Procédures sévères

Une pompe implantée sous la peau, puis rechargée quatorze fois : 96 souris vont être utilisées, toutes tuées et leur cerveau prélevé, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent du lactate en continu, passent deux séances d'imagerie par résonance magnétique sous anesthésie gazeuse, subissent une perfusion d'une heure de substrats marqués au carbone 13, et passent des tests d'anxiété et de dépression ainsi qu'un test de restriction alimentaire dont le porteur admet qu'il peut induire une anxiété. L'objectif déclaré est de compenser le déficit énergétique du cerveau vieillissant ou atteint de la maladie d'Alzheimer. Les deux souches transgéniques retenues sont suivies de 4 à 18 mois, choisies parce qu'elles sont déjà "très étudiées dans la littérature", ce qui permet selon le porteur de limiter le nombre d'animaux témoins.

Objectifs

Le cerveau est l'organe le plus énergivore du corps. Le vieillissement et de manière exacerbée, la maladie d'Alzheimer se caractérisent par une diminution du métabolisme énergétique cérébral. Une moindre utilisation cérébrale du glucose a été démontrée chez les patients atteints de la maladie d'Alzheimer par rapport aux sujets sains. De plus en plus de preuves indiquent qu'un métabolisme anormal du glucose dans le cerveau est un événement précoce détectable bien avant les défaillances cognitives caractéristiques de la maladie d'Alzheimer. Ce déficit énergétique implique de multiples cellules cérébrales : neurones, astrocytes et microglie et impacte leurs interactions, en particulier la navette lactate astrocyte-neurone (Astrocyte-neuron lactate shuttle). Une diminution du transporteur de glucose endothélial et astrocytaire a été rapportée ainsi qu'une diminution de l'expression des enzymes permettant la conversion entre lactate et pyruvate. Ce dysfonctionnement de l'ANLS a été montré, au moins en partie, responsable du déficit énergétique propre à la maladie d'Alzheimer. De plus, il a été mis en évidence que le vieillissement réduit l'expression du transporteur neuronal spécifique du glucose, diminuant l'entrée du glucose dans les neurones. La diminution des acteurs clefs de l'ANLS, carrefour métabolique du cerveau, semble être une caractéristique précoce et majeure de la maladie d'Alzheimer ; le glucose, substrat cérébral principal, ne pouvant plus être métabolisé. L'objectif de ce projet est de stimuler l’ANLS, par administration de lactate dans le but de contrecarrer le déficit énergétique cérébral et limiter ou retarder ainsi les déficits fonctionnels associés au vieillissement et a fortiori à la maladie d’Alzheimer.

Bénéfices attendus

Le vieillissement et de manière plus exacerbée, la maladie d'Alzheimer sont caractérisés par un déficit énergétique cérébral induit par une diminution de la capacité cérébrale à métaboliser le glucose. Nous proposons dans ce projet une stratégie de substitution énergétique en administrant du lactate. Les bénéfices attendus sont un maintien de l'équilibre énergétique cérébral couplé à un maintien des fonctions cérébrales ou un retard dans leurs altérations.

Procédures

- Procédure chirurgicale (implantation de pompes osmotiques + recharges). 1 fois + 14 fois / 15 min. -Examens par résonance magnétique nucléaire sous anesthésie gazeuse ; technique non-invasive pour les animaux (durée : 2 fois ; 30 - 45 min). -Tests de comportements cognitivo-sensori-moteurs, test de l'anxiété et test de dépression (1 fois chaque test, 10 min par test) - Perfusion de substrats marqués au carbone 13 pour permettre la mesure des échanges métaboliques. 1 fois / 1 heure. - Prélèvement du cerveau sur animaux préalablement mis à mort.

Impact sur les animaux

- L'implantation des pompes osmotiques nécessaires à l'administration de lactate nécessite une chirurgie. Chez l'animal anesthésié, des modifications du rythme respiratoire, mises en évidence grâce au monitoring pourraient survenir. Cette nuisance entraînera l'arrêt de l'expérimentation. - L’imagerie par résonance magnétique nucléaire est une technique non invasive, cependant, durant l’examen d'IRM, un changement important du rythme cardiaque et/ou respiratoire, mesurés grâce à un capteur placé entre l'animal et le lit IRM, peut subvenir, du fait de la variabilité entre les animaux de sensibilité aux anesthésiques. Cette nuisance entrainera l'arrêt de l'expérimentation. - Les tests de comportement, notamment le test de restriction alimentaire, pourraient induire une anxiété chez les animaux.

Devenir

Le cerveau des animaux doit être prélevé pour décrypter les mécanismes moléculaires mis en jeu.

Remplacement

Le but final de notre projet de recherche a une envergure translationnelle et nécessite donc une approche intégrative. De ce fait, notre projet nécessitant le fonctionnement du cerveau dans son intégrité afin de tester l'effet neuroprotecteur d'une modulation du métabolisme énergétique cérébral par administration de lactate et de pouvoir envisager une application rapide chez l’Homme, il n'existe pas de remplacement disponible à nos modèles expérimentaux (maladie d'Alzheimer).

Réduction

Une réduction du nombre d’animaux est rendue possible par le fait que l’imagerie par résonance magnétique nucléaire est une technique d’investigation non-invasive et permet donc un suivi longitudinal des animaux ainsi que la réalisation de tests comportementaux, sur les mêmes animaux. Les effectifs ont été déterminés grâce à un calculateur de taille d'échantillons ainsi que par notre expérience acquise lors d’études précédentes. Les différences intergroupes seront mises en évidence par des tests statistiques.

Raffinement

L'Imagerie par résonance magnétique est une technique non invasive, cependant, l’utilisation d’anesthésique peut entraîner des nuisances et des effets indésirables pour les animaux. Afin de limiter les nuisances éventuelles au bien-être des animaux, durant les expérimentations d’imagerie, du gel oculaire sera appliqué afin d'éviter toute sècheresse oculaire et la température corporelle de l'animal sera maintenue grâce à un lit chauffant. Une variation importante du rythme cardiaque et/ou respiratoire, mesurés par un capteur positionné entre le rat et le lit de l'imageur, au cours de l'expérience sera retenu comme point limite. La récupération post-imagerie sera réalisée sous lampe chauffante jusqu’au réveil complet des animaux. Une réhydratation systématique avec sérum physiologique en sous-cutané sera aussi réalisée. Après leur retour en cage collective, les animaux seront observés de façon journalière par le zootechnicien et ou la personne en charge de l'expérimentation. Lors de ces observations, la capacité de l’animal à s’alimenter, le comportement et sa vivacité et l’état du pelage seront vérifiés. Un échange quotidien entre le zootechnicien et l’expérimentateur permettra une intervention et une prise de décision rapide en cas de souffrance constatée. Enfin, afin de garantir le bien-être animal, les animaux seront hébergés en cage collective comprenant une litière, des frisures en papier craft ou lanière de peuplier des bâtonnets de bois à ronger, un tube cartonné pour pouvoir se cacher. Le nombre réduit de manipulateurs (1 seul zootechnicien et 1 unique expérimentateur) participera à réduire le stress des animaux.

Choix des espèces

Les souris utilisées dans ce projet sont deux souches très étudiées dans la littérature, leur utilisation permettra de minimiser le nombre d'animaux contrôles. Les souris partagent de nombreuses similitudes biologiques et génétiques avec les humains, ce qui permet d'observer des mécanismes pathologiques similaires à ceux de la maladie d'Alzheimer chez l'homme. Les modèles de souris transgéniques peuvent être génétiquement modifiés pour développer des caractéristiques de la maladie d'Alzheimer, ce qui permet d'explorer des hypothèses sur la neuroprotection. Il est possible de suivre des souris sur des périodes prolongées pour observer l'évolution de la maladie et l'impact de l'intervention neuroprotectrice. Les modèles murins permettent d'évaluer les fonctions cognitives et comportementales, fournissant des données sur l'efficacité du traitement neuroprotecteur. Le projet porte sur la neuroprotection dans le cadre du vieillissement cérébral sain ou pathologique (maladie d'Alzheimer). Les animaux seront donc utilisés de 4 mois à 18 mois.

Jusqu'à dix-neuf prélèvements de sang par incision de la queue et dix-huit gavages ou injections hebdomadaires par animal : 4 800 souris diabétiques vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le protocole compare cinq variantes d'une protéine, à cinq doses et par quatre voies d'administration, pour identifier la combinaison la plus efficace contre le diabète de type 1. Le porteur énumère lui-même les risques de perforation de l'œsophage, de perforation d'organes internes, d'œdèmes, d'hématomes et de lésions veineuses liés à ces gestes répétés, tout en décrivant le modèle comme présentant une hyperglycémie modérée. Toutes les souris sont tuées pour des analyses post-mortem.

Objectifs

Notre recherche porte sur le diabète de type 1 (DT1), une maladie caractérisée par la destruction des cellules pancréatiques responsables de la production d'insuline. Cette destruction entraîne des hyperglycémies chroniques, pouvant entraîner de graves complications vasculaires. Nous avons identifié une protéine capable de régénérer ces cellules et avons développé cinq variantes de cette protéine, que nous avons testées sur des souris diabétiques. Nos résultats préliminaires indiquent que ces nouvelles protéines stimulent la prolifération des cellules productrices d'insuline, ce qui pourrait en faire des traitements prometteurs pour le DT1. Pour développer un traitement antidiabétique, nous souhaitons évaluer l’efficacité de chacune de ces protéines. L’objectif est de déterminer laquelle d’entre elles est la plus efficace, ainsi que la dose optimale et la méthode d’administration la plus adaptée. Nous testerons donc cinq concentrations différentes avec quatre méthodes d'administration (intrapéritonéale, sous-cutanée, intraveineuse et orale) sur un modèle de souris diabétiques, afin d'évaluer leur efficacité dans le contexte du DT1. Notre approche sera séquentielle et hiérarchisée : si l'une des protéines candidates montre de bons résultats avec une méthode et une dose spécifiques, nous pourrons écarter les autres options, réduisant ainsi le nombre de souris nécessaires.

Bénéfices attendus

Les résultats de cette étude seront déterminants pour identifier la dose optimale et la voie d'administration offrant la meilleure efficacité antidiabétique de nos analogues. En les combinant avec les autres études en cours, notamment les études pharmacocinétiques, nous maximiserons les chances de succès dans le développement d'une thérapie pour le diabète de type 1.

Procédures

En plus de la mesure de la glycémie en début de procédure, plusieurs prélèvements sanguins seront effectués sur chaque animal, selon leur groupe : trois prélèvements seront réalisés par ponction de la veine caudale (après incision de la queue) pour le groupe traité pendant 3 semaines (soit 4 prélèvements au total, incluant le prélèvement initial; durée de l'intervention : 30 secondes); dix prélèvements seront réalisés pour le groupe traité pendant 10 semaines (soit 11 prélèvements au total; durée de l'intervention : 30 secondes); dix-huit prélèvements seront réalisés pour le groupe traité pendant 18 semaines (soit 19 prélèvements au total; durée de l'intervention : 30 secondes). En fonction des groupes, chaque animal recevra soit une injection, soit une administration orale par gavage du composé, effectuée de manière hebdomadaire : trois injections ou administrations orales pour le groupe traité pendant 3 semaines (durée de l'intervention : entre 30 secondes et 1 minute); dix injections ou administrations orales pour le groupe traité pendant 10 semaines (durée de l'intervention : entre 30 secondes et 1 minute); dix-huit injections ou administrations orales pour le groupe traité pendant 18 semaines (durée de l'intervention : entre 30 secondes et 1 minute).

Impact sur les animaux

Les souris utilisées dans cette étude constitue un modèle classique pour l'étude du diabète de type 1 (DT1), présentant généralement une hyperglycémie modérée. La ponction de la veine caudale, qui implique l'extraction de sang de la veine située dans la queue, peut entraîner une douleur ou un inconfort, avec un risque d'infection si le site n'est pas correctement aseptisé. Ces prélèvements seront effectués de manière hebdomadaire, pouvant atteindre jusqu'à 18 prélèvements selon les groupes, augmentant ainsi le risque d'infection. L'administration orale par gavage peut provoquer du stress et de l'inconfort, avec des risques de perforation ou de blessure de l'œsophage, ainsi que d'aspiration de liquide dans les poumons, entraînant des difficultés respiratoires si la sonde est mal positionnée, surtout en cas de répétition de la procédure. Les injections intrapéritonéales (IP), sous-cutanées (SC) et intraveineuses (IV) comportent également des risques d'inconfort et de douleur au site d'injection. Pour les injections IP, il existe un risque de perforation des organes internes, tandis que les injections SC peuvent provoquer des œdèmes ou des hématomes si elles sont administrées trop rapidement. Les injections IV, quant à elles, comportent des risques de saignements et de lésions veineuses. Dans tous les cas, une infection peut survenir si les conditions d'asepsie ne sont pas rigoureusement respectées. Il est important de noter que les injections et les gavages seront également réalisés de manière hebdomadaire, jusqu'à 18 administrations selon les groupes, ce qui accentue les risques liés à ces procédures répétées.

Devenir

À la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort pour permettre des analyses post-mortem.

Remplacement

Dans notre étude, les composés développés présentent des caractéristiques pharmacodynamiques uniques qui ne peuvent être pleinement évaluées que dans des systèmes biologiques complexes, comme ceux des souris. L'étude in vivo est essentielle pour mesurer avec précision l'efficacité et l'interaction de nos analogues avec leurs cibles biologiques, ainsi que pour comprendre les réponses physiologiques qu'elles déclenchent. Ces mécanismes ne peuvent pas être reproduits de manière fiable par des méthodes in vitro ou par modélisation informatique, rendant l'approche in vivo indispensable pour évaluer l'efficacité thérapeutique potentielle des composés.

Réduction

Nous veillerons à utiliser un nombre minimal d'animaux dans nos expériences. Des analyses statistiques sur des échantillons préliminaires ont révélé que 16 animaux par condition suffisent pour obtenir des résultats exploitables, sans nécessiter de répétitions supplémentaires. Certaines souris peuvent ne pas développer d’hyperglycémie, mais elles ne seront pas écartées, car elles présentent une infiltration lymphocytaire significative, un indicateur préclinique important du diabète de type 1 (DT1). Ainsi, notre étude inclura les souris diabétiques et prédiabétiques pour obtenir des données complètes et fiables sur l'efficacité de nos composés. Enfin, pour réduire le nombre d’animaux utilisés, nous adopterons une approche séquentielle et hiérarchisée. Si un composé montre une efficacité notable avec une voie d'administration et une dose spécifique, les autres conditions seront progressivement écartées. Nous ajusterons les expériences en fonction des résultats obtenus, conformément aux principes des 3R.

Raffinement

La glycémie sera mesurée par prélèvement d'une goutte de sang de la veine caudale. Avant l'incision, une crème analgésique contenant de la lidocaïne sera appliquée sur l'extrémité de la queue pour assurer une anesthésie locale. La ponction sera effectuée rapidement et avec précision pour minimiser le stress, et une légère pression sera appliquée pour arrêter le saignement et prévenir les hématomes. Pour les injections intrapéritonéales (IP), sous-cutanées (SC) et intraveineuses (IV), la zone d'injection sera désinfectée avant et après chaque administration, afin de réduire le risque d'infection. Des aiguilles de petit calibre seront utilisées pour minimiser la douleur et les traumatismes tissulaires. Avant une injection IV, la queue de la souris sera réchauffée dans de l’eau tiède afin de dilater les vaisseaux sanguins, facilitant ainsi l'injection et réduisant les tentatives. Les volumes injectés seront limités afin d’éviter tout inconfort. Pour l'administration orale (gavage), des sondes d’alimentation adaptées seront employées afin de minimiser le risque de perforation de l’œsophage ou de lésions internes. Les animaux seront surveillés attentivement pour déceler tout signe de détresse ou de difficultés respiratoires. Tous les animaux seront hébergés dans un environnement enrichi et en groupes sociaux, dans des portoirs ventilés. Ils auront accès à de l'eau stérilisée et des aliments irradiés pour minimiser les risques de contamination. Durant toute la procédure, les animaux seront surveillés à l’aide d'une grille de score pour évaluer et objectiver les éventuelles souffrances, avec des points limites précoces et des mesures correctives adaptées.

Choix des espèces

Les souris utilisées dans cette étude constituent un modèle de référence pour l'étude du diabète de type 1 (DT1), car elles développent spontanément la maladie par des mécanismes similaires à ceux observés chez l'humain. Leur phénotype et les étapes de progression du DT1 sont bien documentés, ce qui permet des études précises et reproductibles. Dans notre étude, ces souris sont essentielles pour évaluer l'efficacité de nos composés dans un contexte de DT1. Pour cette étude pharmacodynamique (i.e. l'étude des effets des analogues sur l'organisme), nous utiliserons des souris âgées de 8 à 20 semaines. Cet intervalle d'âge correspond à la période adulte, où les processus métaboliques sont stabilisés, offrant ainsi une meilleure représentativité des réponses physiologiques et pharmacologiques. À cet âge, les souris présentent un profil métabolique mature, ce qui permet d'obtenir des données d'efficacité plus fiables et transposables, tout en minimisant les variations liées à la croissance ou aux effets du sevrage.

144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Privées du gène de l'interleukine 10, elles développent spontanément une colite et reçoivent pendant dix semaines une alimentation contenant du glyphosate à deux doses réglementaires, avec collecte hebdomadaire de fèces puis prélèvement de sang sous sédation profonde juste avant la mise à mort. L'inflammation peut provoquer des diarrhées sévères, une déshydratation et une perte de poids atteignant 20 % en quelques jours, seuil qui déclenche alors la mise à mort. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit le dialogue entre microbiote, intestin et foie, et présente l'usage d'un animal de laboratoire "entier" comme "nécessaire".

Objectifs

Les Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin (MICI) sont des pathologies complexes qui résultent de la combinaison de plusieurs facteurs de risques : génétiques et environnementaux. Dans ces facteurs environnementaux, un déséquilibre du microbiote intestinal, ensemble des bactéries colonisant les intestins, favorise l’apparition de ces pathologies. D’autre part, les contaminants présents dans notre alimentation, tel que le glyphosate, pourraient jouer un rôle dans ces pathologies, notamment chez des individus génétiquement prédisposés. Le glyphosate est le pesticide le plus utilisé dans le monde, et les consommateurs sont principalement exposés via leur alimentation. Chez les plantes, il agit en inhibant une protéine indispensable à la survie de la plante, mais cette protéine est aussi présente dans certaines bactéries du microbiote intestinal. Ainsi, nos résultats préliminaires montrent que l’exposition au glyphosate impacte la composition du microbiote intestinal. Cependant il n’est pas connu si ces changements du microbiote, induits par glyphosate, peuvent favoriser l’apparition de MICI. L’interleukine 10 (IL-10), une molécule du système immunitaire impliquée dans la réponse anti-inflammatoire, est la principale protéine anti-inflammatoire intestinale. Des souris dont l’interleukine 10 a été supprimée (IL-10-/-) développent spontanément une inflammation de l’intestin en vieillissant. De plus, le microbiote intestinal joue un rôle majeur dans le développement de cette pathologie chez ces souris IL-10-/-. Ce modèle de souris est donc approprié pour étudier l’impact de facteurs environnementaux sur le développement des MICI. Dans ce projet nous souhaitons donc étudier l’impact d’une exposition alimentaire au glyphosate sur le développement de l’inflammation intestinale, en utilisant des souris mâles et femelles dont l’interleukine 10 a été invalidée.

Bénéfices attendus

Avec ce projet, nous souhaitons approfondir les connaissances sur l’impact de l’exposition alimentaire au glyphosate dans le contexte d’une prédisposition génétique au développement de pathologie intestinale telle que la colite. Nous évaluerons ainsi les effets de l’exposition aux pesticides sur le microbiote intestinal, et leur impact sur la progression de la colite.

Procédures

Les souris seront nourries avec un régime contenant ou non du glyphosate, à deux doses différentes : la DJA (dose journalière admissible) et la NOAEL (dose sans effet nocif observable), pendant 10 semaines. Les fèces des souris seront collectées sur animaux éveillés de façon non invasive : les souris seront gardées dans des boîtes en plastique (désinfectées et non hermétiques), dans un endroit bien ventilé, de manière à pouvoir faire leurs besoins sans contrainte ni manipulation inutile pendant 2 heures. Ces prélèvements auront lieu chaque semaine. A la fin des expérimentations, les souris seront mises sous sédation profonde afin de prélever le sang (geste effectué en 30 secondes). Suite à la collection, l’animal sera euthanasié. L’ensemble des autres prélèvements sera réalisé post-mortem.

Impact sur les animaux

Les souris de ce modèle, peuvent, pour certaines, développer, à partir de 8 semaines, une colite qui peut engendrer une déshydratation suite à des diarrhées sévères, et une perte de poids pouvant atteindre 20% de leur poids initial en quelques jours, ce qui constitue un point limite mettant fin à l’expérimentation pour ces souris. Selon nos résultats préalables la survie globale de cette cohorte est estimée à 85% pour les femelles et 90% pour les mâles âgés de 14 semaines. Aucune perte de poids ni de signe de toxicité n’ont en effet été observé dans la précédente cohorte de souris de type sauvage exposées aux mêmes doses de glyphosate dans le laboratoire.

Devenir

A l'issu de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever le sang et différents organes pour réaliser les analyses et répondre à la question scientifique.

Remplacement

L'utilisation d'animaux de laboratoire entier est nécessaire car le projet étudie des phénomènes biologiques (voies métaboliques) qui font intervenir différents tissus (microbiote intestinal, intestin grêle, gros intestin, foie) agissant en synergie via un dialogue inter-organe. De plus, afin d'étudier l'interaction entre l'alimentation, le microbiote intestinal et le génome de l’hôte, l'utilisation de souris de laboratoire est appropriée avec notamment la possibilité d'utiliser des animaux génétiquement modifiés. Enfin, actuellement, il est impossible de mimer ce dialogue complexe entre les différents compartiments et organes par l'utilisation de méthodes alternatives (modèles cellulaires).

Réduction

Nous avons conçu l’expérience pour à la fois répondre à nos questions scientifiques et respecter la nécessité de réduire le nombre d'animaux dans la recherche scientifique. Nous utiliserons le plus petit nombre possible d'animaux requis pour cibler nos objectifs en fournissant des résultats statistiquement significatifs. Un nombre suffisant de souris sera utilisé dans toutes les expériences afin d'observer des effets biologiquement pertinents et statistiquement significatifs. Le nombre d'animaux a été déterminé par un calcul de puissance et basé sur nos résultats préliminaires. Les résultats de notre étude de pouvoir statistique (calcul permettant d’évaluer le nombre nécessaire d’individus pour confirmer ou non notre hypothèse de recherche) basée sur des résultats préliminaires mesurant un marqueur non invasif d’inflammation intestinale nous a permis de définir le nombre d’animaux nécessaires par groupe expérimental. Nos données préliminaires montrent également que les effets du glyphosate peuvent être dépendants du sexe, nous étudierons donc séparément une cohorte de souris femelles et une cohorte de souris mâles afin de comparer les effets du glyphosate dans les 2 sexes.

Raffinement

Les souris seront surveillées quotidiennement pendant toute la durée du protocole par du personnel compétent. Les mesures nécessaires à la prise en charge de la douleur potentielle des souris avec colite seront adaptées en fonction de l’état des animaux (analgésie et suivi des signes de mieux/mal être avant et après le traitement). Les effets du traitement seront contrôlés par une surveillance selon un score standardisé. Ce score (prenant en compte la variation du poids de l’animal, son apparence externe, les signes cliniques mesurables et le changement de comportement) correspond à une grille d’évaluation clinique permettant de prendre des mesures progressives (points limites) en fonction de l’élévation du score (augmentation de la fréquence des observations, administration de solution saline pour lutter contre la déshydratation, administration d'antalgiques pouvant être renouvelé toutes les 12h, euthanasie précoce). Ainsi, le protocole expérimental pourra être atténué voire suspendu en cas de mauvaise tolérance ou de souffrance des animaux. L’environnement des animaux sera enrichi afin de leur permettre d’avoir un comportement le plus naturel possible (cotons, maisons, cycle jour/nuit).

Choix des espèces

Le modèle murin est largement utilisé dans la recherche sur les MICI car c’est un modèle permettant notamment l’étude des interactions entre l’alimentation, les polluants de l’alimentation (tels que le glyphosate), le microbiote intestinal et l’intestin. De plus, nous utiliserons un modèle de souris déficient pour l’interleukine 10 (souris IL10-/-) permettant de modéliser l’apparition d’une colite similaire à la colite hémorragique chez l’Homme. Ce modèle génétique de colite existe uniquement chez la souris. Nous utiliserons des souris de 4 semaines et les exposerons aux différents régimes pendant 10 semaines. En effet, nous souhaitons étudier un éventuel effet potentialisateur du glyphosate sur l’inflammation intestinale. Or, les souris IL10-/- développent spontanément une colite qui peut évoluer rapidement vers des stades sévères à partir de 12 semaines d’âge. Ainsi, afin d’être capable d’observer un éventuel effet du glyphosate, nous devons donc utiliser ces souris assez jeunes, juste après le sevrage.

Opérés du cerveau le jour de leur naissance, soumis à sept jours de vie à une nouvelle chirurgie puis à deux heures d'hypoxie, gavés ou injectés les trois jours suivants, 576 ratons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils passent ensuite des IRM sous anesthésie à 7, 30 et 45 jours, dont une de deux heures, et des tests de réflexes à 8, 10 et 12 jours. À 55 jours, une privation de nourriture de 72 heures précède un test censé mesurer un état dépressif. Tous sont tués pour prélèvement d'organes, et ni ce test de dépression ni le test de mémoire employé à 45 jours ne sont nommés.

Objectifs

Une meilleure compréhension du métabolisme énergétique cérébral chez le nouveau-né, en prenant en compte les différences liées au sexuel, pourrait permettre de définir de nouvelles pistes thérapeutiques dans un contexte de pathologies cérébrales pédiatriques caractérisées par un déficit énergétique. Les objectifs seront les suivants : - Décrypter les spécificités du métabolisme énergétique cérébral du nouveau-né en bonne santé, en fonction du sexe. - Mettre en évidence les spécificités sexo-dépendantes des altérations métaboliques périnatales dans le contexte de l’hypoxie-ischémie néonatale. - Développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le contexte d’un déficit énergétique cérébral, en fonction du sexe.

Bénéfices attendus

Il est attendu de ce projet de combler une lacune dans le domaine de la neuroénergétique. Ce projet offrira une compréhension des mécanismes moléculaires et de la coopération cellulaire qui sous-tendent les différences entre le cerveau des nouveau-nés masculins et féminins, ainsi que des différences dans la manière dont le cerveau masculin et féminin peuvent être capables de répondre aux agressions neuronales et aux stratégies neuroprotectrices.

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie afin de diminuer l'expression de certains transporteurs de substrats énergétiques cérébraux (1 fois, à la naissance, durée 15 min). Pour l'induction de l'hypoxie-ischémie, les animaux subiront une chirurgie (1 fois, à l’âge de 7 jours, durée inférieure à 10 min) puis une hypoxie (1 fois, 30 min après la chirurgie, durée 2 h). Pour l'un des groupes, trois injection de substrat énergétique seront réalisées (juste après l'hypoxie-ischémie et sur les deux jours suivants, âge : 7, 8 et 9 jours de vie, durée : 2 s). Pour un des groupes, les ratons seront gavés avec des substrats énergétiques (gavage juste après l'hypoxie-ischémie et sur les deux jours suivants, âge : 7, 8 et 9 jours de vie, durée : 2 min). Les animaux effectueront des examens par résonance magnétique nucléaire de diffusion sous anesthésie gazeuse ; technique non-invasive pour les animaux (à l'âge de 7 et 30 jours ; durée : 30 - 45 min). Ils effectueront aussi des examens par résonance magnétique nucléaire fonctionnelle sous anesthésie (1 fois, à 45 jours d'âge, durée : 2 h). La neuroprotection sera évaluée au niveau fonctionnel par des tests de comportements de réflexes précoces (réalisés à 8, 10 et 12 jours ; durée : 5 min) et de mémoire (évaluée à 45 jours ; durée 10 min). La dépression sera évaluée par un test comportemental associé à une restriction alimentaire (réalisé à 55 jours ; durée de la restriction : 72 h ; durée du test : 10 min).

Impact sur les animaux

Les modèles de répression de transporteurs utilisés dans ce projet sont bien connus des membres de l’équipe. La modification génétique n’entraîne pas de modifications au niveau pondéral, qualité du poil, appétit des animaux, activité et mobilité. Cependant, l'induction du modèle nécessite une chirurgie sous anesthésie générale par hypothermie maintenue tout le long de l’acte. Suite à l'opération, la plaie suturée peut s'infecter ou présenter des difficultés à cicatriser. La chirurgie nécessaire à l’induction de l’hypoxie-ischémie pourrait entraîner une perte de poids, une plaie et des douleurs postopératoires. L’administration de lactate sera réalisée par une injection intrapéritonéale, ce qui constitue une nuisance. La réponse à l'hypoxie-ischémie est variable d'un individu à l'autre. Dans de rares cas, des lésions cérébrales supérieures à 50 % pourraient subvenir. Elles représenteront un point limite. Le test de restriction alimentaire pourrait entraîner chez certains animaux un stress.

Devenir

Mise à mort des animaux pour prélèvement d'organes pour une analyse post-mortem (n = 576). La répression de l'expression des différents transporteurs ainsi que l'induction de lésions cérébrales par hypoxie-ischémie ne permettra pas d'utiliser les animaux pour un autre projet.

Remplacement

Des modèles d’organoïdes ainsi que des modèles d’hypoxie cellulaires existent, cependant, ces modèles s’affranchissent de la (patho)physiologie de l’organisme entier. Le but final de notre projet de recherche a une envergure translationnelle et nécessite donc une approche intégrative, prenant entre autre la dimension sexuée. De ce fait, notre projet nécessitant le fonctionnement du cerveau dans son intégrité afin de comprendre le métabolisme cérébral en fonction du sexe et tester l'effet neuroprotecteur des molécules afin de pouvoir envisager une application rapide chez l’Homme, il n'existe pas de remplacement disponible à notre modèle expérimental.

Réduction

Une réduction du nombre d’animaux est rendue possible par le fait que l'IRM est une technique d'investigation non-invasive qui permet un suivi des animaux ainsi que la réalisation de tests comportementaux, sur les mêmes animaux. Les différences inter-groupes seront mises en évidence par des tests statistiques. Le nombre d'animaux considéré pour ce projet a été déterminé en prennant en concidération nos projets précédents et en utilisant un calculateur de taille d'échantillon.

Raffinement

Lors des chirurgies, avant anesthésie un antalgique sera administré. Le réveil des ratons et la récupération de la température corporelle s’effectueront dans un caisson ventilé. Les ratons seront surveillés plusieurs fois par jour pendant 3 j puis de manière hebdomadaire. La mise en place d’une grille de scorage et l’utilisation de points limites adaptés permettront la délivrance d’un antalgique si une douleur est constatée. La cicatrisation sera contrôlée ; en cas d’infection de la plaie un désinfectant et un antalgique seront administrés. Les IRM seront réalisées sous anesthésie générale. Une modification de rythme cardiaque ou du rythme respiratoire par rapport aux normes physiologiques, mise en évidence par un capteur placé sous l'animal entraînera l'arrêt de l'expérimentation. Du gel ophtalmique sera utilisé, pour éviter la sécheresse oculaire. Pour le gavage, une canule à bout rond en plastique à usage unique sera utilisée afin de limiter les risques de blessure pour l'animal. Le volume administré, à température ambiante prendra en considération la corpulence de l'animal. En l'absence de détresse respiratoire et de reflux, l'animal sera remis à sa cage et surveillé régulièrement pendant 1 heure. Pour le test de dépression, nécessitant une privation de nourriture ponctuelle, la prostration de l'animal représentera un point limite. Au niveau de l'hébergement, les animaux seront élevés en cage collective, sur une litière en peuplier, caractérisée par un fort pouvoir absorbant et une granulométrie adaptée. L'hébergement sera enrichi d'un nid végétal, du coton et un tunnel en carton.

Choix des espèces

Le rat Wistar est plus gros que des modèles souris, ce qui est un atout pour les examens non-invasif par IRM. La taille de son cerveau facilitera aussi les chirurgies. Cette espèce est utilisée depuis plusieurs années dans le modèle d'hypoxie-ischémie, ainsi de nombreux groupes témoins dans la littérature permettent de faire des comparaisons et limitent le nombre de témoins. Les animaux recevront une injection cérébrale à la naissance (P0) afin de diminuer l'expression des différents transporteurs. Pour certains, une hypoxie-ischémie sera réalisée à 7 jours de vie. Ils seront ensuite suivis par IRM à 7, 30 et 45 jours de vie et par des tests de comportement, de 8 à 55 jours de vie, afin de pouvoir comprendre les différences du métabolisme énergétique cérébrale du nouveau-né mâle et femelle et évaluer les effets protecteurs des substitutions thérapeutiques à court et à long terme. Les tests de reflexes seront réalisés à 8, 10 et 12 jours de vie. Un test permettant de mettre en évidence les défaillances neurologiques sera réalisé à 24 jours de vie. L'anxiété sera évaluée à 28 jours de vie. Un test de mémoire sera réalisé à 45 jours de vie et l'état dépressif des animaux sera évalué à 55 jours de vie.

Deux chirurgies crâniennes espacées de quatorze jours, la première pour greffer des cellules de glioblastome dans le cerveau, la seconde pour y injecter des nanocapsules chargées de deux médicaments. 50 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, avec perte de poids liée à la progression tumorale et troubles neurologiques possibles aux stades avancés. Celles qui n'ont atteint aucun point d'arrêt cent vingt jours après la greffe seront "considérées comme guéries" et tuées elles aussi. Le RNT annonce une échelle d'évaluation de la souffrance et des points d'arrêt sans préciser lesquels, et ne nomme pas les deux médicaments associés.

Objectifs

Le glioblastome est une forme très grave de cancer du cerveau, avec un pronostic difficile. Malgré des traitements comme la chirurgie, la chimiothérapie et la radiothérapie, l'espérance de vie moyenne est d'environ 15 mois. Deux grands obstacles rendent ces traitements moins efficaces : d'abord, une barrière protège le cerveau et empêche les médicaments d’atteindre facilement la tumeur, et ensuite, certaines cellules cancéreuses sont résistantes à la chimiothérapie et continuent de se propager dans le cerveau. Après une chirurgie, la plupart des patients font face à des rechutes agressives près de l'endroit où la tumeur a été retirée. Pour améliorer la survie de patients, il est essentiel d'empêcher ces rechutes. Deux approches prometteuses sont en développement : l'administration directe de médicaments dans le cerveau à l'aide d'implants ou de gels, et l’utilisation de nanomédicaments. La première permet d'amener les traitements directement à la tumeur, en contournant la barrière protectrice du cerveau, tandis que la seconde utilise des particules minuscules pour cibler les cellules cancéreuses, dépasser la résistance du cancer et limiter les effets secondaires. Dans ce projet, des nanoparticules ont été développées pour transporter deux médicaments qui, bien qu'ils n'aient jamais été testés ensemble pour traiter le glioblastome, se sont révélés très efficaces contre les cellules cancéreuses en laboratoire. L’objectif est maintenant de vérifier leur efficacité en les administrant directement dans le cerveau de souris porteuses de tumeurs. Cinquante souris seront utilisées pour évaluer cette nouvelle combinaison de traitements.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est de vérifier l’efficacité anticancéreuse d’un nouveaux traitement combinatoire véhiculant des agents chimio-thérapeutiques pour les tumeurs cérébrales très agressives. Les retombées de ce projet pourraient permettre de répondre à un besoin médical non pourvu dans le traitement de ces tumeurs qui n’a pas bénéficié d’innovation thérapeutique depuis 2005.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux chirurgies à 14 jours de distance: 1) greffe tumorale de cellules; 2) administration intratumorale d'un traitement anti-cancéreux. La durée approximative des chirurgies ou tout acte nécessitant une anesthésie de l’animal ne dépassera pas les 30 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances anticipées dans ce projet concernent la greffe, le traitement intracérébral et les actes chirurgicaux. Les sources de stress potentielles avant/pendant ces actes sont la manipulation, contention des animaux, les injections d'anesthésiques, l’incision de la peau. La perte de poids reflétant la progression tumorale des tumeurs intracrâniennes est aussi un effet indésirable attendu dans ce projet. Il est également possible, quoique rare, que les animaux développent des troubles neurologiques lors de stades avancés de la pathologie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale, lorsque l'un des points d'arrêts est atteint. Si les animaux n'ont pas atteint ces points au jour 120 post-greffe tumorale, ils seront considérés comme guéris et seront mis à mort.

Remplacement

L'objectif de ce projet est de tester l'efficacité d'un traitement combiné, administré localement, qui délivre des agents chimiothérapeutiques pour traiter des tumeurs cérébrales très agressives. Les équipes de recherche ont élaboré les différentes étapes de l'expérimentation en s'appuyant sur des résultats obtenus précédemment. La validation de l'efficacité du traitement chez des animaux vivants (in vivo) est une étape cruciale avant d'envisager des essais cliniques chez l'humain. Actuellement, il n'existe aucune autre alternative à l'expérimentation animale pour ce type de recherche.

Réduction

Le nombre total d'animaux requis pour ce projet est de 50. Ce chiffre a été déterminé en se basant sur des protocoles déjà établis : nous avons utilisé une méthode statistique pour calculer le nombre nécessaire d'animaux afin d’obtenir des différences statistiquement significatives entre les groupes étudiés (n = 10 animaux par groupe x 5 groupes expérimentaux = 50 animaux). L'étude de survie durera environ 22 jours pour les animaux témoins et pourra s'étendre jusqu'à 120 jours pour les animaux traités. Les jours de décès après la greffe seront analysés à l'aide d'un logiciel statistique, afin de comparer la survie entre les différents groupes.

Raffinement

Les souris seront hébergées par groupes de 5 par cage, avec des mesures d'enrichissement de leur environnement pour assurer leur bien-être. Cela inclut l'utilisation de litière à base de cellulose, de petits dômes stérilisables, et des morceaux de bois à ronger dans chaque cage. Les animaux seront observés quotidiennement, et des efforts seront faits pour les habituer aux situations potentiellement stressantes afin de minimiser leur inconfort. Une échelle d'évaluation de la souffrance sera utilisée pour mesurer leur niveau de douleur ou de détresse, en tenant compte de critères comme la perte de poids, les changements physiques ou comportementaux, la réaction aux stimuli, et l'apparition de signes cliniques de souffrance. En fonction du score obtenu, des mesures seront prises pour soulager la détresse (comme fournir de l'eau gélifiée, de la nourriture dans la cage ou des enrichissements supplémentaires) et pour gérer la douleur, notamment avec des analgésiques.

Choix des espèces

Le modèle souris (avec le modèle rat) représente le modèle le plus étudié dans le traitement des tumeurs cérébrales. Le modèle de tumeur que nous étudions est un des modèles les plus utilisé dans la littérature pour des études des mécanismes immunitaires et la délivrance des médicaments pour le traitement des tumeurs cérébrales agressives. Les différents travaux scientifiques dans ce domaine ont utilisé très majoritairement des souris de 5 à 8 semaines : afin de pouvoir confronter nos résultats avec la littérature nous avons choisi d’utiliser des souris de 7 semaines.

Une hépatite fulminante leur est provoquée par intoxication au paracétamol ou au thioacétamide, suivie pour une partie des animaux d'une laparotomie avec injection dans la veine porte ou dans la rate. 1 890 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, la survie attendue dans le groupe non transplanté étant inférieure ou égale à 30 %. Le porteur écrit que l'induction de l'hépatite "n'est pas un acte sévère" et que les animaux ont "totalement récupéré" au bout de cinq jours, tout en décrivant un état comateux possible. Aucune souris ne sort vivante du projet, la procédure étant classée sévère et de ce fait "non réutilisable".

Objectifs

La greffe de foie est le traitement reconnu pour de nombreuses maladies du foie au stade terminal mais il y a pénurie de foies donneurs. La transplantation d’hépatocytes isolés de foies donneurs est une alternative prometteuse mais limitée par cette même pénurie et l’incapacité à amplifier les hépatocytes in vitro. Un nouveau concept thérapeutique a émergé visant à utiliser des cellules souches pluripotentes (CSP) comme une source illimitée de cellules du corps. C’est cette capacité que nous utilisons pour produire des quantités illimitées de cellules hépatiques dérivées de CSP (StemHep) mais également des vésicules extracellulaires (VeHep). Actuellement, la physiopathologie de l’insuffisance hépatique et la régénération hépatique ne sont pas modélisées in vitro. Seuls les modèles in vivo, qui permettent de mesurer les capacités thérapeutiques de cellules, sont validés par les instances réglementaires. Nous devons donc valider l’effet thérapeutique des différents protocoles de productions de StemHep et des VeHep sur des modèles d’hépatite fulminante chez la souris avant de pouvoir les utiliser en phase clinique. De plus, nous devons pouvoir suivre la distribution de nos cellules en fonction du site d’injection et montrer qu’elles n’ont pas de capacité tumorigène dans un modèle murin immunodéficient bien établi et reconnu au sein des instances réglementaires.

Bénéfices attendus

A ce jour, dans le cas d’insuffisance hépatique, il n’existe aucune alternative à la greffe de foie. Notre projet se positionne en recherche translationnelle pour développer de nouvelles biothérapies à partir de cellules souches pluripotentes pour répondre aux besoins médicaux urgents non satisfaits dans le domaine des maladies du foie, et éviter la greffe de foie. Ce projet innovant permettra une avancée majeure en thérapie cellulaire et son succès permettra d’envisager le lancement d’une première phase clinique pour lutter contre une maladie dont la prévalence mondiale, déjà très élevée, risque d’augmenter fortement dans les années futures.

Procédures

Injection intrapéritonéale sur animaux vigiles (1min/animal, une fois) Laparotomie et injection intraportale ou intrasplénique sur animaux anesthésiées (20min/animal, une fois)

Impact sur les animaux

Ce projet portera sur l’étude des paramètres biologiques et biochimiques dans des modèles d’hépatite fulminante. L’induction de l’hépatite par voie intrapéritonéale n’est pas un acte sévère mais l’ensemble de ce projet est classé en protocole sévère puisqu’il est attendu une survie inférieure ou égale à 30% dans le groupe non transplanté et les animaux transplantés subissent une laparotomie justifiant ce classement. L’hépatite fulminante peut induire un état comateux des souris et la chirurgie engendrera douleur et stress aux animaux. Cette sévérité est restreinte à une durée de 4-5 jours post opératoire, les animaux ayant totalement récupérés au bout de 5 jours.

Devenir

Procédure sévère donc non réutilisable.

Remplacement

Modèles d’hépatite : malgré des avancées récentes, notamment dans la mise en place d’organoïdes, il n’existe à ce jour aucun modèle in vitro permettant de mimer la complexité d’une structure hépatique. La toxicité de diverses molécule peut être étudiée dans quelques modèles développés in vitro mais ceux-ci ne permettent pas de valider un effet thérapeutique. Seuls les modèles in vivo peuvent montrer la capacité thérapeutique de notre médicament. Nous avons cependant pu obtenir de réaliser ces études chez la souris avant de passer en clinique sans avoir besoin de développer un modèle chez les gros animaux. Modèle de tumorigénicité : nous mettons en place des techniques prédictives de tumorigénicité in vitro. Ces techniques nous permettrons de limiter les études faites in vivo mais actuellement seules les études in vivo sont validées par les instances réglementaires avant le lancement d’une phase d’étude clinique.

Réduction

Notre expérience précédente et la simulation statistique nous permet de conclure qu’il nous faut 10 souris par groupe d’étude pour obtenir un test statistique acceptable. Nous avons essayé de diminuer ce nombre à 5 souris par groupe mais cela diminuerait énormément la force de l’étude puisque la différence de survie serait alors statistique uniquement si toutes les souris du groupe transplanté survivent, ce qui ne peut être considéré comme plausible scientifiquement.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupes sociaux avec enrichissement dans les cages. L’utilisation d’un tableau de scoring de points limites nous permet d’évaluer de manière précise la nécessité de mise à mort rapide des animaux si nécessaire afin de limiter au maximum leur souffrance. Il prend en compte l’aspect des animaux (poils, yeux, posture), leur comportement (mobilité, isolation, réaction aux stimuli) et leur poids. Il permet d’homogénéiser le suivi et la prise de décision entre les utilisateurs. Afin de minimiser stress et douleur, nous utilisons des traitements pré et post-opératoires adaptés. L’ensemble de la procédure chirurgicale est réalisé en condition stérile et la mise en place, au sein de la pièce dédiée à la chirurgie, de postes isoflurane automatiques permet un meilleur contrôle des paramètres d’anesthésie.

Choix des espèces

Les souris intoxiquées au paracétamol ou au thioacétamide sont des modèles de choix et de référence dans la littérature scientifique pour l’étude de la physiopathologie de l’IHA induite chez l’Homme. Comme ce qui est décrit dans la littérature, les animaux seront âgés de 6-10 semaines au moment du début du protocole.