Procédures sévères
Etude des mécanismes physiologiques d’adaptation à la survie périnatale dans un modèle murin invalidé pour deux gènes.
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Séparés de leur mère dès la naissance, des souriceaux nouveau-nés sont laissés seuls six à vingt-quatre heures, puis tués pour prélever leur sang et leurs tissus. 300 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, les femelles gestantes tuées pour recueillir les embryons comprises. L'objet déclaré est de comprendre l'adaptation métabolique qui suit la naissance chez des souris privées de deux gènes, alors que 40 à 50 % des souriceaux mutants meurent déjà avant le sevrage, et le porteur anticipe que l'isolement et l'hypoglycémie, qu'il nomme "souffrance métabolique", peuvent conduire à la mort. Un écart de 5 °C de température corporelle après huit heures d'observation sert de seuil de mise à mort anticipée.
Objectifs
Dans le cadre de cette demande, nous souhaitons disséquer les conséquences physiologiques de la perte de fonctions de deux gènes in vivo, en utilisant la souris comme modèle. Ces gènes, retrouvés uniquement chez les mammifères placentaires, sont exprimés exclusivement dans le cerveau, avec une expression marquée dans les neurones. Chez l'humain, le locus où sont hébergés ces gènes est lié à des anomalies génétiques entraînant une maladie rare. Ce syndrome se caractérise par un tableau clinique complexe avec par ailleurs des défauts au moment de la naissance. C’est pour cela que nous souhaitons comprendre l’effet de l’invalidation de ces gènes sur l’adaptation métabolique/physiologique qui survient durant la période autour de la naissance.
Bénéfices attendus
De nature fondamentale, les expériences proposées sont susceptibles d’avoir des retombées dans le domaine biomédical puisque les données cliniques les plus récentes indiquent que la perte d’expression des gènes que nous étudions est causalement reliée à la physiopathologie d’un syndrome humain rare. A plus long terme, nos souris invalidées pour nos gènes d’intérêts, pourraient donc représenter de nouveaux modèles pré-cliniques de cette maladie.
Procédures
Après la naissance par délivrance naturelle ou par césarienne, les souriceaux seront séparés de la mère et mis à mort pour collecter du sang et des tissus soit directement après la séparation soit au bout de 6h et 24h.
Impact sur les animaux
Le phénotype de cette lignée est que les souriceaux KO-SNORD115/116 sont de plus petite taille et présentent une mortalité périnatale avec une pénétrance incomplète, avec 40-50% des souriceaux mutant qui décèdent avant le sevrage, dont environ 60% dans les 48 heures suivant la mise-bas. Dans ce projet, lors de la séparation prolongée avec la mère, nous anticipons que l’isolement et la «souffrance métabolique» (hypoglycémie) chez les nouveaux nès constitueront indéniablement un stress, pouvant conduire jusqu’à la mort. Pour limiter ce stress, nous avons décider ne pas dépasser 24h de séparation.
Devenir
Les femelles gestantes seront mises à mort pour recueillir les embryons. En fin d'expérience, les embryons et les nouveau-nés seront mis à mort. Des tissus pourront être collectés pour des analyses métaboliques/moléculaires/histologiques.
Remplacement
Nous comptons explorer la fonction biologique de nos deux gènes d'intérêts. Ces gènes, retrouvés uniquement chez les mammifères placentaires, sont exprimés uniquement dans le cerveau, avec une expression marquée dans les neurones post-mitotiques. A ce jour, il n’existe donc malheureusement pas de modèles alternatifs crédibles permettant d’aborder la fonction de ces deux gènes de manière intégrée, et ce notamment lorsqu'il s'agit d'études métaboliques visant à décrire les mécanismes mis en jeu au cours de la naissance chez les mammifères placentaires.
Réduction
D’après des expériences antérieures et celles rencontrées dans la littérature scientifique, 15 animaux par groupe est le nombre minimum nécessaire pour réaliser des analyses statistiques adaptées et mettre en évidence des différences statistiquement significatives.
Raffinement
Des mesures seront prises pour réduire au maximum les nuisances. Les souriceaux seront placés individuellement avec un peu du nid réalisé par la mère et de la litière pour garder la stimulation olfactive. Du nursing sera réalisé avec un coton tige pour que les petits soient délicatement stimulés sur les flancs pour rappeler le comportement de la mère. Nous veillerons à ne pas dépasser 24h de séparation avec la mère. En fonction de la mortalité observée, que l’on peut attendre plus grande chez nos mutants, on pourrait être amené à réduire le temps d’observation en se fixant comme seuil temps pour lequel 50% des souriceaux mutants sont morts. Au bout de 8h d’observation, si la température des petits montre un écart de 5°C par rapport à la température mesurée au départ, alors nous anticiperons qu’ils ne passeront pas la nuit et ils seront mis à mort avant la fin de l’expérience.
Choix des espèces
Tous les modèles animaux de la pathologie décrits à ce jour sont réalisés chez la souris. C’est donc le modèle murin de choix de référence dans notre domaine de recherche qui, non seulement permet d’établir des comparaisons avec les données de la littérature, mais aussi de réduire le nombre de souris en évitant de répéter des expériences inutiles déjà publiées. L'objectif est d'étudier les mécanismes physiologiques d’adaptation à la surive périnatale, donc l’étude portera sur des souriceaux obtenus après la mie bas par délivrance naturelle ou bien par césarienne.
Développement et évaluation de l’effet thérapeutique de cellules immunitaires modifiées pour l’immunothérapie dans des modèles de tumeurs solides chez la souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système nerveux
Des cellules tumorales sont injectées dans le cerveau de souris anesthésiées, un dispositif intracérébral est posé au cours de la même chirurgie, puis les traitements arrivent une semaine plus tard directement dans le cerveau, sur animal éveillé. 7 969 souris vont être utilisées, 7 744 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour des analyses post-mortem. Suivent deux à trois séances d'imagerie par semaine sous anesthésie, trois ponctions de liquide céphalorachidien de trente minutes et des prises de sang tous les quinze jours, tandis qu'un autre groupe reçoit les cellules tumorales dans les deux yeux. Le porteur écrit que la tumeur oculaire fera baisser la vision sans conséquence pour les animaux, la vue n'étant pas leur organe sensoriel dominant, et greffe les deux yeux pour diviser par deux le nombre de souris.
Objectifs
Le système immunitaire est l’ensemble des éléments du corps qui surveillent et détruisent les cellules anormales. Malheureusement les cellules cancéreuses arrivent souvent à passer outre ce système. L’immunothérapie a été développée ces dernières années afin de réactiver le système immunitaire contre les tumeurs et de très bons résultats cliniques ont été rapportés. En utilisant une technique appelée thérapie cellulaire adoptive, nous permettons à certaines cellules du système immunitaire de reconnaitre spécifiquement la tumeur. Elles sont ensuite perfusées chez les patients cancéreux dans le but de reconnaître, de cibler et de détruire les cellules tumorales. L'immunothérapie cellulaire a montré récemment des résultats extrêmement prometteurs en utilisant des cellules modifiées et particulièrement dans le cas des cancers hématologiques (certains lymphomes et leucémies). Cependant, des résultats moins encourageants ont été observés dans certains cancers. Dans ce projet, nous allons génétiquement modifier les cellules immunitaires afin de les rendre plus efficaces et élargir leur utilisation à d’autres cancers. Les expériences proposées vont permettre d’identifier de nouveaux mécanismes anti-tumoraux et de nouvelles méthodes de traitement qui seront directement applicables dans le domaine d’immunothérapie des cancers.
Bénéfices attendus
De façon générale, la thérapie cellulaire adoptive correspond à l’expansion in vitro de cellules qui reconnaissent spécifiquement les tumeurs avant leur réinjection chez les patients. Ce nouveau type de stratégie thérapeutique anti-cancéreuse a montré des résultats prometteurs dans les essais cliniques récents mais des améliorations doivent encore être apportées pour notamment augmenter l'activité et la persistance des cellules immunitaires modifiées en évitant les effets indésirables tels l'épuisement (rendant les cellules insensibles à une activation ultérieure) Dans notre laboratoire, nous avons identifié un gène agissant comme un régulateur clé de la différenciation et formation de la mémoire immunologique de ces cellules. Nous avons observé que des cellules modifiées où ce gène a été génétiquement désactivé, sont beaucoup plus efficaces pour éradiquer des cellules tumorales dans un modèle de leucémie aigüe. Dans ce projet, nous souhaitons étudier les bénéfices de ces modifications, dans des modèles de tumeurs solides. Dans un premier temps, nous travaillerons sur des tumeurs associées à un mauvais pronostic chez les patients : comme le lymphome cérébral primitif (LCP) et le glioblastome. Les cellules modifiées que nous allons développer dans cette étude représentent une option thérapeutique intéressante pour ces patients mais des travaux précliniques restent nécessaires. Le projet permettra de faire des avancées majeures dans le domaine de la thérapie cellulaire adoptive dans le but d’améliorer le pronostic des patients atteints par ces cancers.
Procédures
Dans un premier groupe d’animaux, des cellules tumorales seront injectés dans le cerveau des animaux anesthésiés (durée anesthésie 30min). Ces animaux seront ensuite traités par voie intraveineuse (injection unique sur animal vigile – durée du geste inf à 20sec) Dans un second groupe d’animaux, des cellules tumorales seront injectées dans le cerveau des animaux anesthésiés. Au cours de cette chirurgie, un dispositif intracérébral sera installé (durée de l’anesthésie environ 1h30). Une semaine après l’intervention, les souris vigiles recevront des traitements directement dans le cerveau grâce au dispositif intracérébral (injection unique – durée du geste 5 min) Dans un troisième groupe d’animaux, des cellules tumorales seront injectées dans le cerveau des animaux anesthésiés. Au cours de cette chirurgie, un dispositif intracérébral relié à une pompe sous-cutanée implantée au niveau du dos de l’animal seront installés (durée de l’anesthésie environ 1h30). Ces animaux seront ensuite traités par voie intraveineuse (injection unique sur animal vigile – durée du geste inf à 20sec) Les trois groupes d’animaux seront suivis par imagerie à raison de 2 à 3 imageries/semaine. Les imageries seront réalisées sur animaux anesthésiés et dureront environ 15 min. De plus, nous prélèverons du liquide céphalorachidien sous anesthésie générale (3 prélèvements à au moins deux semaines d’intervalle, durée du geste 30 min) ainsi que du sang sur animal vigile (1prélèvement toutes les deux semaines, durée du geste inférieur à 20sec) Concernant les greffes intraoculaires de cellules tumorales, les cellules seront injectées dans le vitré, sous anesthésie générale et avec antalgie adaptée. La procédure dure entre 10 et 15 minutes par œil. L’évaluation de la croissance tumorale sera réalisée de façon non invasive, soit par examen ophtalmologique (ophtalmoscopie indirecte ou par photographie du fond d’œil, quotidiennement pendant 3 jours après la greffe puis 1 fois par semaine, durée de l’examen 15 min) soit par bioluminescence (2 fois par semaine, durée de l’examen 15 min), sous anesthésie. Le traitement sera délivré 1 fois par voie intraveineuse sur animal vigile (durée du geste inf à 20 sec), ou par injection intravitréenne sur animaux anesthésiés ((durée 15 min). L’évaluation de la réponse au traitement sera réalisée de façon identique à l’évaluation de la croissance des cellules tumorales greffées.
Impact sur les animaux
Les animaux greffés avec des cellules tumorales au niveau du cerveau vont développer des tumeurs. Les souris peuvent perdre du poids dans les jours qui suivent la chirurgie et/ ou présenter, dans de rares cas, des troubles moteurs (comportement rotatoire et/ou troubles de l’équilibre). Le traitement des souris par voie intraveineuse provoque uniquement la douleur de l’aiguille utilisée pour l’injection. Dans certains cas, des dermatites peuvent se développer 3 semaines après l’injection provoquant une perte de poils à long terme. Le traitement des souris par voie intracérébrale peut provoquer des douleurs ainsi qu’une légère perte de poids durant 2-3 jours. Le prélèvement sanguin provoque la douleur de l’aiguille et dans de rares cas une perte de poids de l’animal. Le prélèvement de liquide céphalo-rachidien peut provoquer des douleurs ainsi qu’une légère perte de poids durant 2 jours. Les animaux greffés au niveau de l’œil développeront une tumeur dont la croissance n’est pas douloureuse mais qui entrainera une baisse de la vision. Cette baisse de la vision n’aura pas de conséquence sur les animaux (sociabilisation, alimentation), ni sur le poids de l’animal, la vue n’étant pas l’organe sensoriel prédominant chez les rongeurs. Dans de rares cas, des réactions inflammatoires ou infectieuses pourront être observées suite à la greffe ou l’administration de traitements
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem
Remplacement
Ce projet découle de résultats obtenus in vitro à l'aide de lignées cellulaires en culture. En résumé, on a découvert que certaines modifications comme l’inactivation d’un gène spécifique induit une survie prolongée de certaines cellules immunitaires, appelés les lymphocytes T. L’association de plusieurs modifications génétiques sur ces cellules devrait améliorer l’effet antitumoral des cellules modifiées. D’autre part, un grand nombre d’études ont montré l’effet délétère de certains messagers, appelés cytokines, sur le système immunitaire . Le fait de bloquer certains de ces messagers, en ajoutant des inhibiteurs de cytokines au traitement, devrait améliorer, in vivo, l’effet antitumoral des cellules modifiées. Pour valider cette hypothèse, le modèle animal est nécessaire. En effet, après la validation in vitro des bénéfices de ces traitements par différents types de cellules, il est nécessaire de les évaluer dans un système plus physiologique avant d'envisager une application clinique chez l'homme en thérapie cellulaire. A ce stade, l’utilisation d’animaux est indispensable pour valider les mécanismes de régulation et d’action de ces traitements, ainsi que la toxicité éventuelle de cette thérapie cellulaire.
Réduction
Le nombre de souris par groupe est de 10 afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante, car de notre expérience, il y a toujours une certaine hétérogénéité entre souris. Ce nombre d’animaux tient compte de la nécessité d'utiliser le moins de souris possible et de pouvoir effectuer des statistiques fiables pour valider les effets biologiques observés. Pour finir, le suivi de croissance tumorale et évaluation de la réponse au traitement se fait in vivo, par imagerie de façon longitudinale et répétée, ce qui évite de devoir prévoir des animaux pour différents time points précis. Les deux yeux sont greffés afin de diminuer par deux le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Pour limiter le stress des animaux, un délai minimal de 7 jours est respecté entre la réception des animaux et la mise en place des procédures expérimentales pour leur permettre de s’adapter à leur nouvel environnement. Les interventions chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale associée à des analgésiques adaptés aux interventions chirurgicales mises en place. Toutes les expérimentations sont réalisées sur tapis chauffant, et le réveil est réalisé sur tapis chauffant ou sous lampe chauffante. Pour les animaux ayant subis une chirurgie cérébrale ou une injection intraoculaire des soins pré et post-opératoires sont appliqués pour prévenir et/ou gérer la douleur. Un supplément alimentaire hydratant est mis à disposition dans les cages jusqu’au rétablissement complet de la souris (récupération du poids, absence de signes extérieurs de souffrance, absence de troubles moteurs). Pour limiter les effets secondaires dus à l’injection des cellules modifiées, comme les dermatites, nous étudierons l’effet de la délétion d’un gène potentiellement responsable de ces effets secondaires. Ces animaux sont surveillés quotidiennement pour évaluer leur état général et deux à trois fois par semaine pour mesurer la taille de la tumeur afin d'appliquer les points limites décrits dans une grille bien définie. Cette grille de score permet d’évaluer, de façon objective et spécifique, l’état global de l’animal (poids, état physique général, comportement moteur). Elle est adaptée à chaque type de procédure. En cas d’atteinte d’un point-limite tel que décrit dans la grille de score, l’animal est mis à mort.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en recherche en immunologie anti-cancéreuse car la connaissance complète du génome murin permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés, dont les souris génétiquement modifiées pour des protéines spécifiques d’intérêt ainsi qu’un grand nombre de modèles de tumeurs transplantées.
Etude des agonistes des récepteurs B-adrénergiques dans le traitement des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Une molécule irritante instillée dans le rectum sous anesthésie, ou une bactérie pathogène administrée par gavage, déclenchent chez elles une inflammation intestinale : 110 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever le colon. La moitié relève d'un niveau de souffrance modéré, l'autre d'un niveau sévère, avec prostration, saignements rectaux, diarrhée prolongée et perte de poids pouvant dépasser 20 % du poids initial. L'objet déclaré est de vérifier chez la souris un effet anti-inflammatoire déjà observé sur des macrophages en culture. Sur la réduction du nombre d'animaux, le porteur promet une planification minutieuse et des évaluations régulières de ses pratiques, sans donner d'effectif par groupe ni de calcul.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) sont des pathologies chroniques entrecoupées de période de phase aigüe. A l’heure actuelle, seule la phase aigüe est prise en charge sans pour autant induire un effet curatif. En effet, les traitements proposés jusqu’à présent, visent surtout à améliorer le bien-être du patient. Par ailleurs, le traitement le plus répandu (qui est basé sur l’utilisation des corticoïdes) ne peut pas être utilisé chez l’enfant. Enfin, les MICI peuvent au bout d’un certain temps, entraîner la survenue du cancer colorectal Il est donc important de mettre en place des traitements qui peuvent agir sur la phase chronique et sur la phase aigüe et capables de prévenir la survenue d’une phase aigüe. Dans ce contexte d’inflammation chronique de l’intestin, qui est une véritable gêne pour le patient, nous voulons voir si les ligands des récepteurs du stress peuvent permettre la diminution de cette inflammation. En effet, nous avons réussi à montrer dans les modèles in vitro et grâce à l’analyse de différents marqueurs, basé sur des lignées primaires de macrophages, qu’un traitement par ces ligands permettait une modification du phénotype des macrophages primaires d’un type pro-inflammatoire vers un type anti-inflammatoire et pourrait à ce titre avoir un effet anti-inflammatoire global. Notre projet vise à confirmer l’effet anti-inflammatoire des ligands des récepteurs du stress dans un modèle murin d’inflammation intestinale aigüe et au cours de la phase chronique de la maladie pour répondre au besoin de traiter les patients en phase chronique de la maladie. L’ensemble de ces résultats nous permettra de déterminer si les ligands des récepteurs du stress ont des effets bénéfiques in vivo dans un contexte inflammatoire.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de mettre en évidence l’intérêt thérapeutique d’une stimulation des récepteurs du stress pour la prise en charge des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. Nous pourrons également évaluer si les traitements présentes des effets toxiques et définir les doses de traitement qui pourront ensuite servir à des études de toxicité ou de disponibilité.
Procédures
La procédure expérimental 1 nécessite l’anesthésie des souris pour l’injection intrarectale. L’anesthésie gazeuse sera pratique une seule fois (au moment de l’induction de l’inflammation) et durera 5 min maximum. La pesée quotidienne des souris durera moins d’1 minute et les injections intrapéritonéales prévues tous les 2 jours dureront également moins d’1 minute. La procédure expérimentale 2 nécessite un gavage des animaux. Ce geste technique durera moins d’1 minute. Les pesées (quotidiennes) et les injections intrapéritonéales (tous les 2 jours) dureront moins d’1 minute.
Impact sur les animaux
Nous supposons que la procédure expérimentale classée sévère engendrera de la douleur chez les animaux et de la diarrhée. Nous pouvons nous attendre à avoir des animaux prostrés, peu mobiles, des saignements rectaux, une diarrhée prolongée, ou une perte de poids supérieure à 20% du poids initial. Concernant le modèle expérimental chronique, classé en procédure modérée, nous supposons que l’infection des souris par un pathogène puisse induire des selles molles voir des diarrhées et une perte de poids mais aucune autre souffrance. La littérature ne rapporte pas de saignements rectaux dans ce modèle et nous ne nous attendons pas à en retrouver.
Devenir
Les animaux devront tous être mis à mort afin de pouvoir collecter le colon.
Remplacement
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) sont des pathologies chroniques entrecoupées de période de phase aigüe. A l’heure actuelle, seule la phase aigüe est prise en charge sans pour autant induire un effet curatif. En effet, les traitements proposés jusqu’à présent, visent surtout à améliorer le bien-être du patient. Par ailleurs, le traitement le plus répandu (qui est basé sur l’utilisation des corticoïdes) ne peut pas être utilisé chez l’enfant. Enfin, les MICI peuvent au bout d’un certain temps, entraîner la survenue du cancer colorectal Il est donc important de mettre en place des traitements qui peuvent agir sur la phase chronique et sur la phase aigüe et capables de prévenir la survenue d’une phase aigüe. Dans ce contexte d’inflammation chronique de l’intestin, qui est une véritable gêne pour le patient, nous voulons voir si des molécules qui reconnaissent les récepteurs de stress peuvent permettre la diminution de cette inflammation. En effet, nous avons réussi à montrer dans les modèles in vitro et grâce à l’analyse de différents marqueurs, basé sur des lignées primaires de macrophages, qu’un traitement par ces molécules permettait une modification de la réponse inflammatoire et pourrait à ce titre avoir un effet anti-inflammatoire global. Notre projet vise à confirmer l’effet anti-inflammatoire de ces molécules ciblant les récepteurs du stress dans un modèle murin d’inflammation intestinale aigüe et au cours de la phase chronique de la maladie pour répondre au besoin de traiter les patients en phase chronique de la maladie. L’ensemble de ces résultats nous permettra de déterminer si ces molécules ont des effets bénéfiques in vivo dans un contexte inflammatoire.
Réduction
Notre projet s'engage à réduire autant que possible l'utilisation d'animaux dans l'expérimentation à des fins de recherche, tout en garantissant des normes élevées de bien-être animal et d'intégrité scientifique. Le développement des modèles in vivo est fondé sur des recherches scientifiques approfondies et un protocole expérimental bien défini. Avant de commencer toute expérience, nous réaliserons une planification minutieuse pour nous assurer que chaque animal est utilisé de manière pertinente. Enfin, nous évaluerons régulièrement nos protocoles et pratiques pour identifier de nouvelles opportunités de réduction et d'amélioration.
Raffinement
Les souris disposeront d’une phase d’habituation à la manipulation par les expérimentateurs pour réduire leur appréhension. Les souris seront examinées tous les jours pour surveiller leur inconfort (contrôle des fèces, isolement du groupe, absence de toilettage). Par ailleurs, les injections intrarectales se feront sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane pour limiter le stress sur un tapis chauffant pour limiter la perte de chaleur durant l’anesthésie. Les animaux seront hébergés à raison de 6-10 souris par cage en présence d’éléments nécessaires à la fabrication d’un nid. De la nourriture et de l’eau seront ajoutés dans la cage pour prévenir le manque de mobilité possible de certains animaux. Également, des points limites spécifiques de chaque modèle seront appliqués.
Choix des espèces
L’étude du rôle des ligands du récepteur de stress β3 dans la prévention de l’inflammation intestinale in vivo nécessite l’utilisation de modèles murins, dont les similarités des caractéristiques cliniques et histo-pathologiques avec l’homme permettent l’extrapolation à l’homme. C’est donc une approche validée par la communauté scientifique dans notre domaine d’étude. Nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines correspondant à un stade de développement adulte, stade auquel le système digestif murin est bien en place afin d’étudier le potentiel anti-inflammatoire des agonistes des récepteurs. Le modèle murin induit de MICI, obtenu par l’utilisation de molécules chimiques irritantes en intrarectal est très utilisé car il est relativement simple à mettre en œuvre et car dès le début, la durée et la sévérité de l’inflammation sont contrôlables. Le modèle murin d’infection du tractus gastro-intestinal par une bactérie pathogène de la souris est un modèle de référence pour l’étude de l’inflammation chronique et est très documenté dans la littérature. Enfin, les quantités de ligands du récepteur de stress utilisées chez la souris sont faibles et permettent de diminuer les coûts tout en obtenant des résultats pertinents.
Génération d’anticorps humains à l’aide d’une nouvelle lignée de souris génétiquement modifiée.
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Fournir des anticorps de référence pour des kits de diagnostic vendus à des clients, en remplacement des produits d'origine humaine : voilà l'objet de ce protocole, où 568 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour collecter leur sang et leur rate, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. La souffrance vient ici de leur génome plus que des gestes, qui se limitent à un prélèvement de sang mensuel de deux minutes. Ces souris développent une lymphoprolifération vers seize à dix-huit semaines chez les femelles, une insuffisance rénale progressive, des ganglions gonflés et des lésions cutanées, et leur espérance de vie ne dépasse pas vingt à vingt-trois semaines. Le porteur annonce qu'une lignée cellulaire cultivée à partir de leur rate rendra ensuite les animaux inutiles, et affirme dans le même temps que le recours à la souris est "indispensable" pour obtenir des anticorps de forte affinité.
Objectifs
Le but est de générer des anticorps humains à l’aide de souris génétiquement modifiées et de les mettre à disposition pour la clinique humaine. Ces anticorps seront utilisés dans des kits cliniques capables de détecter des anticorps donné, spécifiques d’une cible précise (bactérie, virus, allergène, marqueurs métaboliques, tumoraux, d’auto-immunité, etc.). Ces kits nécessitent un contrôle positif comprenant un sérum humain et des anticorps de référence pour assurer la qualité des tests. Toutefois, pour des raisons légales et éthiques, la production d’anticorps à partir de produits d’origine humaine est appelée à disparaître. Un autre obstacle est le manque de standardisation dû à la variabilité du taux d’anticorps d’un patient à l’autre. En outre, il est devenu difficile de répondre à la demande croissante en produits d’origine humaine. Pour certaines pathologies, il est parfois ardu d’obtenir un sérum humain présentant la spécificité requise. La production d’anticorps humains grâce à la souris offre plusieurs avantages : - Innocuité garantie : absence de contamination par des agents pathogènes. - Production robuste : respectueuse des contraintes réglementaires. - Évolution technologique : vers la suppression des produits d’origine humaine. - Standardisation : assurant la reproductibilité des tests. - Offre sur mesure : adaptée aux besoins spécifiques. Nous utiliserons des souris génétiquement modifiées pour reproduire une réaction immunitaire humaine et obtenir des anticorps très proches de ceux des patients. Pour ce faire, une lignée de souris, spécialisée dans la production d’anticorps humanisés IgG utiles pour le traitement de pathologies telles que l’otite, la sinusite, la bronchite et la pneumonie, avec une deuxième lignée de souris, caractérisée par une intense production de globules blancs.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra le développement d'une lignée cellulaire in vitro stable pour la production d'IgG à partir de la rate des souris génétiquement modifiées utilisées, contribuant ainsi à réduire le nombre d'animaux nécessaires à la production de grands lots d'anticorps. De plus, la capacité de moduler la réponse immunitaire constitue un atout considérable, permettant la génération d’anticorps spécifiques pour le traitement de maladies infectieuses et utiles dans le cadre de l’auto-immunité, des inflammations chroniques, des cancers, des allergies, voire des troubles hématologiques. Les animaux seront étudiés avant que le phénotype dommageable ne devienne trop prononcé (avant 20 semaines).
Procédures
Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins, avec un intervalle de 1 mois entre chaque. Il faut environ 2 minutes pour réaliser un prélèvement.
Impact sur les animaux
Ces animaux présentent un phénotype susceptible de causer plusieurs effets indésirables, notamment une lymphoprolifération qui se manifeste entre 16 et 18 semaines chez les femelles, et entre 18 et 20 semaines chez les mâles. Ils développent également une insuffisance rénale progressive, une lymphadénopathie, ainsi que des lésions cutanées. Leur espérance de vie est de 20 semaines pour les femelles et de 23 semaines pour les mâles. De plus, la répétition des prélèvements sanguins pourrait entraîner un léger inconfort chez les souris.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de l'expérience afin de collecter le sang et la rate.
Remplacement
Une réponse immunitaire in vivo est essentielle pour obtenir des anticorps ayant la plus forte affinité pour une cible spécifique, c’est-à-dire un antigène donné. Les anticorps synthétiques, en revanche, seraient moins spécifiques. C’est pourquoi l’utilisation des souris est indispensable. Les souris génétiquement modifiées permettent de reproduire une réaction immunitaire comparable à celle observée chez l'homme, ce qui permet d’obtenir des anticorps très proches de ceux retrouvés chez les patients.
Réduction
Chaque année, nous allons produire 96 animaux, dont 80 seront utilisés pour réaliser les prélèvements de sang. Les autres animaux serviront pour de nouveaux accouplements. Pour ce projet, nous utiliserons à la fois les mâles et les femelles. Le nombre théorique d'animaux pourra être réduit si le client obtient le nombre d'anticorps nécessaire avant l'utilisation de l'ensemble des animaux. Nous prélèverons les rates pour ensuite réaliser la production des anticorps in vitro. Le but étant de trouver entre 2 et 30 références de nouveaux anticorps grâce à ces souris. Ainsi, les animaux seront utilisés uniquement pour la phase de développement initiale. Une fois les anticorps créés, l’utilisation d’animaux ne sera plus requise. Nous évaluerons la production d’anticorps chez toutes les souris à la fin du protocole. L’approche décrite dans ce projet permettra la stabilisation d’une lignée productrice d’anticorps d’intérêt, ce qui permettra de s’affranchir de l’utilisation d’animaux pour les étapes ultérieures de la production. Ce projet ne nécessite pas de faire des statistiques.
Raffinement
Afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, nids d'enrichissement, stabulation en groupe), ce qui permettra de réduire le stress et de limiter au maximum la souffrance animale. Une surveillance quotidienne de l'état de santé des animaux sera assurée, avec un suivi de l'apparition des ganglions lymphatiques et des lésions cutanées à partir de l'âge de 11 semaines (âge d'apparition des premiers symptômes). En cas de signes de souffrance, le personnel qualifié et le vétérinaire pourront décider de l'arrêt de l'expérimentation et de l'euthanasie de l'animal. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion supplémentaire au sein du groupe. Les animaux blessés, qu'il s'agisse du dominant isolé ou des dominés restés en groupe, recevront des soins appropriés. Les animaux blessés seront retirés temporairement de la procédure (si nous parvenons à les soigner) ou définitivement, une euthanasie sera alors réalisée. Des soins locaux seront administrés à tout animal blessé. Si une douleur est présente, un antalgique pourra être administré selon les recommandations vétérinaires. Lors des prélèvements sanguins, nous effectuerons une compensation du volume prélevé avec du sérum physiologique.
Choix des espèces
La génétique et le système immunitaire des souris sont bien caractérisés. De plus, il existe de nombreux réactifs immunologiques spécifiques aux souris, permettant une analyse très détaillée de la réponse immunitaire face aux antigènes. Par ailleurs, l’utilisation de modèles animaux standardisés comme la souris permettra d’induire une réponse humorale caractéristique et facilement identifiable. Les animaux seront utilisés entre 8 à 18 semaines, c'est-à-dire une fois qu'ils sont adultes mais avant que le phénotype dommageable ne devienne trop prononcé.
Suivi à long terme de lignées de souris génétiquement modifiées pouvant développer des tumeurs cérébrales
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Ataxie, aphasie, troubles respiratoires, dos voûté, poils hérissés : ces signes, notés trois fois par semaine sur une grille, déclenchent la mise à mort des souris chez qui la tumeur cérébrale se développe trop. 300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements terminaux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles portent des formes modifiées d'un gène qui provoquent chez elles des tumeurs du système nerveux central entre neuf et quatorze mois, et 96 d'entre elles subissent une chirurgie de vingt minutes, 102 un prélèvement de sang. Le porteur annonce des connaissances qui "devraient" améliorer la prévention et le traitement des cancers du système nerveux, quand le suivi des animaux, lui, va jusqu'à dix-huit mois de vie avec une tumeur en croissance.
Objectifs
Notre équipe étudie le rôle d’un gène impliqué dans différents types de cancer. Dans ce projet, nous nous intéressons plus particulièrement à 2 formes modifiées de ce gène qui sont observées dans le développement de tumeurs cérébrales chez les patients Li-Fraumeni, un syndrome de prédisposition tumoral. L’objectif du projet est de réaliser un suivi à long terme et un échantillonnage de 3 lignées de souris génétiquement modifiées pour ce gène. Ces lignées nous permettront d’étudier l’initiation et la progression tumorale dans le système nerveux central (SNC) comme chez les patients Li-Fraumeni. Le développement tumoral sera suivi en utilisant différentes modalités et différents organes seront également analysés en détails au niveau histologique, métabolique et moléculaire.
Bénéfices attendus
D’une manière générale, le projet devrait générer de nouvelles connaissances permettant d’améliorer la prévention et le traitement des cancers du système nerveux central. De façon plus spécifique, il aboutira à la génération de modèles d'études inédits du syndrome Li-Fraumeni permettant de comprendre les mécanismes à l’origine du développement de tumeurs cérébrales chez ces patients. Ces modèles animaux seront utilisés pour des études mécanistiques et pour la découverte de nouveaux biomarqueurs circulants améliorant le suivi des patients.
Procédures
Procédure chirurgicale : 96 souris (20 minutes par souris). Sur animaux vigiles : prélèvement sanguin 102 souris (3minutes par souris). Les nuisances associées à ce modèle murin peuvent être : le développement d’une masse tumorale pouvant entrainer des troubles neurologiques (ataxie, aphasie notamment), des signes d'anémie, ou troubles du comportement.
Impact sur les animaux
Les caractères observables pour les animaux exprimant les formes mutées dans le SNC est le développement de tumeurs cérébrales entre 9 et 14 mois de vie. Les nuisances associées à ce développement de tumeurs peuvent être les suivantes: développement d’une masse tumorale pouvant entrainer des troubles neurologiques (ataxie, aphasie notamment), des signes d'anémie, ou troubles du comportement. Les nuisances liées à l'expérimentation seront liées aux prélèvements sanguins ou lors de la perfusion intra-cardiaque.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des prélèvements terminaux
Remplacement
Les questions posées dans le cadre de ce projet impliquent l’utilisation de modèles murins reflétant au mieux la physiologie d’un point de vue intégrée, en particulier par rapport aux mécanismes liés à la reprogrammation métabolique des cellules cancéreuses. Il n’existe à ce jour aucun modèle de substitution, et l’utilisation de souris reste la seule alternative pour l’analyse des mécanismes précoces impliqués dans l’initiation tumorale.
Réduction
Dans le cadre de ce projet, nous utiliserons 100 animaux par lignée soit 300 animaux pour les 3 lignées. Ce nombre a été déterminé à partir d'expériences comparables réalisées dans le passé et par analyse statistique, nous permettant ainsi d'estimer la variabilité expérimentale que l'on observerait pour les analyses souhaitées.
Raffinement
Un examen des animaux sera effectué 3 fois par semaine et les fiches de suivi individuel seront complétées afin de détecter les premiers signes neurologiques et comportementaux associés à l’émergence de tumeurs cérébrales (ataxie, troubles de la respiration, isolement, absence de mobilité ou agitation anormale, modification de l’embonpoint, hérissement des poils, dos voûté). La sévérité de ces signes sera déterminée selon une grille d’évaluation qui permettra la mise en place de soins éventuels ou conduira à l’euthanasie des animaux. Certains animaux ne présentant pas le génotype d’intérêt seront utilisés comme animaux compagnons pour ne pas garder d’animaux isolés. Les souris seront hébergées en portoirs ventilés à raison de 5 animaux maximum par cage. Dans chaque cage nous ajouterons de l'enrichissement (bâtonnets en coton (safe roll), frisottis, cabane en carton). Afin de réaliser les procédures de chirurgie dans les meilleures condition, nous utiliserons une combinaison d'anesthésique et d'antidouleur.
Choix des espèces
L’espèce choisie pour cette étude est la souris car elle est l’espèce qui est le mieux défini génétiquement et pour laquelle les données scientifiques de référence sont nombreuses. Les animaux seront suivis en longitudinal de l’âge de 4-6 semaines et jusqu’à l’âge de 18 mois maximum.
Rôle d’une molécule dans la progression tumorale et étude d’une thérapie ciblant cette molécule dans des modèles murins
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 020 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 180 d'entre elles et sévère pour 840. Une partie reçoit une greffe de cellules de tumeur cérébrale par injection directe dans le crâne sous anesthésie, puis un suivi par imagerie une à deux fois par semaine pendant trente-deux semaines au maximum, avec les symptômes neurologiques, les céphalées et la perte de poids que le porteur associe à ce cancer. D'autres portent une tumeur greffée sous la peau du flanc, mesurée au pied à coulisse deux à trois fois par semaine. Le porteur décrit des cultures de cellules en trois dimensions "largement utilisées en parallèle", seules les thérapies efficaces sur ces organoïdes passant chez la souris, et conclut néanmoins que les tests précliniques sur animaux sont "indispensables".
Objectifs
Une protéine a été identifiée dans la survenue, la survie et la résistance des tumeurs du cerveau, cancers très agressifs et invasifs. Il sera vérifié ici les rôles de cette protéine en la supprimant ou en l’ajoutant au cours du développement des tumeurs. De plus, dans le but de développer un anticorps thérapeutique ciblant cette protéine, des nouveaux anticorps seront marqué par fluoresence afin de suivre leur capacité à ne cibler que les tumeurs exprimant la protéine.
Bénéfices attendus
Le cancer du cerveau étudié dans cette étude est l’une des plus fréquentes tumeurs originaires du cerveau, et en dépit des efforts de la recherche, cette pathologie reste incurable. Les traitements actuels sont très délétères et la survie des patients après diagnostic est de 12-18 mois. Cette étude déterminerait l’intérêt d’une nouvelle cible thérapeutique et participerait au développement d’un traitement supplémentaire pour la prise en charge de ces patients.
Procédures
Les souris recevant une greffe de cellules tumorales dans le cerveau subiront une seule injection intra-crânienne, sous anesthésie gazeuse et injection d’anti-douleurs en sous-cutanée (1 fois 30 minutes) en début de protocole afin d’induire le développement des tumeurs chez les souris. Ensuite elles subiront des manipulations pour les prises de poids (manipulation totale/souris = 1 minute, 2 à 5 fois par semaine) ou pour les suivis de croissance tumorale par imagerie sous anesthésie gazeuse et avec 1 injection d’une molécule permettant la visualisation (manipulation totale/souris = 10 minutes environ 1 à 2 fois par semaine) pendant toute la durée du protocole (maximum 32 semaines). Les souris recevant une greffe de cellules tumorales en sous-cutané sur le flanc subiront une injection (1 fois 40 secondes). A la suite de cette injection la souris développera une tumeur sous-cutanée. Ensuite elles subiront des manipulations pour les prises de poids (manipulation totale/souris = 1 minute, 2 à 3 fois par semaine) ou pour les suivis de croissance tumorale par des mesures au pied à coulisse (2 à 3 fois par semaine, 2 minutes de manipulation maximum donc 30 secondes d’immobilisation). L’anticorps sera administré par injection intraveineuse dans la veine de la queue (1 seule fois, 2 minutes de manipulation dont 3 secondes d’injection). Des prélèvements sanguins sont réalisés (5 fois, 2 minutes dont 2 secondes d’insertion de l’aiguille de la seringue dans la queue).
Impact sur les animaux
Toutes les souris prévues dans le protocole subiront différentes manipulations chaque semaine pouvant engendrer un stress pour des prises de poids et le suivi de la croissance tumorale. Les souris subiront également une injection intra-crânienne unique à 8 semaines, pour induire les tumeurs. Ces nuisances sont diminuées par la mise en place de précautions spécifiques à chaque geste. En particulier, l’injection intra-crânienne sera faite sous anesthésie et avec des antidouleurs adaptés. Ces animaux développeront des tumeurs avec les nuisances liées aux cellules tumorales de cancer du cerveau (symptômes neurologiques, des céphalées et une perte de poids). Certaines souris subiront des injections intraveineuses dans les veines de la queue qui pourraient entrainer un inconfort ou des inflammations au site d’injection.
Devenir
Tous les animaux porteurs de tumeurs seront mis à mort en fin de procédure expérimentale selon les critères décrits dans le projet afin de pouvoir récolter les cerveaux ou les tumeurs pour des analyses biologiques. Les animaux non porteurs ne pourront pas être réutilisés et devront également être mis à mort afin d'éviter un développement de tumeurs de manière tardive.
Remplacement
Des travaux sur des cultures de cellules cancéreuses pour lesquelles notre protéine d’intérêt a été préalablement bloquée entrainent la mort de ces cellules. Les cancers du cerveau nous intéressent pour la diversité des cellules qui les composent ainsi que toutes les interactions entre elles = microenvironnement tumoral. Ces éléments sont nécessaires à la compréhension de l’impact de notre protéine d’intérêt. D’après les publications scientifiques, cette diversité n’est pas retrouvée dans les cultures cellulaires (qui contiennent en général un nombre très limité de types cellulaire différents) mais uniquement dans les tumeurs chez la souris où l’on retrouve un microenvironnement tumoral complet avec tous les types cellulaires comme les cellules cancéreuses, les cellules immunitaires, les cellules des tissus touchés par ce type de cancer. Les test-précliniques sont aussi indispensables pour valider la capacité d’un nouvel outil thérapeuthique à atteindre la tumeur et pas d’autres sites dans le corps. Mais ce protocole reste complémentaire à des tests sur des cellules en culture en 3 dimensions appelés organoïdes largement utilisées en parallèle puisque seuls les thérapies ayant montré un effet significatif sur ces cellules tumorales en culture seront testées chez la souris.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux, dans les expériences de suivi de la croissance tumorale les lignées seront testées selon des go/no go. En effet, les lignées seront testées une par une et dès que 3 lignées parmi les 9 auront répondu à l’inhibition de la protéine, les lignées restantes ne seront pas testées. Dans l'expérience d'imagerie des anticorps par fluorescence, les souris seront utilisées pour différents temps d’imagerie (15 min, 1h45, 6h et 24h).
Raffinement
Les souris ont une période d’habituation aux expérimentateurs qui vont suivre le protocole. Les souris seront élevées et hébergées par groupes, avec un milieu enrichi pour améliorer leur bien-être (maison en carton, coton). Tout au long de notre expérience, le suivi rigoureux des animaux (pesées, suivi de la croissance tumorale etc.) plusieurs fois par semaine permettra la recherche de tout signe de souffrance. Des points limites adaptés sont mis en place au-delà desquels, si aucun moyen de correction de la douleur n’a été efficace, les souris sont mises à mort. L’implantation intra-crânienne, les injections et le suivi de croissance tumorale sont réalisés par du personnel qualifié afin de réduire au maximum le temps de manipulation et le stress des animaux avec au besoin anesthésie et anti- douleurs adaptées.
Choix des espèces
La souris sera le modèle dans ce protocole, nous utiliserons des femelles à 8 semaines pour induire la formation de tumeurs d’une manière proche à ce type de tumeurs chez l’Homme, puis nous suivrons cet avancement chez les mêmes individus. La souris est utilisée car elle permet de maintenir la diversité cellulaire dans les tumeurs qui est nécessaire à l’étude de notre protéine d’intérêt. De plus cette protéine n'est pas exprimée dans toutes les espèces mais on retrouve une forte ressemblance entre la forme humaine et murine, justifiant encore l'usage des souris. En dernier lieu, le modèle murin est compatible avec une étude en laboratoire en raison de sa petite taille, de sa manipulation aisée et des nombreux outils destinés à l'analyse des tumeurs qui n'existent pas tous pour d'autres espèces que l'homme et la souris.
Evaluation preclinique de nouvelles molécules thérapeutiques pour le traitement des maladies inflammatoires de l’intestin dans le modèle murin de colite induite par le transfert de lymphocytes T
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
7 040 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacune pouvant recevoir jusqu'à deux gavages par jour pendant huit semaines. Une injection de lymphocytes T dans l'abdomen de souris immunodéficientes y déclenche une colite, avec diarrhée, sang dans les fèces, perte de poids et parfois des lésions de type psoriasis, tandis que les animaux subissent des prélèvements de sang au sinus rétro-orbital ou à la jugulaire, deux à quatre notations de symptômes par semaine et jusqu'à deux échographies intra-rectales. Le bénéfice annoncé tient en une phrase, tester "à terme" de nouvelles approches thérapeutiques pour les malades. Le porteur écrit que l'évolution de la maladie entraîne "une perte de poids majeure sans impact sur le bien-être général de la souris".
Objectifs
Les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI), telles que la maladie de Crohn (MC) et la rectocolite hémorragique (RCH), sont des pathologies caractérisées par une inflammation de la paroi d’une partie du tube digestif, due à une dérégulation du système immunitaire avec pour conséquence des lésions destructrices. Ces maladies présentent des caractéristiques communes : migration de cellules inflammatoires au niveau de la paroi du tube (dans tout le système digestif pour MC alors que la RCH affecte plus le rectum et le colon). L’augmentation et la dérégulation du recrutement des granulocytes et leur suractivation contribuent à la chronicité et à l’amplification de la maladie. Le nombre de malades atteints de MICI est estimé en Europe à 1 million de patients ayant une MC et 1,5 million un RCH. Leur fréquence varie considérablement d’un pays à l’autre et leur incidence augmente avec le niveau de développement socio-économique des pays. En France, en 2022 on dénombrait 303800 personnes prises en charge pour MICI dont 53% de femmes. Les MICI sont diagnostiquées chez des sujets jeunes (entre 20 et 30 ans pour la MC, 30 à 40 ans pour la RCH). La MC prédomine chez les femmes de façon claire notamment entre 20 et 40 ans ; la RCH est plus fréquente chez l’homme après 30 ans.. S’il n’existe pas de traitement pour guérir ces maladies, les médicaments actuels permettent la plupart du temps leur contrôle durable et une qualité de vie satisfaisante des 2 types de pathologies en dehors des poussées. Toutefois certains patients ne répondent pas ou plus aux traitements proposés. Il est donc nécessaire de découvrir de nouvelles alternatives thérapeutiques. L’objectif du projet est d’évaluer l’efficacité de nouveaux composés dans un modèle de transfert de lymphocytes T provenant de souris immunocompétentes à des souris immunodéficientes. Les symptômes observés dans ce modèle sont reconnus comme étant caractéristiques des deux pathologies. Seules les molécules ayant démontré une efficacité in vitro sur les différentes voies de signalisation ciblées dans le cadre de ces pathologies seront testées chez l’animal.
Bénéfices attendus
A terme, ce projet permettra de tester et développer de nouvelles approches thérapeutiques innovantes ayant le potentiel d’améliorer la prise en charge thérapeutique des patients atteints de MICI.
Procédures
1- injection par voie intra-péritonéale de cellules inflammatoires une fois dans l’étude : moins de 1 minute, vigile 2- les composés ou leur solvant seront administrés par gavage (maximum deux fois par jour), par voie intraveineuse (maximum trois fois par semaine) ou intrapéritonéale (une fois par jour) pendant 8 semaines maximum: moins d’une minute à chaque administration, vigile. 3- 1 prélèvement sanguin : veine jugulaire ou sinus rétro-orbital, 1 fois dans l’étude, 5 minutes, anesthésie gazeuse 4- 3 autres prélèvements au maximum dans une journée, veine saphène ou submentale médiale (n’excédant pas en tout 150µL, répartis sur 1 ou 2 jours, 15 minutes en tout, vigile) pour la pharmacocinétique 5- 2 à 4 scorings par semaine, 15 min à chaque fois, vigile 6- au maximum 2 échographies intra-rectales, 20 min chacune, sous anesthésie gazeuse
Impact sur les animaux
L’injection intrapéritonéale de lymphocytes T chez des souris immunodéficientes induit le développement des signes cliniques des MICI. Les effets indésirables attendus chez ces souris incluront donc une diarrhée, du sang dans les fèces et de la perte de poids. Conformément à ce qui est décrit dans la littérature et à ce qui a été observé lors de projets précédents, des signes de psoriasis peuvent également apparaitre. Les souris recevront également différents traitements (pendant au maximum 8 semaines) par gavage oral ou par injection intrapéritonéale ou intra-veineuse, traitements susceptibles de créer de l’inconfort voire de la toxicité. Conformément à ce qui est décrit dans la littérature, confirmé par notre expérience, l’évolution de la maladie entraine une perte de poids majeure sans impact sur le bien-être général de la souris (mobilité, toilettage..) D’autres gestes effectués seront également susceptibles de générer de l’inconfort et incluent : - les différents prélèvements de sang réalisés - l’administration intra-rectale de gel d’échographie nécessaire à l’acquisition d’images de colon par échographie - l’acquisition d’images de colon par échographie intra-rectale
Devenir
Les souris seront mises à mort. Les tissus seront collectés post-mortem pour l’analyse de la physiopathologie.
Remplacement
À ce jour, aucun modèle cellulaire ne récapitule complètement l’installation d’une MICI dans un organisme, la complexité cellulaire associée, ni même la cinétique d’absorption et d’élimination d’une molécule. Cette complexité rend ainsi nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour évaluer l’efficacité de potentiels candidats médicaments. Les expérimentations chez l’animal permettent de préserver l’intégrité des organes impliqués dans la pathologie, leurs interactions cellulaires et leurs interactions avec les systèmes nerveux, endocrinien, circulatoire, gastro-intestinal, immunitaire. Ils sont indispensables pour comprendre les mécanismes pathogéniques, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, tester l’efficacité et la toxicité de thérapies innovantes.
Réduction
Nous utiliserons un modèle bien établi dans la littérature afin de limiter la phase de mise au point et ainsi de réduire le nombre d’animaux. Le nombre de souris utilisées par groupe sera réduit au minimum tout en permettant une bonne analyse statistique. Le modèle ayant été mis en place depuis plusieurs années, nous savons qu’il faut 12 animaux par groupe pour une étude thérapeutique et 20 animaux par groupe pour une étude prophylactique. Tous les composés qui seront testés dans ce modèle seront sélectionnés sur la base de leur efficacité in vitro et leur bonne distribution pharmacocinétique. Un grand nombre de composés synthétisés sont préalablement éliminés sur la base de ces résultats et ne sont pas évalués in vivo.
Raffinement
Les animaux feront l’objet d’une surveillance journalière. Enfin, si les points limites préalablement établis sont atteints, l’animal sera mis à mort de façon anticipée afin d’éviter toute souffrance. Afin de réduire le stress, Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé en continu (température, pression, hygrométrie, renouvellement d’air, alternance jour/nuit) relié à un système d’alarme. La densité dans les cages sera en conformité avec les recommandations et autant que possible, les groupes d’animaux dans les études resteront ceux formés pendant l’acclimatation. Les animaux et leurs conditions d’hébergement (environnement, nourriture, eau de boisson) seront sous surveillance quotidienne. L’environnement des animaux sera enrichi à leur arrivée et pendant toute la période d’acclimatation (igloo, sizzle pad, aspen).
Choix des espèces
L'utilisation de la souris est basée sur une littérature abondante décrivant ce modèle de MICI induit par le transfert de lymphocytes T à des souris immunodéficientes Les animaux seront utilisés au stade adulte afin d’évaluer les composés d’intérêt à visée anti-inflammatoire sur un système immunitaire mature.
Validation d’un candidat médicament dans le traitement d’une maladie neurogénétique rare
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Pour vérifier si un candidat médicament déjà testé contre une autre maladie neurodégénérative agit aussi sur une maladie neurogénétique rare, 290 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles portent les symptômes de la maladie, démarche irrégulière, tremblements, difficultés respiratoires et perte de poids continue, et reçoivent le traitement par gavage, par injection sous la peau ou par une mini-pompe implantée chirurgicalement pendant quatre semaines, avec deux prélèvements de sang à la queue et cinq tests comportementaux que le porteur ne nomme pas. Les cerveaux sont prélevés après une mise à mort par exsanguination sous anesthésie. Seuls des mâles sont utilisés, la variabilité des symptômes chez les femelles étant jugée trop grande, et les souris qui se dégradent jusqu'aux points limites annoncés, poils hérissés, prostration, isolement, sont mises à mort avant la fin.
Objectifs
Le projet de recherche vise à développer un médicament dans le traitement d’une maladie neurogénétique rare avec symptômes moteurs et mentaux sévères. Ce candidat médicament a déjà montré des résultats positifs dans le traitement d’une autre maladie neurodégénérative et ce projet a pour objectif de voir si, sur la base des mêmes mécanismes d’action, ce médicament démontre les mêmes effets innovants sur une autre maladie aux atteintes sévères similaires.
Bénéfices attendus
Les résultats du projet permettront de, premièrement, valider que l’administration du médicament possède un intérêt thérapeutique dans un modèle de souris de cette maladie génétique et deuxièmement, d’évaluer si le traitement peut empêcher l’apparition des symptômes, ou les ralentir. Ces résultats permettront le développement clinique du médicament ciblant les symptômes de cette maladie avec pour objectif de répondre à une forte attente des patients et de combler un besoin médical non pourvu.
Procédures
Une partie des animaux sera traitée par voie orale (
Impact sur les animaux
Le modèle animal de cette maladie présente des symptômes moteurs et mentaux qui s’aggravent progressivement avec l’âge. Les animaux présentent notamment une démarche irrégulière, des tremblements, des difficultés respiratoires et une perte de poids constante, progressive et indépendante de la prise alimentaire. La pose de mini-pompe par chirurgie peut entrainer une inflammation légère et transitoire.
Devenir
La mise à mort de l'ensemble des animaux se justifie par le besoin de prélever les cerveaux. Ces derniers serviront à réaliser des analyses biologiques qui nous permettront de comprendre le mécanisme d’action du traitement et de démontrer que les symptômes de la maladie sont atténués voire résorbés par le traitement.
Remplacement
Nous cherchons à étudier les effets d’un traitement avec notre molécule sur l’amélioration et l’apparition des symptômes de la maladie. Pour cela, nous devons obligatoirement passer par une étude animale car aucun modèle cellulaire ne permet actuellement de mimer fidèlement les traits comportementaux de la maladie et de reproduire la complexité d’un organisme vivant. Notre projet correspond ainsi à un travail de préclinique visant à mettre au point des études cliniques qui seront conduites chez les patients atteints de cette maladie.
Réduction
Dans un souci de réduction du nombre d’animaux utilisés, nous avons conçu notre projet de façon progressive. Ainsi, le projet est constitué de 3 expériences indépendantes : l’expérience 2 ne sera réalisée que si l’expérience 1 a montré des résultats satisfaisants et ainsi de suite. Si dès l’expérience 1 les résultats ne sont pas satisfaisants, l’étude sera arrêtée et les expériences 2 et 3 ne seront pas réalisées. L’étude ne sera réalisée que sur les mâles à cause d’une trop grande variabilité des symptômes chez les femelles.
Raffinement
Ce projet vise à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal. Les animaux seront surveillés pendant toute la durée de l’étude, de façon à prévenir toute survenue de points limites (poils hérissés, prostration, isolement dans la cage), et leur poids sera évalué de façon quotidienne. Le traitement sera administré par le personnel compétent, permettant ainsi de limiter au maximum le stress associé à ce geste. Une habituation aux tests de comportement sera réalisée avant chaque test et des mini-pompes seront implantées sous la peau afin de délivrer la molécule quotidiennement sans déranger l’animal. Ces mini-pompes seront implantées sous anesthésie et analgésie générales, les animaux seront sur un tapis chauffant et auront du gel hydratant sur les yeux tout au long de la chirurgie (15 minutes maximum) afin de ne pas assécher leurs yeux. De plus les cages seront supplémentées en nourriture gélifiée afin de limiter l’effort que l’animal doit fournir pour se nourrir quand il vieillit.
Choix des espèces
Les études précédemment réalisées avec cette molécule ont été faites chez la souris. Dans un souci de cohérence et afin de pouvoir compléter nos données, la présente étude sera également réalisée chez la souris. Puisque l’étude vise à montrer qu’un traitement améliore les symptômes voire retarde leur apparition, notre étude sera réalisée sur des souris adultes présentant les symptômes de la maladie.
Nouvelle thérapie ciblant les voies de la résolution de l’inflammation dans des modèles inflammatoires murins d’arthrite
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
La douleur dure jusqu'à la mise à mort de l'animal, sauf si un point limite est atteint plus tôt, pour l'un des quatre modèles d'arthrite de ce projet. 1092 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. L'inflammation est déclenchée par une injection de collagène dans la queue, dans l'articulation du genou ou dans la voûte plantaire, suivie selon le porteur de boiterie, de gonflement des articulations, de prostration et de difficultés à marcher, avec des traitements injectés trois fois par semaine et des prises de sang hebdomadaires sur animal vigile. Le projet teste deux molécules censées relancer la résolution de l'inflammation sans immunodéprimer les patients, bénéfice annoncé pour des personnes en échec thérapeutique quand les atteintes infligées aux souris sont, elles, immédiates et certaines.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chronique ont aujourd’hui une incidence en constante augmentation notamment dans les pays industrialisés. Ces maladies chroniques peuvent être systémiques et toucher tout l’organisme comme la polyarthrite rhumatoïde ou la sclérose en plaque ou alors elles peuvent être localisées à un seul organe comme la maladie de Crohn ou le diabète de type I. Ces inflammations chroniques entraînent de nombreux dommages tel que la formation de lésions, une réparation tissulaire inefficace voire la destruction de l’organe dans les formes les plus sévères. Les traitements actuels, tel que les molécules inhibitrices du TNFa (molécule inflammatoire), ont pour objectif d’empêcher l’initiation de l’inflammation de se mettre en place et ainsi limiter l’inflammation exacerbée chez ces patients. Seulement, l’effet de ces molécules n’est pas spécifique à la pathologie et elles sont associées à de nombreux effets secondaires tel que des nausées/vomissement, de la fatigue ainsi qu’une immunodépression du système immunitaire rendant les patients très fragiles aux infections. Les nouvelles stratégies d’immunothérapie cherchent à améliorer l’effet anti-inflammatoire des traitements en limitant les effets secondaires et pour cela les approches sont plus spécifiques des cellules de l'immunité. De nouveaux récepteurs à la surface des cellules immunitaire ont été identifiés comme jouant un rôle dans la modulation de leur fonction inflammatoire. Nous aimerions tester différentes molécules capables d’activer un de ces récepteurs et analyser les effets engendrés par cette activation dans différents modèles animaux de maladies inflammatoires. Ce type d’étude nécessite une preuve d’efficacité in vivo dans des modèles précliniques, c’est pourquoi nous voulons tester ces thérapies chez la souris. Le nombre d’animaux utilisés sera de 1092 souris pour combiner un nombre réduit d’animaux avec une pertinence statistique.
Bénéfices attendus
Les traitements actuels utilisés contre la polyarthrite rhumatoïde sont des traitements 1) limitant la douleur du patient avec notamment des corticoïdes ou des anti-inflammatoires associés à 2) un traitement de fond modulant le système immunitaire (immunosuppresseur ou immunomodulateur). Ces traitements entrainent néanmoins de nombreux effets secondaires tels que des vomissements/nausées, de la fatigue, des maux de tête ... Les immunomodulateurs, quant à eux, induisent une immunodépression du patient le rendant plus sensible aux infections du quotidien. De plus, et malheureusement, il a été démontré que dans 50% des cas une inefficacité du traitement est observée un an après la première injection. Il est donc primordial de mettre en place de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces patients. Nous avons donc développé de nouvelles molécules ciblant les récepteurs de la résolution de l’inflammation. Ces molécules ne modifient pas l’initiation de l’inflammation et permettraient donc aux patients de ne plus être immunodéprimés et de pouvoir répondre à tout type d’attaque extérieure puisque leur système immunitaire serait totalement fonctionnel. Chez l’animal nous espérons pouvoir activer la phase de récupération dans ces différents modèles avec notamment une diminution des signes cliniques et une meilleure survie. Si ces études in vivo sont bénéfiques pour l’animal nous envisageons de pouvoir débuter un essai clinique chez l’humain afin de traiter les patients n’ayant plus de possibilité thérapeutique et de leur proposer une nouvelle stratégie.
Procédures
Les animaux seront soumis à plusieurs type d'injection : intra-péritonéal, intra-articulaire (genou), intradermique, voûte plantaire ou sous-cutanée. Ces injections seront effectuées sous anesthésie et analgésique. Des prélèvements sanguins au niveaux de la veine mandibulaire pourront être effectués sur animaux vigiles (1 fois par semaine maximum). Pour finir les traitements seront injectés en intra-péritonéale sur animaux vigiles (3 fois par semaine)
Impact sur les animaux
Modèle 1 : les animaux subiront une injection en intra-dermale dans la queue de collagène II, engendrant une douleur rapide le temps que le produit diffuse dans l’organisme. Par la suite les animaux commenceront à montrer des signes cliniques de la pathologie avec notamment une perte de poids, le gonflement des articulations et des difficultés à marcher. Modèle 2 : lors de l’induction de la pathologie les animaux recevront une injection dans l’articulation cela entrainant une douleur légère de courte durée (lors de la piqûre). Par la suite les animaux commenceront à montrer des signes cliniques (boiterie, prostration) provoquant de la douleur chez l’animal et ceci jusqu’a l'euthanisie de l'animal sauf si les points limites sont atteints avant. Modèle 3 : une injection dans l’articulation du genou sera faite entrainant une douleur légère et rapide. Rapidement des signes cliniques seront visible (boiterie, difficulté à poser la patte …) provoquant de la douleur chez l’animal. Modèle 4 : une injection dans la voûte plantaire sera effectuée entrainant une légère douleur lors de l’injection. Rapidement (dès 2h) des signes cliniques vont apparaitre de type gonflement et boiterie entrainant de la douleur.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et des organes d'intérêts pourront être prélevés pour compléter les analyses.
Remplacement
Avant l’utilisation chez l’animal, nous sélectionnerons préalablement nos molécules par différents tests in vitro notamment d’affinité et d’avidité pour le récepteur mais aussi d’efficacité sur des cellules humaines. Cela nous permettra de réduire le nombre d’animaux puisque seulement 2 molécules seront étudiées dans nos modèles
Réduction
Le nombre d’animaux sera réduit autant que possible. En effet les différents axes définis plus haut ainsi que les 2 études pilotes permettent de réduire l’utilisation de l’animal puisque l’étude principale ne sera exécutée que sur l’étude pilote ayant montré une induction optimale et un effet délétère minimal sur l'animal. En amont nous avons étudié par un test statistique le nombre d'animaux nécessaire afin d'observer une différence significative dans nos expériences. Basé sur un test de distribution normale d'échantillons nous avons déterminé un nombre d'animaux de n=22 animaux/groupe nécessaire pour obtenir une différence significative entre le groupe contrôle et le groupe traité dans nos expériences
Raffinement
Les animaux auront une phase d’acclimatation de plusieurs jours et ne seront pas manipulés afin de limiter leur stress. En amont de l’expérience le protocole sera entièrement planifié afin d’éviter du stress à l’animal et les points limites seront définis afin d’anticiper toute souffrance. Les animaux montrant des signes de douleurs (prostration, poils hérissé, isolation, boiterie) lors de l’expérience recevront des anti-douleurs 3 fois par jour puis dans l’eau de biberon pour la nuit. Les animaux ne seront pas maintenus au-delà des délais décrits pour chaque modèle, limitant leur utilisation si cela n’est pas nécessaire. L’animal sera maintenu en groupe, avec des frisottis pour se camoufler ainsi que des dômes ou des tunnels. Si un animal montre de l’agressivité il sera isolé afin de préserver les autres animaux et mis dans une cage avec des enrichissements de type : dôme ou tunnel, frisottis, coton
Choix des espèces
Afin d'étudier le rôle des différentes cibles in vivo dans des modèles expérimentaux d'inflammations induit par des molécules chimiques, nous utiliserons différentes lignées chez la souris décrite pour déclencher ce type d'inflammation. Les souris utilisées auront entre 6 et 10 semaines car l’inflammation générée par les molécules chimiques utilisées dans les différents modèles est homogène dans cette tranche d’âge contrairement à des âges précoces ou avancés où les défenses immunitaires sont différentes et peuvent induire une hétérogénéité de réponse inflammatoire.
Distribution cérébrale d’agents thérapeutiques après exérèse tumorale subtotale : étude sur un modèle de fenêtre crânienne de glioblastome opéré. (EU2/2)
- Recherche appliquée
- Cancers
Un morceau de crâne remplacé par une fine lame de verre laissée en place jusqu'à la mort de l'animal, puis huit points d'observation en microscopie après une injection unique: 60 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées au terme du suivi ou dès l'atteinte d'un point limite. Chaque souris reçoit d'abord une greffe de cellules de glioblastome dans le cerveau, puis, trois semaines plus tard, une seconde chirurgie pour retirer la tumeur, avec jusqu'à cinq séances d'imagerie par bioluminescence entretemps et une injection intrapéritonéale de luciférine avant chacune. Le projet vise à décrire la cicatrisation cérébrale après exérèse et la distribution de cinq molécules fluorescentes, le porteur relevant que la plupart des études in vivo omettent cette chirurgie pourtant systématique chez les patients. Les souris utilisées sont nues et immunodéficientes, ce qui évite le rejet des cellules tumorales humaines greffées, et elles sont hébergées seules après la pose de la fenêtre crânienne.
Objectifs
La chirurgie correspond au premier traitement des patients atteints de tumeurs cérébrales, même si elle est le plus souvent imparfaite et laisse systématiquement quelques cellules tumorales qui doivent être traitées par des thérapies complémentaires (radiothérapie et chimiothérapie). Etrangement, la plupart des études in vivo chez l'animal n'incluent pas cette chirurgie. Ainsi, les conséquences de l'opération, telles que la cicatrisation du tissu cérébral après l'opération, sont mal connues et rarement prises en compte chez l'animal. Or, la chirurgie impacte forcément l'efficacité des traitements complémentaires (tels que les chimiothérapies) délivrés par voie intraveineuse après l'opération. Pour les recherches qui tentent de développer des thérapies innovantes incluant des agents de chimiothérapie, il paraît pertinent et nécessaire de mieux prendre en considération la situation post-opératoire. C'est pourquoi dans ce projet, nous proposons d'étudier par microscopie de fluorescence les modifications du tissu cérébral survenant après l'extraction de la tumeur et leurs conséquences. Notamment, nous souhaitons : 1-étudier la structure et la perméabilité des vaisseaux sanguins cérébraux lors de la "cicatrisation" après chirurgie ; 2-étudier la reprise/recroissance de la tumeur à partir des cellules tumorales laissées après chirurgie ; 3-évaluer l'impact sur la distribution intracérébrale de molécules fluorescentes administrées par voie intraveineuse. Nous prévoyons de travailler avec 5 molécules fluorescentes de taille variable qui seront administrées par voie intraveineuse et nous comparerons comment elles se répartissent dans les vaisseaux sanguins cérébraux, dans les cellules tumorales restantes et dans le cerveau sain. Les méthodes mises en œuvre dans ce projet et utilisées dans des projets précédents, sont parfaitement maitrisées. Le projet se déroulera sur 2 établissements distincts (Etablissement Utilisateur 1 : hébergement, chirurgies, injection d'agents fluorescents, imagerie de fluorescence, ; Etablissement Utilisateur 2 : imagerie par production et émission de lumière)
Bénéfices attendus
L'efficacité des thérapies anticancéreuses (agents de chimiothérapie, thérapies ciblées, ...) administrées par voie orale ou intraveineuse, est directement dépendante de la quantité d'agent thérapeutique capable d'atteindre les cellules tumorales dans le cerveau. La chirurgie, qui vise à ôter la tumeur, n'est jamais complète et laisse toujours quelques cellules tumorales à l'origine d'une reprise de la tumeur. Ce sont ces cellules "restantes" que ciblent les chimiothérapies complémentaires : il faut donc que les médicaments injectés par voie intraveineuse soient capables de les atteindre pour les détruire. Dans ce contexte, ce projet permettra de mieux comprendre la "cicatrisation" post-opératoire, et de décrire la distribution des agents de chimiothérapie, administrés après chirurgie, en fonction de leur taille. Ces éléments de connaissance sont indispensables pour nos travaux futurs qui visent à développer et optimiser de nouvelles thérapies pour les tumeurs cérébrales: ces données ouvriront des pistes de réflexion et fourniront des arguments solides concernant le "meilleur timing" pour l'administration de substances actives après chirurgie.
Procédures
Pour chaque souris, nous réaliserons une greffe de tumeur par injection de cellules tumorales dans le cerveau (1ère chirurgie d'environ 30 minutes) puis environ 3 semaines après, la tumeur formée sera ôtée par chirurgie (2ème chirurgie d'environ 30 minutes). La deuxième chirurgie nécessite d'ôter une partie de l'os du crâne (= appelée volet osseux pour permettre d'accéder à la tumeur) et en fin de chirurgie, l'os manquant sera remplacé par une lame de verre très fine pour permettre les observations du cerveau en microscopie de fluorescence. La fenêtre en verre restera positionnée jusqu'à la mise à mort des animaux. Les animaux feront l'objet de plusieurs analyses en imagerie : entre la 1ère et la 2ème chirurgie, des imageries basées sur la lumière émise par les cellules tumorales appelée bioluminescence (environ 10 minutes, répétées maximum 5 fois sur 3 semaines) nécessiteront l'injection intrapéritonéale d'un produit de contraste (appelé luciférine) avant chaque acquisition ; après la 2ème chirurgie, des molécules fluorescentes seront injectées par voie intraveineuses (1 injection 1 fois) et un suivi par microscopie sera réalisé à différents temps (avant injection, 5 min, 1h, 4h, 24h, 48h, 72h et 168h après injection puis 1 à 2 fois / semaine pour une partie des animaux)
Impact sur les animaux
La première nuisance attendue correspond au développement d'une tumeur cérébrale qui peut induire des symptômes cliniques. Mais, l'expérience montre que l'intervention chirurgicale suffisamment anticipée (environ 3 semaines après la greffe de cellules tumorales) permet de lever ces symptômes. Les chirurgies et l'imagerie par émission de lumière (bioluminescence) se feront sous anesthésie chimique. Nous privilégierons l'anesthésie gazeuse lors des imageries en microscopie de fluorescence. L'imagerie par bioluminescence nécessite un transport des animaux dont les conditions ont été optimisées lors de projets précédents afin de réduire l'inconfort et le stress des souris. Le cycle jour/nuit de l'animalerie étant inversé, la gêne occasionnée par les expérimentations diurnes sera faible, les animaux étant ainsi manipulés durant leur phase d'activité. Les injections en intraveineuse, effectuées dans la veine de la queue à l'aide d'aiguilles très fines, sont parfaitement maitrisées, ce qui permet d'éviter les risques d'extravasation notamment lors des injections d'agent anticancéreux.
Devenir
La fin de l'expérimentation correspond soit à un temps de prélèvement des échantillons, soit à l'atteinte d'un point limite, ce qui se traduit par la mise à mort pour tous les animaux.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est dans ce contexte pas possible puisque la chirurgie des tumeurs cérébrales et l'analyse de ses conséquences, notamment sur le devenir d'agents thérapeutiques, ne peuvent être étudiées qu’in vivo sur un modèle animal.
Réduction
Grâce au suivi par imagerie, nous sommes en mesure d'évaluer les événements au cours du temps. A ce stade, nous ne pouvons pas prédire si des différences faibles, modérées, ou fortes entre les différents lots et/ou au cours du temps seront observées. C'est pourquoi, nous prévoyons un maximum de 10 animaux / lot mais les expérimentations seront conduites par palier. Ainsi, pour l'étape 1, une appréciation intermédiaire des effets au bout de 4 animaux par lot (étape 1a) permettra d'ajuster la démarche en poursuivant uniquement pour les lots/les temps d'analyses/les paramètres les plus pertinents (étape 1b) selon un principe go/no go ("go" si une différence perçue doit être confirmée / "no go" si on ne constate aucune différence ou si une différence très évidente apparaît). L'étape 2 comparant la biodistribution et les effets des formes libre ou encapsulée d'agent anticancéreux ne sera conduite que si elle reste pertinente au regard des résultats de l'étape 1. Parmi les différents paramètres (longueur et ramification du réseau vasculaire, intensité de fluorescence proportion de surface fluorescente, etc…) obtenus à partir des analyses d'images de fluorescence acquises au cours du temps, ceux qui paraitront les plus pertinents feront l'objet d'une comparaison statistique.
Raffinement
Une attention toute particulière sera portée aux animaux, pendant l'hébergement, au moment des chirurgies et des imageries, et lors du transport entre les 2 établissements utilisateurs. Hébergement à 5 souris / cage jusqu'à la pose de la fenêtre crânienne puis hébergement individuel pour garantir le bien-être optimal des souris ; température et hygrométrie contrôlées, eau et nourriture ad libitum, enrichissement sous forme de sopalin et de bâtonnets en bois à ronger. Pour prévenir la douleur liée aux interventions chirurgicales et au stress engendré par la contention, les animaux seront anesthésiés. Chirurgies : anesthésie locale et analgésie pré-, per-, et post-opératoire. Protection des yeux par du gel ophtalmique. Température de l'animal maintenue par tapis chauffant. Micro-saignements stoppés à l'aide de cotons hémostatiques. Au réveil : Maintien au chaud dans une cage propre ; administration d'eau sucrée et accès à quelques croquettes humidifiées placées directement dans la cage pour faciliter la réhydratation et la récupération. Après chirurgie : nettoyage quotidien de la zone incisée. Observation quotidienne du comportement naturel et face à l'expérimentateur pour évaluer la douleur et le stress ; mesure quotidienne du poids ; alimentation, hydratation, motricité et coordination. Quel que soit le groupe, la mise à mort sera pratiquée dès atteinte des points limites définis (perte de poids et problème de motricité essentiellement). Transport : à pied entre les 2 établissements d'expérimentation dans une cage à couvercle filtrant. Les cages seront placées dans un sac isotherme pour les isoler de l'environnement extérieur, et selon la température extérieure, des ‘bouillottes’ préalablement chauffées pourront être disposées sous la cage pour éviter des variations de température liées aux conditions climatiques.
Choix des espèces
Dans les études menées en oncologie, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles murins (souris et rats). Les souris constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibiltié et de leur facilité de manipulation. Les souris nue sont classiquement utilisées dans le cas de greffes de cellules tumorales humaines : du fait de leur immunodéficience il n'y a ainsi pas de rejet du greffon tumoral implanté. Nous utiliserons des souris femelles et mâles, puisque les paramètres à étudier sont a priori indépendants du sexe.
Evaluation de l’effet des antidépresseurs sur l’épilepsie des souris modèles de la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Des souris génétiquement modifiées pour développer une forme de maladie d'Alzheimer présentent déjà, entre 3 et 5 mois, des activités épileptiques. 132 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour des analyses histologiques de leur cerveau. Après une chirurgie de 90 minutes au plus pour poser des électrodes, chacune est isolée 15 jours sous enregistrement continu de son activité cérébrale, pendant que trois antidépresseurs, selon les groupes, sont mélangés à son eau de boisson durant 10 jours. Le porteur indique que certains antidépresseurs pourraient provoquer des crises d'épilepsie sévères et une mortalité précoce, et qualifie d'"indispensable" l'isolement pendant les enregistrements. Le bénéfice pour les patients reste au conditionnel : le projet "pourrait, à long terme", aider à limiter leur épilepsie, écrit-il.
Objectifs
Dans ce projet, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées qui développent la maladie d’Alzeihmer (MA) et des activités épileptiques. Nous étudierons les effets de 3 antidépresseurs sur les activités épileptiques présentes chez nos souris. Pour cela, nous utiliserons des techniques d’enregistrement continu de l’activité cérébrale par électroencéphalographie. Compte tenu des connaissances actuelles sur les mécanismes d’action des antidépresseurs et de nos travaux antérieurs, nous suspectons un effet aggravateur de certains anti-dépresseurs et un effet protecteur pour d’autres sur l’activité épileptique dans le cadre de la MA. Notre projet pourrait, à long terme, permettre de limiter la survenue de l’épilepsie chez les patients atteints de la MA en remplaçant les traitements antidépresseurs aggravateurs par d’autres traitements ayant des bénéfices au moins similaires mais non responsables de l’accélération du déclin cognitif.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de déterminer si certains antidépresseurs exacerbent les activités épileptiques présentes chez les souris modèles de la maladie d’Alzheimer et si d'autres antidépresseurs ont un rôle protecteur vis-à-vis de ces mêmes activités. Ainsi, si notre hypothèse se vérifie, ce projet justifiera la mise en place d’études cliniques permettant de tester cette hypothèse chez les patients. A long terme, ce projet pourrait donc permettre de mieux adapter les traitements et ainsi apporter un bénéfice considérable aux patients atteints de la maladie d’Alzheimer (MA) en évitant de majorer leur épilepsie.
Procédures
Les animaux anesthésiés et analgésiés auront une chirurgie (d'une durée maximale de 90 minutes) pour la pose d’électrodes afin de réaliser des électro-encéphalogrammes. Les encéphalogrammes des animaux seront réalisés en continu pendant 15 jours. Les anti-dépresseurs seront administrés par voie orale en les mélangeant à l’eau de boisson durant 10 jours.
Impact sur les animaux
La chirurgie est susceptible d’induire une douleur modérée au stade post opératoire durant 24-48 heures. L’isolement des animaux au cours des enregistrements électrophysiologiques durera 15 jours : ceci peut induire un stress modéré. Cet isolement est indispensable à la conduite des enregistrements. Habituellement, les évènements épileptiques des souris modèles de la MA sont essentiellement des pointes isolées qui surviennent pendant le sommeil et ne sont pas associées à une modification comportementale. Mais l’administration chronique de certains antidépresseurs pourraient exacerber ces activités épileptiques et provoquer des crises d'épilepsie sévères et ainsi provoquer une mortalité précoce des souris. Les pesées peuvent entrainer un stress léger de quelques dizaines de secondes. Le génotypage des animaux pourra entrainer une douleur légère de courte durée.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour récuperer leurs cerveaux en vue d'analyses histologiques.
Remplacement
Le projet a pour objectif d’évaluer les effets des antidépresseurs couramment utilisés en clinique sur l’épilepsie dans la maladie d’Alzheimer (MA). L'épilepsie comme la dépression dépendent d'interactions qui se font entre différentes régions cérébrales au sein de larges réseaux, qui ne peuvent pas, à l'heure actuelle, être mimées dans de simples cultures cellulaires. Une approche par modélisation informatique des interactions entre maladie d'Alzheimer, épilepsie et antidépresseur ne pourra se faire que sur la base de données expérimentales qui ne sont que parcellaires pour le moment. Ainsi, nous sommes dans l’obligation d’utiliser un modèle murin de la MA qui ne peut donc être remplacé par aucun autre modèle.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe (n=12) a été déterminé sur la base de nos études antérieures de l’activité épileptique des souris modèles de la MA, de sorte à avoir une puissance statistique suffisante pour les analyses nécessaires aux comparaisons intergroupes (4 différents traitements) et intragroupes (comparaisons entre chacun des 10 jours de traitement à la baseline).
Raffinement
Les souris sont hébergées à 4 dans des cages contenant du matériel de nidification ainsi qu'une buchette pour l'enrichissement. Les animaux sont habitués à l'expérimentateur lors de 3 séances de manipulation de 10 minutes par souris (handling) avant le début des enregistrements. Les animaux seront suivis quotidiennement par des personnels formés au soin. Si une altération de l’état est observée, une grille de scoring sera utilisée pour déterminer la conduite à tenir. Les critères évalués sont : l’aspect général de l’animal (pelage, peau, yeux, bouche), les fonctions corporelles (respiration altérée), le comportement (posture, locomotion, isolement, réaction à la manipulation), le poids (pesée une fois par semaine puis quotidienne en cas de perte de poids). Pour ce dernier, le poids en fin de chirurgie sert de référence pour calculer le pourcentage de perte (pour prendre en compte le poids du connecteur). Nous avons identifié deux situations pour lesquelles une attention particulière sera portée aux souris : d’une part, la chirurgie (pose des électrodes d’éléctroencéphalographie (EEG) et période post opératoire) qui pourrait provoquer de la douleur ou de la souffrance ou l'angoisse et, d’autre part, l’isolement lors des enregistrements EEG, qui pourrait affecter le bien-être des animaux. Pour les chirurgies (acte avec réveil), les animaux seront d’abord anesthésiés puis analgésiés 15 minutes avant le début de la chirurgie. Une injection d'anti-inflammatoires sera réalisée en fin de chirurgie et le lendemain pour éviter d’éventuelles douleurs post opératoires. Pendant les deux semaines qui suivront la chirurgie, les animaux seront inspectés tous les jours. Les animaux doivent rester isolés les uns des autres lors des enregistrements électrophysiologiques pour éviter qu’ils ne rongent les câbles les uns des autres et pour éviter qu’ils ne perturbent le sommeil de leurs congénères. Or, il a été montré qu’un isolement peut provoquer une souffrance de l’animal et des modifications neurologiques si l’isolement dure plusieurs semaines (les isolements durent 5 semaines dans la plupart des études sur le sujet). Une attention particulière a donc été portée à la réduction du nombre de jours d’isolement (15 jours). La procédure s’achèvera ainsi par la mise à mort les animaux dès que les enregistrements seront terminés.
Choix des espèces
Dans ce projet, nous utiliserons des souris transgéniques modèles de la maladie d’Alzheimer. Cette lignée reproduit de nombreuses caractéristiques de la pathologie observées chez l’humain : plaques amyloïdes, déclin cognitif progressif et activités épileptiques, entre autres. Cette lignée constitue donc un modèle idéal pour l’étude des effets des antidépresseurs sur l’épilepsie dans la MA. Les animaux seront inclus dans le protocole à l’âge adulte, entre 3 et 5 mois. A cet âge, les souris modèles de la MA sont à un stade précoce de la maladie d’Alzheimer mais présentent déjà des activités épileptiques qui ne progressent pas avec l’âge.
Infarctus du Myocarde chez la souris – Identification de cibles thérapeutiques
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
Six échocardiographies sous anesthésie gazeuse, trois prélèvements sanguins à la veine mandibulaire et une chirurgie provoquant un infarctus du myocarde: 588 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour prélever le cœur. Le porteur indique que les animaux chez qui la thérapie génique échoue développeront une insuffisance cardiaque, avec troubles du rythme, difficultés à l'effort et morts subites, et que le risque anesthésique augmente chez des souris dont la fonction cardiaque est déjà dégradée. L'objectif déclaré est d'identifier des cibles de régénération cardiaque pour l'humain, dans un cadre translationnel adossé à des cliniciens. Le choix de la souris repose, selon le porteur, sur la similarité du développement et du fonctionnement cardiaques avec l'humain et sur la pertinence du modèle d'infarctus, seuls des animaux adultes étant utilisés.
Objectifs
L’objectif global de ce projet de recherche est d’identifier de nouvelles cibles cliniquement pertinentes pour induire la régénération et réparation cardiaque chez l’Homme à la suite d’une cardiomyopathie d’origine ischémique (Infarctus du myocarde). Ce projet s’inscrit dans un contexte translationnel vers le développement d’un traitement clinique grâce à l’étroite collaboration avec les cliniciens.
Bénéfices attendus
Ainsi, ce projet va permettre d’augmenter nos connaissances sur la régulation de la prolifération des cardiomyocytes et la régénération cardiaque afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour combattre les pathologies cardiovasculaires qui constituent un problème majeur en santé publique.
Procédures
-1 Chirurgie d'infarctus du myocarde sous anesthésie générale (classe modérée; 45 min-1h) - 1 injection intraveineuse sous anesthésie générale ou rétroorbitaire sous anesthésie générale et locale (classe légère, 2-5 min) - 3 prélèvements sanguins à la veine mandibulaire (classe légère, 2-5min) -6 échocardiographies sous anesthésie gazeuse (classe légère, 30 min) - 1 injection intra péritonéale (classe légère, 1 à 2 minutes)
Impact sur les animaux
Des douleurs post-chirurgie et aux sites d’injection sont à envisager. Par ailleurs le stress lié à l’anesthésie est à prendre en considération. Si le traitement par thérapie génique ne fonctionne pas, il n’y aura pas d’amélioration de la pathologie cardiaque induite par le modèle d’infarctus du myocarde. Ainsi, les animaux suite à la chirurgie, vont développer au cours du temps une pathologie cardiaque qui conduira in fine à une insuffisance cardiaque se caractérisant particulièrement par des difficultés à l’effort avec des troubles du rythme et des morts subites. Au cours du projet, certains animaux recevront une injection unique par voie intra péritonéale et seront soumis à un prélèvement sanguin. La principale nuisance attendue est le stress de l'animal lié à la contention. Des injections intraveineuses seront également réalisées sous anesthésie générale gazeuse. Les échographies réalisées pour le suivi de la fonction cardiaque seront réalisées sous anesthésie générale pour limiter le stress des animaux. Cependant, les anesthésies pourront être réalisées sur des animaux dont la fonction cardiaque n'est pas optimale. Le risque de mort inhérent à toute anesthésie pourrait être augmenté chez ces animaux.
Devenir
A l'issue de la procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de prélever les coeurs et faire des analyses post-mortem.
Remplacement
Notre projet nécessite l’utilisation d’animaux. Malgré les stratégies de remplacement mises en place dans le projet, ces dernières ne peuvent pas remplacer l’organisme entier en raison de l’isolement des cellules du contexte physiologique. Ainsi, l’expérimentation animale utilisant des souris contrôles et rapportrices est indispensable à l’étude intégrée des phénomènes physio-pathologiques et à la réalisation de notre projet.
Réduction
Afin de limiter ou éviter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires, et ce, sans pour autant compromettre le bien-être animal, tout en obtenant suffisamment de données pour répondre aux questions reliées à l'étude, des stratégies ont été mises en place. Ainsi, l’élaboration précise des protocoles et le choix pertinent des contrôles sont des éléments déterminants. De plus nous procèderons à une utilisation maximale les données obtenues sur chaque animal. Par ailleurs, l’utilisation d’outils statistiques couplée à notre expérience permettent d’estimer au mieux le nombre d’animaux nécessaires.
Raffinement
Le contrôle des paramètres environnementaux mais également du statut sanitaire des animaux permettra de limiter la variabilité des résultats expérimentaux obtenus, et ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de résultats statistiquement valables. Des stratégies d’optimisation sont mises en place au cours du projet afin de réduire voire de supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse chez l’animal. - Modifications apportées à l'élevage afin d'améliorer le bien-être des animaux : enrichissement des cages. - La planification des procédures expérimentales (disponibilité des locaux d'expérimentation, du matériel, période d'acclimatation des animaux aux pièces d’expérimentation) diminue le stress des animaux et favorise la validité de l'expérience. - Lors du procédé chirurgical, recourir à l'anesthésie/analgésie, donner les soins pré-, per- et post-opératoires adéquats. Établir des points limites les plus précoces possibles en fonction de l'objectif de l'expérimentation
Choix des espèces
Chez la souris, le développement et le fonctionnement physiologique du cœur sont similaires à ceux décrits chez l’Homme. Par ailleurs, le modèle d’Infarctus du Myocarde représente le modèle le plus pertinent en ce qui concerne la compréhension de la physio-pathologie humaines. Pour ce projet, seules les souris adultes seront utilisées. Les stades adultes permettront d'étudier les cibles thérapeutiques potentielles identifiées pour la régénération cardiaque après infarctus du myocarde.