Choix des espèces
Les modèles précliniques de souris obèses et insulino-résistantes partagent avec l'humain de fortes homologies dans les régulations physiologiques, en particulier le contôle de l'homéostasie glucidique et de l'adiposité. Le laboratoire travaille depuis de nombreuses années sur la souris en régime gras et a accumulé un grand nombre d'informations physiologiques et moléculaires qui seront utilisées pour interpréter les résultats obtenus. Les souris utilisées seront âgées de 8 semaines au début des procédures, âge à partir duquel toutes les structures cérébrales sont matures.
Étude de la machinerie de synthèse des protéines chez la souris
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
128 souris vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie profonde, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque souris reçoit un antalgique puis une anesthésie profonde, avant l'ouverture de la cage thoracique et une perfusion cardiaque qui fixe les tissus, pour étudier la composition des ribosomes dans différents organes. Le porteur indique n'attendre qu'un léger stress et une légère douleur liés aux injections. Il justifie le recours à l'animal par la nécessité de travailler sur "organisme entier", les protéines identifiées devant ensuite être étudiées in vitro.
Objectifs
Ce projet est un projet de recherche fondamentale. Il vise à élucider les mécanismes complexes qui régissent l’expression des gènes, un processus essentiel dans le fonctionnement cellulaire. Les ribosomes, les machines moléculaires qui synthétisent les protéines, jouent un rôle central dans ce processus. Historiquement, les ribosomes ont été décrits comme étant identiques dans toutes les cellules. Cependant, des études récentes ont mis en évidence une grande hétérogénéité dans la composition des ribosomes et ont émis l’hypothèse de l’existence d’une multitude de ribosomes différents, décrits comme ribosomes “spécialisés”, chacun avec une activité spécifique. Afin d’étudier ces ribosomes “spécialisés” dans différents organes (le foie, le cerveau ou la rate par exemple) et comprendre leur fonctionnement, nous avons mis en place une approche innovante permettant de déterminer la nature des différentes protéines qui les composent. Nos premiers résultats obtenus dans des cellules en culture, nous ont permis de mettre en évidence près de 600 protéines qui se lient directement aux ribosomes. Cela ouvre de nouveaux champs de recherche pour la compréhension des mécanismes fondamentaux du fonctionnement cellulaire qui sont contrôlés par les ribosomes. Actuellement, nous souhaitons étendre notre étude en caractérisant la composition de ribosomes spécialisés dans différents organes chez la souris. Pour cela, nous avons généré une souris qui nous permet de marquer tous les ribosomes de chaque cellule et de les purifier. Cette lignée de souris est viable et n’a pas de phénotype dommageable. Elle n’a pas non plus d’immunodéficience connu ou de phénotype immunologique. Pour effectuer nos analyses, nous devons fixer les tissus (aussi appelés organes) avec un produit chimique chimique afin de stabiliser les interactions entre les ribosomes et les protéines qui interagissent avec eux. . Nos résultats indiquent que si la fixation des organes récupérés a lieu après la mise à mort des souris alors la fixation n’est pas homogène et cela introduit des biais expérimentaux dans l’analyse de la composition des ribosomes. Pour réaliser des analyses fiables, les organes seront donc fixés sur les animaux sous anesthésie profonde sans réveil. Les tissus seront ainsi figés avant la mise à mort des animaux. Cette procédure garantit que les interactions entre les ribosomes et d'autres protéines restent inchangées, reflétant ainsi la situation réelle dans les cellules vivantes.
Bénéfices attendus
La réalisation de notre projet aura des apports importants pour la connaissance fondamentale sur les rôles spécifiques des ribosomes spécialisés présents dans chaque organe et permettra d’ouvrir une nouvelle voie de recherche afin de caractériser le rôle fonctionnel de l’interaction entre certains détecteurs de virus et les ribosomes, dans le cadre de la réponse immunitaire innée. En outre, les protéines identifiées comme associées aux ribosomes spécialisés dans les différents organes seront une ressource d’intérêt pour des chercheurs dans différents domaines de la biologie.
Procédures
Tous les animaux de notre protocole seront soumis aux interventions suivantes : changement d'animalerie 7 jours avant le début des expériences, injection sous-cutanée pour la livraison d’antalgiques : 1 fois par animal 30 minutes avant l'injection d'anesthésiques, durée de l’injection : 10 secondes puis 1 injection dans l'abdomen pour anesthésie profonde : 1 fois par animal, durée de l'injection : 10 secondes ; puis la cage thoracique sera ouverte par chirugie (temps de l'intervention 5 minutes) et une perfusion cardiaque sous anesthésie profonde (durée de la mise en place de la perfusion : 5 secondes, temps de perfusion : 12 minutes.
Impact sur les animaux
Cela entrainera donc un léger stress dû au changement d'animalerie, un léger stress dû à la contention puis une légère douleur due aux injections de l'antalgique et de l'anesthésique.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort puis les organes d'intérêt seront prélevés afin d’analyser les ribosomes spécialisés et de les comparer entre les différents organes.
Remplacement
L’objectif de ce projet étant de connaitre les partenaires des ribosome in vivo et de comparer la liste de ces partenaires entre plusieurs organes il est nécessaire de travailler sur organisme entier. Les protéines identifiées dans notre étude pourront ensuite être validées et leur fonction cellulaire étudiée dans des modèles cellulaires in vitro.
Réduction
Le nombre de souris par lot a été déterminé sur la base de données préliminaires. Le nombre d'animaux dans chaque lot a été réduit au maximum et sera composé de 8 souris contrôles non transgéniques et de 8 souris transgéniques.
Raffinement
Les souris utilisées dans notre projet n’ont pas de phénotype dommageable. Les animaux seront maintenus en groupes sociaux au sein de chaque cagée (en moyenne 5 animaux par cagée). Afin de réduire la souffrance, le stress et la douleur de l’animal, la perfusion des souris sera réalisée sous anesthésie profonde. Aussi, des antalgiques seront administrés aux souris avant l’anesthésie afin d’éviter d’éventuelles douleurs liées à la procédure de perfusion. Pendant toute la durée de l’anesthésie profonde, les animaux seront placés sur un tapis chauffant, afin de limiter les risques d'hypothermie, et un gel oculaire sera appliqué sur les yeux afin d'éviter les risques de sècheresse oculaire. En cas de problème non anticipé lors de la perfusion intracardiaque, la souris sera immédiatement mise à mort par dislocatoion cervicale.
Choix des espèces
La souris est un bon modèle pour étudier la composition des ribosomes notamment dans les cellules du système immunitaire présentes dans les organes du système immunitaire car il permet d’avoir accès à suffisamment de matériel biologique pour pouvoir réaliser des analyses biologiques. Par ailleurs, le choix du modèle souris est imposé par la nécessité de pouvoir réaliser, à terme des expériences d’infection par divers virus dans des animaux génétiquement modifiés afin de valider nos premiers résultats obtenus sur des lignées cellulaires. Nous utiliserons dans notre projet des animaux adultes afin d’étudier les fonctions des ribosomes dans des conditions physiologiques chez l’adulte.
Dispositif de formation initiale et continue en chirurgie sur le modèle porcin
- Enseignement supérieur
140 cochons vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque animal sert de support à des chirurgies de l'abdomen, laparotomies et cœlioscopies, ou à des greffes de foie et de rein, non pour produire des connaissances mais pour former des étudiants et des chirurgiens en exercice, deux à quatre par animal. Le porteur indique que certaines procédures bilatérales, comme l'ablation des deux reins, ne permettent pas la survie de l'animal. Il décrit la simulation sur "gros animal" comme "devenue indispensable" à la formation, tout en revendiquant chercher à réduire l'usage d'animaux.
Objectifs
L'objectif de ce projet vise à former et perfectionner des étudiants de 3ème cycle, des chirurgiens et des médecins à diverses procédures et gestes chirurgicaux chez le modèle porcin. L’enseignement des disciplines chirurgicales et interventionnelles auprès des étudiants en Médecine de 3ème cycle est piloté par l'UFR de Médecine et repose sur l’enseignement théorique et l’enseignement par la simulation réalisés à la Faculté de Médecine et la mise en pratique au CHU dans les services. L’enseignement par la simulation repose sur l’école de chirurgie qui dispose de différents modules complémentaires d'enseignement : simulation en drylab (simulateurs, simulateurs numériques), microchirurgie sur petit animal réalisé à l'animalerie petits animaux de la faculté de médecine, chirurgie sur sujets anatomiques réalisé au laboratoire d'anatomie de la faculté de médecine, chirurgie sur sujets revitalisés réalisé au laboratoire d'anatomie de la faculté de médecine, et chirurgie expérimentale sur gros animal (porc) qui est réalisée sur la plateforme de chirurgie d’un organisme de recherche publique et qui fait l'objet du présent dépôt au comité d'éthique.
Bénéfices attendus
Avec l’application de la loi européenne sur le temps de travail des étudiants en troisième cycle des études de médecine, leur exposition à la clinique et à la pratique a très nettement diminué. Par ailleurs, la réforme du troisième cycle des études de Médecine a diminué la durée de leur formation. L’ensemble des équipes pédagogiques a donc jugé prioritaire la mise en place de programmes de simulation pour s’adapter à cette évolution et permettre à ces futurs médecins/chirurgiens d’avoir quand même une formation adéquate. En parallèle de cela, le dogme érigé par l’Haute Autorité de Santé (HAS) « Jamais la première fois sur le patient » impose désormais une formation et une pratique en amont de l’application à l’Homme. Pour toutes ces raisons, la simulation chirurgicale sur gros animal est devenue indispensable. La formation mise en place permettra aux étudiants en chirurgie viscérale (urologie, chirurgie digestive, gynécologie, viscérale pédiatrique) en fin de cursus de perfectionner leur technique et leurs connaissances après avoir pu faire de la simulation en dry lab et avoir passé les étapes précédentes du curriculum. L’objectif est donc de permettre à ces futurs praticiens d’avoir réalisé les interventions correspondant à leurs disciplines sur un gros animal avant de le faire chez l’Homme. En ce qui concerne la formation continue, l’objectif est de pouvoir offrir un perfectionnement à des médecins chirurgiens installés sur de nouvelles techniques ou des techniques hyper spécialisées comme la transplantation ou la chirurgie endoscopique.
Procédures
Dans le cadre de la formation initiale, les animaux seront soumis aux gestes chirurgicaux suivant : (1) laparotomie sur le système urinaire avec apprentissage des gestes techniques de type dissection, néphrectomie ou anastomose ; (2) laparotomie sur le système digestif avec apprentissage des gestes techniques de type dissection, préhension des vaisseaux, cholécystectomie ; (3) laparotomie sur le système gynécologique avec apprentissage des gestes techniques de type dissection, ovariectomie, hystérectomie, anastomose digestive ; (4) coelioscopie sur le système urinaire avec apprentissage des gestes techniques de type préhension des tissus sans traction, dissection, néphrectomie et réimplantation urétéro-vésicale ; (5)coelioscopie sur le système digestif avec apprentissage des gestes techniques de type ligature, cholécystectomie, cathétérisme, gastrolyse ; (6) coelioscopie sur le système gynécologique avec apprentissage des gestes techniques de type dissection, hystérectomie. La formation continue sera de 2 types : (1) formation à la transplantation de foie et/ou de rein. Dans ce cadre, les gestes d’un greffe de ces 2 organes seront réalisés chez l’animal : préparation à la greffe, prélèvement et conservation d’organes, transplantation ; (2) formation à la technique de dissection sous muqueuse endoscopique. Pour cela, l’animal est soumis à une endoscopie pour réaliser une exérèse de tissu situé au niveau de l’oesophage et l’estomac.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, les animaux étant anesthésiés et sous analgésie durant toute la durée de l'intervention, puis euthanasiés sans réveil possible en fin de procédure, aucune douleur ou inconfort ne sera subi(e) par les animaux utilisés pour ces formations. Durant cette intervention, les animaux peuvent être soumis à une laparotomie ou une coelioscopie au niveau du système digestif, urinaire ou gynécologique. Des sessions spécifiques peuvent dédiés à une dissection de muqueuse sous endoscopie ou à des formations à des greffes hépatiques, rénales ou cardiaques. Les points listés ci-dessous pourraient être rencontrés lors de la procédure chirurgicale et conduiront à l'euthanasie de l'animal avant la fin de la session : - hémorragie abondante ne pouvant pas être contrôlée par le chirurgien responsable, - rythme cardiaque excessif pendant plusieurs minutes (>200 battements/min), et ne pouvant pas être stabilisé par une modulation de l'anesthésie ou de l'analgésie - perte des signaux de monitoring, - incident technique ou humaine permettant pas de poursuivre la procédure chirurgicale.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'issu de chaque journée de formation sans réveil au préalable. En effet, pour optimiser l’utilisation des animaux, les procédures sont pour certaines bilatérales et ne permettent pas la survie et donc le réveil, comme par exemple la néphrectomie bilatérale, la cystectomie, etc. Par ailleurs, pour diminuer le nombre d’animaux utilisés, les sessions sont poussées jusqu’à la gestion de complications peropératoires avec des plaies vasculaires graves à réparer. Enfin, les interventions réalisées sont à risque de complications postopératoires qui ne pourraient être gérées et de douleur.
Remplacement
Cette formation en chirurgie expérimentale sera faite sur modèle porcin car cette espèce, très proche de l’Homme en termes d’anatomie et de physiologie digestive, est la plus adaptée pour l’apprentissage des gestes chirurgicaux devant être exécutés chez l’Homme. Il est important de savoir que l’Ecole de Chirurgie met tout en place pour remplacer et diminuer l’utilisation d’animaux pour la simulation. Elles ont mis en place un parcours de formation progressif permettant de réserver le matériel animal pour les étudiants en fin de cursus dans un but de perfectionnement et non d’apprentissage de base. Tout au long de leur cursus, les étudiants de troisième cycle ont des formations avec de la simulation procédurale. Elles reposent au début sur du dry lab avec de la manipulation et de la technique laparoscopique sur des pelvitrainer, puis sur des simulateurs numériques pour reproduire dans les limites de la technologie actuelle des exercices et des interventions chirurgicales pas à pas. En parallèle, les étudiants/internes ont de sessions de dissection sur des sujets cadavériques ou des pièces anatomiques. Enfin, lors de leur dernière année de cursus, la formation propose un perfectionnement sur 2 types de modèles : les sujets cadavériques revitalisés et les modèles porcins. L’objectif de la formation est donc de se rapprocher progressivement pendant le cursus de déroulé d’interventions les plus proches possibles de la réalité, tout en épargnant au maximum l’utilisation de sujets anatomiques et d’animaux. En fin de cursus ou pour la formation continue, il n’y a pour l’instant pas d’autre modèle aussi fidèle à disposition que ces 2 modèles pour permettre un perfectionnement chirurgical adapté à la pratique sur l’Homme.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour cette formation a été réduit au minimum satisfaisant pour garantir un confort d’intervention tout autant pour les personnes chargées de veiller à la préparation, anesthésie et analgésie des animaux, que pour les étudiants et médecins devant se former (de 2 à 4 personnes formées par animal opéré). Toute addition de séances ou d’animaux supplémentaires fera l’objet d’un avenant à la présente saisine. Les animaux destinés à ces formations seront préférentiellement des porcs destinés à la réforme.
Raffinement
Les animaux utilisés lors de ces formations de chirurgie proviennent de nos élevages sur site. Les conditions d’hébergement, d’abreuvement et d’alimentation permettent de couvrir les besoins des animaux en conditions d'élevage porcin (conventionnel et mini-porc). Les animaux, qui font l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel habilité, sont hébergés en groupe avec des densités et des tailles de compartiment conforme à l’arrêté du 1er février 2013 fixant les conditions d’aménagement des établissements utilisateurs, éleveurs ou fournisseurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques. La formation réalisée reposera sur l'expertise de chirurgiens spécialisés en chirurgie viscérale et digestive, en urologie, en gynécologie et en chirurgie viscérale pédiatrique, et de médecins interventionnels experts (gastroentérologues) en collaboration avec des personnels scientifiques et techniques formés à l’expérimentation animale et à la chirurgie sur modèle porcin. L'anesthésie et l’analgésie durant les interventions ont été conçues pour supprimer la douleur induite par une chirurgie et la manipulation des viscères.
Choix des espèces
Le porc est l'espèce modèle la plus utilisée en chirurgie expérimentale à visée humaine. L'anatomie générale du porc ainsi que la taille et la conformation des différents organes internes sont très proches de celles de l'Homme. Le porc représente donc un modèle de prédilection pour l'apprentissage de gestes chirurgicaux qui sont réalisés sur des patients humains dans le cadre d'interventions classiques en chirurgie. Les animaux sélectionnés seront des porcs conventionnels juvéniles de 30 à 40 kg car ce poids permet de disposer d'animaux avec des organes internes dont la taille se rapproche le plus de celle observée chez l'Homme. Des miniporcs de race Yucantan pourront aussi être utilisés pour ces mêmes raisons. Le choix se fera en fonction des disponibilités car les animaux choisis seront préférentiellement des animaux destinés à la réforme.
Exploration du métabolisme du fer en physiologie et dans les maladies neurodégénératives et inflammatoires_1
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système nerveux
368 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 48 d'entre elles étant anesthésiées puis tuées sans réveil. Modèle d'une maladie neurodégénérative pédiatrique, la maladie de Sanfilippo, 160 d'entre elles reçoivent une injection de fer et l'ensemble subit des prélèvements sanguins avant une euthanasie terminale pour nécropsie. Le porteur indique remplacer quand c'est possible l'animal par des cultures cellulaires, qui restent issues des souris, et affirme que la complexité physiologique du projet ne peut être reproduite in vitro. Il justifie l'espèce par la disponibilité d'une souche mutée et d'outils développés de longue date.
Objectifs
Les héparanes sulfate (HS) sont des sucres complexes. Des mutations ou des défauts dans cette machinerie de recyclage des HS provoquent généralement une accumulation progressive de fragments de sucres partiellement dégradés dans un compartiment cellulaire spécifique; le lysosome. Cela conduit à une pathologie métabolique grave nommée mucopolysaccharidose de type III. Cette maladie neurodégénérative pédiatrique est caractérisée par l’accumulation de sucres défectueux essentiellement dans le cerveau. Les conséquences cliniques de celle-ci sont la perte des facultés d’élocution, de compréhension et de motricité des jeunes enfants atteints ainsi que des décès prématurés. A l’heure actuelle, établir un diagnostic précoce de la pathologie est complexe et aucun traitement ne permet de ralentir la détérioration mentale. Des essais de thérapie génique sont en cours d'étude (notre équipe et collaborateurs). Un premier essai à base de vecteurs a été réalisé chez 4 patients, le suivi de 5 ans montre des résultats encourageants. La poursuite de l’amélioration de cette approche prometteuse continue et des essais précliniques avec le vecteur sont en cours dans notre équipe. Ainsi, d’autres alternatives thérapeutiques restent à être recherchées pour les patients qui seront exclus de cette approche et pour les patients chez qui la thérapie génique aurait échoué. Parmi elles, l’exploration de l’accumulation du fer observée dans le cerveau de patients et dans notre modèle de souris. Les dépôts de fer s’accumulent progressivement avec l’âge aussi bien chez les patients que dans le modèle de souris. Le fer est extrêmement toxique et est capable de produire du stress oxydant, de l’inflammation, voire une mort cellulaire dépendante du fer ou ferroptose. De ce fait, nous souhaitons explorer la ferroptose dans la maladie, en vue de diagnostic et/ou traitement associant la thérapie génique en cours. Les objectifs de ce projet sont de mettre en évidence de la ferroptose dans cette maladie et identifier les populations cellulaires touchées dans le contexte de la maladie de Sanfilippo.
Bénéfices attendus
Ce travail va nous permettre de mieux comprendre la physiopathologie de la maladie de Sanfilippo . A travers l'étude approfondie des cultures cellulaires issues des animaux, nous allons pouvoir decrypter les mécanismes de la ferropotose associés. La modélisation de la surcharge en fer va aussi nous permettre d'étudier avec précision aussi bien sur l’inflammation que le stress oxydant. l'étape suivante sera la perspective de se projeter vers une solution thérapeutique majeure à cette pathologie pédiatrique grave qui n’est actuellement toujours pas soignée.
Procédures
80 animaux vont subir un prélevement sanguin à la veine caudale. Pour les 80 souris cela se fera en quelques secondes avec une couverture analgésique et un anesthésique approprié. Toutes les 368 souris (males et femelles) suivront une anesthésie et analgésie terminale en vue d'une euthanalise réglementaire necessaire à la bonne réalisation des expériences de nécropsie associées (immunologie et culture). 160 souris vont avoir une injection non douloureuse de fer en solution ou de serum physiologique en intrapéritonéale en une seule fois avec un volume réglementaire. c'est un geste qui sera réalisé avec un minimum de contention par des personnes habitués et qui dure moins de 10 secondes.
Impact sur les animaux
160 souris de ce projet recoivent une injection unique en intrapéritonéale d'une solution tamponnée contenant du fer. L'observation de l'animal en continu dans l'heure qui suit permet de déceller toute anomalie synonyme de douleurs (prostration, changement dans l'aspect de l'animal). Le personnel de la zootechnie qui les observent quotidiennement peut détecter d’éventuelles blessures, un comportement anormal ou un amaigrissement. Il n'est pas attendu d'effets particulier car nous avons une euthanasie de l'animal qui se déroule 7 jours après l'injection de fer.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés à l'issue de chaque procédure expérimentale
Remplacement
Quand cela est possible, le modèle animal est remplacé par des cultures cellulaires mais qui reste issues de l’animal. Nous avons une étape « in vitro » indispensable à la compréhension et au décryptage des interactions cellulaires et des voies de signalisation de la ferroptose dans notre modèle Afin de valider ces interactions cellulaires au sein du cerveau, actuellement seul le modèle in vivo peut modéliser les interactions entre plusieurs cellules du cerveau pour une démarche thérapeutique. Nous sommes également vigilantes sur les avancées des modèles organoïdes afin de mettre en perspective le remplacement de notre modèle animal. Pour l’instant, la complexité physiologique et les réponses systémiques de ce projet ne peuvent pas être reproduites in vitro.
Réduction
Un nombre restreint de souris est utilisé dans chaque groupe (n=10) afin de perfectionner la procédure et de maximiser les chances de réussite et de réduire le nombre de pertes potentiels. Notre étude utilise des méthodes expérimentales validées, publiées et utilisées extensivement par les laboratoires de recherche. Les analyses statistiques seront effectuées à l'aide d'un logiciel de statistique performant. des tests statistiques adaptés seront utilisés. Les résultats avec p
Raffinement
Afin de réduire au maximum les douleurs et l’inconfort des animaux, cette étude sera conduite par un expérimentateur formé à l’expérimentation animale et avec le diplôme de chirurgie. Pour les injections IP, elles seront réalisées par un personnel compétent et habitué. De toute façon, nos procédures nécessitent une manipulation fréquente des animaux qui permettra à l’expérimentateur d’observer et d’évaluer l’état de santé de l’animal ainsi que son évolution dans le temps. En particulier, nous observerons : Les altérations physiques : • Les variations du poids de l’animal (et variations de l’ingestion de nourriture et d’eau), flan creusé/dos vouté, yeux enfoncés/vitreux • Les signes cliniques observables (fréquence respiratoire et cardiaque) •Les changements du comportement •Les réponses comportementales aux stimuli externes Tout écart de la normalité sera répertorié et des solutions seront considérées pour pallier à cette situation. L’ensemble de ces 4 critères sera utilisé pour déterminer l’état de santé de l’animale. Dans le cas où une souris montrerait un état de santé détérioré qui ne pourra être amélioré par les traitements (antidouleur, antibiotiques, administrations de solutions glucosées, etc…), la souris sera euthanasiée. En tous cas, une perte de poids supérieure à 20 % dans l’espace d’une semaine est considérée en soi comme un point limite et engendra l’euthanasie de l’animal. Ces cas sont très rares, dans le cadre de nos expériences mais le nombre d’animaux utilisés prend en considération ces éventuelles pertes pour les tests statistiques. Nous réaliserons les expériences anatomiques, cellulaires et moléculaires sur les mêmes animaux utilisés. La technique de préhension de l’animal sera réalisée sans lui tenir la queue suivant les recommandations du service du bien-être animal.
Choix des espèces
Le métabolisme du fer a été très étudié chez la souris qui s'est révélé être un modèle pertinent. Les hypothèses scientifiques sur lesquelles reposent le projet ont été élaborée sur la base de travaux déjà publiés chez la souris. Cette souche mutée pour l’enzyme alpha-N acetylglucosaminidase (Naglu) est adaptée pour examiner la pathophysiologie de la maladie de Sanfilippo B et développer des thérapies pour les maladies lysosomales. Notre projet de recherche est basé sur l’utilisation de modèles animaux génétiquement modifiés qui nécessitent d’utiliser des animaux contrôles sauvages. Aucune autre espèce n’est disponible avec autant d’outils précieux (Ac, protéines recombinantes) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l’utilisation des souris comme modèles dans ce type de projet : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. Les stades de développements sont adaptés aux caractéristiques physiopathologiques de la maladie que nous voulons étudier. Les animaux seront utilisés à 2 et 5 mois. Ce sont des ages assez précoce qui vont nous permettre de pourvoir étudier le développement de la pathologie + ou- en présence de fer exogène. A 2 mois ces animaux ont les 1er influx de fer et à 5 mois on peut voir les consequences de cette accumulation les fonctions du cerveau et des differents types cellulaires qui y coexistent.
Evaluation sur modèle ovin d’un dispositif permettant la réalisation de pose de prothèses artérielles sans arrêt circulatoire et sans sutures
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
16 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, quatre d'entre elles étant opérées puis tuées sans réveil. Elles subissent une ou plusieurs chirurgies avec incision d'environ douze centimètres au niveau de la carotide ou de l'artère iliaque, et jusqu'à cinq anesthésies générales, pour valider un instrument censé poser des prothèses artérielles sans arrêt circulatoire ni suture. Le porteur indique que la taille des artères de la brebis est proche de celle de l'humain, ce qui justifie selon lui de tester le dispositif sur cette espèce. Les artères et la prothèse sont prélevées après la mise à mort, présentée comme "indispensable" pour confirmer les données d'imagerie.
Objectifs
Ce projet a pour objectif la validation d'un instrument chirurgical innovant dans le cadre de la réalisation d’un pontage artérielle (technique chirurgicale consistant à créer une dérivation afin de court-circuiter une artère endommagée), qui est employé pour la prise en charge de certaines pathologies vasculaires. Ce projet sera constitué d'une étude pilote (phase réalisée en aigue) et d'une étude de validation du dispositif (sur 3 mois de suivi).
Bénéfices attendus
A l’issue de cette étude, le dispositif innovant sur lequel porte ce projet pourrait permettre de réaliser des pontages artériels sans arrêt circulatoire et sans suture. Ces pontages seront utilisés dans le traitement de certaines pathologies vasculaires. Le dispositif d’intérêt pourrait permettre de faciliter le geste technique chirurgical et de limiter la morbidité associée à la chirurgie et, ainsi, d’améliorer la prise en charge de ces pathologies vasculaires.
Procédures
Les animaux de l'étude pilote (n=4) auront une anesthésie générale, ceux de l'étude de l'efficacité (n=12) auront 5 anesthésies générales au total. Tous les animaux auront une procédure chirugicale (incision d'environ 12cm) au niveau de la carotide droite ou de l'iliaque droite, les animaux de l'étude pilote auront les 2 (durée de la chirurgie évaluée à 1h30 maximum). Les animaux de l'étude d'efficacité auront chacun 4 sessions d'imagerie médicale (contrôles échographiques et scanographiques) effectuées 7 jours, 1 mois, 2 mois et 3 mois après l'intervention chirurgicale (durée de 45 min à chaque fois).
Impact sur les animaux
Isolation de l'animal pour la prémédication ce qui peut etre source de stress. Mise en place d'un cathéter veineux en jugulaire. Intubation, mise sous respiration mécanique et anesthésie générale gazeuse. Le projet nécessite de réaliser juqu'à 5 anesthésies générales par animal. Incision (environ 12cm) au niveau de l'encolure ou de la région iliaque droite. Scanner au temps basal, à J7, M1, M2 et M3.
Devenir
Tous les animaux (n=16) du projet seront mis à mort à la fin de la procédure pilote ou des 3 mois de suivi de la procédure d'efficacité. Le prélèvement des artères et de la prothèse est indispensable afin de pouvoir confirmer les données d'imagerie par des analyses histologiques.
Remplacement
Le dispositif a été testé au préalable sur bancs d’essai (simulateur). Cet instrument doit encore être éprouvé in vivo afin de vérifier la possibilité de mise en œuvre technique. A l’état actuel des connaissances scientifiques, la complexité du système cardiovasculaire impose de tester le dispositif sur modèle animal. Les tailles des artères de la brebis sont proches de celles de l'humain, ce modèle permet donc de tester le dispositif dans sa version finale, identique à celle qui pourra être utilisée chez l’Homme.
Réduction
Le nombre d'animaux a été réduit au maximum en veillant toutefois à obtenir un nombre suffisant de dispositifs implantés pour réaliser une évaluation de l'efficacité. La réalisation d’une étude pilote sur 4 animaux permettra de valider au préalable une faisabilité technique et de déterminer la zone d'implantation la plus adaptée (carotide ou aorte) pour l'étude d'efficacité. Si l’étude de faisabilité ne donne pas de résultats satisfaisants, l’étude d'efficacité ne sera pas entreprise et seuls 4 animaux seront utilisés in fine.
Raffinement
Toutes les procédures expérimentales ainsi que l’environnement d’hébergement ont été optimisés. Les animaux arriveront par groupe de 2 à 6 et seront hébergés ensemble dans un box avec de la fibre de bois au sol et des objets d'enrichissement (jouets, ballots de foins), une période d'acclimatation de 5jours sera respectée avant toute procédure. Les gestes interventionnels seront toujours réalisés sous anesthésie générale, par du personnel formé, permettant un temps interventionnel réduit au maximun, afin de prévenir la souffrance et l’angoisse des animaux. Le bien-être des animaux sera contrôlé en veillant aux conditions d'hébergement et au comportement des animaux. Des observations quotidiennes seront réalisées par une personne compétente basées sur l'apparence physique externe, le comportement (sociabilité, appétit) et les réponses comportementales aux stimuli externes (bruits...). Ces contrôles permettent de repérer tout animal malade ou blessé pour prendre des mesures appropriées. Tout constat d'un mal-être est remonté au responsable du bien-être des animaux pour examen approfondis, traitements adaptés et/ou consultation du vétérinaire référent. Les contrôles effectués au temps basal puis 7jours, 1, 2 et 3 mois après l'intervention chirurgicale se feront par imagerie médicale (échographie et scanner) qui est une approche non invasive, qui n’est pas source de douleur. L’utilisation de la contention physique douce, possible chez la brebis (réalisée notamment pour la tonte des animaux), pour la mise en place de la voie veineuse jugulaire externe est préférable à l’administration d’une prémédication intramusculaire source de douleur et de stress. La mise en place d’un tissu sur les yeux lors de la contention douce de l'animal réduit les stimuli externes et donc le stress de l'animal. Une fois la voie veineuse périphérique mise en place, l’anesthésie générale est induite en quelques secondes et sera maintenue par halogénés.
Choix des espèces
La brebis est un animal proche de l’Homme d’un point de vue physiologique et anatomique (taille, structure et forme des organes, etc.). Les dispositifs médicaux de la clinique humaine peuvent directement être utilisés chez l’ovin. L'utilisation d'équipements d'imagerie médicale destinés à l'Homme permet d'avoir une qualité d'imagerie équivalente à celle obtenue chez l’humain. D’autre part, contrairement au Porc, la Brebis possède une stabilité dans le diamètre des vaisseaux qui n’augmente pas de manière significative à partir d’un certain âge. Cette caractéristique permet au dispositif de rester en place tout au long de la période suivi post-chirurgical dans le cadre de l’étude d'efficacité. Cette étude pourra également servir de référence si une autre étude avec un suivi sur du long-terme (1an) est nécessaire. En effet, ceci serait impossible chez le Porc qui atteindrait un poids d'environ 300kg. Les animaux seront des Brebis adultes (de 5 à 8 ans). En effet, la taille des artères doit être suffisante pour pouvoir mettre en place le dispositif et surtout leur diametre ne doit plus varier pendant le temps de suivi.
Formation à la ceolioscopie sur modèle porcin dans le cadre de la formation des futurs chirurgiens et chirurgiens en formation continue de spécialité digestive.
- Formation professionnelle
100 cochons vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque animal sert de support à une séance de quatre heures où trois chirurgiens s'exercent à des gestes de chirurgie digestive, ablation de la vésicule, anastomose de l'intestin, ablation de la rate et gastrectomie, non pour produire des connaissances mais pour former des internes et des chirurgiens. Le porteur mentionne comme seul risque un saignement, minime ou incontrôlé. Il affirme que le remplacement est "impossible" faute de modèle in vitro ou in silico et qualifie le recours à l'animal d'"indispensable" pour cette formation.
Objectifs
L'apprentissage de la chirurgie se fait de plus en plus en dehors du bloc opératoire pour des raisons de sécurité, de temps et de coût. Dans le cadre de la formation du D.I.U. de chirurgie laparoscopique avancée, nos étudiants doivent Le projet est justifié sur le plan éducatif car il n’existe pas de modèle de simulation permettant l’apprentissage de la laparoscopie en condition réelle. Cet apprentissage est particulièrement difficile du fait des problèmes d'exposition, de vision en 2 dimensions et dans le contrôle du saignement. Il nécessite un travail répété et prolongé au dehors du bloc opératoire. Les programmes ont été définis par les responsables de D.E.S. de chaque spécialité concernée.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra aux internes et jeunes chirurgiens d'acquérir une formation en chirurgie laparoscopique avancée qui leur sera très utile lors de leur future pratique.
Procédures
Tous les animaux (100 porcs) subiront les mêmes techniques de chirurgie sans modifications sous anesthésie générale et analgésie et ne se réveilleront pas de l'anesthésie. La séance de TP dure 4 heures au total. -15 min : Mise en place des trocarts et des introduction des instruments -15 min : Laparascopie exploratrice -30 min : Cholécystectomie -60 min : Anastomose du grêle -30 min : Dissection du pédicule splénique et hépatique -30 min : Splénectomie partielle puis totale -60 Min : Chirurgie Bariatrique : Sleeve gastrectomie
Impact sur les animaux
Saignement Minime ou hémorrhagie incontrôlée
Devenir
L'animal ayant subi les différentes procédures chirurgicales nécessaires à la formation ne sera pas réveillé. La formation étant centrée sur les critères de techniques chirurgicales, les animaux seront mis à mort sous anesthésie générale à la fin des interventions ce qui leur évitera toutes souffrances post opératoire.
Remplacement
Le remplacement n’est pas possible car la formation doit avoir lieu au sein d’un organisme vivant complexe avec une anatomie proche de celle de l'homme. Il n’y a ni modèle in vitro ou ni modèle in silico. Le recours à l'expérimentation animale est indispensable pour cette formation avant la validation des compétences pour les chirurgiens.
Réduction
Pour limiter le nombre d'animaux, 3 chirurgiens seront postés sur le même animal. Les procédures chirurgicales seront répétées et perfectionnées sur des porcs. Cette stratégie nous permet de n’inclure que 100 porcs sur cinq ans dans le groupe de mise au point chirurgicale.
Raffinement
La méthodologie utilisée nous permettra d’assurer l’absence de souffrance inutile et le bien-être des animaux. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi). Le vétérinaire réfèrent du Laboratoire passera une fois par semaine voir les animaux ainsi qu’à la demande des zootechniciens si besoin. Les animaux seront en box commun pendant le temps d'adaptation à l'animalerie (en moyenne 5 jours).
Choix des espèces
Anatomiquement, le porc est l'espèce animale qui est la plus proche de l'être humain sur laquelle on peut réaliser de la chirurgie digestive laparoscopique. Animaux matures, entre 45 et 60 kilos ce qui correspond à 1 an ou 1 an et 18 mois d'âge.
Etudes des propriétés intrinseques des neurones néocorticaux chez trois modèles transgéniques (souris) de maladie neurodéveloppementale
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2 384 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de l'anesthésie sans réveil au modéré. Des modèles transgéniques de troubles neurodéveloppementaux subissent des enregistrements cérébraux de quatre heures sous anesthésie, des tests de réaction aux sons et au toucher et des administrations par gavage ou injection. Une partie des souris est tuée sous anesthésie pour prélever le cerveau, tandis que le porteur indique en garder 540 vivantes pour des expériences ultérieures. Il affirme que le modèle animal est "absolument nécessaire" et qu'aucun remplacement in vitro ou in silico n'est possible.
Objectifs
Les troubles neurodéveloppementaux (TN) touchent environ 1 enfant sur 60. Les facteurs génétiques, ainsi que les facteurs environnementaux, jouent un rôle important dans l'étiologie de ce trouble complexe. Certains TN se caractérisent par des déficiences en matière de communication et d'interaction sociale ainsi que par des comportements stéréotypés répétitifs. Les personnes atteintes de ce trouble présentent souvent une réponse inappropriée aux stimuli sensoriels. Cette sensibilité anormale peut avoir un impact dévastateur sur leur vie quotidienne (par exemple, incapacité à porter certains vêtements, à tolérer le bruit ou la lumière dans un centre commercial ou une école) et peut entraîner des inégalités dans l'accès à l'éducation, etc. A ce jour, il n'existe aucun traitement permettant d'améliorer la vie de ces personnes. L'objectif de notre projet actuel est de mieux comprendre les processus neurobiologiques qui sous-tendent les défauts de traitement de l'information sensorielle dans les modèles murins de la TN. Nous effectuerons des enregistrements cérébraux et des tests comportementaux afin de tester la capacité de molécules potentiellement thérapeutiques à corriger les défauts de traitement sensoriel dans le cerveau.
Bénéfices attendus
Notre projet s'attaque à des défis importants pour comprendre la base neurobiologique de l'expérience sensorielle atypique dans les TN (et sa remédiation). Les innovations particulières de notre approche sont (1) l'utilisation d'un système cérébral qui est hautement conservé entre les souris et les humains, fournissant ainsi un système modèle idéal pour les études translationnelles. (2) Nous utilisons une approche thérapeutique basée sur un mécanisme, soutenue par de solides données préliminaires et publiées et par la génétique humaine. Notre proposition aborde un certain nombre de défis importants en suspens dans la recherche sur les TN, y compris la pertinence de développer des approches expérimentales comparables dans les modèles de recherche humains et rongeurs, et le rôle critique des caractéristiques sensorielles altérées dans les TN. De plus, comme les caractéristiques sensorielles sont fortement déterminantes pour d'autres symptômes des TN, toute approche thérapeutique ciblant le traitement atypique de l'information sensorielle a le potentiel d'améliorer d'autres symptômes de ce trouble.
Procédures
Nous effectuerons des enregistrements cérébraux sur des souris anesthésiées qui recevront une analgésie tout au long de l'expérience pour gérer toute douleur. La durée de cette expérience sera de 4 heures. Nous effectuerons des tests comportementaux pour observer la capacité exploratoire des souris et leur réaction aux sons et au toucher. Les souris seront manipulées et habituées avant ces tests comportementaux. Les tâches comportementales seront effectuées pendant 10 jours, à raison de 20 minutes maximum par jour. Pour certains tests, les souris reçoivent un produit médicamenteux par injection intrapéritonéale ou par gavage. Chaque prise de médicament durera environ 5 seconds.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront à des test de comportement. Certains de ces tests sont légèrement anxiogènes, ou implique une contention de l'animal. Certains animaux reçoivent une drogue expérimentale. Cela implique une injection intraperitonéale ou l'adminsitration par gavage. L'administration par voie i.p. peut provoquer une légère douleur au site d'injection. Le gavage peut conduire à une irritation au niveau de l'oesophage. L'administration d'anesthésique implique également une injection qui est légèrement douloureuse.
Devenir
Pour certaines procédures, les souris seront gardées en vie pour des expériences ultérieures afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans les études futures. Pour les expériences impliquant les enregistrements cérébraux, les souris seront euthanasiées humainement alors qu'elles sont encore sous anesthésie et leur cerveau sera collecté pour un examen morphologique des neurones. Pour les expériences comportementales, les souris seront euthanasiées humainement par une personne formée et selon les méthodes réglementaires approuvées.
Remplacement
Le modèle animal est absolument nécessaire pour reproduire la complexité des interactions neuronales nécessaire pour le traitement de l’information sensorielle qui demande un système intact. Le remplacement par les méthodes in vitro ou in silico n’est pas possible à ce jour. Cependant, certaines expériences préliminaires visant à tester le potentiel des nouvelles molécules thérapeutiques seront réalisées in vitro avant l'application de ces molécules chez l’animal.
Réduction
Pour les enregistrements cérébraux, notre stratégie d’expérimentation nous permet d’effectuer une analyse précoce de nos données au fur et a mesure et de modifier la taille d’echantillon si besoin. Pour les tests comportementaux, la taille de nos échantillons est similaire à celle suggérée par d'autres études similaires. Nous ne pouvons pas utiliser les mêmes souris dans les groupes non traités, administrés avec le véhicule et administrés avec le traitement, car cela aurait pour conséquence que les mêmes souris subissent chaque test comportemental plusieurs fois, ce qui pourrait confondre nos résultats comportementaux, comme cela a été rapporté dans plusieurs études précédentes. Il s'agit d'une considération particulièrement importante dans nos tests, car nous examinerons l'accoutumance sensorielle, qui pourrait être affectée par la répétition des mêmes tests sur les souris plusieurs fois. En outre, nous effectuerons certaines études pilotes pour tester, a priori, la faisabilité technique de certaines manipulations. Cela nous permettra de poursuivre nos études dans les meilleures conditions expérimentales, afin de limiter le nombre d'animaux utilisés dans l'ensemble de notre étude.
Raffinement
Avant expérimentation: Surveillance quotidienne et vérification de l’état de l’animal (posture, comportement, vivacité, état de pelage). Pendant les enregistrements cérébraux: Le séance d'enregistrement se fait sous anesthésie générale. Le mélange anesthésique utilisé a une action analgésique. Un crème ophtalmique est appliqué aux yeux. L'animal est maintenu sur tapis chauffant. Durant la séance d’enregistrement la température de l’animal est contrôlée grâce à une sonde rectale. Pour les enregistrements longs: injection s.c. d'une solution physiologique. Réduire au maximum l’angoisse : Hébergement de manière à correspondre aux besoins de l’animal – mise à disposition du matériel pour la construction d’un nid. Utilisation d'un tube de transfert afin de limiter le stress lié à l'interaction avec l'expérimentateur.
Choix des espèces
Ce modèle (la souris) a été choisi car les rongeurs ont un système sensoriel très développé et sont considérés comme une espèce modèle pour les études concernant le traitement de certains types d'informations sensorielles. De plus, la souris est actuellement la seule espèce de mammifère dont il est possible de modifier le génome en routine pour créer des modèles de maladies humaines. 4 à 16 semaines, selon le type de manipulation prévu. Justification : Nous nous appuyons sur des études antérieures réalisées au sein de notre laboratoire ou de celui de nos collaborateurs pour définir les meilleures conditions expérimentales afin d'assurer le bon déroulement de nos expériences.
Contrôle d’inactivation des vaccins antirabiques
- Formation professionnelle
- Tests réglementaires
- Contrôles de qualité
10 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures dont la souffrance déclarée va de l'anesthésie sans réveil au niveau sévère. Sevrées, elles reçoivent une injection intracérébrale du vaccin antirabique à contrôler et, en cas d'inactivation incomplète du virus, peuvent développer des signes de rage comme la prostration et la paralysie. Le porteur décrit un test libératoire réglementaire de contrôle qualité et indique que le nombre de souris par groupe est fixé par la pharmacopée. Il affirme qu'aucun remplacement n'est possible aujourd'hui, tout en signalant que des tests in vitro sont en développement.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de s’assurer de l’inactivation des vaccins antirabiques destinés à l’Homme au travers d’un test de contrôle qualité assurant ainsi la mise sur le marché de lots de vaccins conformes aux normes de sécurité et d’activité. Ce test de contrôle qualité est un test libératoire réglementaire qui est réalisé pour vérifier que le vaccin est sans risque pour le patient avant leur commercialisation"
Bénéfices attendus
Ce projet permet de mettre à disposition des lots commerciaux de vaccins antirabiques sûrs et efficaces pour protéger les populations contre le virus de la rage.
Procédures
Toutes les souris utilisées dans le projet subissent une injection intracérébrale sous anesthésie gazeuse, suivie d’une euthanasie à la fin de la période de test (21 jours). L’anesthésie dure environ 1 minute, l’injection intracérébrale dure environ 3 secondes et l’euthanasie est instantanée. L’observation clinique quotidienne réalisée ensuite dure environ 30 secondes par cage (qui contient 5 à 6 souris) mais ce temps peut être raccourci en fonction du nombre de souris contenues dans la cage. Dans le cadre d’investigations (cas clinique suspectant la présence de virus rabique), des ré injections de broyats sont réalisés (1 minute 30 par souris). Le vétérinaire sanitaire ainsi que le responsable de l’activité sont informés dès que l’état de santé d’une souris se dégrade.
Impact sur les animaux
- Injection intracérébrale sous anesthésie gazeuse, - Dans le cas rare d’inactivation incomplète du virus, des signes typiques de la rage (tels que la prostration, l'hypoactivité et paralysie) peuvent apparaître au cours du tests. Il sera alors réalisé des investigations comme décrit dans la procédure N°4 soit la ré inoculation d’un broyat de cerveau en voie intracérébrale.
Devenir
Euthanasie de toutes les souris, car la réutilisation des animaux est impossible suite à l’injection d’échantillon à contrôler.
Remplacement
Pas de remplacement possible actuellement :il est nécessaire d’utiliser des souris pour détecter une éventuelle présence de particules rabiques actives dans les échantillons testés. Cependant, des tests in vitro sont en cours de développement pour la fabrication de vaccins antirabiques de nouvelle génération et devraient se substituer aux tests in vivo actuels dans les années futures
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé pour la qualification des techniciens est le même que pour un test en situation réelle. Par soucis de réduction d’animaux, pour la requalification le nombre de souris est à minima divisé par quatre par rapport à un test en situation réelle. Le nombre de souris par groupe engagées dans les tests est défini par la réglementation et ne permet pas de réduire au-delà
Raffinement
Pour les procédures où des effets indésirables sont attendus, des points limites sont mis en place afin d’éviter aux animaux toutes atteintes potentielles à leur bien être tout au long des dites procédures Les souris sont hébergées en groupe dans des cages contenant de l’enrichissement varié, tels que des Dome-Home (petits abris cartonnés, matériels de nidification, roue, morceaux de bois à ronger) dans des locaux appropriés à leur espèce et conformes à la réglementation
Choix des espèces
L’espèce « souris » est une espèce sensible au virus rabique. Elle est décrite comme modèle de prédilection dans la pharmacopée européenne et dans les rapports techniques de l’OMS (organisation mondiale de la santé) pour la fabrication des vaccins rabiques. Les souris sont toutes utilisées juste après le sevrage (12-15g), stade de développement où les souris sevrées sont les plus sensibles au virus rabique et où l’inoculation en intracrânien peut se faire aisément, sans dommage pour l’animal. C’est le stade d’utilisation recommandé dans les rapports techniques de l’OMS pour les vaccins.