Procédures sévères

Une souris placée sous surveillance dont l'état ne s'améliore pas en 48 heures est mise à mort. 560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour récupérer leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, modéré ou sévère, pour reproduire chez elles des comportements proches des phases du trouble bipolaire. Elles reçoivent une injection sous la peau chaque jour pendant huit semaines, de roténone pour les souris traitées, un inhibiteur de la chaîne mitochondriale, et passent trois fois chaque test comportemental, à quatre semaines d'intervalle, sans que le porteur nomme ces tests. Il décrit une "légère douleur" au point d'injection, un "stress modéré" lié aux manipulations, à la contention et parfois à l'isolement, et des effets de la roténone sur l'anxiété, alors que le projet déclare aussi un niveau de souffrance sévère.

Objectifs

Le trouble bipolaire est une cause d’invalidité majeure dans le monde avec plus de 45 millions de personnes atteintes. Il est caractérisé par une alternance entre des phases dépressives similaires à la dépression majeure et des phases maniaques présentant une élévation anormale de l’humeur ainsi que des altérations cognitives allant de la distractibilité à des comportements à risque. L’espérance de vie des patients est réduite en moyenne de 10 ans à cause du risque élevé de mort par suicide (1 patient sur 10) et de comorbidités (par exemple les troubles de l’addiction et de l’anxiété, mais aussi des troubles somatiques telles que les maladies cardiovasculaires). Cependant, les mécanismes neurobiologiques ainsi que les éléments précipitant les différentes phases restent largement méconnus, à tel point qu’il n’existe pour l’instant pas de modèle expérimental récapitulant les principaux aspects de la maladie. L’objectif de ce projet est à d’établir des méthodes d’étude des phases maniaques et dépressives du trouble bipolaire au niveau comportemental, puis de se focaliser sur les transitions entre phase, un aspect méconnu de la maladie qui pourrait amener à une meilleure compréhension de sa biologie et à de nouvelles pistes thérapeutiques. Pour cela, nous avons besoin d’un modèle de la maladie récapitulant les deux phases à l’échelle individuelle. Notre laboratoire dispose déjà de l’expertise nécessaire pour étudier les phénotypes anxiodépressifs, et nous sommes en train de mettre au point des tests pour évaluer les phénotypes maniaques inhérents au trouble bipolaire. Nous proposons donc ici d’établir et de caractériser un modèle récent de trouble bipolaire basé sur une des hypothèses majeures du domaine, à savoir l’hypothèse mitochondriale. Celle-ci se base sur un ensemble de données suggérant qu’une dysfonction mitochondriale légère serait au centre de cette pathologie. La première phase de caractérisation est de reproduire et d’étendre les résultats comportementaux suite à un traitement chronique de roténone, un inhibiteur de la chaîne mitochondriale.

Bénéfices attendus

Les études précliniques sont peu nombreuses sur le trouble bipolaire et sont critiques pour mieux comprendre sa neurobiologie et de nouvelles thérapies. Cette étude permettra d’évaluer la reproductibilité d’un modèle murin prometteur de la pathologie, et de développer de nouvelles pistes de compréhension de la maladie avec un suivi longitudinal et individuel des animaux.

Procédures

Une injection sous-cutanée est réalisée quotidiennement pendant 8 semaines. Les tests comportementaux ont pour objectif d'évaluer les comportements se rapprochant de la phase maniaque ou dépressive du trouble bipolaire. Chaque test comportemental a lieu 3 fois (une fois pendant la phase sans symptômes, une fois en phase maniaque et une fois en phase dépressive) à 4 semaines d'intervalle. Ils ne durent que 5 à 10 minutes par souris.

Impact sur les animaux

Les injections sous-cutanée (7 fois par semaine sur 8 semaines), sont espacées de 24h. Les doses de roténone sont modérées par rapport à celles utilisées dans la littérature. Elles peuvent provoquer une légère douleur au niveau du site d’injection. Les tests comportementaux sont couramment utilisés et peuvent provoquer un stress modéré en lien avec la manipulation, les contensions et l’isolement dans certains cas. La roténone en elle-même ne semble pas induire de phénotypes comportementaux à court terme (au moins jusqu’à deux semaines) d’après la littérature. A un mois, la roténone semble induire une hypoanxiété, puis de l’anxiété à 2 mois.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés et les cerveaux seront récupérés pour des études ultérieures

Remplacement

Aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le stress chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant. L’étude de la réponse cérébrale et comportementale nécessite également l’utilisation d’animaux.

Réduction

Les effectifs sont optimisés, les analyses comportementales nécessitent une taille d’effectifs suffisante compte tenu de la variabilité inter-individuelle (n = 20 sujets en tenant compte de cette variabilité). La stratégie des 8 groupes avec deux groupes (contrôles et traités) se base sur un effet attendu relativement important. Nous faisons le choix de travailler chez les animaux des deux sexes en accord avec les directives d'intégrer le sexe comme variable biologique dans les recherches : en effet, les troubles psychiatriques dont le trouble bipolaire sont un facteur majeur d'invalidité dans le monde et peuvent s'exprimer différemment chez les hommes et les femmes. Il est donc essentiel de s'intéresser aux deux sexes pour une meilleure compréhension du trouble et développer des approches thérapeutiques adaptées.

Raffinement

Les conditions d’élevage des animaux seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement du milieu (cabanes plexiglass et cartons, tubes). Les animaux sont hébergés une semaine avant l’initiation des expériences. Des habituations à la pièce d’expérimentation d’au moins une heure sont réalisées avant les tests comportementaux pour diminuer le stress des animaux. En complément, une friandise (sous la forme d'un morceau de gâteau) sera distribuée après chaque injection et après les tests comportementaux afin de diminuer le stress en faisant associer les manipulations à un événement positif. En cas de blessure, les animaux recevront un traitement analgésique jusqu’à la disparition des signes de douleur . En cas d’hypothermie, chaque animal est placé sur une couverture thermorégulée pour éviter toute hypothermie. Les éxpérimentateurs sont experts dans la préhension et la contention des souris, et sont soucieux d’éviter tout stress inutile lors de la réalisation des procédures. Des points limites gradés sont appliqués : les animaux surveillés sont pesés et oscultés quotidiennement (hydratation, température, état de la blessure si blessure). La décision d’euthanasie est prise s’il n’y a pas d’amélioration au bout de 48h. Dans ce cas, une euthanasie sera réalisée afin d'éviter toute souffrance supplémentaire.

Choix des espèces

Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, ainsi que l'expérience du laboratoire dans l'évaluation comportementale des rongeurs, l’implémentation de modèles de troubles de l’humeur, ainsi que la possibilité d’utiliser des vecteurs viraux permettant l’utilisation de l’optogénétique font de la souris le modèle le plus pertinent. Les techniques précédemment mentionnées seront mises en œuvre ultérieurement une fois les modèles mieux caractérisés. Les souris seront adultes, âgées de 7 semaines ou plus. Le modèle roténone ayant été développé chez des animaux adultes et les patients étant typiquement diagnostiqués à l’âge adulte, nous nous focalisons sur le stade adulte dans un premier temps.

Barrière intestinale fragilisée par des agents chimiques, absorptions chroniques ou massives d'alcool, fonction du foie altérée: 4 150 souris et 3 850 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, 5 900 d'entre eux en gravité sévère. Les animaux peuvent présenter des diarrhées parfois hémorragiques, une perte de poids, un état de choc et une détresse cardio-respiratoire avec des troubles de la régulation de leur température. Le porteur décrit des gestes "peu invasifs ou traumatisants" et affirme écarter tout individu susceptible de subir un inconfort trop important, tout en indiquant que dans les études de survie la mort constitue le point final expérimental et qu'aucun point limite anticipé ne pourra alors s'appliquer. Il ajoute que les moyens de lutte contre la douleur peuvent introduire un biais expérimental, et vise une gravité "sévère mais qui permette de maintenir des animaux dans un état acceptable du point de vue éthique".

Objectifs

Notre laboratoire est engagé dans la compréhension des mécanismes impliqués dans la décompensation aigue de la cirrhose hépatique et dans le développement de solutions thérapeutiques visant à protéger les patients qui la subissent. La cirrhose du foie est le stade terminal courant des maladies chroniques du foie provenant de différentes étiologies. L’aggravation de la maladie hépatique déclenche une cascade d’événements avec une prolifération bactérienne intestinale et une dysbiose comme événements centraux. Les toxines bactériennes peuvent directement provoquer la mort des hépatocytes, tandis que la dysbiose affecte également la fonction de barrière intestinale et augmente la translocation bactérienne, ce qui entraîne des épisodes inflammatoires, des infections systémiques, une vasodilatation et contribue à une décompensation aiguë accompagnée de défaillances de plusieurs organes. Les patients qui montrent des signes similairesou qui sont atteints de ces symptômes présentent une inflammation systémique élevée, qui est principalement précipitée par une infection bactérienne avérée et/ou une hépatite alcoolique sévère. Au cours de l’évolution de la cirrhose, les modifications du microbiote (dysbiose) sont aggravées par des modifications de la motilité intestinale, de la perméabilité, de la fonction de barrière envers le compartiment lymphatique et sanguin, de l'hypertension portale et du système immunitaire. Le rôle du microbiote semble crucial chez les patients atteints de cirrhose décompensée, car de nombreux événements déclencheurs sont liés aux microbes ou à leur interaction avec l’hôte. Ce projet de recherche sur cette maladie hépatique met l’accent sur les mécanismes associés au microbiote qui sont impliqués, de manière à pouvoir les cibler ou pour identifier des paramètres permettant d’évaluer les propriétés de composés en développement. Nous mettrons en place des modèles expérimentaux conçus pour fragiliser la barrière intestinale et induire une translocation bactérienne, ces modèles induits par des actions directes d’agents chimiques ou par des absorptions chroniques ou massives d’alcool pourront également être combinés à des modèles pathologiques où la fonction hépatique est altérée de manière à reproduire les caractéristiques de la pathologie.

Bénéfices attendus

Lors d’épisodes de défaillance hépatique et par voie de conséquence d'autres organes, il est nécessaire de prendre en charge les patients pour les défaillances multiples le plus précocement possible pour préserver le capital hépatocytaire qui subsiste, et qui peut se révéler être vital lors de la survenue d’un second évènement aigu. Aujourd’hui les traitements employés agissent sur les symptômes tels que la pression portale, l’infection, l’hémorragie digestive ou le syndrome hépato-rénal à l’aide de corticoïdes par exemple de manière à préserver les chances d’éligibilité à la transplantation. Les solutions thérapeutiques que nous espérons proposer visent aussi à agir sur les mécanismes à l’origine des effets fulminants observés. (Infection, inflammation, et immunité). L’action régulatrice de composés sur la translocation bactérienne par une action directe sur la barrière ou indirecte sur le microbiote pourrait avoir un impact important sur la réduction des effets déclencheurs de la défaillance aigue du fonctionnement du foie.

Procédures

Au cours des procédures expérimentales qui constituent ce projet conduit sur des rats ou des souris, nous serons amenés à effectuer des gestes peu invasifs ou traumatisants, il s’agit d’administrer aux animaux par des moyens classiques d’injection des agents qui vont conduire à l’apparition de la pathologie souhaitée ou à contrario des produits destinés à en limiter ou réduire les symptômes. Ces administrations seront dans certains cas répétées de manière quotidienne sur des périodes courtes (une semaine) , ou de manière bi-hebdomadaire au cours de période plus longues ( 10 semaines max) Dans les cas ou une immobilisation est plus confortable, pour l’opérateur et pour l’animal, et de manière systématique pour les prélèvements, une légère anesthésie de quelques minutes (3min) sera pratiquée par exposition des voies respiratoires à un agent anesthésiant.

Impact sur les animaux

Au cours de ce projet dont la finalité est le développement de modèles permettant de mener des évaluations de propriétés thérapeutiques de composés dans le traitement des patients dans un état ACLF dont la survie est engagée. La relation entre le foie et l’intestin joue un rôle primordial lors des phases qui précèdent le déclenchement de l’ACLF, l’altération de la fonction barrière et la translocation bactérienne sont des éléments que nous avons considérés et que nous devons reproduire dans nos modèles. Les modèles développés chez les rongeurs pourront présenter des troubles de la fonction digestive, associés à des diarrhées parfois hémorragiques et une perte de poids. Au cours de l’épisode ACLF, nous pourrons observer des animaux en état de choc et de détresse cardio-respiratoire, avec des épisodes de troubles de la régulation de la température corporelle. Les effets cités sont observés de manière plus ou moins prononcée, ces signes constituent les critères d’atteinte des points limites. Certains animaux atteindront des stades qui nécessiteront un point d’arrêt anticipé lorsqu’il sera possible de les appliquer par exemple lors de la mise à mort à un temps fixe précoce prédéterminé. En revanche, dans les situations d’études de survie où la mort est le point final expérimental, il ne pourra pas y avoir recours à des points limites anticipés. Pour évaluer les effets de nos composés, nous nous fixons comme objectif de reproduire une gravité qui sera jugée sévère mais qui permette de maintenir des animaux dans un état acceptable du point de vue éthique et conservant toute pertinence scientifique.

Devenir

L'évaluation histologique des organes majeurs (foie, reins et cerveau) et une investigation approfondie des biomarqueurs plasmatiques circulants imposent la mise à mort des animaux

Remplacement

La possibilité de disposer d’un modèle animal qui permet d’évaluer les effets des nouveaux composés sur tous les aspects d'une pathologie présente chez l’homme constitue une étape clé dans la lutte contre ces maladies et font de nos modèles des outils translationnels très pertinents. Bien qu'une première phase de sélection des meilleurs composés soit effectuée sur des modèles acellulaires ou cellulaires, contribuant ainsi à l’utilisation de méthodes alternatives visant à remplacer partiellement l’utilisation des animaux comme nous le rappelle la règle des 3R’s, l’évaluation finale du potentiel thérapeutique des produits dans des modèles animaux reste cependant nécessaire. Le recours à l'emploi d’un animal vivant permet d’évaluer la réelle efficacité des composés dans un système biologique complexe et «global », capable de métaboliser les principes actifs donc de déceler les effets secondaires, capable d'activer toutes les voies de signalisation qui participent à la caractérisation de ce modèle. Son remplacement à ce stade du projet scientifique (phase pré clinique) n'est pas envisageable dans une système biologique isolé ou cellulaire qui quel que soit sa nature ne pourra apporter tous les enseignements issus de l'expérimentation in vivo.

Réduction

La stratégie de réduction consiste à ne réaliser que les essais avec les composés les plus prometteurs ayant satisfait aux étapes de sélection préliminaires in vitro. La réduction du nombre d'animaux est motivée par la longueur/lourdeur des procédures expérimentales, cela nous a conduit lors d'essais pilotes ou préliminaires de cibler le juste nombre d'individus nécessaires à l'obtention de résultats pertinents. Les paramètres que nous étudions in vivo (bio marqueurs, induction/répression de gènes, effets histologiques etc) doivent être relevants. Nous écartons les paramètres dont la pertinence serait trop faible pour être statistiquement décelable qu'avec des effectifs trop importants. Nous disposons de données expérimentales ou publiées dans la littérature sur les paramètres biologiques ou biomarqueurs les plus pertinents et "robustes". La connaissance de la variance de ces biomarqueurs permet de définir un effectif théorique à l'aide du test statistique de Welsh qui associe variance et probabilité d'atteinte d'un seuil de significativité. Cette approche statistique permet d'affiner les effectifs et de réduire donc les nombres d'animaux qui seraient surévalués et non nécessaires à l'obtention d'un résultat biologique relevant. Les administrations par voie veineuse de manière répétées peuvent présenter des difficultés techniques qui obligent parfois à augmenter les effectifs des groupes (échec des injections à combler), la possibilité des injections multiples ou continues sur es des animaux cathétérisées est de ce point un avantage car cela permet de réduire le nombre d'animaux au strict nécessaire.

Raffinement

Les rats sont hébergés par paire , les souris par trio , l’enrichissement du milieu est systématisé par l’apport de dispositifs permettant aux animaux de rongeur (blocs ou billes des bois), un apport de coton compressé permet de maintenir l’instinct de création du nid, des tunnels en polycarbonate transparent teinté en rouge sont placés dans les cages pour apporter un espace simulant la dissimulation et favorisant le maintien de l’instinct grégaire des rats. Nous avons opté pour la pose de cathéters qui offrent un accès à l’aide d’un bouton métallique bouché par un obturateur aimanté qui présente l’avantage de pouvoir faire cohabiter les animaux dans une même cage sans crainte d’arrachage du cathéter par les congénères, cela constitue une amélioration significative du bien-être des animaux. L'établissement de points limites dans ce modèle expérimental de défaillance hépatique nous permet d'écarter tout individu susceptible de subir un inconfort trop important ou de la douleur. Bien conscient que nous développons dans ce projet des modèles sévères, nous nous efforçons d'avoir recours à des moyens analgésiques adaptés et non confondants. La pathologie et les mécanismes qui la déclenchent sont en partie connus, l'emballement inflammatoire en est une composante, le recours à des moyens de lutte contre la douleur peut introduire un biais expérimental ; une étape de validation s’impose pour chaque situation.

Choix des espèces

La littérature scientifique, est riche sur la cirrhose du foie, les rongeurs sont de bons répondeurs aux stimuli métaboliques, (condition importante dans ce projet.), mais il faut noter que la réponse du rat à l’induction de la fibrose (composant nécessaire à l’apparition de la cirrhose) est meilleure que celle de la souris. Dans le cas où il n’y a pas de différences majeures entre les espèces, le choix de l’espèce peut être strictement économique. L’hébergement des souris de petite taille est plus aisé. La souris nécessite 10 fois moins de réactifs ou médicaments parfois rare et précieux ou onéreux que le rat. La contrainte de la souris de petite taille est que les volumes d’échantillons biologiques obtenus sont limités, et on obtient moins d’informations scientifique à partir d’un seuil animal. Le recours dans ce cas au rat peut présenter des avantages.

Toutes tuées à l'issue parce qu'aucune ne peut sortir de l'animalerie pour raisons de sécurité biologique, 3 697 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, 1 455 d'entre elles en gravité sévère. Leur microbiote est d'abord détruit par cinq jours d'antibiotiques dans l'eau de boisson et une injection intrapéritonéale, avant le gavage de bactéries toxinogènes puis des candidats médicaments, avec jusqu'à six prélèvements de fèces par jour pendant deux jours. Les diarrhées décrites, la déshydratation et les douleurs intestinales peuvent durer plusieurs jours, jusqu'à guérison ou atteinte d'un point limite. Le hamster, modèle historique de cette infection, a été écarté parce qu'il est "extrêmement sensible" et présente une forte mortalité, la souris offrant une colonisation intestinale stable et des données déjà accumulées au laboratoire.

Objectifs

Certains agents pathogènes bactériens ont la capacité de coloniser l’intestin humain et de s’y reproduire très efficacement, entraînant des symptômes sévères (diarrhées violentes, perforation de la paroi intestinale…) pouvant engager le pronostic vital du patient. La sévérité de ces infections tient à la production par ces bactéries pathogènes de toxines qui ciblent et détruisent les cellules de la paroi intestinale et du côlon. Pathogènes opportunistes, ces bactéries intestinales entraînent rarement des infections chez les personnes en bonne santé car leur développement est inhibé par les nombreuses bactéries qui colonisent naturellement l’intestin et constituent le microbiote (encore appelé flore intestinale). En revanche, ces pathogènes prospèrent dans l’intestin de personnes affaiblies et/ou dont le microbiote a été perturbé par un traitement antibiotique, les rendant ainsi particulièrement sensibles à l’infection. Malgré la pression considérable que ces bactéries pathogènes exercent sur les systèmes de santé, avec des coûts globaux annuels estimés à plusieurs milliards de dollars, il n’existe à ce jour aucune approche pleinement satisfaisante pour les traiter. En effet, les antibiotiques restent le standard thérapeutique contre ces infections, or ils participent à la perturbation du microbiote intestinal favorisant le développement même de ces pathogènes et sont responsables de l’augmentation continue de l'antibiorésistance, deux facteurs clés favorisant le risque de récurrence des infections. Dans ce contexte, nous développons 2 approches thérapeutiques inédites permettant, après administration par voie orale, de cibler les bactéries pathogènes dans l’intestin et de les éliminer de manière spécifique sur la base de leur séquence génétique, ou bien de les modifier génétiquement afin d’abolir leur production de toxines, les rendant ainsi inoffensives. Ces deux approches ont l'avantage unique d’être extrêmement spécifiques : contrairement aux antibiotiques elles ne ciblent que les bactéries pathogènes et préservent ainsi le reste du microbiote, limitant ainsi le risque de récurrence des infections. L'objectif de ce projet est donc d’évaluer l’efficacité de ces deux approches thérapeutiques dans des modèles murins d’infection par ces pathogènes bactériens intestinaux afin de sélectionner la plus prometteuse en vue d’en faire un médicament et d’organiser des essais cliniques chez l’Homme.

Bénéfices attendus

Il n'existe à ce jour aucune approche thérapeutique pleinement satisfaisante pour soigner les infections causées par les bactéries pathogènes intestinales productrices de toxines. En effet, si les antibiotiques demeurent le standard thérapeutique contre ces infections, ils perturbent grandement le microbiote intestinal, un point clé favorisant le développement de ces pathogènes intestinaux. De plus, ils sont responsables de l’augmentation continue du phénomène d’antibiorésistance. De ce fait, les antibiotiques peuvent paradoxalement être contre productifs et favoriser le risque de récurrence des infections chez les patients. Dans ce contexte, ce projet vise à tester l'efficacité de 2 modalités thérapeutiques inédites et permettant de combler les lacunes des antibiotiques. La première modalité consiste en un antimicrobien extrêmement spécifique capable de reconnaître et d’éliminer les bactéries pathogènes dans l’intestin sur la base de leur séquence génétique. La seconde fonctionne à la manière d’un produit de thérapie génique et permet de cibler les bactéries pathogènes dans l’intestin et de le modifier génétiquement afin d’inactiver les gènes responsables de la production de toxines, les rendant ainsi inoffensives. Ces deux approches ont en commun leur spécificité sans précédent: elles ne ciblent que les bactéries pathogènes et n’engendrent aucune perturbation du microbiote intestinal. Elles se démarquent donc très nettement des antibiotiques et réduisent le risque de récurrence des infections à ces pathogènes intestinaux. En utilisant des modèles murins de colonisation et d’infection intestinale, ce projet vise à démontrer la capacité de ces 2 approches à éliminer les bactéries pathogènes ou à les rendre inoffensives tout en préservant le reste du microbiote intestinal. Le principal bénéfice en découlant sera le développement d’une stratégie thérapeutique alternative plus performante, plus sûre et plus adaptée au traitement clinique des infections intestinales aux bactéries productrices de toxines que les antibiotiques.

Procédures

Les interventions prévues sur les animaux sont les suivantes : - Une administration d’antibiotiques via l’eau de boisson (biberon) pendant 5 jours - Une administration d’antibiotique par injection intrapéritonéale (quelques secondes par animal) - Une administration orale par gavage de bactéries puis des candidats médicaments que nous testons (quelques secondes par animal) - Prélèvements de fèces: ils seront effectués au maximum une fois par jour (sauf procédure spécifique: 6 fois par jour pendant 2 jours), en récoltant les fèces excrétées naturellement par les animaux, en les plaçant dans une boite pendant quelques minutes. Il est également attendu que certains animaux infectés présentent une diarrhée et une perte de poids associées à la maladie que nous étudions.

Impact sur les animaux

La piqûre d’aiguille pour l’injection d’un antibiotique entraîne une douleur légère de courte durée. Le gavage oral avec les bactéries ou avec le traitement à tester entraîne une gêne et un stress légers et de courte durée. Les prélèvements de fèces entraînent un stress physique léger et un isolement de courte durée (5 minutes maximum). La maladie étudiée entraîne des symptômes tels que de la diarrhée, et donc une déshydratation légère à modérée, ainsi que des douleurs intestinales légères à modérées pouvant durer plusieurs jours (jusqu’à guérison ou atteinte d’un point limite, tel que décrit dans la section dédiée).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. En effet, la quasi-totalité de ces animaux seront infectés par des bactéries pathogènes, empêchant toute sortie de l’animalerie pour des raisons de sécurité biologique. Les quelques animaux qui ne seront pas infectés seront tout de même hébergés dans l’enceinte de la même animalerie, et doivent donc aussi être considérés comme potentiellement contaminés.

Remplacement

Les bactéries cibles colonisent l’intestin, où elles produisent des toxines qui entraînent notamment des diarrhées. Un traitement efficace doit donc être capable d’atteindre l’intestin afin d’agir sur ces bactéries. Bien que des modèles in vitro permettent de simuler les conditions gastrique et intestinale et seront utilisés en première intention au laboratoire, seule l’utilisation d’animaux permet de récapituler à la fois les obstacles physico-chimique qui seront rencontrés par notre traitement chez l’homme, mais aussi les conditions physiologiques dans lesquelles ces bactéries cibles seront retrouvées chez l’homme. De plus, bien que la réduction/abrogation de la production des toxines sera montrée préalablement in vitro au laboratoire, un modèle récapitulant les symptômes causées par l’infection avec ces bactéries est nécessaire pour évaluer l'efficacité de notre traitement dans la réduction/abrogation de ces symptômes chez l’homme.

Réduction

Nous effectuerons un grand nombre de tests préliminaires in vitro au laboratoire avant de passer chez l’animal. Ainsi, la diminution et l’abrogation de la production de toxines par les bactéries confrontées à notre traitement seront mesurées in vitro; la stabilité de notre traitement en conditions physico-chimiques physiologiques (acidité de l’estomac, présence d’enzymes digestives) sera mesurée in vitro; la capacité de notre traitement à tuer les bactéries ciblées sera évaluée par culture microbienne au laboratoire. Ces tests préliminaires permettront de réduire au strict minimum les tests devant absolument être effectués sur animaux en les effectuant que sur les candidats médicaments les plus prometteurs. De plus, toutes nos procédures sont construites autour de calculs de puissance statistique, afin de garantir au maximum que les résultats produits puissent répondre aux questions scientifiques, tout en utilisant le juste nombre d’animaux. Nous allons vérifier la colonisation bactérienne (un des indicateurs principaux) dans l’intestin des animaux au cours de l’expérience à partir du matériel fécal; cette stratégie non invasive, que nous avons déjà mis en place précédemment, nous permettra de procéder ) des études longitudinales sur un même individu, réduisant ainsi le nombre d’animaux à euthanasier sans perdre des informations essentielles pour le développement et l'interprétation de nos expérimentations.

Raffinement

Les conditions d’hébergement des animaux seront celles classiquement admises, notamment en termes de socialisation (jamais moins de 3 animaux par cage) et d’enrichissement (stick de coton pour nidification); la nourriture et l’eau seront fournies ad libitum (sauf exception la veille au soir d’une administration de traitement oral). Il n’est pas prévu d’isoler des animaux ou de restreindre leur environnement au cours du projet. L’infection par nos bactéries toxinogènes cibles entraînera sous quelques jours des diarrhées dont la sévérité peut évoluer rapidement. C’est pourquoi dans toutes les procédures impliquant des animaux infectés par des bactéries produisant des toxines, nous prévoyons une surveillance accrue des animaux (au minimum 1 fois par jour; voire 2 fois par jour dans les cas des animaux ayant perdu du poids ou peu mobiles), afin d’anticiper l’aggravation des symptômes et le cas échéant de procéder à la mise à mort des animaux pour éviter toute souffrance inutile. Des blocs d’hydrogel et des morceaux de nourriture pourront être fournis au fond de la cage pour les souris pouvant présenter des symptômes les empêchant d’accéder aussi librement que possible à l’eau et la nourriture présents dans le capot de la cage. Un autre moyen de limiter la souffrance animale est d’effectuer les tests de notre traitement en 2 jours maximum (sauf exception). Ainsi, l’expérimentation pourra être terminée avant que les symptômes n’atteignent des niveaux trop élevés. Enfin, nous avons prévu d’utiliser pour la plupart de nos procédures une souche ne produisant pas la toxine majeure de cette bactérie cible; des telles bactéries possèdent encore une toxine mineure avec le même mécanisme d’action, mais dont la dose toxique est 1000 fois moindre que la première. La majorité de nos procédures utiliserons cette souche comme alternative, moyennant certains changements dans la nature de notre traitement, à l’exception des procédures évaluant l’effet du traitement sur les symptômes eux-mêmes, par définition, où l'efficacité devra être démontrée contre les souches sauvages impliquées dans la maladie chez l’homme.

Choix des espèces

De nombreux animaux ont été infectés expérimentalement par la bactérie pathogène que nous étudions tels que hamsters, souris, rats, lapin et cailles, mais aussi des cochons et des singes. Le modèle historiquement utilisé pour étudier la pathologie est le hamster, cependant ce modèle est extrêmement sensible et présente une forte mortalité. Dans ce projet, nous limitons au maximum les souffrances éprouvées par les animaux, en travaillant majoritairement avec des versions fortement atténuées de ces bactéries. Ainsi, la souris devient le modèle le plus simple pour lequel il existe des données de littérature confirmant une colonisation intestinale stable. Nous disposons également de nombreuses données antérieures générées dans notre laboratoire chez la souris sur des candidats médicaments similaires, ce qui bénéficiera au projet. Le modèle souris récapitule également certains des symptômes clés de ces infections bactériennes chez l'Homme; cela nous permettra d'évaluer l'impact de notre traitement sur l'évolution de la maladie. Nous utiliserons des animaux adultes jeunes, typiquement âgés de 6 à 9 semaines en début d’expérimentation. L’âge des animaux en fin d’expérimentation ne dépassera pas 12 semaines, du fait de la durée maximum des expériences prévues dans les différentes procédures. Il faut noter que cet âge maximum n’est pas une limite scientifique, mais simplement un fait lié à la durée de nos expériences. Les individus plus jeunes ou beaucoup plus âgés pourraient être plus sensibles aux toxines produites par nos bactéries cibles, et ainsi développer des symptômes plus sévères, ce qui n’est pas nécessaire pour notre projet, et serait même contre-productif en termes d’obtention de colonisation intestinale stable avec ces bactéries.

Pesées jusqu'à cinquante-deux fois, colite déclenchée par une administration intrarectale sous anesthésie, puis gavage jusqu'à trois fois par jour pendant cinquante-deux jours: 8 750 souris et 1 750 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, 3 150 d'entre eux en gravité sévère. S'y ajoutent une coloscopie hebdomadaire jusqu'à huit fois par animal avec prélèvement de micro-biopsies, des prises de sang rétro-orbitales et des mises à jeun de douze à vingt-quatre heures. Les modèles de colite provoquent perte de poids, diarrhées et présence de sang dans les fèces, une perte de poids supérieure à 20 % en 24 heures justifiant selon le porteur une mise à mort immédiate. Tous ces animaux sont tués à l'issue, le prélèvement de tissus et l'examen de leur système immunitaire servant à fixer les doses qui seront ensuite administrées à des patients en essai clinique.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité thérapeutique de nouveaux traitements sur des modèles d’inflammation chronique de l’intestin chez le rongeur. Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (ou MICI) regroupent la maladie de Crohn (MC) et la rectocolite hémorragique (RCH). Toutes deux se caractérisent par une inflammation de la paroi d’une partie du tube digestif, due à une dérégulation du système immunitaire intestinal. Cette inflammation incontrôlée est responsable de lésions tissulaires et de la chronicité de la maladie. Son origine semble résulter de la combinaison complexe de facteurs environnementaux, associés à une susceptibilité génétique du patient et à la réactivité particulière de son système immunitaire, et au microbiote. Les traitements actuels sont peu nombreux et sont dans 70% des cas inefficaces. Les cycles récurrents d’inflammation peuvent conduire à des complications : sténose, fistules, perforations entrainant une urgence chirurgicale. Les MICIs sont également associés à un risque accru de cancer colorectal. Les informations qui seront générées par le biais de ces études seront utilisées pour préparer les phases précliniques et cliniques du développement pharmaceutique de ces nouveaux traitements. Ces informations comprennent entre autres : • Dose minimale produisant un effet thérapeutique • Dose minimale pour lequel l’effet thérapeutique est le plus élevé. • Déterminant pharmacocinétique qui conduit à l’efficacité thérapeutique • Régime de doses pour les études toxicologiques exploratoires et règlementaires. • Régime de doses pour les essais cliniques chez le volontaire sain, puis chez le patient.

Bénéfices attendus

La colite ulcérative et la maladie de Crohn sont contrôlées à l’aide de médicaments immunosuppresseurs et antiinflammatoires (acide 5-aminosalicylique) qui atténuent l’inflammation intestinale. Ces traitements peuvent durer plusieurs mois, voire plusieurs années. Les traitements biologiques prescrits en deuxième intention sont très coûteux et peuvent engendrer une immunogénicité et une perte d’efficacité due à la production d’anticorps neutralisants par le patient. De nombreux patients sont également réfractaires à ces traitements. Les études qui constituent ce projet s'inscrivent dans le cadre du développement de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes dont des thérapies cellulaires et des fécalothérapies. A court terme, elles permettront de confirmer l'efficacité de nouveaux candidats médicament dans les MICIs. A plus long terme, ces études constitueront la base pour un traitement applicable à l'homme en déterminant les doses efficaces qui pourraient être administrées chez les patients dans les essais cliniques.

Procédures

Les gestes techniques concernent tous les animaux. - Pesées : Durée 30 secondes, sur animal vigile, jusqu’à une fois par jour soit jusqu’à 52 fois par animal. - Administration d’agent inducteur d’une inflammation intestinale, 3 possibilités : par voie intrarectale : 30 secondes sous anesthésie gazeuse, une fois par animal. Avec ou sans présensibilisation par voie cutanée : 15 secondes sur animal vigile, une fois par animal. par voie intraveineuse : 30 secondes sous anesthésie, une fois par animal. par voie intrapéritonéale : 10 secondes sur animal vigile. - Prélèvement de sang par voie retro-orbitale : 30 secondes, sous anesthésie générale , 1 fois par œil et par animal. Le prélèvement retro-orbital sera utilisé, seulement dans le cas où un volume plus large et un prélèvement rapide est nécessaire. Prélèvements de sang via la veine caudale : 30 secondes, sur animal vigile ou anesthésié. • Prélèvements de sang terminaux par ponction cardiaque ou veine abdominale : 30 secondes, sous anesthésie générale profonde. • Administrations des composés à potentiel thérapeutique: voie selon le composé : o Par voie orale à l’aide d’une sonde gastrique : 10 secondes sur animal vigile, jusqu’à 3 fois par jour, max 52 jours. o Par voie intrapéritonéale : 10 secondes sur animal vigile, une fois par jour, jusqu’à 7 jours, 7 fois max par animal. o Sous-cutanée : 10 secondes sur animal vigile, une fois par jour, 52 jours max. o Par voie intraveineuse retro-orbitale : 30 secondes, sous anesthésie générale, Une fois par œil et par animal. o Par voie intraveineuse via veine caudale : 30 secondes, sur animal vigile ou anesthésié, Une fois par semaine pendant 8 semaines. Pour certaines procédures seulement :•Coloscopie (proc.1): 15 minutes sur animal anesthésié, une fois par semaine soit jusqu’à 8 fois par animal. Prélèvement de 2 micro-biopsies 2 fois par animal max.• Test de perméabilité intestinale/administration de dextran par voie orale : 10 secondes sur animal vigile, une fois toute les 2 semaines soit 4 fois par animal; •Mise à jeun pour l’induction de l’inflammation intestinale (proc.2). Durée 12 à 24 heures, une fois par animal. •Mise à jeun pour le test de perméabilité intestinale (proc. 1). Durée 4 heures, une fois toutes les 2 semaines soit 4 fois par animal.

Impact sur les animaux

Ces procédures induiront chez l’animal des nuisances modérées à sévères : pesée quotidienne (30s), injection de cellules (30s), administration de traitement par gavage ou injection (i.p., i.v., s.c.) (15 à 30s) pendant plusieurs jours ainsi qu’une préhension accompagnant ces administrations (1 min). De plus, les animaux seront également soumis à des prélèvements sanguins sous anesthésie générale qui peuvent générer également des nuisances (30 à 60s). Des microéchantillons de sang pourront également être prélevés sur animaux vigiles (30s). Une mise à jeun de 4h, pendant le cycle diurne, pourrait être réalisée pour une étude perméabilité intestinale (4h par étude). Une mise à jeun de 12 à 24 heures, pourrait être réalisée pour induire le modèle TNBS selon la procédure numéro 2. Les effets indésirables attendus des modèles de colite sont une perte de poids, des diarrhées, la présence de sang au niveau des fèces et/ou du rectum. Une piloérection, une réduction de la mobilité et une perte de poids > à 20% en 24h ou 30% depuis le jour 0 justifieraient une mise à mort immédiate.

Devenir

Tous les animaux de la procédure seront mis à mort. L’évaluation de l’efficacité des composés à potentiel thérapeutique nécessite des analyses approfondies de différents tissus et du système immunitaire

Remplacement

Il existe des modèles ex-vivo d’organoïdes intestinaux permettant un premier criblage pour évaluer l’efficacité des composés permettant de limiter le recours à l’animal dans les premières phases de développement. Cependant, ce système dépourvu d’autres organes et de structures immunologiques clés (ganglions mésentérique, rate, système lymphatique, hépatique, rénale et circulatoire) ne peut pas à ce jour constituer un environnement fiable pour prédire la pharmacologie in vivo. Seul un modèle animal peut permettre d’étudier les interactions entre des entités à potentiel thérapeutique et ces différents systèmes biologiques très complexes impliquant entre autres la migration de cellules immunitaires vers l’intestin. Cependant, des tests in vitro et in silico qui permettent de prédire les profiles pharmacocinétiques et les interactions avec la cible moléculaire d’intérêt seront utilisés en amont des études de ce projet. Ceci permettra de limiter le recours à l’animal.

Réduction

Les entités thérapeutiques auront préalablement été évaluées de manière extensive sur une batterie de tests in silico et in vitro. Ces tests permettent par exemple de prédire le profil pharmacocinétique d’un composé (ex : lipophilie, absorption, distribution, métabolisme), de déterminer les caractéristiques d’interaction du composé avec la cible d’intérêt (ex. un récepteur, un canal ionique, une enzyme). En outre, le profil pharmacocinétique chez le rongeur aura aussi été déterminé. De nombreux composés auront donc été éliminés du fait de leur faible performance sur ces tests. Ainsi, les tests sur animaux sont réduits au minimum nécessaire. Le nombre d’animaux prévu pour ce projet se base sur les données de la littérature et les données de mise en place des modèles, notamment des analyses de puissance statistique et des tests de détermination de la taille des groupes expérimentaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des locaux conformes aux exigences règlementaires de la directive n°2010/63/UE. Ils seront hébergés en groupe dans des cages contenant de l’enrichissement afin favoriser un comportement naturel (nidification, instinct grégaire, recherche de nourriture...). Les animaux seront habitués à la manipulation avant le début des études en utilisant exclusivement des techniques non-aversives (ex : prélèvement de l’animal de sa cage avec l’aide d’un tunnel). Les procédures potentiellement douloureuses ou sources d’inconfort ou de stress se feront sous anesthésie générale. Les animaux feront l’objet d’une surveillance clinique a minima journalière sur la durée des procédures. Les locaux et systèmes d'hébergement suivront un programme de contrôle d’hygiène et sanitaire afin de prévenir tout biais. Les conditions d’ambiance seront contrôlées sur la durée des procédures. Un programme de soins adapté sera mis en œuvre pour l’ensemble des animaux affectés à ce projet, par ou sous l'autorité du vétérinaire. Un plan d'action incluant la communication sera établi et mis en place lors d'apparition d'évènements inattendus. Le nombre de manipulations sur l’animal sera réduit au strict nécessaire car le stress lié à la manipulation non seulement affecte le bien être mais peu aussi impacter la réponse inflammatoire et immunitaire. Des critères d'arrêt anticipé seront mis en place pour chaque procédure afin de réduire tout inconfort, stress, souffrance ou douleur inutile.

Choix des espèces

La grande majorité des modèles et des techniques utilisés dans le cadre de la recherche médicale et pharmaceutique ont été décrits chez les espèces rats et souris. De nombreuses données sur les modèles de MICIs chez le rongeur existent déjà dans la littérature et peuvent être utilisées pour l’avancement des projets. Adulte : Les données de la littérature indiquent que les rats (min. 5 semaines) et les souris (min. 7 semaines) adultes représentent des modèles fiables pour l’évaluation de l’efficacité de composés dans le domaine des MICIs car ils disposent d'un système immunitaire mature

Exposées sous anesthésie à deux instillations de silice cristalline par la gorge, des souris développent une fibrose qui gagne l'ensemble du poumon, et d'autres, injectées dans la peau d'acide hypochloreux cinq jours par semaine pendant jusqu'à dix semaines, une fibrose de la peau et des poumons. 383 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, modéré ou sévère, pour provoquer une sclérodermie chez des souris génétiquement prédisposées à l'auto-immunité et évaluer les effets d'une poussière de pierre artificielle à laquelle des travailleurs peuvent être exposés. Le porteur affirme n'avoir observé dans ses études antérieures aucun signe de "souffrances respiratoires" et ne pas s'attendre à de l'inconfort avec cette poussière, alors qu'une partie des procédures est déclarée d'un niveau de souffrance sévère. Toutes les souris seront tuées pour prélever sang, poumons, peau, rate, reins et cœur.

Objectifs

Ce projet a 2 grands objectifs qui sont les suivants: 1) optimiser le modèle de souris sclérodermique, qui à ce jour ne reflète pas entièrement la physiopathologie observée chez l’homme (inflammation, autoimmunité et fibrose cutanée et pulmonaire). Nous évaluerons ces paramètres physiopathologiques dans le nouveau modèle que nous proposons et qui sera induit dans des souris génétiquement susceptibles de développer une autoimmunité en présence de la protéine recombinante contre laquelle les auto-anticorps sont dirigés et de silice cristalline utilisée comme adjuvant pour stimuler la réponse immunitaire. En effet, les modèles murins actuels sont soit génétiques soit induits par injection de substances chimiques tels que l’acide hypochloreux (HOCl) ou la bléomycine (BLM).

Bénéfices attendus

Les bénéfices du projet seront : 1) de disposer d’un nouveau modèle de souris sclérodermiques dans lequel seront retrouvés les grands paramètres qui définissent cette maladie : l'inflammation, l’autoimmunité et fibrose cutanée/pulmonaire ; cela permettra d’une part d’apporter de nouvelles connaissances sur la physiopathologie de cette maladie et d’autres part de disposer d’un modèle pertinent pour tester de nouvelles thérapies; 2) d’évaluer les risques sur la santé d’une exposition à la poussière de pierre reconstituée à laquelle les travailleurs peuvent être exposés dans leur cadre professionnel et d’apporter de nouvelles connaissances sur leurs effets (autoimmunité, inflammation et fibrose). Ces informations pourraient à terme permettre de mieux informer les utilisateurs des risques encourus, de contribuer à mieux protéger les personnes exposées et à limiter l’utilisation de cette pierre artificielle.

Procédures

Des souris vigiles (n=100) seront soumises à une injection intra-dermique (5 jours/semaine) pendant 10 semaines maximum. Des souris anesthésiées (n=383) seront soumises à 2 expositions par voie respiratoire de NaCl ou de particules minérales é 15 jours d'intervalle). Des souris vigiles (n=131) seront soumises à 4 injections sous-cutanées (tous les 15 jours). Des souris vigiles (n=16) seront soumises à 2 injections intra-veineuse d'anticorps (une par mois). Des souris vigiles (n=58) seront soumises à 26 injections intra-péritonéales soit 3 fois/semaine. Des souris anesthésiées (n=58) auront une biopsie cutanée (punch de 4 mm).

Impact sur les animaux

L'injection intra-dermique d'acide hypochloreux (HOCl) peut entrainer une gêne (démangeaisons) dans les 2-3 minutes post-injection et aussi parfois une plaie cutanée (au niveau du bas du dos). Les souris exposées à l'acide hypochloreux (HOCl) développent une fibrose cutanée au point d'injections (bas du dos) et une fibrose pulmonaire légère à modérée qui se développe à partir de la 3ième semaine. La fibrose induite est localisée dans la région sous-pleurale et s'étend peu à l'ensemble du parenchyme pulmonaire. Les souris exposées par instillations oropharyngées de silice cristalline (SiO2) développent une fibrose pulmonaire modérée qui s'étend à l'ensemble du parenchyme pulmonaire. Il n'a pas été décrit dans la littérature et nous n'avons pas non plus observé dans nos études antérieures de signes de difficulté ou de souffrances respiratoires dans ces deux modèles. Même si nous ne nous attendons pas à avoir d’inconfort ou de souffrance animale avec une exposition à la poussière de pierre artificielle (PA) nécessitant le recourt à des antalgiques, nous serons attentifs sur ce point. D'après la littérature, des injections sous-cutanées répétées à 15 jours d'intervalles n'ont pas non plus montré d'effets indésirables chez les souris.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour réaliser des prélèvements de trissus et d'organes (sang, poumons, peau, rate, rein et coeur).

Remplacement

La sclérodermie systémique est une maladie autoimmune (présence d’autoanticorps dans la circulation sanguine), complexe avec des manifestations dans plusieurs organes (peau et poumons majoritairement) qu’il est impossible de reproduire in vitro. Il est important d’avoir un modèle de souris sclérodermique qui se rapproche le plus possible de ce qui est observé chez l’homme (fibrose cutanée et pulmonaire, autoimmunité et inflammation) pour tester de nouvelles molécules thérapeutiques.

Réduction

Le choix des conditions expérimentales est fixé en lien avec les questions scientifiques du projet et les principes de réduction. Les procédures expérimentales sont rigoureusement planifiées afin de n’utiliser que le nombre d’animaux strictement nécessaire mais suffisant pour réaliser des analyses statistiques. Pour atteindre les objectifs scientifiques du projet, un nombre maximum de 383 souris sera utilisé.

Raffinement

Les procédures ont été travaillées pour limiter le stress et la souffrance des animaux. Les souris seront au maximum 5 par cages et les cages seront enrichies. Une observation régulière (entre 3 à 5 jours/semaine selion les procédures) des souris sera réalisée (apparence physique, comportement) et, si des signes de souffrance sont détectés chez les animaux, des sédatifs ou des anti-douleurs adaptés pourront leur être administrés.

Choix des espèces

Parmi les rongeurs, il n'existe pas d'autres modèles de sclérodermie systémique que le modèle murin. Par ailleurs, le modèle murin est indispensable pour suivre les effets systémiques et en particulier l'autoimmunité caractérisée par la production d'autoanticorps. Les souris seront adultes car la sclérodermie systémique est une pathologie qui affecte des adultes.