Procédures sévères

Toutes tuées pour prélever organes et tissus, 350 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un AVC leur est provoqué avec ouverture du crâne sous anesthésie, puis un activateur du plasminogène muté leur est injecté, l'ensemble durant deux heures, avec deux passages de dix minutes en imagerie par résonance magnétique. Le porteur annonce une perte de masse corporelle, des douleurs postopératoires, du stress et des déficits fonctionnels, et compte un test comportemental répété quatre fois vingt secondes sans en préciser la nature. Il écrit que la mise à mort de tous les animaux répond au critère de réduction et que la sévérité de l'AVC ne permet pas, pour leur bien-être, de les garder en vie.

Objectifs

Lors d’un AVC ischémique, le traitement pharmacologique est une injection d’une enzyme recombinante (sans mutations) qui est l'activateur tissulaire du plasminogenè (tPA). Il permet de déclencher la dégradation du caillot sanguin mais présente un risque d’hémorragie, une augmentation de l’inflammation et un risque d’ouverture de la barrière hémato-encéphalique qui augmenterait la lésion. Or, le tPA existe sous deux formes : simple chaine et double chaine. Ces deux formes ont des effets différents dans l’organisme. Le tPA une fois clivé au caillot sanguin devient un tPA double-chaine qui serait responsable des effets indésirables. Alors, afin de les diminuer, nous avons muté le tPA afin de générer des nouveaux mutants originaux. Après une évaluation précise et significative in vitro de leur capacité à lyser des caillots sanguins ainsi qu’une étude préliminaire in vivo afin de déterminer leur demi-vie et leur répartition dans l’organisme nous avons sélectionné les meilleurs mutants. Notre objectif est d’évaluer chez la souris l’efficacité des nouveaux tPA mutants. Au regard du risque hémorragique, du volume de lésion, de la recanalisation, de la reperfusion, de l’inflammation et de la récupération fonctionnelle, nous déterminerons les effets des nouveaux mutants du tPA in vivo pour in fine proposer une alternative au traitement classique de l’AVC ischémique chez l’humain. De façon concomitante, nous comparerons les différences entre les deux formes du tPA afin de mieux comprendre leurs effets lors d’un traitement de l’AVC ischémique.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet pourront grandement améliorer notre compréhension de la physiopathologie de l’AVC et présentent un grand potentiel translationnel vers l’humain via l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

- Procédures 1 et 3 : habituation à la préhension (>1 semaine), test comportemental (4 fois de 20s), procédure chirurgicale (induction de l’AVC avec craniotomie sous anesthésie et analgésie suivi de l'administration du traitement (tPA), 2h ), imagerie par résonnance magnétique (2 fois pendant 10min), mise à mort (chirurgie terminale sous anesthésie et analgésie en vue du prélèvement des organes, 5min). - Procédures 2 et 4 : procédure chirurgicale (induction de l’AVC avec craniotomie sous anesthésie et analgésie suivi de l'administration du traitement (tPA), 2h), imagerie par résonnance magnétique (2 fois pendant 10min), mise à mort (chirurgie terminale sous anesthésie et analgésie en vue du prélèvement des organes, 5min).

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître seraient pour l’ensemble des procédures : une perte de masse corporelle, des douleurs post-opératoires, du stress et des déficits fonctionnels.

Devenir

Tous les animaux utilisés au cours du projet seront mis à mort afin de récupérer les organes et les tissus pour des analyses cytologiques, histologiques, biochimiques et enzymatiques. Cela répond au critère de réduction puisqu’il permet de diminuer le nombre d’animaux utilisés. De plus la sévérité de l’AVC ischémique ne permet pas pour le bien-être animal de garder en vie les animaux.

Remplacement

Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. Les alternatives comme la culture cellulaire en déprivation d'oxygène et de glucose ou encore des cultures organotypiques de tranches de cerveaux ne permettent pas dévaluer les effets secondaires du tPA dont notamment le risque pro-hémorragique et ne permettent pas d'évaluer la récupération fonctionelle à la suite du traitement. De plus, nous avons au préalable mener des expériences in vitro.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, nos travaux précédemment publiés et la littérature mais aussi en fonction de la part d'inconnu avec laquelle nous souhaitons mettre au point un nouveau modèle animal. Le nombre d’animaux pourra être revu à la baisse selon l’aisance de l’expérimentateur (habileté, expérience dans les différentes techniques prévues) et de la significativité des résultats. Un nombre moyen pour chaque groupe, comprenant un pourcentage d'entrainement à ce nouveau modèle et de perte dans ce nombre (15%) a donc été défini. De plus, l'utilisation de techniques d'imagerie non invasives permet de réduire le nombre d'animaux utilisés. Des sous-étapes de techniques in vitro déjà validées pourront également compléter et vérifier le passage de la prochaine étape in vivo.

Raffinement

Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés et analgésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel qualifié 7j/7, cela pendant toute la durée du projet. Il sera suivi quotidiennement par du personnel qualifié. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum et une période d'une semaine d'acclimatation sera respectée. Les animaux seront placés dans un environnement enrichie avec un dôme de cellulose, des carrés de cotons et du papier kraft dans chaque cage. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux (acclimatation, observation, médication, réveil dans enceinte chauffée, croquettes mouillées, masse corporelle) pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant tout le projet jusqu’à la mise à mort de l’animal. Tout le matériel et consommables utilisés dans cette procédure expérimentale seront neufs (comme les seringues et aiguilles), ou soigneusement nettoyés et désinfectés pour les réutiliser (pinces métalliques).

Choix des espèces

La souris (mus musculus) est l’espèce de référence utilisée pour étudier l’inflammation et l’ischémie cérébrale dans la littérature. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. Les propriétés tissulaires des artères cérébrales sont identiques chez l’homme et la souris. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier le traitement de l'accident vasculaire cérébrale. Les animaux utilisés seront des souris jeunes adultes âgées de 8 à 15 semaines. Ces âges correspondent à ceux utilisés en majorité dans les modèles d’AVC.

Paralysie partielle ou totale des membres, douleurs articulaires, automutilation possible : 10000 rongeurs subissent l'induction d'une encéphalomyélite auto-immune ou d'une arthrose, puis reçoivent des substances à tester, parfois chaque jour jusqu'à leur mise à mort. 4500 souris, 2500 rats, 1500 cochons d'Inde et 1500 hamsters dorés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue pour des analyses in vitro et ex vivo. Les maladies sont provoquées par des injections répétées sur des rongeurs éveillés, sous la peau puis dans la cavité abdominale pour l'encéphalomyélite, afin d'évaluer l'efficacité ou la toxicité de substances et de dispositifs médicaux pour l'industrie pharmaceutique et les "clients" de l'établissement. Le porteur justifie le choix des rongeurs par leur petite taille, un organisme "similaire à l'Homme" et le fait qu'ils sont "faciles à héberger". Il affirme aussi que les traitements testés "minimiseront les nuisances", alors que l'objectif inclut d'en évaluer la toxicité.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de réaliser différents traitements chez le rongeur après induction de modèles expérimentaux, l’arthrose et l'encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE). Le but est d’évaluer l’efficacité ou la toxicité de substances ou dispositifs médicaux pour l’industrie pharmaceutique dans des modèles présentant les signes caractéristiques de pathologies, soit l’arthrose et la sclérose en plaques.

Bénéfices attendus

Ce projet permet d’induire des pathologies afin de tester des substances sur des modèles expérimentaux correspondants. Le bénéfice attendu est donc de pouvoir développer et tester ces substances sur l’Homme afin de proposer des traitements aux pathologies correspondantes. In fine, l’objectif est d’améliorer la santé humaine.

Procédures

Pour le développement du modèle de l’arthrose, les animaux vigiles reçoivent plusieurs injections d’une substance en sous-cutané, de 2 à 5 injections. Ensuite, une substance sera inoculée en dose unique ou répétée après le développement de l’arthrose. Ces administrations peuvent être quotidiennes jusqu’à la mise à mort des animaux. Les substances sont administrées par voie sous-cutanée, intraveineuse, intradermique, intramusculaire, intrapéritonéale, intra-articulaire ou orale. Pour la mise en place du modèle d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale, les animaux vigiles subissent l’injection d’une première substance en sous-cutanée, pratiquée sur le haut et sur le bas du dos, puis l’injection en intrapéritonéale d’une seconde substance qui est répétée 2 à 3 jours après. En fonction de l’étude, si l’administration sur animal vigile n’est pas possible, il peut être réalisée une anesthésie générale et la mise en place d’une analgésie adaptée. Une substance test peut ensuite être injectée par voie orale, intraveineuse, intrapéritonéale, intramusculaire, sous-cutanée ou intradermique. A l’issue du projet, tous les animaux sont mis à mort pour des analyses vitro et ex-vivo.

Impact sur les animaux

Le modèle de développement d’arthrose peut générer de la douleur au niveau des articulations. Les effets liés au développement de modèle peuvent aboutir à une baisse d’activité ainsi qu’un changement de comportement (baisse de la prise alimentaire, agressivité, automutilation, …). Les traitements testés minimiseront les nuisances. Le modèle de développement d’encéphalomyélite auto-immune peut provoquer une paralysie partielle ou totale au niveau des membres. Cette paralysie peut s’accompagner d’une allodynie et/ou d’une douleur plus ou moins persistante au niveau des membres paralysés. Les premiers signes cliniques peuvent apparaitre avec une paralysie progressive de la queue et du train arrière qui peut se propager au niveau du train avant. Les effets liés au développement de ce modèle peuvent aboutir à des changements comportementaux (baisse d’activité, baisse de la prise alimentaire) et physiques (perte de poids, absence de réflexes, immobilité). Les traitements testés minimiseront les nuisances.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, tous les animaux sont mis à mort pour réaliser des analyses vitro et ex-vivo.

Remplacement

Le développement de produits pharmaceutiques ou de dispositifs médicaux nécessite de réaliser des expériences chez l’animal dans le cadre du développement préclinique, afin d’évaluer l’activité des produits dans un organisme complet et complexe. Des tests in vitro sont réalisés au préalable par nos clients ou par notre installation. Il est nécessaire de recourir aux animaux afin de tester une substance dans un organisme complexe. Les modèles induits décrit dans ce projet sont caractérisés par des signes cliniques physiques. Dans le cas de l’arthrose, il s’agit de douleurs et de raideurs tandis que dans l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale il s’agit de paralysie des membres. Ces signes pathologiques et leurs résorptions ne peuvent être observés qu’avec l’utilisation d’animaux.

Réduction

Pour chaque protocole, le nombre d’animaux est réduit au minimum requis tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement fiables. Par exemple, un nombre minimum d’animaux est requis pour les essais réglementaires, chaque groupe est composé de 10 animaux minimum (5 mâles et 5 femelles minimum). Les analyses statistiques seront effectuées à l'aide du logiciel GraphPad Prism 4, comme décrit dans les procédures internes.

Raffinement

De l’enrichissement comme des batônnets à ronger, des huttes/tunnels, du papier kraft/coton sont ajoutés dans les cages. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux compatibles. En fonction du mode d’administration, il est possible de mettre en place une analgésie adaptée en fonction des observations quotidiennes des animaux. En fonction du projet, le poids corporel des animaux sera enregistré deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience. Si nécessaire, une pesée plus régulière peut être réalisée. Les animaux sont observés quotidiennement et un monitoring (observation du déplacement, posture, paralysie, comportement, respiration, aspect des yeux, de la peau, des poils, des muqueuses et des excrétions dans la cage) peut être mis en place. La perte de poids sera évaluée en fonction du poids de départ de chaque animal. Selon les essais et besoins expérimentaux, une observation de la tolérance locale (observation de l’apparition et de l’évolution d’œdème ou d’érythème) après chaque traitement peut être réalisée. Pour le développement de modèle de l’arthrose, un scoring est réalisé pour chaque patte de l’animal (enflure et rougeur de la cheville ou poignet jusqu’aux phalanges) deux fois par semaines au minimum après traitement jusqu’à la fin de l’expérience. Pour le développement de modèle d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale, un scoring sera réalisé quotidiennement après traitement afin d’évaluer l’apparition d’une paralysie (queue, membres postérieures et antérieures) jusqu’à la fin de l’étude. Des points limites spécifiques sont développés pour chacune des procédures décrites.

Choix des espèces

Les rongeurs sont des mammifères de petite taille ayant un organisme similaire à l’Homme. Leur génotype est connu et ils sont faciles à héberger. En outre, de nombreux articles bibliographiques sont disponibles pour décrire les différents modèles. Les animaux utilisés seront des adultes ou des jeunes adultes, car ils nécessitent un système immunitaire et des organes totalement développés et fonctionnels.

1 200 souris et 1 200 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. La voûte plantaire d'une patte arrière est incisée sous anesthésie générale, ou un produit inflammatoire y est injecté, puis les seuils de douleur sont mesurés le lendemain. La douleur est ici l'effet indésirable attendu et le paramètre étudié, le projet visant à mesurer l'effet antalgique propre de produits déjà utilisés en clinique. Le porteur affirme que l'étude de la douleur exige un "organisme entier", pose douze animaux par condition comme un minimum, et indique que la seconde espèce ne sera pas utilisée si la première donne des résultats satisfaisants.

Objectifs

Le but du projet est de rechercher des produits efficaces pour diminuer ou supprimer une douleur aiguë, notamment les douleurs postopératoires qui sont caractérisées par une hypersensibilité tactile. La douleur est définie comme une expérience sensorielle et émotionnelle désagréable, liée à une lésion tissulaire existante ou potentielle. Elle peut être aiguë ou chronique, spontanée ou provoquée, discrète ou intense, mais elle est avant tout personnelle, subjective, émotionnelle et comportementale. La douleur postopératoire aiguë est causée par un geste chirurgical et elle est présente immédiatement après l'opération, provoquée par des lésions induites par la chirurgie ainsi que par un processus inflammatoire qui entraine un excès de sensibilité à la douleur (nociception). Quand la douleur postopératoire est mal traitée, une douleur postopératoire chronique peut persister pendant plusieurs semaines ou mois. Si elle persiste, elle risque de ralentir le rétablissement et de devenir chronique. Elle est alors plus difficile à traiter. Notre projet permet de déterminer l’effet antalgique propre d’un produit.

Bénéfices attendus

Une douleur postopératoire mal traitée peut entrainer des douleurs chroniques qui persistent à distance de la chirurgie pendant plusieurs semaines ou mois. Celle-ci est fréquente et peut se retrouver chez 40% des patients. Elle est associée à une hypersensibilité tactile diffuse autour de la chirurgie et qui est assez difficile à bien prévenir et ensuite à bien traiter quand elle s'est développée. La prise en charge rapide et efficace de la douleur postopératoire est importante pour assurer un confort postopératoire et une réhabilitation précoce, et pour éviter le développement de douleurs prolongées ou chroniques. Ce projet permet de déterminer précisément l'effet antalgique de produits utilisés en condition clinique, notamment sur la prévention d'une hypersensibilité tactile.

Procédures

Une chirurgie avec incision de la voute plantaire d'une patte arrière est réalisée sous anesthésie générale, en 10 minutes au maximum, la veille des tests, avec une durée maximale de 2 jours. Une administration d'un produit inflammatoire dans une patte arrière, et les tests sont réalisés le jour même avec une durée maximale d'une journée. L'objectif des procédures est de déterminer l'efficacité de molécules antinociceptives en réalisant des mesures des seuils de douleur.

Impact sur les animaux

L'administration d'un produit inflammatoire et la chirurgie se font sous anesthésie générale à l'isoflurane afin de réduire le stress de la manipulation. Cependant, les effets indésirables attendus de ces 2 protocoles sont une douleur qui est le principal paramètre étudié. Des effets indésirables peuvent survenir après la chirurgie. Une inflammation au niveau de la cicatrice peut survenir nécessitant une désinfection.

Devenir

Les procédures étant classées "sévère", les animaux ne seront pas réutilisés dans un autre projet. A la fin de chaque expérimentation, après recueil des paramètres prévus, les animaux seront euthanasiés quand la procédure est terminée. Aucun prélèvement de sang ou d’organe n’est prévu dans le projet.

Remplacement

L'étude de la douleur chez l'animal implique l'utilisation d'animaux entiers. La sensibilité à la douleur est complexe avec des symptômes qui touchent différents organes. L'utilisation de modèle avec des organes isolés ne permet pas d'évaluer l'influence de différents produits sur la sensibilité à la douleur. Des résultats obtenus lors de précédentes études et des données de la littérature permettent de sélectionner les produits à étudier (doses, voies d'administration, volumes). Des alternatives non animales ne peuvent être envisagées pour rechercher l'ensemble des objectifs prévus. Les méthodes expérimentales in vitro ou in silico ne permettent pas de reproduire l’ensemble des symptômes de la douleur, il est donc nécessaire de travailler sur un organisme entier.

Réduction

La variabilité des réponses aux effets d’un traitement chez le rongeur justifie une taille de groupe de minimum 12 animaux par condition expérimentale. Un effectif inférieur expose à un risque de devoir reproduire les procédures pour valider statistiquement la solidité des résultats obtenus par une analyse de la variance. En cas de résultat significatif, les différences entre chaque groupe et le groupe contrôle seront explorées à l’aide d’un test de comparaisons multiples adapté. En cas de trop petit nombre d'animaux, il faudrait refaire une étude pour confirmer les effets et observer des différences significatives entre les groupes. En cas de faible ou non efficacité d'un produit, son étude sera arrêtée. Si une étude réalisée chez une espèce donne des résultats antalgiques satisfaisants, la deuxième espèce ne sera pas utilisée.

Raffinement

Une surveillance attentive des animaux est réalisée. Les animaux seront hébergés à plusieurs afin de maintenir leur socialisation et dans des cages enrichies avec des tunnels et/ou du Sizzle dry et des aliments directement dans les cages (dans les copeaux). Les administrations des différents produits sont effectuées par du personnel expérimenté. L'administration par voie orale se fera à l’aide de sondes souples pour limiter les irritations. L'administration d'un produit inflammatoire et la chirurgie (animaux placés sur une plaque chauffante pour limiter le refroidissement) se feront sous anesthésie générale. Un produit protecteur est instillé au niveau de chaque oeil pour éviter le déssèchement de la cornée. Les animaux seront observés attentivement en respectant les points limites. Ils seront euthanasiés en cas d'atteinte des points limites mis en place pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse.

Choix des espèces

Après recherche bibliographique, le rat et la souris sont apparus parmi les modèles animaux les plus fréquemment décrits, et les plus appropriés pour ce projet. Les animaux utilisés sont des adultes conformément aux publications de référence.

Deux bains vaccinaux d'une heure à quinze jours d'intervalle, puis une anesthésie, une pêche à l'épuisette et une injection de Vibrio harveyi dans l'abdomen : 300 jeunes bars de deux grammes vont être utilisés ainsi, tous tués à l'issue pour prélever leur rate. Les procédures sont classées au niveau de souffrance sévère. L'objet déclaré est de faire baisser des pertes qui peuvent atteindre 70 % d'un élevage aquacole, en vue d'une future demande d'autorisation de mise sur le marché. Le porteur juge ces nuisances légères puisqu'elles sont réalisées sous anesthésie, avant d'écrire dans le même paragraphe que les bars subiront des effets indésirables d'intensité sévère, nage anormale, isolement, arrêt de l'alimentation, et que certains mourront.

Objectifs

Les pertes économiques dues aux pathogènes en élevage aquacole s’élèvent à plusieurs milliards de dollars chaque année. Parmi les maladies qui impactent l’aquaculture, la vibriose, causée par une bactérie, est considérée comme l’une des plus importantes, engendrant des pertes pouvant aller jusqu’à 70% d’un élevage. Cette maladie est fortement influencée par les conditions environnementales (hausse des température notamment) ainsi que par la gestion des élevages (densités d’élevage, stress). Actuellement, les moyens de lutte classiquement utilisées sont de 2 types : les antibiotiques, dont les usages sont problématiques et dont l’efficacité tend à diminuer, et la vaccination, qui vise à stimuler les moyens de défenses de l’hôte. Jusqu’à présent, peu de vaccins commerciaux sont disponibles en aquaculture. C’est dans ce contexte que nous souhaitons continuer le développement d’un nouveau type de vaccin, composé du microorganisme inactivé et formulé en solution avec des particules microscopiques, capables de transporter plus de 2000 antigènes, s’administrent par les muqueuses, ne nécessitent pas d'ajout d'autres composés, sont totalement éliminables par l’organisme, sans impact sur l’environnement et leur coût de production est faible. Cette technologie est déjà utilisée chez les primates, et le chien. Notre objectif est de développer ces vaccins sur le bar commun, une espèce marine de milieu tempéré pour laquelle la vibriose génère des pertes importantes. Les objectifs de ce projet sont d’étudier l’efficacité d’un vaccin à nanoparticules sur la vibriose du bar, et d’identifier le type de nanoparticules qui confère la meilleure protection contre l’infection.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est qu’au moins 1 des 4 vaccins testés permette d’améliorer la survie des juvéniles de bars infectés par la souche de Vibrio étudiée. Dans le cas de résultats prometteurs, l’objectif serait de développer un vaccin de ce type, utilisable par balnéation à un coût réduit, et conférant au bar une protection contre plusieurs souches de Vibrio, afin qu’il puisse être généralisé en élevage. Ce bénéfice serait à moyen terme, puisqu’elle permettrait d’obtenir des résultats positifs visant in fine à faire une demande d’autorisation de mise sur le marché d’un vaccin.

Procédures

Les bars seront soumis à deux vaccinations par balnéation, d'une heure chacune à deux semaines d'intervalle, au sein même de leur aquarium. Suite à cela, les poissons seront anesthésiés dans leur aquarium avant d'être pêchés à l'épuisette. A la suite de quoi, une micro-injection d'une dose de bactérie sera réalisée, d'une durée inférieure à la minute.

Impact sur les animaux

Un stress léger d’1 heure pourra intervenir lors des vaccinations (2 par lot, à 14 jours d’intervalle), lié à la baisse du niveau de l’eau. Il n’est pas attendu d’effets indésirables suite à la vaccination. Lors de l’infection bactérienne, les bars seront tout d’abord anesthésiés avant d’être pêchés, puis soumis à une injection intra-péritonéale de bactéries. Ces nuisances sont considérées comme légères puisqu’elle sont effectuées sous anesthésie. Suite à l’injection, une douleur pourra survenir dans la zone du point d’injection. De surcroit, lors de cette infection, les bars seront soumis à des effets indésirables d’intensité sévère puisqu’ils pourront induire l’apparition de signes cliniques (nage anormale, isolement, couleur anormale, manque de réactivité, absence d’alimentation) ou une mortalité de certains poissons.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour la réalisation de prélèvements de rate.

Remplacement

Il n’existe pas, à notre connaissance, d’expérimentations déjà décrites dont le but est de montrer l’intérêt de ces vaccins à nanoparticules contre la vibriose du bar. L’objectif de ce projet est de démontrer que cette technologie de vaccin améliore la survie de cette espèce en cas d’infection. Pour ce type d’approche, il n’existe pas aujourd’hui de méthodes alternatives à l’expérimentation animale.

Réduction

Le nombre de 300 individus (5 lots*60 poissons) a été réduit à son minimum tout en permettant, pour chaque modalité testée, d’étudier 60 bars (dans 4 aquariums distincts) tout en assurant des conditions de maintenance optimales (15 bars/aquarium). En effet, le bar européen étant grégaire à ce stade de vie, le nombre d’animaux par aquarium répond à cette contrainte. Ce nombre d’animaux permettra de réaliser une analyse statistique de résistance fiable.

Raffinement

La procédure expérimentale a été conçue pour minimiser les dommages causés aux animaux, ainsi que pour réduire au maximum toutes manipulations de ceux-ci. Tout d’abord, les bars récéptionnés subiront une acclimation progressive d’un degré par jour pour passer de 19°C (température à laquelle ils sont maintenus à l’écloserie) à 24°C (température d’expérimentation). Ensuite, les vaccinations seront effectuées au sein même des aquariums d’élevage, et la pêche précédent les infections sera réalisée sur poissons préalablement anesthésiés au sein même de leurs aquariums. Aussi, pendant toute la durée des anesthésies, des bullages seront mis en place pour assurer une bonne oxygénation de l’eau. Les injections bactériennes seront réalisées sur les poissons préalablements posés sur un linge humide avec les yeux couverts par ce linge, en utilisant une aiguille à usage unique. Des tables de suivi de soins et de bien-être des animaux ont été mises en place lors de la réalisation des procédures. De plus, les conditions d’hébergement des animaux viseront à être optimales (paramètres de l’eau et alimentation à satiété) et leur environnement sera enrichis pour être adapté à leurs besoins (couvercles sur les bassins, luminosité diminuée, effet de groupe).

Choix des espèces

L’espèce choisie est le bar commun. Le choix de cette espèce a été faite car il s’agit d’une espèce aquacole de premier plan. En effet, il s’agit de la première espèce d’élevage marin en France et de la deuxième en Europe. De plus, l’étude s’intéresse à un vaccin traitant spécifiquement l’infection d’une souche de bactérie du genre Vibrio, vis-à-vis de cette espèce. Les animaux utilisés seront de jeunes bars communs de 2 grammes. Cette taille correspond à celle à laquelle les juvéniles sont vaccinés, en sortie d’écloseries. Ce stade de vie a été également choisi car à cette période, le stress dû au transfert de l’écloserie vers un site de pré-grossissement les rend plus vulnérables à d’éventuelles infections. Enfin, cette taille d’animaux permet de vacciner les poissons par balnéation dans de bonnes conditions, tout en limitant la quantité de vaccin nécessaire.

456 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une tumeur du foie leur est implantée par chirurgie, en quinze à vingt minutes, puis elles reçoivent jusqu'à trois injections de nanoparticules magnétiques et jusqu'à quatre injections destinées à l'imagerie, chaque séance d'hyperthermie exigeant trente minutes d'anesthésie. Le porteur indique que le développement tumoral peut réduire le toilettage, faire perdre du poids et modifier le comportement social, et que l'anesthésie prolongée expose à l'hypothermie et au dessèchement de la cornée. Il conclut que l'animal reste "essentiel" pour évaluer une nouvelle thérapie, après avoir décrit des tests sur cellules hépatiques qui ont déjà servi à caler les concentrations et les protocoles d'hyperthermie.

Objectifs

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est le cancer du foie le plus fréquent représentant la troisième cause de mortalité liée au cancer dans le monde. Les traitements actuels sont lourds avec de nombreux effets secondaires et le pronostic reste sombre pour les CHC avancés. La combinaison de plusieurs stratégies est considérée comme l’approche la plus prometteuse pour le CHC. L’hyperthermie magnétique a récemment été montrée comme pouvant induire la mort des cellules tumorales. Ce procédé à base de petites billes magnétiques (nanoparticules) permet de chauffer une zone tumorale à une température de 40-46°C induisant dans l’organisme un stress thermique pouvant restaurer de nombreux paramètres au niveau des zones tumorales. Cette thérapie est utilisée en clinique comme traitement d’un cancer cérébral et pourrait être transposable au CHC. Notre projet propose d'améliorer la fonctionnalité de ces billes en les couplant avec des molécules ayant des propriétés anti-inflammatoires permettant un traitement plus ciblé. Notre projet vise à tester l’efficacité de cette stratégie sur un modèle murin de CHC et d’établir une procédure préclinique induisant un effet thérapeutique. Cette approche prometteuse permettra d’améliorer la prise en charge du patient en proposant un traitement plus spécifique limitant les effets secondaires.

Bénéfices attendus

Les nanoparticules constituent une approche combinée innovante pour le traitement du CHC. La validation de l’effet anti-tumoral sur le modèle tumoral murin permettrait de considérer cet outil comme une nouvelle approche thérapeutique agissant sur les zones tumorales . Dans cette perspective la combinaison du traitement des nanoparticules avec une thérapie classique pourrait permettre de booster la réponse anti-tumorale et augmenter les chances de rémission des patients.

Procédures

Les animaux seront soumis à une seule procédure chirurgicale pour l’induction du modèle tumoral dans le foie au début de l’expérimentation. Cette procédure durera entre 15-20 minutes par souris. Ils seront soumis en fonction des groupes soit à une injection unique, soit 2 injections ou 3 injections de nanoassemblages. L'injection durera 5-10 secondes par souris. De plus pour le suivi de la croissance tumorale, une injection dans le péritoine sera nécessaire en fonction des groupes sur deux temps , 3 temps ou 4 temps. Cette injection permettra de réaliser une imagerie par la suite. Cette procédure d'injection et d'imagerie durera 12-15 minutes.

Impact sur les animaux

Dans le modèle tumoral du CHC, les animaux peuvent éprouver des effets indésirables avec le développement tumoral tel que la diminution du toilettage, la perte de poids, une modification du comportement social. Lors de l’injection des nanoassemblages, le traitement hyperthermique nécessite une anesthésie de 30 minutes, durant ce temps les animaux pourraient être sensibles à des effets classiques d'une anesthésie longue tels qu'une hypothermie, dessèchement de la cornée et une modification de la fonction respiratoire.

Devenir

Tous les animaux inclus dans les procédures sont euthanasiés pour récupérer le foie, mener des analyses d’histologie, de microscopie, de biologie cellulaire et d’immunologie.

Remplacement

L’animal reste essentiel afin d’évaluer une nouvelle thérapie et son effet anti-tumoral . Néanmoins il est possible de limiter l’utilisation des animaux pour certaines phases d’expérimentation. Les tests sur des cellules utilisés sont des stratégies de remplacement du modèle animal dans nos premières phases de test tout en apportant des informations permettant d’affiner nos conditions d’expérimentations. L’utilisation des cellules hépatiques à la place du modèle animal permet de tester l’internalisation et l’efficacité de l’hyperthermie. L’étude sur des cellules d’hépatocytes normaux ou tumoraux par la suite permet d’affiner les concentrations de nanoassemblages, ainsi que valider les protocoles d’hyperthermie magnétique sur ce modèle avant de passer chez l’animal.

Réduction

La détermination de la taille des groupes ainsi que le choix de l’analyse statistique ont été fait avec EDA (Experimental Design Assistant) afin d'obtenir des effectifs suffisants et statistiquement interprétables . L'effectif global pourrait être amené à diminuer en fonction des informations découlant des différentes phases d’expérimentation. Par exemple dans le cas d’une inefficacité d’un schéma d’injection de nanoassemblages, le groupe prévu pour ce schéma pourrait ne pas être testé au cours de la phase suivante. Dans le cas également de l’observation d'une prise tumorale semblable des lots du groupe contrôle, celui-ci pourrait être réduit dans les tests suivants.

Raffinement

Des enrichissements seront mis dans chaque cage permettant de participer au bien-être des animaux et également une diminution du stress. Si des souris paraissent agressives lors du protocole, une séparation des souris pourraient être nécessaire avec le maintien d’un enrichissement de type dôme pour les souris isolées ou en binôme. Une procédure d’habituation sera mise en place après le temps d’acclimatation des animaux consistant à une manipulation des animaux sans procédure. Par la suite les animaux seront conditionnés afin de limiter le stress lors de la manipulation. Ainsi avant toutes expérimentations, un stimulus sonore (tapotement sur la cage) sera réalisé avant récupération pour les phases d’expérimentation. Les animaux associeront ce stimulus sonore à une manipulation à venir. Notre expérimentation sera basée sur des études antérieures permettant une connaissance du modèle tumoral avec un moindre impact sur le bien-être des souris. De plus le suivi du développement tumoral par mesure de la bioluminescence est un outil supplémentaire permettant une maitrise de la croissance tumorale durant l’expérimentation, et évitant de multiplier les temps de sacrifice. Un système de suivi avec un score sera mis en place. Celui-ci tiendra compte de différents signes cliniques, ainsi que de points limites définis afin d’éviter la détresse et la douleur lors de l’expérimentation.

Choix des espèces

La souris reste un modèle de référence pour la recherche fondamentale. Le modèle tumoral du CHC est modèle pertinent validé et référencé chez les rongeurs. De nombreuses données existent dans la littérature. Le choix de l’espèce et la souche sont basés sur ces données existantes. Les souris utilisées pour ce projet de recherche sont des souris adultes de 8 à 10 semaines, car la croissance hépatique est achevée et le système immunitaire est mature. Le CHC est un cancer avec une prévalence importante chez les hommes mais montre également une constante hausse chez les femmes , ce qui explique notre choix d’utiliser des souris des deux sexes.

Inoculées par une souche de Leptospira qui provoque habituellement la mort par atteinte rénale ou hépatique en cinq jours environ, 74 gerbilles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur décrit les procédures comme trois injections dans l'abdomen et des pesées d'une minute, sans nommer à cet endroit l'infection mortelle qui constitue l'objet même du test. Le test n'est validé que si cinq des six gerbilles du groupe témoin atteignent les points limites, et c'est précisément la baisse de cette mortalité que le projet cherche à corriger pour pouvoir libérer à nouveau des lots de vaccin. Aucune ne sera gardée vivante ni replacée, la biosécurité étant invoquée, et toutes seront tuées à l'issue.

Objectifs

L'objectif est de valider le modèle gerbille infectée par un inoculum de leptospirose, pour permettre la libération de lot vaccinal et l’attestation de leur stabilité. En effet, dans le cadre d'un test d'efficacité vaccinal, un test in vivo avec des animaux infectés par la leptospirose est encore nécessaire. Le vaccin testé étant le seul vaccin humain disponible pour cette bactérie, il est soumis à une certaine contrainte d'approvisionnement et ne peut donc pas prendre de retard dans sa fabrication sous peine de mettre le public à risque en danger (égoutiers et agriculteurs, en premier lieu). Cependant, le contrôle libératoire montre actuellement des limites d’efficacité car la virulence de l’infection dans le groupe contrôle n’atteint pas le niveau attendu, et les lots de vaccins ne peuvent plus être validés. En effet, afin de valider qu’un vaccin fonctionne, deux groupes de 6 animaux sont comparés. Un groupe de test recevant le vaccin et une dose d’inoculum et un groupe témoin ne recevant du véhicule et une dose d’inoculum. Le test est validé si les animaux du groupe témoin montrent une mortalité de 5/6 animaux, suite à l’atteinte de points limites spécifiques définis en amont. Récemment, la mortalité n'est plus suffisante pour valider la virulence de l’inoculum et donc l’efficacité d’un vaccin. Ainsi, il est nécessaire de mener une étude de virulence permettant de comparer différentes conditions (gerbilles de différentes origines ainsi que des inoculum différents) afin de trouver la cause de cette perte de virulence et pouvoir à nouveau réaliser de tests d’efficacités et de stabilité du vaccin.

Bénéfices attendus

Ce projet permet de valider le modèle gerbille inoculée avec de la leptospirose. Ce modèle sera ensuite utilisé pour réaliser des tests de lots ou de stabilité de vaccin.

Procédures

Les animaux recevront 3 injections intrapéritonéal d'1mL a chaque fois. Les animaux seront vigiles, la contention ne dure pas plus d'une minute. Les animaux sont également pesés au cours de l'étude, ils sont transportés dans les mains, ou à l'aide d'un tunnel, dans une boite de pesée avant de retourner dans leur hébergement. La pesée dure environ 1 minute.

Impact sur les animaux

Lors des injections de NaCl ou vaccin, et lors des inoculations, les animaux subiront une contention de courte durée (moins d'une minute) afin de réaliser une injection intrapéritonéale. Les animaux seront inoculés par une souche de Leptospira, qui provoque habituellement la mort de l’animal par atteinte rénale ou hépatique en environ 5 jours. Des euthanasies anticipées seront réalisées pour minimiser les souffrances de l’animal. Les signes cliniques et points limites anticipés varient en fonction de la souche utilisée, et ont été définis lors d’étude de virulence passées, puis confirmés ensuite pendant de très nombreuses études de contrôle libératoire de lots vaccinaux.

Devenir

Le but d'un test de virulence est d'observer la mortalité et la morbidité des animaux. Aussi, pour des raisons de biosécurité, les animaux infectés par la leptospirose ne pourront pas être réutilisé où replacer. Ils devront être euthanasiés en fin de procédure. Une première étude sera réalisée avec 37 animaux afin de tester plusieurs conditions expérimentales. Si cette première étude est un succès et qu'aucun nouveaux raffinements n'est nécessaire, les 37 autres animaux prévus à ce projet ne seront pas commandés à notre fournisseur et ne seront donc pas utilisés.

Remplacement

Afin de valider les tests in vivo décrit dans l'Autorisation de Mise sur le Marché (AMM) du vaccin contre la leptospirose, nous devons valider le modèle gerbille qui sera utilisé pour ces même tests. Nous ne pouvons donc pas encore remplacer l’animal sur ce projet

Réduction

Un contrôle libératoire classique de lot vaccinal nécessite 15 gerbilles (2 groupes de 6 et 3 surnuméraires), et un test de virulence croisant deux paramètres en nécessite 29 (4 groupes de 6 et 5 surnuméraires). Le fait de grouper un contrôle libératoire et un test de virulence permet de n’utiliser que 37 gerbilles au lieu des 44 gerbilles (15+29) utilisées si ces études avait été conduites séparément. Le nombre d’animaux surnuméraire est maintenu au minimum et basé sur notre expérience du modèle gerbille, et de la conflictualité parfois observée dans ces groupes d’animaux.

Raffinement

Des analyses des causes 5M (Analyse de recherche de causes selon 5 points : la Main d’œuvre, le Matériel, le Milieu, la Méthode, et les Mesures ) ont été réalisées en amont de ces études afin de construire des groupes expérimentaux minimisant au maximum les biais et permettant de tester le plus de conditions possibles en parallèles. Les animaux seront hébergés en groupe dans une cage avec litière. Du matériel de nidification et du matériel à ronger sera mis à leur disposition quotidiennement. Des signes cliniques prédictifs et des points limites précoces attendus, spécifique à chaque souche de leptospirose utilisés, sont mis en place afin de réduire la souffrance animale le plus tôt possible. Ces points limites sont basés sur une longue expérience avec le modèle et leur prédictivité a été confirmée lors d’études de virulences. Les animaux seront anesthésiés (kétamine) avant toute euthanasie (pour atteinte des points limites ou en fin d'étude)

Choix des espèces

La gerbille est une des espèces rongeuses sensible à la bactérie Leptospirosa au point de reproduire les signes cliniques aboutissant à la mort comme cela est parfois observé chez l’homme. De plus, le vaccin contre cette bactérie est immunogène dans cette espèce. Les animaux utilisés seront âgés de minimum entre 8 et 12 semaines lors de leurs arrivés en animalerie. Ce seront donc des animaux adultes. Cet âge est décrit dans l'AMM.

Infectées par aérosol de Mycobacterium avium après une heure trente passée dans un nébuliseur, 117 souris par molécule évaluée reçoivent ensuite un antibiotique par voie orale cinq jours sur sept, pendant un, deux ou trois mois. Au total 660 souris vont être utilisées pour cinq molécules, toutes tuées à l'issue pour prélèvements et analyses, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont hébergées jusqu'à quatre mois après l'infection, quinze d'entre elles servant d'abord à éprouver la tolérance d'une molécule jamais administrée, sous surveillance rapprochée les premières heures. Le porteur écrit qu'aucune douleur n'est attendue et qu'il n'y a ni perte de poids ni perte de mobilité après infection, alors que la procédure est classée sévère et que les points limites sont recherchés chaque jour.

Objectifs

Les infections à M. avium (MAC) ont une prise en charge complexe, basée actuellement sur une association d’au moins trois antibiotiques pour une durée de 12 mois à 24 mois, avec un taux de succès limité (52 à 70% selon les séries). Ces infections surviennent chez des patients ayant des maladies respiratoires chroniques. Pour améliorer la prise en charge de ces patients, de nouveaux traitements sont nécessaires. Une fois synthétisées, il faut évaluer l'efficacité de ces nouvelles molécules. l'objectif de ce travail est d'évaluer l'efficacité et la sécurité de ces molécules.

Bénéfices attendus

Ce projet est une étape importante de sélection d'une molécule efficace et sure pour le traitement des infections à M. avium avant d'envisager une éventuelle évaluation chez l'homme.

Procédures

Il y aura 2 parties, qui seront réalisées pour chacune des molécules évaluées. Dans la première, au maximum 15 souris auront une administration par voie orale de la molécule de 5 à 10 secondes une fois puis seront surveillées. Dans la partie 2, chacune des 117 souris subira une infection unique par voie aérienne (geste non invasif, durée 30 minutes de l'aérosol, avec une durée totale dans le nébuliseur de 1h30) de mycobactéries. 90 souris sur les 117 infectées auront une administration par voie orale d'antibiotiques de 5 à 10 secondes par jour (5 jours sur 7) pendant 1 mois pour 30 d’entre elles (6 de chaque groupe de traitement), pendant 2 mois pour 30 d'entre elles (6 de chaque groupe de traitement), et pendant 3 mois pour les 30 dernières (6 de chaque groupe de traitement). Les animaux seront hébergés jusque 4 mois après l'infection. Au total, pour 5 molécules, 660 souris au maximum seront utilisées dans ce projet. Les animaux seront euthanasiés selon une méthode humaine et réglementaire

Impact sur les animaux

Pour la première partie, les souris seront surveillées de manière rapprochée, en particulier dans les premières heures suivant l’administration, car comme il s’agit d’une nouvelle molécule, elle peut, peut-être, être responsable de signes de souffrance (douleur, stress physique, peur...). Pour la deuxième partie, la nébulisation de mycobactérie pourra induire un stress le temps de l’aérosol (durée totale de 1h30 de cette partie de la procédure). Aucune douleur n’est attendue. Sur l’ensemble des données disponibles sur le modèle murin d’infection à mycobactéries non tuberculeuses, il n’y a pas de perte de poids ou de mobilité après infection. Par précaution, les souris seront pesées de manière bihebdomadaire au minimum. L'administration orale contrôlée peut être inconfortable, surtout les premiers jours et générer de la peur, surtout les premiers jours; le geste dure moins de 30 secondes.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour réaliser des prélèvements et analyses

Remplacement

Le remplacement du modèle animal par un autre modèle n'est pas possible du fait que l'infection à myobactérie touche différents organes et différents types de cellules. Des premiers travauxont été faits sur cellule, mais néanmoins pour évaluer complètement ce nouvel antibiotique il faut ensuite vérifier son efficacité sur les différents organes, ce qui ne peut être reproduit in vitro.

Réduction

Ce modèle permet de mieux mimer l’infection telle qu’elle est chez l’homme et elle a l’avantage de produire une infection homogène au sein des souris, permettant ainsi de limiter le nombre de souris par groupe pour obtenir des résultats scientifiquement solides. Le nombre de souris a donc été réduit au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l'analyse statistique

Raffinement

Les souris seront dans des hébergements en groupe (5 par cage). Il sera utilisé un enrichissement dans les cages avec cachettes et matériel de nidification pour permettre le jeu des souris. La litière est une litière de rafle de mais. Le projet commencera au minimum 15 jours après leur arrivée dans l’animalerie pour permettre aux souris de s’habituer aux nouveaux locaux. Le nombre d'expérimentateur sera limité pour habituer les souris. Les souris seront surveillées tous les jours sur différents aspect (poids, comportement, allure) pour vérifier leur bien être. Des points limites ont été définies et sont rechercher de manière systématique quotidiennement. En cas d'atteinte de point limite, sera réalisée une euthanasie selon une méthode humaine et réglementaire. Le geste est réalisé par du personnel formé et sera immédiat et sans douleur pour l’animal

Choix des espèces

Les souris possédent un système respiratoire proche de l'homme. Elles entreront dans l'étude au stade de jeunes adultes, soit 8 à 12 semaines (infection à mycobactéries principalement chez les adultes chez l'homme)

Une injection de carragénine dans le coussinet plantaire de la patte arrière droite provoque un œdème inflammatoire, puis la patte est pressée à intensité croissante pour mesurer le seuil de douleur, à deux, quatre et six heures. 81 cobayes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. La douleur ne sera pas soulagée pendant les sept heures qui séparent l'induction de l'œdème de la mise à mort, le porteur indiquant que les difficultés de locomotion attendues conduisent à poser de l'hydrogel au sol pour les animaux qui n'atteignent plus les biberons. Les "candidats médicaments" anti-inflammatoires et analgésiques évalués ne sont pas nommés, et le porteur précise que le modèle cobaye a été retenu par le client de l'étude.

Objectifs

Le marché pharmaceutique évolue sans cesse dans le but de proposer des composés anti-inflammatoires et analgésiques toujours plus efficaces, plus rapides et plus sûr. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer les propriétés anti-inflammatoires et anti-douleurs de nouveaux composés pharmaceutiques, administré en dose unique, dans le traitement de l’œdème podal chez le cobaye, induite par injection de carragénine dans le coussinet plantaire. L’efficacité des différents composés sera évaluée au travers de deux tests simples : l’un portant sur la mesure du volume de la patte des cobayes avant et après induction d’un œdème inflammatoire et l’autre sur des mesures de seuil de la douleur à une pression croissante exercée sur la patte du cobaye.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer l’efficacité de nouveaux composés contribuant ainsi au développement de nouveaux médicaments analgésiques et anti-inflammatoires dans le but de proposer des molécules plus performantes que celles actuellement disponibles sur le marché.

Procédures

Les animaux seront soumis à une unique administration par voie orale ou intrapéritonéale des produits tests en respectant les volumes d’injections recommandés. Ces injections seront réalisées en maximum 3 minutes. Un œdème au niveau de la patte arrière droite des animaux sera provoqué par l’injection de carragénine, un polysaccharide sulfaté, connu pour induire rapidement un œdème inflammatoire au site d’injection. Une seule patte sera injectée pour limiter l’impact sur le comportement physiologique de l’animal (prise alimentaire, abreuvement, mobilité etc..). Cette injection sous-cutanée dans le coussinet plantaire sera réalisée sur des animaux anesthésiés par voie gazeuse et durera maximum 10 minutes (anesthésie comprise). Une évaluation du volume de la patte ainsi que du seuil de la douleur sera réalisée en amont de l’induction de l’oedème podal puis à 3, 5 et 7 heures et à 2, 4 et 6 heures post-induction respectivement. Chaque mesure durera entre 2 et 10 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux seront manipulés régulièrement pour les différentes actes, nécessitant des contentions assez contraignante, ce qui est susceptible d’induire un stress (administration des produits, évaluation de l'intensité de la douleur et mesure du volume podal). Les contentions seront rapides (inférieure à 3 minutes). Les animaux ressentiront une douleur et/ou une gêne liée à l’inflammation de la patte arrière droite qui ne pourra être soulagée au maximum pendant 7h soit de l’induction de l’œdème podal jusqu’à l’euthanasie de l’animal. Cette douleur pourrait engendrait des difficultés de locomotion des animaux (évitement de contact de la patte arrière droite avec le sol).

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin d'étude afin de réaliser des prélèvements de la patte arrière droite permettant la réalisation d'analyses histologiques des marqueurs de l’inflammation ou des dosages des PGE2 et TNFa (dans l'étdue principale). De plus, la procédure expérimentale étant classée sévère, la réutilisation des animaux de l'étude pilote et de l'étude principale ne sera pas permise.

Remplacement

A l’heure actuelle, il n’existe malheureusement pas d’alternative expérimentale modélisant le comportement d’un organisme entier vivant de manière fiable permettant l’évaluation des effets anti-inflammatoires et analgésiques de candidats médicaments. Le recours à l’expérimentation animale est donc nécessaire pour répondre aux objectifs de ce projet et aux exigences réglementaires.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux, une étude pilote sera réalisée sur 9 animaux dans un premier temps afin de déterminer la dose de tramadol à utiliser pour en faire un produit de référence dans l’étude principale. Dans l’étude principale, pour obtenir des résultats statistiquement exploitables permettant d’étudier l’efficacité d’un nouveau composé anti-inflammatoire et analgésique au cours du temps, des groupes de minimum 8 cobayes seront constitués.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 7 jours minimum sera respectée pour les cobayes. Ils seront hébergés en groupes sociaux en parcs ou en cages (hors isolement des animaux pour agressivité ou blessure qui pourra être jugé nécessaire par le vétérinaire) avec les enrichissements appropriés (bâtonnets de bois, galets de foin ainsi qu’une plateforme et une cachette). Ils seront observés quotidiennement pour déceler précocement tout signe clinique anormal et mettre en place, en accord avec le médecin vétérinaire, des mesures de prise en charge aussi rapidement que possible (mesure de soutien de type désinfection de plaies, hydratation, isolement etc. n’interférant pas avec les candidats médicaments administrés et n’impactant pas les résultats de l’étude en cours ou bien une mise à mort de l’animal en cas d’état de santé considérablement dégradé, irréversible et ne pouvant être amélioré par un traitement sans interférer avec l’objectif de l’étude). Les études ne durant que 24-48h, il n’y aura pas de suivi de poids particulier pendant l’étude. Si les animaux sont hébergés dans l’animalerie pendant plus d’une semaine, des pesées seront réalisées de façon régulière (minimum une fois par semaine) pour s’assurer de l’évolution et la croissance des cobayes. Suite à l’induction de l’inflammation, si des cobayes présentent des difficultés de locomotion et donc des difficultés à atteindre les biberons d’eau, de l’hydrogel sera placé au sol. Les animaux seront observés de façon approfondi à l‘aide d’une grille de scoring portant sur l’état général des animaux, la mobilité générale et l’aspect du site d’induction de l’inflammation toutes les heures à partir de l’administration de carragénine jusqu’à leur euthanasie. Afin de faciliter et rendre la mesure de l’intensité de la douleur plus robuste, les animaux pourront être habitués à la contention nécessaire à ce test. Pour cela, les animaux seront manipulés dans les jours précédents le test et une contention identique à celle nécessaire pour le test sera réalisée afin que l’animal s’habitue à celle-ci.

Choix des espèces

Le cobaye a été choisi pour ce projet car cette espèce fait partie des 2 espèces (avec le rat) les plus utilisés pour ce type d’étude d’induction d’œdème podal et de test de mesure du volume podal et de l'intensité de la douleur (Sabine S Maez et al. 2012 ; Warda M. Abdu Kaidama et al. 2021). Le modèle cobaye a été choisi par le client de cette étude en raison des données précédemment obtenues. Les animaux seront réceptionnés à un poids entre 300 et 350g pour être utilisés dans l'étude (environ 1 semaine après la réception) à un poids de 350 à 400g. Ce poids est classiquement utilisé dans la littérature pour ce modèle, il correspond à un âge d'environ 3-4 semaines. Des mâles seront utilisés dans l'étude pilote car ce sexe est classiquement utilisé dans la littérature pour ce modèle (Sabine S Maez et al. 2012 ; Warda M. Abdu Kaidama et al. 2021). Dans l'étude principale, des mâles et des femelles seront utilisés.

Nerf sciatique exposé et ligaturé sous anesthésie, puis semaines de tests de sensibilité mécanique et thermique, puis splash test, labyrinthe en croix surélevé et enfin test de nage forcée la veille de la mise à mort : 3 168 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. 2 112 d'entre elles subissent la chirurgie, les 1 056 autres une injection dans le coussinet plantaire. La douleur chronique ainsi installée ne sera compensée par aucun antalgique ni anti-inflammatoire, le porteur indiquant que le sujet même de l'étude l'interdit, et certains groupes seront maintenus deux mois pour observer l'anxiété qui accompagne la douleur. Toutes sont tuées dès la fin de leur procédure, leurs tissus alimentant une banque destinée à des analyses ultérieures.

Objectifs

La perception de la douleur, ou nociception, est une expérience multidimensionnelle qui affecte les capacités sensorielles, émotionnelles, motivationnelles et les fonctions cognitives. L’ATP est une molécule de signalisation présente dans le système nerveux central (SNC) qui module l’activité nerveuse via l'activation de protéines particulières (appelées récepteurs P2X4) exprimées dans les neurones mais aussi des cellules avoisinantes soutenant le fonctionnement des neurones, les cellules gliales. Les récepteurs P2X4 est impliqués dans des pathologies du système nerveux central comme les douleurs chroniques et les maladies neurodégénératives durant lesquelles son expression est augmentée. En revanche, l’effet distinct sur les 2 types cellulaires du SNC (neurones et cellules gliales) n’est pas connu et est le sujet principal de notre étude. De même il a été précédemment démontré chez l’humain que le développement de douleurs chroniques est associé avec l’apparition de symptômes d’anxiété et de dépression. Le but de notre projet est de déterminer le rôle respectif des récepteurs P2X4 neuronaux et de ceux présents dans les cellules gliales dans les douleurs chroniques mais aussi leur implication dans le développement de l’anxiété chez les souris des deux sexes, en combinant des approches cellulaires, électrophysiologiques et comportementales.

Bénéfices attendus

Ces travaux permettront de mieux comprendre la fonction de la signalisation médiée par l’ATP dans les neurones et les celules gliales dans la moelle épinière et le cerveau dans le développement et le maintien des douleurs chroniques et de l’anxiété associée. Ce projet pourrait déboucher sur l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques afin de mieux lutter contre les douleurs chroniques. Ce projet est financé par l’ANR.

Procédures

L’ensemble de ces 3168 animaux effectueront des tests comportementaux évaluant leurs sensibilités mécaniques et thermiques d’environ 10 à 30 minutes chacun sur une période d’une semaine. Parmi ces 3168 animaux : 1) 2112 animaux seront soumis à 1 chirurgie d’exposition du nerf sciatique avec ligature pour la moitié d’entre eux et sans ligature pour le reste des animaux d’une durée de 10 à 30 minutes sous anesthésie générale précédée de 2 injections sous-cutanées d’antalgique général et local de 10 à 30 secondes chacune. Sur ces 2112 animaux, 1056 animaux (528 animaux groupe SHAM et 528 animaux groupe SNI) participeront à ces tests comportementaux aléatoirement sur 2 périodes d’une semaine parmi 3 possibles : J14+J30 ; J14+J60 ou J30+J60 pour effectuer un suivi au cours du temps tout en limitant le stress induit par ces tests. Ces mêmes animaux effectueront également des tests pour évaluer leur anxiété et dépression lié à la chronicité de la douleur. Ces tests ne seront effectués aléatoirement sur 2 des 3 périodes par ordre croissant d'impact sur l’anxiété et la dépression de l’animal soit dans l’ordre : le splash test, puis le labyrinthe en croix surélevé et enfin le test de nage forcée. Ces trois tests durent chacun 5 minutes (avec 15 min d'adaptation pour le labyrinthe) et seront séparer d’une journée minimum chacun afin de ne pas cumuler l’anxiété lié à ces tests. Le test de nage forcée ne sera effectué qu’une fois en fin de procédure le jour précédant la mise à mort étant très impactant pour l’animal 2) 1056 animaux seront soumis à une injection intra-plantaire dans la patte arrière d’une durée de 30 secondes. »

Impact sur les animaux

Les effets attendus sur les animaux sont une augmentation des seuils de douleur mécanique et thermique provoquée par nos modèles de douleusr chroniques. Cette augmentation ne pourra pas être compensée par une prise d’antalgique ou d’anti-inflammatoire étant donné le sujet de notre étude. Nous limiterons donc au maximum la durée de maintien de ces animaux avec le plus d’enrichissement possible afin de limiter les souffrances. Nous maintiendrons certains groupes 2 mois afin de pouvoir voir l’impact à long terme sur les comorbidités associées à la douleur telle que l’anxiété des animaux.

Devenir

Les animaux seront utilisés dans le cadre de la compréhension des mécanismes mis en jeu dans les douleurs chroniques, à ce titre les animaux subissent des procédures classées sévères. C’est pourquoi ces animaux seront mis à mort dès la fin de la procédure à laquelle ils seront rattachés afin de ne pas engendrer de stress et de souffrance au-delà de la période nécessaire à l’étude. C’est également dans cet optique de bien-être animal que la mise à mort peut intervenir en cas d’atteinte des points limites décrits précédemment. De plus la mise à mort des animaux permettra le prélèvement de tissus pour intégrées une banque de tissus permettant d’effectuer des études anatomiques, immunohistologiques et biomoléculaires dans des conditions physio-pathologiques.

Remplacement

Il n’existe actuellement pas de méthode alternative permettant de remplacer l’utilisation de souris car ce projet repose sur la modification de l’expression de récepteurs dans des types cellulaires précis tout en étudiant les évolutions comportementales et fonctionnelles in vivo des circuits du système nerveux. L’étude de la douleur demandant l’étude à la fois de la composante sensoriellle (=nociception) et de la composante émotionnelle le recours au modèle animal est indispensable car ce projet demande une évaluation comportementale et aucun modèle in vitro (cellules ou tissus) ne peut reproduire les conditions des pathologies.

Réduction

L’ensemble de ce projet nécessite l’utlisation de 3168 souris mâles et femelles, réparties en 12 lignées transgéniques différentes dont l’étude sera répartie sur les 5 années du projet. Afin de limiter le nombre d’animaux, chaque animal porteur d’un génotype d’intérêt sera utilisé pour les études comportementales et/ou électrophysiologiques mais aussi pour de nombreuses approches in vitro à partir de prélèvements effectués post-mortem. Cela nous permettra de réduire au maximum le nombre de souris utilisées tout en conservant une significativité scientifique statistique (hétérogénéité interindividuelle). Ainsi, le nombre de souris utilisées dans chacun des groupes expérimentaux sera compris entre 10 et 12 animaux. Nous savons sur la base de nos travaux antérieurs sur la douleur que des groupes de 10 animaux sont suffisants pour assurer une bonne puissance statistique aussi bien pour les approches comportementales qu’histologiques mais qu’un minimum de 12 animaux sont nécessaires pour les approches électrophysiologiques in vivo et obtenir un nombre suffisant de neurones enregistrés. L’analyse de la normalité des données sera réalisée afin de choisir les tests. Les données seront analysées par analyse de variance suivie, si elle est significative, par un test post-hoc de comparaison entre groupes.

Raffinement

A chaque étape du projet, le bienêtre de nos animaux sera au cœur de nos préoccupations. Nos animaux naitront dans notre animalerie de haut statut sanitaire, hébergés en cages collectives sur racks ventiles, garnies de litières leur permettant de reproduire un comportement naturel de fouissage et d’un enrichissement constitué d'un nid végétal et de tubes de cartons, pour leur permettre de construire des nids, de jouer, ronger. Leur soin est confié à des personnels qualifiés et experts. Ils surveillent quotidiennement l’ensemble des animaux et de façon plus poussée et spécifique pendant les phases de récupération qui suit les procédures invasives (chirurgie). Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptes aux procédures de chirurgie. L’expérimenter a une forte expérience pour toutes les procédures proposes. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, une nourriture adaptée.

Choix des espèces

La souris est le seul modèle pour lequel on dispose de nombreux modèles permettant de modifier le fonctionnement de gênes précis permettant des modifications spécifiques d’un type de cellule, d’une protéine, d’une région particulière de l’animal permettant d’analyser les mécanismes cellulaires jusqu’aux comportements complexes. Cela permet de créer des modèles de souris uniques permettant de répondre précisément aux questions posées. Cette grande adaptabilité n’existe que chez la souris. Le système de reproduction des souris permet d'avoir régulièrement des animaux dans un espace relativement réduit. Nous utiliserons ce modèle à l’âge adulte de 8 jusqu’à 26 semaines pour évaluer l’impact des douleurs chroniques sur un système bien développé et permettant un suivi au cours du temps