Procédures sévères

Déjà porteurs d'un matériel d'enregistrement implanté lors d'un projet précédent, deux macaques à longue queue sont repris pour cette étude, deux autres pouvant être opérés en remplacement en cas d'échec. Ces quatre animaux au maximum vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue. Ils sont rendus parkinsoniens par des injections répétées d'une neurotoxine, avec un isolement de soixante-douze heures après chacune, puis soumis pendant deux ans à des enregistrements cérébraux de vingt-quatre heures et à une tâche de vigilance de trois heures par jour, cinq jours sur sept. Le porteur intègre au nombre d'animaux prévus le risque d'hémorragie pendant la chirurgie et de mauvaise implantation, et indique que la mise à mort finale sert à vérifier que l'électrode était bien placée.

Objectifs

Les troubles du sommeil sont très fréquents dans la maladie de Parkinson où environ 70% des patients sont affectés. Ces troubles induisent une mauvaise qualité de l’éveil et du sommeil, ils altèrent fortement la qualité de vie des sujets atteints car ils empêchent la réalisation d’activités quotidiennes comme la conduite automobile. Seulement ces troubles sont mal pris en charge par les traitements actuels et il est important de trouver un traitement efficace. Il est établi que l’activité du cortex cérébral nous aide à déterminer les différents états de veille/sommeil. Ainsi, l’étude de l’activité du cortex et de sa modulation par la stimulation électrique de régions cérébrales profondes sont fondamentales pour mieux traiter ces troubles. Le macaque est un modèle de choix pour étudier les troubles du sommeil. Il présente des structures cérébrales et un comportement de veille/sommeil identique à celui de l’humain. Ce qui n’est pas le cas des rongeurs qui sont des animaux nocturnes. Il est également impossible de remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou de simulation informatique. Nous avons pour objectif de rétablir un comportement de veille/sommeil normal chez le singe parkinsonien. D’abord nous étudierons les états de sommeil du macaque sain et parkinsonien. Puis nous étudierons l’effet de la stimulation électrique d’une zone profonde du cerveau dans le but de restaurer un sommeil normal chez le singe parkinsonien. Le dispositif utilisé dans cette étude est déjà utilisé chez l’être humain. Cette étude permettra d’élargir son utilisation au traitement des troubles du sommeil. La plupart des expériences seront réalisées dans la cage d’hébergement des singes, ce qui diminue l’inconfort et le stress de l’animal. Leur état de santé sera surveillé tout au long des expériences. Ce qui permet d’intervenir immédiatement et de manière appropriée au moindre signe de souffrance. Cette étude nécessitera 2 animaux pour obtenir des résultats exploitables, mais deux autres animaux pourront être inclus dans cette étude si nécessaire. Ce nombre d’animaux a été réduit au maximum mais est suffisant pour ne pas compromettre la validité des expériences.

Bénéfices attendus

D’après la littérature, environ 70% des patients atteints de la maladie de Parkinson souffrent aussi de troubles du sommeil. Donc, si il est possible de réguler les troubles du sommeil par la stimulation cérébrale profonde (SCP) du noyau sous-thalamique (NST), ce projet aboutirait à une meilleure prise en charge des troubles du comportement de veille/sommeil (V/S) chez les patients atteints de cette pathologie. Mais ceci permettrait aussi d’améliorer grandement leur qualité de vie car ces troubles empêchent la réalisation de tâches du quotidien qui demandent de l’attention comme la conduite automobile par exemple. Les bénéfices attendus de ce projet au niveau de la santé sont donc importants. Surtout que d’après la littérature, les troubles du sommeil semblent être des facteurs aggravants des maladies neurodégénératives. Au niveau scientifique ce projet va permettre de caractériser l’activité du noyau sous-thalamique (NST) dans les différents états de vigilance. Ceci permettrait une meilleure compréhension du comportement de veille/sommeil (V/S) au niveau cérébral. De plus. Des retombées technologiques sont aussi attendues de ce projet. En effet, de nouveaux paramètres de stimulation du NST par la SCP sont attendus afin de réguler le comportement de V/S..

Procédures

La phase 1 du projet est la chirurgie d’implantation, celle-ci sera réalisée uniquement si les deux animaux implantés dans un projet autorisé en cours sont sortis de l’étude. Des enregistrements télémétriques de longue durée (24h) de l’activité du cortex et du noyau sous-thalamique se dérouleront sur 2 ans et seront effectués à raison de 10 fois par condition. C’est-à-dire 10 fois chez l’animal sain, 10 fois chez l’animal ayant reçu une stimulation thérapeutique et sain, 10 fois chez l’animal parkinsonien et 10 fois chez l’animal parkinsonien ayant reçu une stimulation thérapeutique. Les enregistrements se feront chez les 2 animaux implantés et à l’état vigile. Ils seront effectués dans la volière d’hébergement de l’animal sans manipulation. La tâche comportementale de vigilance sera réalisée au maximum 3h par jour, à heure fixe et 5j/7 pendant 2 ans. Elle se déroulera sur les 2 animaux implantés, à l’état vigile et sur une chaise pour primates. Les animaux seront progressivement entrainés à réaliser cette tâche et chaque progrès ou bonne réponse sera récompensée. Le test itératif de la latence d’endormissement (TILE) sera réalisé chez les 2 animaux. Ce test sera réalisé 14 fois par conditions décrites précédemment. Pour déterminer les paramètres de la stimulation thérapeutique, des enregistrements sous anesthésie générale et en état vigile seront réalisés pour une durée maximale de 1h. Les enregistrements seront effectués de 5x1h en état vigile dans la volière d’hébergement. Puis des gammes de stimulation seront effectuées de façon à pouvoir tester le voltage maximal à utiliser à fréquence fixe de 130Hz (fréquence de stimulation utilisée en clinique). Le voltage utilisé est de 20% en dessous du voltage laissant apparaitre des effets secondaires. Les enregistrements couplés à la stimulation seront effectués sous anesthésie générale et vigile à raison de 5x1h par condition, ces enregistrements détermineront la fréquence de stimulation à utiliser. Les paramètres de stimulation permettront ensuite de stimuler le singe durant toute une nuit. Les 2 animaux seront ensuite rendus parkinsoniens par des injections d'un produit chimique induisant la pathologie. Après chaque injection les animaux seront isolés pendant 72h jusqu’à l’élimination de la toxine. Les injections permettent l’obtention d’un syndrome parkinsonien modérément sévère et stable. Cette phase dure 4 mois.

Impact sur les animaux

La chirurgie d’implantation peut induire des douleurs au niveau du matériel implanté jusqu’à maximum une semaine après l’implantation. Elle sera réalisée uniquement si les deux animaux implantés dans un projet autorisé en cours sont sortis de l’étude.. Mais, au moindre signe de douleur un accompagnement de l’animal et un traitement médicamenteux est prévu pour réduire au maximum la douleur. La tâche de vigilance peut induire du stress chez l’animal mais celui-ci est rapidement dissipé par un apprentissage progressif à réaliser la tâche. De plus l’entrainement et la réalisation de la tâche sont couplé à un renforcement positif récompensant l’animal. Le test itératif de la latence d’endormissement ainsi que les enregistrements télémétriques de longue durée n’induisent pas d’effets indésirables chez les animaux car ils sont réalisés dans la volière d’hébergement des animaux. Ces derniers sont vigiles, libres de leur mouvement et aucune manipulation n’est effectuée sur ces derniers. Enfin l’induction du syndrome parkinsonien induira chez ces derniers un symptôme parkinsonien progressif et maitrisé. Ce syndrome induira des troubles moteurs semblables à la maladie de parkinson. Les animaux seront suivis et accompagnés durant cette procédure.

Devenir

A la fin du projet il est nécessaire de mettre à mort les animaux afin d’effectuer une étude post-mortem du cerveau pour vérifier le bon positionnement de l’électrode de stimulation profonde.

Remplacement

Le singe Macaque fascicularis, qui ne constitue pas une espèce menacée d’extinction, est un animal qui présente une neuroanatomie, notamment du cortex et du noyau sous-thalamique, très proche de celle de l'humain. Il présente aussi un comportement de veille/sommeil similaire à celui des humains. De plus ce modèle animal a permis l’élaboration de la stimulation cérébrale profonde du noyau sous-thalamique ainsi que son transfert aux patients. Enfin, c’est un modèle de choix validé par la littérature pour l’étude neurophysiologique et comportementale de la maladie de Parkinson induite par injection de neurotoxine. C'est donc pour toutes ces raisons que le Macaque fascicularis est un modèle de choix pour l'étude de l’efficacité de la stimulation cérébrale profonde sur le comportement de veille/sommeil dans la maladie de Parkinson. Cette étude préclinique sur le comportement de veille/sommeil nécessite des animaux ayant de fortes similitudes avec l’humain, il nous est donc impossible de remplacer l’animal vivant par un modèle rongeur qui est un animal nocturne, un modèle cellulaire ou de simulation informatique. Le recours à ces animaux est donc nécessaire dans cette étude qui constitue une étape vers la validation d’un traitement chirurgical applicable à l’humain.

Réduction

Le nombre de d’animaux a été déterminé avec un test statistique appliqué pour l’étude. Il permet de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en gardant un nombre suffisant pour ne pas compromettre la validité des expériences qui seront menées. Les animaux seront leur propre contrôle car les tests seront effectués sur les animaux sains puis rendus parkinsoniens. Pour que cette étude soit exploitable il faut enregistrer des signaux de courte durée (au moins 1h) et de longue durée (au moins 24h) à raison de 10 fois chez un seul animal. Ces durées permettent d’obtenir des données statistiquement exploitables. Les analyses spectrales de ces signaux seront comparées à l’aide de tests statistiques adaptés. Dans la définition du nombre d’animaux prévus, nous prenons en compte le risque de rupture de vaisseaux pouvant créer une hémorragie silencieuse pendant la chirurgie, mais s’aggravant en post opératoire ; la mauvaise implantation car le noyau ciblé est très petit. Ceci nous conduit à inclure 100% d’'animaux en plus, soit 2 animaux supplémentaires qui seront opérés uniquement en cas d’exclusion des premiers, ce qui fait un total de 4 animaux maximum pour cette étude. Une étude préliminaire a permis d’enregistrer les signaux corticaux et du NST d’un animal pendant les différents états de veille/sommeil ainsi que de valider la faisabilité des enregistrements. 2 animaux impliqués dans cette étude sur lesquels les expérimentations sont réalisées sont issus d’un projet autorisé en cours de réalisation ce qui réduit le nombre de nouveaux animaux impliqués dans cette étude de moitié.

Raffinement

Des actions sont mises en place pour limiter les risques chirurgicaux : l’imagerie anatomique préopératoire, la ventriculographie et une vérification électrophysiologie per opératoire sont prévues. De plus, des analgésiques, des anesthésiques et des antibiotiques seront administrés aux animaux avant et pendant l’opération chirurgicale afin de supprimer les douleurs et de diminuer les risques d’infections. En post-opératoire il sera aussi administré des analgésiques et des antibiotiques afin de réduire au maximum les douleurs et les risques d’infections. Afin de diminuer le stress des animaux soumis à ce contexte expérimental un programme d’habituation aux conditions expérimentales (tâche de vigilance) est mis en place dans l’animalerie. Ces entrainements se font selon un protocole progressif, dans lequel chaque étape est apprise progressivement et est récompensée. Un tableau de progression est utilisé pour suivre les progrès des animaux. Les techniciens de l’animalerie et les membres de la cellule bien-être animal s’assurent par des visites régulières qu’aucune souffrance ou mal être n’est ressenti par l’animal au cours de l’expérimentation. Le personnel impliqué sur le projet est formé au bien-être animal. Durant la phase 5, étant donné que l’administration du produit induisant la pathologie se fera en même temps pour les deux animaux dans une pièce adaptée, ils ne seront donc pas séparés car l’isolement des animaux est généralement un standard dans le protocole d’administration de ce produit. Deux animaux sont réutilisés pour cette étude et ont reçu une implantation de matériel d’enregistrement, ce matériel sera utilisé pendant cette étude ce qui dispense cet animal de la chirurgie d’implantation.

Choix des espèces

Le singe cynomolgus (Macaca fascicularis) qui ne constitue pas une espèce de primate menacée d’extinction et qui sont issus d’élevage fait partie des mammifères les plus proches de l’espèce humaine. Son anatomie cérébrale est très proche de celle du cerveau humain, notamment au niveau des structures impliquées dans le comportement de veille/sommeil, ce qui permet de mettre en place la stimulation cérébrale profonde dans les mêmes conditions que chez l’humain, chose impossible à faire avec des animaux plus petits tels que les rongeurs. Ils permettent ainsi la compréhension des circuits neuronaux impliqués dans les mécanismes du comportement de veille/sommeil. Ce modèle animal est d’autant plus pertinent que le comportement de veille/sommeil de ce dernier est très similaire à celui de l’être humain. Aussi, la complexité du comportement de veille/sommeil ainsi que l’impact de la stimulation cérébrale profonde sur ce dernier rend impossible le remplacement de ce modèle animal par un modèle cellulaire ou par une simulation informatique. Des adultes seront utilisés dans cette étude car les traitements à développer à la suite visent des patients adultes.

Porteuses d'une ou plusieurs tumeurs, opérées pour recevoir un implant à libération prolongée et privées de tout analgésique, 464 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le travail porte sur le rôle des neurones de la douleur dans la croissance tumorale, ce qui conduit le porteur à écarter les analgésiques pour ne pas compromettre les résultats. Il affirme dans le même texte qu'aux moments choisis pour tuer les souris, les tumeurs ne seront pas assez grosses pour provoquer une douleur ou une souffrance modérée, tout en annonçant des interventions susceptibles de provoquer des douleurs modérées à sévères et la mise à mort de toute souris perdant 20 % de son poids. Toutes sont tuées pour prélever tumeurs, poumons, rate, ganglions rachidiens, moelle épinière et cerveau.

Objectifs

Les glucocorticoïdes (GC) sont des hormones bien connues pour leurs puissantes propriétés anti-inflammatoires. Elles sont souvent utilisées comme médicaments pour traiter diverses maladies inflammatoires. Leur production est généralement déclenchée par le stress psychologique et dépend de l'activation d'un lien entre le cerveau et les glandes surrénales, appelé « axe HPA ». Des études récentes ont montré que le développement de tumeurs peut également provoquer la production de GC, ce qui peut influencer la croissance des tumeurs et la réponse du système immunitaire contre elles. Des recherches menées dans notre laboratoire ont également montré que certains neurones sensoriels, appelés nocicepteurs, qui sont impliqués dans la perception de la douleur, peuvent influencer la croissance des tumeurs et la réaction du système immunitaire. Nous pensons donc que la stimulation de ces neurones dans la tumeur pourrait activer l'axe HPA et augmenter la production de GC, ce qui pourrait affecter le développement des tumeurs. Notre projet vise à explorer cette question dans différents types de cancers, tels que le cancer du sein, le fibrosarcome, le mélanome, les métastases pulmonaires liées au cancer du sein, et l'adénocarcinome mammaire.

Bénéfices attendus

Les glucocorticoïdes sont produits lors du développement d'un cancer. Ils semblent jouer un rôle crucial dans la croissance tumorale et modulent la réponse immunitaire antitumorale. Parallèlement, la douleur, qui résulte de l'activation des neurones sensoriels ou nocicepteurs, est l'un des symptômes majeurs associés au cancer. Les nocicepteurs, en plus de leur rôle dans la perception de la douleur, régulent également la croissance tumorale et influencent la réponse immunitaire antitumorale. Ainsi, il existe une interaction complexe entre les glucocorticoïdes, les nocicepteurs, la croissance tumorale, et la réponse immunitaire antitumorale, soulignant l'importance de ces éléments dans la progression et le traitement du cancer. Notre projet de recherche a pour objet de comprendre cette interaction et pourrait à terme conduire au développement de thérapies plus ciblées. De plus, en fonction des relations existant entre douleur et production de glucocorticoïdes, cette étude pourra nous éclairer sur l’utilisation raisonnée d’antalgiques et d’anti-inflammatoires stéroïdiens et donc la prise en charge thérapeutique notamment dans le cancer.

Procédures

Les souris seront soumises à différents types d'injections qui n'excéderont pas 10 secondes. Elles subiront également des prélèvements sanguins réalisés sous anesthésie gazeuse. Certaines souris seront également soumises à une procédure chirurgicale afin d'implanter une pilule biodégradable permettant la libération prolongée et continue d'un traitement.

Impact sur les animaux

Les animaux seront porteurs d’une ou plusieurs tumeurs susceptibles de déclencher des douleurs chez les animaux. Compte tenu de la nature même du projet qui propose d’explorer l’effet des neurones impliqués dans la perception de la douleur, aucun analgésique ne pourra être utilisé sans compromettre les résultats expérimentaux. Cependant, des données de la littérature et de notre expérience avec ces différents modèles, nous savons qu’aux temps où nous avons choisi de sacrifier les souris, la taille des tumeurs ne sera pas suffisamment importante pour provoquer de la douleur ou une souffrance modérée. Les souris seront soumises à diverses interventions (injections de cellules, d’agents chimiques et actes chirurgicaux) susceptibles de provoquer des douleurs allant de modérées à sévères, ainsi qu’à un stress de durée variable, allant de courte (10 secondes) à plus longue durée (1 heure).

Devenir

Mise à mort des animaux à la fin des procédures expérimentales pour récupérer les organes d'intérêts (tumeurs, poumon, rate, DRG, moelle epinière, cerveau)

Remplacement

Notre hypothèse repose sur le fait que certains neurones sensoriels pourraient influencer la production des glucocorticoïdes lors du développement tumoral. Compte tenu de la nature même du projet, seuls des modèles animaux sont utilisables pour répondre à ces questions. De plus, la tumeur est un micro-environnement complexe qui ne peut pas être modélisée in vitro et in silico, particulièrement en ce qui concerne son innervation sensorielle. Cependant, pour la recherche des mécanismes de l’interaction neurone-cellules immunitaires-cellules tumorales, nous veillerons à utiliser dès que possible des techniques ex vivo déjà maitrisées au laboratoire, telles que la coculture de neurones, de cellules tumorales et de cellules immunitaires.

Réduction

Le plan de nos expériences est construit de sorte à limiter le nombre de souris au maximum. Les modèles tumoraux obtenus par injection de cellules tumorales sont très bien décrits dans la littérature et en grande partie maitrisés au sein du laboratoire. Ainsi, la pousse tumorale aura lieu dans quasiment 100% des souris. Bien que les stratégies de croisement soient plus complexes pour le modèle de développement tumoral spontané, les femelles développeront également des tumeurs dans 100% des cas. Des expertises antérieures de certains membres de l’équipe, enrichies par des recherches bibliographiques, nous ont permis de déterminer le nombre strict de souris nécessaires par expérience pour obtenir des résultats fiables et exploitables.

Raffinement

Pour réduire le stress des animaux, un temps d'acclimatation d'une semaine sera respecté avant toute procédure. Les souris seront hébergées par groupes de cinq dans des cages avec litière, nid en papier et petites maisons. Elles auront accès librement à la nourriture et à l'eau, et pourront se déplacer librement. Une surveillance quotidienne permettra de repérer tout signe de souffrance (comme la perte de poids, des changements d'apparence ou de comportement). Si des signes de mal-être apparaissent, des mesures comme la mise à disposition de nourriture humide ou le soin des plaies seront mises en place. À partir d'une certaine taille de tumeur, de la nourriture humide sera systématiquement ajoutée dans les cages pour faciliter l’accès à la nourriture et à l’eau, et des bâtonnets de bois seront donnés pour que les souris puissent user leurs dents. Le poids des souris sera mesuré trois fois par semaine, et si une souris perd 20 % de son poids initial, elle sera euthanasiée. Toutes les interventions (mesure des tumeurs, prises de sang, pesée) seront regroupées pour réduire le stress, et les injections seront effectuées par du personnel expérimenté. Les mesures de tumeurs seront réalisées sous une anesthésie légère au gaz pour minimiser la douleur et le stress.

Choix des espèces

La souris constitue un modèle idéal pour notre étude. Le haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l’homme (dans notre cas, les schémas des systèmes immunitaires et neuronaux sont très similaires entre l’homme et la souris), l’état actuel des connaissances, les outils et structures disponibles pour sa manipulation et un temps de génération court font de la souris le modèle idéal à l’étude des systèmes immunitaire et nerveux. De plus, le modèle murin est un modèle de choix par l'existence de souris génétiquement modifiées Des souris d'âge minimum de 7-8 semaines seront utilisées afin d'avoir un système immunitaire et sensoriel mature.

Un cathéter poussé jusque dans le cœur, au cours d'une chirurgie terminale sous anesthésie sans réveil, clôt le parcours de chaque animal. 1 225 souris porteuses d'une mutation provoquant une amylose cardiaque vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour prélever leurs organes. Avant cela, elles subissent une biopsie de l'oreille, deux à cinq échocardiographies sous anesthésie, un à quatre tests de résistance à l'effort de vingt et une minutes et une IRM sous anesthésie, tandis que les dépôts amyloïdes provoquent une défaillance de plusieurs organes et, chez certaines, une pousse excessive des dents qu'il faut couper. Le porteur écrit que les traitements évalués "permettront d'augmenter l'espérance de vie" des patients, alors que ce même projet se limite à fournir des résultats préliminaires sur de nouvelles voies médicamenteuses.

Objectifs

Les patients atteints d'amylose cardiaque ont un pronostic effroyable à plus ou moins court terme. Ceci s'explique notamment du fait d'une intolérance aux médicaments donnés habituellement aux patients présentant une insuffisance cardiaque, mais aussi par l'absence d'un traitement spécifique pour l'amylose cardiaque. Ce manque de solution thérapeutique peut entraîner une modification délétère et irréversible du coeur. L’amylose cardiaque, quel que soit son phénotype, touche environ 2500 nouveaux patients par an en France. Récemment, notre laboratoire a acquis un modèle murin d’amylose cardiaque. Des travaux préliminaires de notre laboratoire sur ce modèle (non publiés) ont montré le développement d’une insuffisance cardiaque à 5 mois d’âge, associée avec une accumulation de protéines amyloïdes. Dans ce contexte, un traitement original pourrait être l’inhibition d'une protéine (appelée O-GlcNAcase) impliquée dans la modification des autres protéines au niveau des cellules. En effet, cette dernière est impliquée dans le dépôt de protéines mal repliées et regroupées entre-elles dans le cerveau, et de ce fait, son inhibition est évaluée dans la prise en charge de la maladie d’Alzheimer. Nous souhaitons évaluer les effets de cette inhibition dans un modèle murin proche de ce qui est observé en clinique. L’objectif de ce projet est donc d’effectuer une étude sur l’impact de l’inhibition de l’O-GlcNAcase dans un modèle murin d’amylose cardiaque par des approches in vivo et ex vivo. De plus, une nouvelle molécule, qui a montré des effets bénéfiques au niveau cardiaque, sera testée. Mais aucune étude ne s'est réellement intéressée à son effet lors d'un administration chronique chez des individus atteints d'une amylose.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de bien comprendre les mécanismes de l'évolution temporelle de la dysfonction cardiaque liés à l'amylose. Il permetta de fournir des résultats préliminaires concernant des nouvelles voies médicamenteuses pour le traitement de l'amylose cardiaque, et ainsi d'avoir un intérêt pour des patients atteints de cette maladie. Ces traitements permettront d'augmenter l'espérance de vie, après le diasgnotic, qui est d'environ 5 à 10 ans actuellement.

Procédures

Les animaux vont suivre 6 interventions. En premier lieu, une biopsie d'oreille sera réalisée pour génotyper les animaux, cette intervention dure 5 minutes. Ensuite, les animaux suivront 2 à 5 échocardiographie sous anesthésie générale, où une sonde sera placée sur le thorax avec du gel d'échographie, cette intervention dure 20 minutes. Les animaux réaliseront 1 à 4 tests de résistance à l'effort pendant 21 minutes. Les animaux suivront un IRM sous anesthésie générale par une injection intra-péritonéale et cette intervention va durer 30 minutes. Pour finir, les animaux suivront l'intervention suivante, chirugie terminale sous anesthésie sans réveil, visant à insérer un cathéter jusque dans le coeur pour étudier la fonction cardiaque. A la suite de cela, les animaux seront mis à mort.

Impact sur les animaux

Chez ces animaux, il est attendu d'observer une défaillance multisystémique causé par les dépôts amyloïdes. La défaillance multi-systémique entrainera une augmentation anormale de la taille des organes, entrainant leur dysfonctionnement. Ces défaillances augmenteront le niveau de stress de l’animal, qui pourra en partie s’observer via son comportement. De plus, quelques animaux de ce modèle ont une croissance exacerbée de leurs dents. Les animaux subiront une anesthésie gazeuse (Echocardiographie et génotypage) et une anesthésie générale par voie intrapéritonéale (IRM, chirurgie terminale). Lors du test de résistance à l'effort, de la douleur, de la fatigue et de l'anxiété peuvent être générés pouvant se traduire avec un comportement plus agressif.

Devenir

A l'issu de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin de récupérer les différents organes pour des études biomoléculaires et histologiques. Ces tissus sont nécessaires pour valider les effets des traitements sur l'organisme et sur les dépôts amyloïdes.

Remplacement

Ce projet vise à caractériser la physiopathologie multi-systémique associée à l'amylose et de tester une nouvelle voie pharmacologique. Des expériences ex vivo et in vitro ne sont pas adéquates pour répondre à la question scientifique posée dans le cadre de ce projet. En effet, l'amylose est caractérisé par un dépôt progressif de fibrilles au sein des différents organes. Actuellement, le seul moyen de reproduire la pathologie de l'amylose est par l'utilisation d'un modèle murin.

Réduction

Nous utiliserons un nombre minimal d'animaux, afin que l'étude sur différents plans (histologique et statistique) puisse se dérouler sans encombre et une analyse des résultats sera effectuée à mi-parcours, afin de déterminer si le nombre d’animaux est suffisant pour l'analyse statistique. Après une approche statistique, le nombre total d’animaux nécessaire est de 1225. Concernant le protocole 1, deux sous-groupes sont établis (Mâles et Femelles). Pour les groupes témoins, le nombre d'animaux nécessaire sera inférieur car ces animaux ne développeront pas la maladie. Par la suite, l’hypothèse est qu’il n’y aura pas de différence entre les mâles et les femelles, permettant de réduire le nombre d'animaux nécessaire par groupe. Les deux premiers protocoles vont se dérouler de la même manière, et de ce fait, les données récoltées dans le premier pourront être réutilisées autant que possible sans pour autant induire de biais expérimentaux liés à la temporalité des protocoles. Une stratégie de reproduction adaptée sera mis en place pour permettre de limiter à l'unique production d'animaux pour les procédures expérimentales. A la fin du projet, une stratégie de cryoconservation de sperme sera mis en place afin de préserver la lignée.

Raffinement

Les animaux sont hébergés aux normes requises et un enrichissement des cages est mis en place. Un suivi des animaux sera réalisé quotidiennement durant toute la durée du protocole expérimental, ce qui permettra de déceler un éventuel signe de souffrance. Pour le suivi, la grille d’évaluation des points limites du bien être des animaux et d’évaluation des expressions faciales de la souris seront utilisées. L’animal sera exclu de l'étude et euthanasié en fonction de son score et de la discussion avec les membres de la cellule SBEA. Lorsque les animaux présenteront une pousse des dents exacerbées, ces dernières seront coupées sous anesthésie gazeuse, puis, dans les jours suivants, il sera mis à disposition de la nourriture en gelée. A des stades avancées, si les animaux présentent des difficultés de mobilité, des croquettes seront disposées directement dans la cage. Pour les différents déficits liés aux dépôts amyloïdes, une injection d'un analgésique sera réalisée par une injection sous cutanée. S’il n’y a pas d’amélioration, l’euthanasie sera à considérer. Concernant le test de résistance à l’effort, les animaux seront soumis à une phase de découverte et à une phase d’habituation avant le test. Pour la chirurgie terminale sous anesthésie sans réveil, un analgésique sera administrée localement, au niveau du site de chirurgie. Pour le réveil, les animaux seront placés sous lampe chauffante pour maintenir leur température corporelle. Un suivi de poids hebdomadaire sera réalisé.

Choix des espèces

Le choix de la souris se justifie par l'expertise du laboratoire vis-à-vis des évaluations fontionnelles et structurelles cardiaques in vivo et ex vivo chez la souris. De plus le modèle génétique de l'amylose cardiaque qui sera utilisé, a été généré uniquement chez la souris. Ce modèle transgénique exprime un variant de l'alipolipoprotéine AII, avec une expression cardiaque, hépatique et rénale.

Placés à 30 kg dans des cages de 52 centimètres sur 117, où ils ne peuvent pas se retourner, 60 porcs y passent quatorze des vingt-huit jours de l'essai. Ils vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, la collecte séparée des fèces et de l'urine imposant, selon le porteur, cette contention prolongée. Le projet mesure la digestibilité d'aliments à très basse teneur en protéines et les émissions gazeuses associées, pour réduire l'impact environnemental de la production porcine à performances de croissance égales. Aucun porc ne quitte l'essai vivant, parce que les acides aminés de synthèse testés, leucine, isoleucine et histidine, ne sont pas autorisés dans l'alimentation porcine.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont de quantifier les effets de stratégies alimentaires à très basse teneur en protéines associées à une gestion optimisée des effluents sur les performances de croissance des animaux, sur l’utilisation digestive et métabolique par les animaux, sur la répartition de l’azote entre urine et fèces avec des répercussions potentielles sur la composition des effluents, les émissions gazeuses associées et leur potentiel de valorisation.

Bénéfices attendus

Notre hypothèse est que nous pouvons réduire l’impact environnemental de la production porcine en maintenant les performances de croissance des animaux. Pour que la réduction d’impacts obtenues au kg d’aliment produit soit conservée au kg de porc produit, il faut que les performances de croissance soient maintenues.

Procédures

Les animaux seront logés dans des cages à digestibilité de dimension : 52 x 117cm pendant 14 jours sur les 28 jours d'expérimentation.

Impact sur les animaux

La mesure de l’utilisation digestive d’un aliment chez le porc nécessite de collecter totalement les fèces des animaux, qui ne doivent pas être contaminées par l’urine. Ainsi, il est nécessaire de placer les animaux dans des cages à digestibilité (dimensions : 52 x 117cm) dont les dimensions sont réduites afin d’empêcher l’animal de se retourner tout en lui maximisant l’espace disponible. Les cages sont ainsi équipées d’un système de parois ajourées mobiles et de barreaux permettant de maintenir le contact entre les animaux.

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasiés à la fin de l'expérimentation car nous allons tester des acides aminés de synthèse pas encore autorisés sur le marché de l'alimentation porcine (leucine, isoleucine, histidine). La mise à mort des porcs sera effectuée par injection intraveineuse de T61 (association d’embutramide, d’iodure de mébenzonium et de tétracaïne hydrochloride à la posologie de 1ml/10kg de poids vif) sous anesthésie (Imalgène IM à la posologie de 15mg/kg de poids vif).

Remplacement

L’objectif de ce projet est de tester l’incorporation d’aliments à moindres impacts environnementaux en condition d’élevage sur l’utilisation digestive des écoaliments, les émissions gazeuses à l’échelle de l’animal et la composition et valorisation des effluents. Ces objectifs ne peuvent être atteints par des méthodes mathématiques ou in vitro et nécessitent le recours à une étude in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux de l’essai et le dispositif expérimental mis en place ont été déterminés sur la base d’essais antérieurs afin d’atteindre le niveau de précision souhaité pour évaluer avec précision l’effet des écoaliments en élevage de porcs. Des protocoles similaires conduits dans l’unité ont utilisés entre 4 et 6 porcs par régime pour obtenir une précision satisfaisante dans les valeurs de digestibilité. En conséquence, nous conduirons nos mesures avec 6 porcs par régime.

Raffinement

La collecte totale des déjections sur des animaux entravés est à l’heure actuelle la seule méthode permettant de mesurer la digestibilité d’un aliment avec une grande précision. Les cages dans lesquelles seront hébergés les animaux seront équipées de barreaux et seront toutes placées dans la même pièce pour maintenir un contact visuel, auditif et olfactif entre les porcs. L’appétit, l’ingestion d’eau, le comportement des animaux ainsi que l’état de la cage seront observés au moins deux fois par jour par le personnel technique afin de détecter des blessures éventuelles, des diarrhées ou des troubles respiratoires. Tout animal présentant l’un de ces troubles fera l’objet d’une prise en charge immédiate.

Choix des espèces

La cible de l’étude est le porc en croissance-finition. Nous allons utiliser un croisement répandu dans les élevages commerciaux français (Piétrain X (Large White X Landrace)). Les animaux seront des porcs d’un poids vif de 30kg en début d’essai pour l'étude des aliments croissance et de 60kg en début d’essai pour l'étude des aliments finition. Nous avons choisi de travailler avec des animaux dont le poids vif moyen atteint au cours de l’étude correspond au poids vif moyen des porcs en phase croissance et en phase finition.

Les souris mâles porteuses de la mutation du syndrome de Rett ont une survie médiane de neuf semaines et présentent dès six à huit semaines hypoactivité, perte de poids, baisse de la température corporelle, troubles de la coordination et sensibilité accrue aux crises d'épilepsie. 216 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une partie des mâles mutés reçoit à trois semaines un vecteur viral de thérapie génique, puis les mâles passent 32 heures d'enregistrement de l'activité, un rotarod, une barre crantée, un test de reconnaissance d'objet nouveau et un test de sensibilité aux crises après injection d'un agent convulsivant. Le porteur écrit que toutes seront tuées "avant l'apparition du phénotype dommageable", et situe les tests à six ou sept semaines, un "stade symptomatique" selon ses propres termes.

Objectifs

Le syndrome de Rett est une maladie d'origine génétique définie par un trouble grave et global du développement du système nerveux central. La pathologie touche essentiellement les filles, rarement les garçons qui eux meurent d'une encéphalopathie néonatale sévère. Ce syndrome entraine un polyhandicap avec déficience intellectuelle sévère et infirmité motrice, ainsi que des troubles respiratoires et cardiovasculaires. Il se manifeste par une régression rapide des acquis après 6 à 24 mois de développement normal. Aujourd’hui, une prise en charge globale des symptômes permet à ces patients de vivre plusieurs dizaines d’années, mais il n'existe malheureusement pas de traitement curatif à ce jour. La thérapie génique est une approche prometteuse, notamment par édition du génome pour corriger le gène muté responsable de la pathologie. Afin d'envisager cette approche thérapeutique, nous avons caractérisé au préalable trois modèles de souris portant des mutations dans ce gène, représentatives de la pathologie humaine, plus spécifiquement dans le domaine du comportement et de la cognition. Cette caractérisation et compréhension des modèles dans nos conditions nous a permis de sélectionner le modèle le plus pertinent pour évaluer une approche de thérapie génique. En parallèle, nous avons développé un vecteur viral AAV (Adeno-Associated Virus) pouvant être injecté par voie intraveineuse périphérique et capable de passer la barrière hémato-encéphalique de manière efficace afin de cibler les cellules portant la mutation dans le gène responsable de la pathologie, et ainsi aboutir à leur correction par édition du génome.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'obtenir une preuve de concept in vivo qu'une approche thérapeutique par thérapie génique permet de corriger les signes cliniques du syndrome de Rett dans un modèle murin, avec pour objectif final de proposer un traitement efficace pour les patients atteints de cette pathologie, contre laquelle il n'existe aucun traitement curatif à ce jour.

Procédures

Injection par voie intraveineuse caudale (durée 2-3 minutes); activité circadienne pour suivre l'activité locomotrice, ainsi que la consommation en eau et en nourriture durant un cycle complet jour-nuit (durée 32h); test de coordination (rotarod) (2 sessions de 15 minutes); barre crantée: test proprioceptif dépendant de la coordination motrice et de la fonction vestibulaire (10 minutes); test de reconnaissance d'un nouvel objet pour évaluer la cognition (30 minutes); test de susceptibilité aux crises épileptiques (durée du test: 20 minutes), après injection par voie intrapéritonéale d'un agent convulsivant( durée d'injection: 5 sec); le suivi du poids des animaux (1X/semaine, à partir de 3 semaines jusqu'en fin d'étude à 7 semaines d'âge).

Impact sur les animaux

La mutation dans le gène responsable de la pathologie induit une mortalité précoce des animaux, avec une médiane de survie de 9 semaines chez les males porteurs de la mutation. Ceux-ci peuvent notamment présenter les symptomes suivants à 6-8 semaines d'âge: hypoactivité, diminution du poids, diminution de la température corporelle, déficit dans la coordination motrice, démarche anormale, déficits cognitifs, et susceptibilité accrue aux crises épileptiques. Les femelles qui portent la mutation ne manifestent des défauts que vers l'âge de 9 mois (déficits moteurs, faible capacité à construire des nids) et peuvent survivre au-delà de l'âge de 1 an. Dans le cadre de notre projet, les femelles seront euthanasiées avant l'âge de 9 mois où commencent à apparaitre les symptomes. Au cours du test de sensibilité aux crises épileptiques par injection d'un agent pro-convulsivant, des crises convulsives peuvent survenir à différents degrés de sévérité; la durée, la latence et la sévérité sont enregistrées. Des effets indésirables sont également liés à l'injection de vecteurs AAV par voie intraveineuse, tel que des saignements au site d'injection.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la réalisation de l'ensemble des expériences, avant l'apparition du phénotype dommageable.

Remplacement

L'objectif de cette étude est d'évaluer une approche thérapeutique dans un modèle de souris portant une mutation dans le gène responsable du syndrome de Rett, représentative de la clinique humaine. Il s'agit en particulier d'étudier la correction des phénotypes comportementaux, de déficit intellectuel et de susceptibilité aux crises épileptiques. Des études in vitro ont été réalisées au préalable afin d'évaluer cette approche dans des modèles de cellules neuronales en culture, ainsi que dans des neurones dérivés de cellules souches pluripotentes de patients et dans des organoides cérébraux, mais seul un modèle animal nous permettra de caractériser la correction des symptômes de la maladie de Rett, et ainsi de valider l'effet thérapeutique par la correction du gène, étape indispensable avant d’envisager un essai thérapeutique chez l’homme.

Réduction

Dans le cadre de cette étude, nous utiliserons 60 mâles portant une mutation dans le gène responsable du syndrome de Rett représentative de la clinique humaine: 30 seront traités par injection d'un vecteur viral permettant de corriger le gène muté pour évaluer l'approche thérapeutique, 30 ne seront pas traités. Ce nombre de souris tient compte d'une probabilité de perte des animaux au cours de l'étude en raison de la mortalité précoce associée à la mutation, tout en permettant d'assurer un nombre d'animaux suffisant durant le protocole afin de pouvoir réaliser des analyses statistiques robustes et fiables.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans les meilleures conditions possibles dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance de l'animal. Afin d’améliorer leurs conditions de vie, elles seront ainsi stabulées dans des conditions optimales pour l’espèce : en groupe, avec des paramètres environnementaux maitrisés, un milieu enrichi à l’aide de "nestlets" ou de maisonnettes en carton. Pour pallier au risque de diminution de la température corporelle, nous augmenterons le nombre de "nestlets"dans les cages. En cas de difficultés motrices, de la nourriture en gel sera ajoutée dans les cages. Tous les animaux seront observés de manière quotidienne et suivis selon un tableau de scoring pour l'évaluation de la douleur et pour l'établissement de points limites, prenant en compte le poids, l'apparence physique, les signes cliniques et le comportement de l'animal. Les manipulations et gestes brusques seront limités pour éviter de déclencher des crises d'épilpesie. Tout au long des procédures, si l’état de santé de l’animal est dégradé, le personnel formé et compétent décide de ne pas réaliser le test et d'euthanasier l’animal. Le type de croisement choisi pour monter les cohortes expérimentales (femelles hétérozygotes X mâles qui ne portent pas la mutation) permet d'optimiser le nombre d'animaux pour créer les cohortes et également de ne pas maintenir de mâles reproducteurs, ceux-ci développant des symptômes pathologiques à 6-8 semaines, avec une survie limitée à environ 9-10 semaines. Les femelles hétérozygotes ne présentent, quant à elles, des symptômes qu'à partir de l'âge de 9 mois; elles seront euthanasiées avant cet âge afin de ne pas maintenir des animaux avec un potentiel phénotype dommageable.

Choix des espèces

Le modèle souris portant la mutation dans le gène responsable de la pathologie permet de reproduire les symptômes de la maladie de Rett observés en clinique humaine. Il permettra ainsi d'évaluer un traitement par thérapie génique et de suivre la correction des phénotypes. Les études précédentes nous ont permis de définir un âge maximum de 8 semaines pour réaliser les tests comportementaux, avant que les animaux n'expriment un phénotype dommageable entrainant leur mort. Par ailleurs, nous savons qu'il faut un délai de 3-4 semaines entre l'injection des vecteurs AAV et une expression efficace des transgènes. Nous utiliserons ainsi des animaux âgés de 3 semaines pour réaliser les injections par voie intraveineuse du vecteur AAV, suivi de l'évaluation de la correction du phénotype à l'aide de tests comportementaux et de cognition à 6-7 semaines d'âge (stade symptomatique similaire au stade retenu en vue d'applications en clinique humaine, chez des sujets jeunes présentant des symptômes du syndrome de Rett).

3 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des injections de bactéries multirésistantes dans l'abdomen, une première série servant à établir la dose qui tue la moitié des animaux, et 840 d'entre elles subissent en plus deux injections d'antigènes puis un prélèvement de sang par semaine sous anesthésie pendant quatre semaines. L'objectif déclaré est de tester sept anticorps et sept vaccins contre des bactéries que l'ONU et l'OMS classent comme prioritaires. Les souris encore vivantes sont gardées sept jours au plus après l'infection avant d'être tuées, et le porteur affirme que le recours au modèle animal est "indispensable" pour mesurer l'effet du traitement en présence d'un système immunitaire complexe.

Objectifs

Les bactéries résistantes aux antibiotiques constituent aujourd'hui un problème de santé public mondial majeur menaçant en particulier le milieu hospitalier. A l'heure actuelle, il y a de moins en moins de nouveaux antibiotiques et de plus en plus de résistances aux antibiotiques. Il faut donc de nouveaux traitements efficaces contre ces infections dont les taux de mortalité sont de plus en plus élevés. Devant cette faille thérapeutique internationale, il est crucial d'orienter les recherches vers de nouvelles cibles et stratégies thérapeutiques comme l'immunothérapie (utilisation de vaccins et d'anticorps). Ce projet vise donc à tester un panel d'anticorps et de vaccins afin de lutter contre ces infections. Des souris seront utilisées pour tester ces nouveaux traitements. Ce projet couvre un domaine exceptionnellement large (l'antibiorésistance) concernant potentiellement toutes les bactéries provoquant des infections chez l'homme. L'efficacité de 7 anticorps ainsi que 7 vaccins sera testée contre les bactéries pathogènes classées comme prioritaires par l'ONU (Organisation des Nations Unies) et l'OMS (Organisation Mondiale de la Santé. Les antibiotiques seront aussi testés dans ce projet. Il y aura d'abord une étude pilote sur un nombre restreint de souris afin de pouvoir définir la dose bactérienne provoquant la mort de 50% des animaux. Ensuite, les nouveaux vaccins et anticorps seront testés ainsi que leur efficacité à protéger les souris. Ce projet s'assurera aussi qu'il n'y a pas d'interférence entre l'immunothérapie et l'antibiothérapie.

Bénéfices attendus

Ces travaux couplés à une étude in vitro permettront de déterminer précisément l’action favorable liée à l’utilisation de thérapies innovantes comme les anticorps monoclonaux ou polyclonaux ou des antigènes, en présence ou en absence d’une antibiothérapie lors d’une infection par des bactéries, y compris les bactèries multi-résistantes. Ces nouvelles thérapeutiques visent non seulement à lutter efficacement contre les infections causées par ces bactéries mais aussi à réduire la pression de sélection induite par les antibiotiques, ce qui permettra de diminuer l’émergence et la dissémination de la résistance aux antibiotiques.

Procédures

- 3000 souris recevront une injection intrapéritonéale 1 fois pour chaque concentration bactérienne testée, 3 fois pour chaque anticorps et 2 fois pour chaque antigène testé. Chaque injection durera quelques secondes. - 840 souris recevront une injection en sous-cutané des antigènes à deux reprises. Chaque injection durera quelques secondes - 840 souris seront anesthésiées pour les prélèvements sanguins une fois par semaine durant les prélèvements sanguins et chaque anesthésie durera moins de 3 min. - Le sang de 840 souris sera prélevé sous anesthésie générale une fois par semaine et pendant 4 semaines. Chaque prélèvement durera quelques secondes.

Impact sur les animaux

Les souris vont développer des infections à des bactéries pathogènes notamment les bactéries multi-résistantes aux antibiotiques. Ces infections seront instaurées par injection en intrapéritonéale qui malgré tout reste une injection invasive pouvant causer un inconfort temporaire comme une faible douleur et un peu de stress. De plus, les infections peuvent provoquer une augmentation de la température corporelle, des difficultés respiratoires ou encore une perte de poids. Par ailleurs, certains lots de souris vont subir des anesthésies par inhalation de gaz qui peut causer des irritations des voies respiratoires temporaires comme la toux ou des mouvements de détresse ainsi que des risques de perturbation de la thermorégulation.

Devenir

Les souris survivantes seront mises à mort à la fin du projet car elles ne pourront pas rester en vie après une bactériémie.

Remplacement

Des études préliminaires in vitro ont permis d’établir les doses optimales d’anticorps à utiliser. Cependant l’emploi du modèle animal est indispensable afin d’étudier l'efficacité du traitement en présence ou en absence d’un système immunitaire complexe, l’impact du microbiote ou une antibiothérapie couplée à l’utilisation d’anticorps monoclonal ou polyclonal. De plus, s’agissant du développement d’une nouvelle stratégie curative l’expérience sur l’animal est justifiée avant l’application sur l’homme. Les souris seront utilisées pour étudier l'effet d'une immunothérapie sur la prévention et le traitement des infections bactériennes, où les mécanismes impliqués ne peuvent pas être modélisés de manière adéquate in vitro ou avec d'autres espèces.

Réduction

Ce projet utilisera une lignée consanguine de mâles et de femelles dont le fond génétique est contrôlé et homogène pour minimiser la variabilité des phénotypes et donc le nombre d’animaux à utiliser. Il se limitera à l’étude des souches bactériennes les plus importantes en tant que souches multirésistantes aux antibiotiques. Le projet utilise pour chaque expérience le nombre minimal d'animaux permettant d'observer une différence significative. Selon l'expertise du laboratoire, il est estimé qu’une réponse sur un nombre de 10 animaux est suffisante pour obtenir une différence statistique.

Raffinement

Pour réduire le stress et l’angoisse des souris, de l’enrichissement sera ajouté dans chaque cage d’hébergement (coton et maison en carton). Les animaux seront hébergés en groupe de cinq maximum, dans des cages équipées afin d'offrir un environnement enrichi et approprié. Les souris auront un accès (à volonté) à l'eau et à la nourriture pour assurer leurs hydratations et leurs besoins nutritionnels. Une surveillance sera effectuée 1 à 2 fois par jour par les membres de ce projet ou le cas échéant par le personnel qualifié de l'animalerie. Afin de limiter au maximum les souffrances liées à la bactériémie, les souris seront gardées maximum 7 jours post-infection avant la mise à mort. Les prélèvements de sang seront faits sous anesthésie légères et peu invasives afin de minimiser le stress et la douleur lors des injections/prélèvements.

Choix des espèces

La souris est un modèle animal bien établi et largement utilisé en recherche biomédicale en raison de sa génétique bien caractérisée et de sa similitude avec l'organisme humain en termes de physiologie et de pathologie. Ces caractéristiques permettent de réaliser des études reproductibles et de haute qualité, fournissant des résultats pertinents et transposables aux humains. De plus, la souris est reconnue comme un modèle d'infection systémique à E. coli et d'autres bactéries permettent de disséquer les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents aux maladies humaines. Nous utiliserons des animaux adultes âgés de 5 à 6 semaines.