Procédures sévères
Identification et rôle de gènes bactériens à expression hétérogène dans la virulence de Citrobacter rodentium chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Gavées une seule fois avec une souche de Citrobacter rodentium, 145 souris sont ensuite manipulées chaque jour pendant quatorze jours pour la récolte de leurs excréments. Pour 115 d'entre elles, le niveau de souffrance déclaré est sévère, avec perte de poids et inconforts liés à la maladie intestinale, les 30 autres relevant d'un niveau léger. Le porteur écrit que la première procédure "ne génère aucune nuisance sur les animaux mise à part le gavage", formulation qui cohabite mal avec les 115 souris déclarées en souffrance sévère dans la seconde. Toutes sont tuées par dislocation cervicale, et il précise qu'ayant reçu des souches pathogènes, elles ne peuvent être ni réhabilitées ni transférées vers un autre établissement.
Objectifs
Les Escherichia coli entéropathogène (EPEC) et E. coli entérohémorragique (EHEC) sont des bactéries responsables d’infections intestinales chez l’homme. Si la plupart de leurs facteurs de virulence ou de fitness ont été identifiés et bien caractérisés dans la littérature, le comportement dynamique des pathogènes au cours du processus infectieux a été moins étudié. Dans le même temps, les progrès récents en technologies de la cellule unique ont révélé qu’une population bactérienne clonale n’est pas une somme de cellules bactériennes identiques mais rassemble plutôt des individus avec des phénotypes potentiellement distincts, un phénomène appelé hétérogénéité phénotypique. Cette nouvelle vision des populations bactériennes a conduit à l’émergence de concepts écologiques qui changent notre compréhension de la façon dont les micro-organismes s’adaptent à leur environnement fluctuant. Cependant, le rôle de l’hétérogénéité phénotypique dans le processus infectieux bactérien a été peu étudié à ce jour. Afin de caractériser le rôle de l’hétérogénéité phénotypique dans les processus de virulence, le projet aura pour objectif d’identifier des gènes exprimés de façon hétérogène par un pathogène au cours de l’infection. Pour cela, nous prévoyons d’utiliser la bactérie Citrobacter rodentium comme modèle d’étude car i) il s’agit d’une bactérie aux propriétés de virulence similaires à celles des EPEC et des EHEC et ii) c’est un agent pathogène intestinal naturel de la souris avec un processus infectieux très bien caractérisé dans la littérature.
Bénéfices attendus
Nous espérons identifier plusieurs gènes de C. rodentium dont l’expression est hétérogène lors de la première étape du processus infectieux. La mise en évidence de ces gènes est un point de départ pour i) comprendre comment C. rodentium s’adapte à l’environnement intestinal et prépare son expansion dans le côlon et ii) explorer si l’hétérogénéité phénotypique a un rôle dans la virulence de C. rodentium et plus largement dans la virulence d’agents pathogènes proches tels que les EPEC et les EHEC. A plus long terme, ces données pourraient conduire à de nouvelles pistes thérapeutiques via une interférence de l’expression de gènes clés dans l’adaptation des pathogènes à leur environnement infectieux.
Procédures
Les animaux subiront un seul gavage intra-gastrique avec la souche infectieuse (durée~10sec). Les souris seront manipulés quotidiennement pendant 14 jours afin de récolter des féces.
Impact sur les animaux
La première procédure impliquant une infection des souris pendant 24h seulement ne génère aucune nuisance sur les animaux mise à part le gavage par voie orale. La seconde procédure évaluant le rôle des gènes identifiés sur la virulence de C. rodentium pendant 15 jours va quant à elle induire différents effets indésirables sur les animaux tels que perte de poids et inconforts associés à la pathologie intestinale.
Devenir
L’ensemble des animaux prévus pour chaque procédure expérimentale sera euthanasié par dislocation cervicale. Les souris ayant été gavées avec des souches pathogènes, il est impossible de réhabiliter ces animaux ou de les transférer vers d'autres établissement expérimental pour réutilisation.
Remplacement
L’objectif du projet est d’évaluer le rôle de l’hétérogénéité phénotypique au cours du processus infectieux. Il est donc nécessaire de réaliser ces essais chez l’animal afin de prendre en compte la complexité du tractus intestinal qui intègre à la fois la réponse immunitaire, la structure du tractus digestif ainsi que la présence du microbiote. Il n’existe pas de modèles cellulaires reproduisant la complexité de ces interactions. Cependant, les étapes de tri cellulaire prévues dans le projet seront d'abord réalisées in vitro en mélangeant une culture bactérienne seule ou en mélange avec des feces de souris dilués de facon à optimiser le process de tri sans devoir ajouter des animaux supplémenatires.
Réduction
Pour nos expérimentations, le nombre d’animaux utilisé a été déterminé par une approche statistique. Ce nombre est nécessaire pour réaliser la sélection de gènes d'intérêt et pour répondre aux différentes questions scientifiques tout en gardant une puissance statistique suffisante dans le traitement de nos résultats, et pour palier à l’exclusion de certains animaux au cours de l’expérimentation. Il s’agit d’un nombre d’animaux maximal qui sera revu à la baisse en fonction des premiers résultats obtenus qui pourront dans certains cas ne pas nécessiter de répétitions pour valider les observations.
Raffinement
Les protocoles expérimentaux ont été raffinés à partir des données de la littérature et de notre expérience antérieure. Un enrichissement de l'environnement est prévu par ajout de cylindre de coton dans les cages. L’ensemble des animaux seront suivis quotidiennement par du personnel qualifié selon une grille de suivi clinique claire comprenant 4 stades distincts établis en fonction de la perte de poids et de l'état visuel des animaux (pelage et comportements). Si les points limites tels que définis dans le projet sont atteints, les animaux seront immédiatement sortis du protocole expérimental et euthanasiés selon la réglementation en vigueur.
Choix des espèces
La souris est l’hôte naturel de l’agent pathogène Citrobacter rodentium utilisé dans cette étude et constitue un bon modèle pour étudier les infections bactériennes intestinales chez les mammifères. Animaux de 4 à 6 semaines. L’utilisation d’animaux pesant entre 18 et 20 g le jour de l’infection permet de limiter la variabilité de réponse entre animaux vis-à-vis de l’infection
Cinétique microglie AVC
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
182 souris vont être utilisées, dont 152 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour le prélèvement du cerveau. 128 d'entre elles subissent un accident vasculaire cérébral provoqué par injection de thrombine, une intervention d'une heure et demie, suivie d'IRM, certaines recevant en plus un cathéter intraveineux, des microparticules d'oxyde de fer ou des injections de microglie fluorescente. Le porteur indique un affaiblissement de la patte avant gauche, une perte de poids et des déficits fonctionnels ou cognitifs possibles, avec un suivi allant jusqu'à trente jours après l'accident. L'effectif retenu inclut 15 % d'animaux comptés pour l'entraînement des expérimentateurs et les pertes, marge chiffrée puis rapportée à l'"aisance" des équipes.
Objectifs
L'accident vasculaire cérébral (AVC) est l'une des principales causes d'invalidité et de décès dans le monde. L’AVC ischémique (AI) représente environ 85% des AVC, il est majoritairement causé par une thrombose ou une embolie entrainant une diminution de l’afflux sanguin vers le cerveau. Peu après l'apparition de l'AI, des phénomènes d’hypoxie et inflammatoires entrainent une dégénérescence neuronale responsable de déficits à long terme. La majorité des études précliniques sur l’AI se sont concentrées sur des temps précoces et sur la mesure du volume de la lésion, définitif 24 à 48 heures après le début de l'AVC, comme critère d'évaluation principal. Cependant, l'AI peut être considéré comme une maladie chronique. En effet, les patients peuvent souffrir de séquelles des mois, voire des années après la phase aigüe. Ainsi, au moins 1/3 des patients développent une dépression et une fatigue en post-AVC. L'origine de ces symptômes n'est pas claire et peut être difficile à traiter, ce qui en fait une priorité de la recherche sur l'AVC. Malgré cela, nos connaissances sur les phases subaiguës et chroniques de l'AI sont très limitées à ce jour. Il a été suggéré que l'apparition de la dépression et de la fatigue post-AVC pourrait être liée à une dérégulation de la réponse immunitaire. La microglie joue un rôle dans la modulation de la neurogenèse et de l'angiogenèse post-AVC. Dans ce projet, nous examinerons la cinétique temporelle et la dynamique spatiale de la microglie après un accident vasculaire cérébral dans les phases aigues et chroniques post-AVC. Une meilleure compréhension de la dynamique microgliale post-AVC pourrait conduire à l'identification de nouvelles stratégies ciblant la microglie pour combattre les séquelles à long terme.
Bénéfices attendus
Une meilleure compréhension de la dynamique microgliale post-AVC pourrait conduire à l'identification de nouvelles stratégies ciblant la microglie pour combattre les séquelles à long terme.
Procédures
Une partie des animaux recevra une injection d'un agent dépletant la microglie (n=48, durée de la procédure 15min) pour étudier l'impact de la dépetion. Une partie des animaux (n=64) recevra une injection 24 heures avant AVC d'un agent fluorescent et de microbilles fluorescentes (durée de la procédure : 1 heure) pour étudier la dynamique de la microglie et ses interactions avec les macrophages périvasculaires et des méninges. Une partie des animaux fera l'objet d'une pose de cathéter intraveineux 24 heures avant AVC pour l'injection de MPIO (microparticules d'oxyde de fer) (n=10, durée de la procédure : 15 minutes) pour évaluer la dynamique de la microglie. Le modèle d'ischémie thromboembolique cérébrale focale par injection de thrombine sera réalisé sur 128 animaux (durée de la procédure 1,5 heures) et les lésions cérébrales seront évaluées par Imagerie par Résonnance Magnétique (IRM) (n=128, durée de la procédure : 15min). Une partie des animaux (n=10) sera suivi en imagerie IRM à J7, J15, J30 post-AVC pour évaluer la localisation de MPIO et donc la localisation de la microglie. Une partie des animaux recevra une injection de microglie fluorescente (n=60, durée de la procédure 1h). Une partie des animaux (n=10) sera suivi en microscopie biphotonique à A 2h, J2, J15, J30 post-AVC pour observer la dynamique de la microglie.
Impact sur les animaux
Chirurgies : Certains animaux peuvent montrer des signes de douleur dans les premières heures après la chirurgie. Un affaiblissement transitoire de la patte avant gauche (correspondant à la zone cérébrale lésée par l'AVC) qui disparaît dans la première semaine après l'AVC. Ils peuvent également présenter une perte de poids, du stress, des déficits fonctionnels et/ou cognitifs. Injections : certains animaux peuvent montrer des signes de douleur dans les premières heures après la réalisation du geste qui disparait dans les jours suivant la procédure. Imagerie : Certains animaux peuvent montrer des signes de stress lié à la nuisance sonore durant les procédures d'imagerie, une perte de masse corporelle après les anesthésies.
Devenir
A l'issue de toutes les procédures, les animaux seront mis à mort pour récupération de leur cerveaux pour analyses ultérieures.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est l’espèce animale la plus étudiée dans l'étude de la réponse immunitaire en post-AVC au niveau du cerveau. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, de nos travaux précédemment publiés, de la littérature et de tests statistiques. Afin d'avoir une idée de la numérotation des groupes, un test de numérotation a été effectué. En fonction de l'expérimentateur (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse en fonction de l'aisance des expérimentateurs. Un nombre moyen pour chaque groupe, comprenant un pourcentage d'entrainement et de perte dans ce nombre (15%) a donc été défini. De plus, l'utilisation de techniques d'imagerie non invasives permet de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés et analgésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux. Nous avons indiqué pour chaque procédure expérimentale les points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces pour permettre de limiter la douleur à son minimum. Le bien-être des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel qualifié 7/7, cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l'accès à l'eau et à la nourriture sera ad libitum. Des dômes de cellulose et des carrés de cotons seront placés dans chaque cage. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l'angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu'à la mise à mort de l'animal.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences vasculaires et en immunologie. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. Les propriétés tissulaires des artères cérébrales sont identiques chez l’homme et la souris. Le fonctionnement du système immunitaire de la souris se rapproche de celui de l'homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la dynamique de microglie dans les AVC ischémiques. Les souris utilisés seront âgées de 8 à 12 semaines et auront un poids d'environ 20 g. Nous réaliserons nos modèles sur des adultes afin de pouvoir pratiquer sur des animaux du même stade de développement que ceux utilisés en majorité dans les modèles d’AVC.
Utilisation de nouveaux outils moléculaires visant à retarder le déclin cognitif dans un modèle de souris Alzheimer 1/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
555 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour des analyses biochimiques ou histologiques. Chacune subit une chirurgie du crâne d'environ quarante-cinq minutes pour qu'un virus soit injecté dans le cerveau, puis des tests comportementaux quotidiens de un à huit jours, dont un conditionnement à la peur par chocs électriques de 0,4 mA appliqués une seconde. Une partie de ces souris est transgénique et modélise la maladie d'Alzheimer, l'objectif étant de tester trois molécules candidates censées retarder le déclin de la mémoire. Le porteur qualifie la douleur du conditionnement de "fugace" et écrit qu'elle n'induit "aucune douleur ni mal-être durables", tout en affirmant que l'évaluation de la mémoire "ne peut se faire que sur des animaux".
Objectifs
La maladie d’Alzheimer est une pathologie neurodégénérative, touchant environ un million de personnes en France. On estime environ 225 500 nouveaux cas diagnostiqués chaque année. A l’heure actuelle, il existe quatre traitements disponibles dont la Rivastigmine et la Mémantine. Néanmoins, ces molécules ne traitent que les symptômes de la maladie d’Alzheimer et ne permettent pas de guérir ou de stopper la progression de la maladie. Au bout de quelque années ces traitements deviennent donc inefficaces et la balance bénéfices/risques n’est plus positive dû aux effets secondaires de ces molécules (troubles digestifs, cardiovasculaire, insomnie etc.). Comprendre et traiter les mécanismes sous-jacents à la maladie d’Alzheimer est donc d’intérêt public. La maladie d’Alzheimer se caractérise par un déficit précoce de la mémoire épisodique, qui permet la mémorisation de nos expériences passées. Ce type de mémoire repose en partie sur le processus de pattern separation, qui permet la discrimination de souvenirs plus ou moins similaires. Des défauts en pattern separation ont été observés chez des patients atteints de la maladie d’Alzheimer ainsi que chez les modèles animaux de cette pathologie. De plus, la mémoire de travail (court terme ; ex : retenir un numéro de téléphone) est une des premières atteintes dans la maladie d’Alzheimer. Ces troubles cognitifs sont associés à une dysfonction précoce du cortex et de l’hippocampe, impliqués respectivement dans la modulation de la mémoire de travail et du pattern separation. Notre équipe a récemment découvert des molécules qui améliorent le pattern separation chez la souris adulte saine, sans aucun effet délétère. Nous souhaitons maintenant tester l’effet de ces molécules dans des tests comportementaux permettant d’évaluer le pattern separation et la mémoire de travail, chez des souris transgéniques modèle pour la maladie d’Alzheimer. Les expériences seront réalisées dans 2 établissements utilisateurs différents. L’ensemble de ces analyses comportementales nous permettra de tester et valider l’effet nos molécules candidates sur l’amélioration de la mémoire dans des modèles murins sain et de vieillissement pathologique, afin de retarder le déclin cognitif des souris modélisant la maladie d’Alzheimer.
Bénéfices attendus
Nos résultats préliminaires montrent que les souris non-transgéniques injectées avec un virus exprimant une de nos molécules candidates, ont une amélioration du pattern separation par rapport aux souris contrôles. Ainsi, en injectant les souris modélisant la maladie d’Alzheimer avec ce même virus à 4-5 mois ou 8-9 mois, nous espérons retarder l’apparition du déclin cognitif précoce (6 mois) ou retarder son évolution (10 mois). En testant 3 molécules candidates, nous espérons identifier le meilleur candidat afin de restaurer à la fois le pattern separation et la mémoire de travail affectés chez les souris modélisant la maladie d’Alzheimer. Ce projet permettra donc la mise en évidence et la caractérisation de molécules pouvant retarder le déclin cognitif, nous offrant ainsi de nouvelles pistes thérapeutiques. Les résultats obtenus nous permettrons d’avoir une meilleure connaissance des mécanismes moléculaires et cellulaires engagés dans la maladie d’Alzheimer.
Procédures
Nous souhaitons tester des molécules candidates chez la souris adultes et les utiliser ensuite chez des souris modélisant la maladie d'Alzheimer, afin de retarder le déclin cognitif. Pour se faire, nous injecterons directement dans le cerveau des virus non-infectieux qui vont permettre l'expression de molécules candidates. Les animaux seront injectés sous anesthésie avec un volume très restreint de virus (maximum 1µl). La durée de la chirurgie est d'environ 45 minutes. Une fois injectés, les capacités cognitives des animaux seront testées quotidiennement avec des tests comportementaux évaluant la mémoire épisodique et la mémoire de travail. Le test de conditionnement à la peur peut générer de la douleur (faible et brève) et de la peur. Ces tests comportementaux sont d’une durée allant de 1 à 8 jours. Le cerveau des animaux sera finalement prélevé pour vérifier la localisation de l'injection et la présence de la molécule candidate injectée.
Impact sur les animaux
1) Nous devons pratiquer une chirurgie stéréotaxique pour injecter des virus dans une zone précise du cerveau, impliquée dans le pattern separation. Cette chirurgie, rapide et standardisée entraîne une douleur post-opératoire légère pendant environ 48h, qui sera suivie et contrôlée. Les virus injectés n’ont aucun effet dommageable connu ou prévisible sur l’animal. 2) L’évaluation des capacités cognitives de nos souris nécessite l’utilisation de tests comportementaux. Le test de conditionnement à la peur nécessite l’utilisation de charges électriques très brèves et de faible intensité, suffisants pour intaurer de la peur uniquement liée au contexte du test et de la douleur fugace chez l’animal, mais n’induisant aucune douleur ni mal-être durables.
Devenir
A l’issu de chaque procédure les animaux seront euthanasiés et seront utilisés pour des analyses biochimiques ou histologiques.
Remplacement
Ce projet s’intègre dans un projet plus global combinant différents travaux de recherche complémentaires allant de l’étude biochimique ou biomoléculaire au comportement. Beaucoup d’études « in-vitro » sont donc effectuées sur des cellules en culture en amont de l’utilisation de lignées d’animaux pour limiter au maximum leur utilisation. De plus, ce projet fait suite à un projet déjà réalisé dans le laboratoire pour lequel des données préliminaires sur animaux sains sont encourageantes. L'évaluation de la cognition et de la mémoire doit se faire via des études comportementales qui ne peuvent se faire que sur des animaux.
Réduction
Afin d’utiliser le nombre minimal d'animaux mais de garantir la validité scientifique et statistique des résultats, nous avons évalué via la bibliographie et une étude empirique qu’un nombre minimum de 15 animaux par groupe est nécessaire pour nos tests comportementaux. Par ailleurs, nous utiliserons les mêmes animaux pour tous les tests comportementaux avec une évaluation de l’état de l’animal avant le début de chaque test. Dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés lors des tests comportementaux, nous n’utiliserons qu’un groupe contrôle pour les tests concernant les souris modèles pour la maladie d'Alzheimer, ce qui nous permet de passer de 7 groupes de souris à 4 groupes.
Raffinement
Pour améliorer au maximum le bien-être des animaux, toutes les mesures sont mises en place tout au long du projet. Les animaux provenant de notre institut sont tous transportés entre les établissements, qui se trouvent dans le même bâtiment, sur des chariots en limitant au maximum bruits et secousses. Le transport est réalisé au moins une semaine avant le début des expérimentations pour permettre une acclimatation des animaux à leur nouvel environnement et réduire les biais expérimentaux liés au stress du transport. De plus, les animaux seront placés dans la salle de test 30 minutes avant le début des tests comportementaux pour les acclimater. Les animaux sont élevés en cage collective enrichie avec un nid végétal (carrés de cellulose + papier kraft), surveillés régulièrement et des points limites de l’établissement et du projet suffisamment précoces ont été mis en place. De plus concernant la chirurgie, un anti-inflammatoire et un anesthésique local sont administrés avant la chirurgie ainsi qu’un anesthésique gazeux pendant la chirurgie. Nous effectuons également un suivi post-opératoire biquotidien pendant 48h (weekend compris), pour lequel nous avons établi des points limites précoces et des mesures conservatoires adaptées à chaque point limite (e.g. administration d’un antalgique si l’animal est prostré, désinfection d’une plaie paraissant infectée, injection de glucose si l’animal perd trop de poids malgré la nourriture humide mise à disposition dans sa cage, chambre de réveil chauffée à 30°C, etc…). Nos animaux sont habitués à la manipulation 7 jours avant le début des tests comportementaux et ils sont pesés et observés tous les jours lorsqu’ils sont en test comportemental. Si une perte de poids et/ou l’animal paraît faible, froid, prostré etc., de la nourriture humidifiée est mise à disposition dans la cage. Si l’état de l’animal se dégrade, nous effectuons une injection de glucose 5% et nous demandons l’avis du vétérinaire référent. Pour réduire la peur et la douleur dans le test du conditionnement à la peur, le choc électrique est réduit à une durée (1 sec) et une intensité (0.4 mA) minimales.
Choix des espèces
Nous avons choisi d’utiliser la souris, animal pour lequel la manipulation génétique est possible, ce qui permet de produire des modèles mimant les pathologies humaines telles que la maladie d’Alzheimer. Les lignées sélectionnées pour notre projet sont déjà bien référencées et caractérisées. De plus, notre laboratoire possède une expertise et le matériel nécessaire pour étudier le pattern separation et la mémoire de travail chez la souris, ce qui facilitera la mise en place des tests comportementaux chez ces lignées murines. Nous souhaitons utiliser un seul stade de développement pour la procédure 1. En effet nos virus nécessitent 4 semaines pour s’exprimer totalement au sein de la structure cérébrale d’intérêt. Il est donc nécessaire d’utiliser des animaux âgés de 4-5 mois pour pouvoir étudier le comportement et la morphologie chez la souris adulte âgées d’au moins 5-7 mois. Pour la procédure 2, nous souhaitons utiliser 3 stades de développement différents. Les souris saines seront injectées avec nos virus à l’âge de 6 semaines pour être testées à 10 semaines en comportement, afin de répliquer les résultats obtenus précédemment chez les souris adultes de 10 semaines injectées avec une molécule candidate à 6 semaines (amélioration du pattern separation). Les souris modèles pour la maladie d'Alzheimer seront utilisées de 4 à 7 mois et de 8 à 11 mois. En effet, nous voulons injecter nos souris Alzheimer avant l’apparition du déclin cognitif précoce (4-5 mois) ou tardif (8-9 mois) et les tester à des âges subséquents (5-7 mois ; 9-11 mois) pour évaluer l’effet de nos protéines candidates sur la prévention du déclin cognitif.
Développement d’une nouvelle combinaison thérapeutique dans des modèles murins de cancer du sein triple négatif
- Recherche appliquée
- Cancers
Inoculées de cellules tumorales dans la glande mammaire, 1 215 souris immunodéficientes reçoivent jusqu'à quinze injections intraveineuses, jusqu'à quatre prélèvements de sang, jusqu'à trois séances d'imagerie nucléaire par semaine et, pour certaines, une ablation de tumeur. Pour 480 d'entre elles, le niveau de souffrance déclaré est sévère, les 735 autres relevant d'un niveau modéré. Le porteur ne décrit pourtant que des nuisances "légères", douleur locale à l'inoculation, gêne fonctionnelle liée à la tumeur, stress de quelques secondes aux injections, et affirme qu'aucune nuisance n'est attendue de l'imagerie ni des anesthésies. Toutes sont tuées à l'issue pour des analyses immunohistochimiques, l'objectif étant de tester une radiothérapie interne au lutétium-177, seule ou combinée à un inhibiteur de réparation de l'ADN.
Objectifs
L’identification et la validation de nouvelles cibles spécifiques du cancer du sein triple négatif (CSTN) constituent un enjeu important dans les approches thérapeutiques de plus en plus personnalisées. L’analyse des tumeurs du CSTN a révélé la présence de plusieurs cibles thérapeutiques potentielles. Parmi celles-ci, l’antigène membranaire spécifique de la prostate (PSMA). Depuis quelques années, la médecine nucléaire a ouvert de nouvelles opportunités pour le traitement des cancers métastatiques en développant les approches de Radiothérapie Interne Vectorisée (RIV). Elle repose sur l’utilisation combinée deux radionucléides différents : l'un pour l'imagerie (Gallium-68) pour visualiser la cible, et l'autre pour la thérapie (Lutetium-177). Les résultats encourageant du traitement RIV 177Lu-PSMA chez les patients atteints d'un cancer de la prostate nous permettent d'envisager d'utiliser cette thérapie pour les patientes atteinte de CSTN que nous combinerons à un traitement courant chez ces patientes, les inhibiteurs de réparation de l’ADN (PARPi). L’objectif principal de ce projet sera l’évaluation de l’efficacité de la RIV 177Lu-PSMA seule ou combiné avec des PARPi dans des modèles murins de CSTN. Pour cela, il sera nécessaire de caractériser l’expression de PSMA dans plusieurs modèles murins de CSTN puis d’évaluer la biodistribution du 177Lu-PSMA dans ces modèles. Enfin, nous évaluerons le potentiel de la thérapie 177Lu-PSMA seule ou combinée à des PARPi en vue d’une utilisation clinique.
Bénéfices attendus
La caractérisation de l’expression de PSMA dans les modèles de CSTN contribuera à élargir les connaissances scientifiques pour les futurs développements de thérapie ciblant le PSMA dans le CSTN. L’ensemble des résultats de ce projet permettra d’obtenir des données précliniques préliminaires indispensables pour le transfert clinique du 177Lu-PSMA chez des patientes atteintes de CSTN métastatiques en mono-thérapie ou en combinaison avec les PARPi.
Procédures
Les animaux sous anesthésie gazeuse seront soumis à une inoculation de cellules dans la glande mammaire (durée estimée de 1 à 5 min). Des prélèvements sanguins (veine latérale de la queue) pourront être réalisés sur (durée estimée 1-2min ; maximum 4 prélèvements espacés de minimum de 13 jours) et des injections intra-veineuses (veine caudale, durée estimée 1-2min ; maximum 15) pourront être réalisées sur des animaux vigiles. Les animaux sous anesthésie gazeuse seront soumis à des examens d'imageries nucléaires sur un équipement dédié au petit animal (durée moyenne d'un examen : 20 min ; maximum 3 imageries par semaine). Les animaux sous anesthésie gazeuse seront soumis à une ablation des tumeurs (durée maximale estimée de 15 min).
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont : - Une douleur ou inflammation locale liée à l’inoculation des cellules (nuissance légère). - Une gêne fonctionnelle liée à la présence de la tumeur(nuissance légère). - Le stress modéré lors des injections (molécules radioactives ou PARPi), réduite à une dizaine de secondes car réalisée par un expérimentateur expert (nuissance légère). Aucune nuisance liée à l’imagerie in vivo ou aux anesthésies n’est attendue.
Devenir
A l'issue des procédures, les animaux seront mis à mort en vue de la réalisation d'analyses mécanistiques comme des études immunohistochimiques sur les tissus.
Remplacement
Plusieurs étapes de screening réalisées en amont des expériences demandés dans cette procédure seront effectuées afin de réduire le nombre de molécules à évaluer et donc le nombre d’animaux. En effet, l’ensemble des PARPi subiront un screening in vitro pour sélectionner celui qui montre les effets les plus importants. Concernant la RIV PSMA, des études ex vivo sur coupes histologiques de patientes atteintes de CSTN seront réalisés afin de montrer l’affinité du radiopharmaceutique pour sa cible. Ces approches alternatives ne permettent pas de prendre en compte l’organisme vivant dans sa totalité et ne peuvent, à l’heure actuelle, se substituer à l’utilisation de modèles animaux. En effet, les modèles animaux vivant sont, dans les derniers stades d’études, nécessaire pour explorer et évaluer l’effet antitumoral, que ce soit la dissémination de métastases dans la circulation sanguine, mais aussi l’impact du système immunitaire, par le biais d’imagerie.
Réduction
Ces travaux ont été précédés par des études in vitro permettant de sélectionner les doses les plus adaptées. Une forte expertise du laboratoire s’étendant sur plusieurs années d’expériences concernant les modèles animaux permet d’affiner le nombre d’animaux. De plus le nombre d’animaux de ce projet a été défini de façon à utiliser le minimum d’animaux tout en obtenant des données statistiquement suffisantes. Les modèles de tumeur inoculées en position orthotopique dans la glande mammaire (MFP) sont des modèles maitrisés par le laboratoire. Toutes les procédures seront réalisées sur des groupes randomisés avec un groupe témoins négatif (recevant du véhicule) L’ensemble des résultats, y compris négatifs, feront l’objet d’une publication afin d’éviter la reproduction d’expérience.
Raffinement
Pour le bien-être des animaux inclus dans ce projet, des méthodes de raffinements sont utilisées afin d'augmenter au maximum le bien-être des animaux. Pour cela nous mettons à disposition un enrichissement de milieu avec coton pour la nidification bâtonnet de bois pour ronger et cabane de cachette dans chacune des cages. L’hébergement en groupe est maintenu. Les conditions d'hébergement seront optimales (température, hygrométrie, luminosité). Le nombre d’animaux est adapté à la taille de la cage et en adéquation avec la règlementation. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée par le personnel de l’animalerie qui est sensibilisé aux différents modèles. Après leur arrivée à l’animalerie, une période d’acclimatation de 7 jours est définie afin d’acclimater les animaux à leur nouvel environnement. Pour limiter l’anxiété des animaux, ils seront habitués à la contention et à l’appareillage de contention pour les injections intra-veineuses dès la fin de la période d’acclimatation.La surveillance quotidienne permettra de visualiser les points limites, basés sur l’observation de l'état général des animaux et la détermination du score clinique (grille de score en annexe) prenant en compte notamment l’apparence, le poids, le comportement naturel et provoqué, l’hydratation, la douleur et la taille de la tumeur (déterminé 3 fois par semaine).
Choix des espèces
Le modèle souris est adapté pour les études concernant le développement de traitements en cancérologie. De plus, les souris immunodéficientes porteuses de greffe de lignée tumorale humaine (xénogreffe) sont adaptées pour les études fondamentales et appliquées de développement de traitements des cancers humains. Les animaux utilisés seront des adultes femelles de 6-8 semaines pesant environ 20 grammes. L'inoculation des cellules tumorales doit être réalisée chez des souris pour lesquelles les organes génitaux sont arrivés à maturité, ce qui justifie l'utilisation d'animaux plus âgés (6 à 8 semaines). Les animaux seront réceptionnés à 6 semaines à l'animalerie, et auront 1 semaine d'acclimatation, pour avoir un âge d’environ 7-9 semaines au début des expérimentations. L’âge de 7-9 semaines est communément choisi pour ce type de projet.
Etude de l’inflammation et de la douleur intestinale
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
3 980 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement de tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une colite leur est induite, des électrodes sont implantées par une chirurgie de vingt minutes pour mesurer leur sensibilité viscérale, et elles sont tuées trois jours plus tard, après des injections intraveineuses et des prélèvements de sang à la veine caudale ou jugulaire. Le porteur écrit que chaque procédure induit de la douleur et qu'aucun antidouleur ne peut être administré, la médication risquant d'interférer avec l'inflammation recherchée et avec la molécule testée. Il conclut que ces limites rendent l'expérimentation animale "incontournable" et le recours à l'"organisme entier" "indispensable", pour évaluer des molécules dont l'apport annoncé reste de préparer un passage en clinique.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, touchent chaque année des milliers de personnes en France, avec des phases inflammatoires suivies de rémissions. Les symptômes incluent diarrhée, fièvre, douleurs abdominales, fatigue et perte d’appétit, rendant leur traitement complexe. L'objectif thérapeutique évolue vers la recherche d'une "rémission physiologique". Malgré les avancées des thérapies biologiques, leur coût élevé et leur efficacité parfois limitée nécessitent le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Les effets polyvalents des molécules et les enjeux thérapeutiques sous-jaccents rendent indispensable l’utilisation de modèles in vivo. Nos modèles d’inflammation et de douleur intestinale sont indispensables pour étudier les effets d’une molécule sur un organisme entier et pour accélérer le passage en clinique chez l’homme. L’objectif de cette étude est d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques pour les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin chez la souris via 3 modèles inflammatoires. En ce qui concerne le choix d’un modèle aigu ou chronique, il dépendra d’une part du mécanisme d’action de la molécule à tester et d’autre part de la cible thérapeutique. De la même façon, la fréquence, la voie et le volume des administrations seront variables puisque dépendants des molécules.
Bénéfices attendus
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, touchent chaque année des milliers de personnes en France, avec des phases inflammatoires suivies de rémissions. Les symptômes incluent diarrhée, fièvre, douleurs abdominales, fatigue et perte d’appétit, rendant leur traitement complexe. L'objectif thérapeutique évolue vers la recherche d'une "rémission physiologique". Malgré les avancées des thérapies biologiques, leur coût élevé et leur efficacité parfois limitée nécessitent le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. L’objectif de cette étude est d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques pour les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin chez la souris. La validation de molécule(s) analgésique(s) et/ou anti-inflammatoire(s) dans des modèles de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin murins serait un premier pas vers des tests chez l'humain et la possible commercialisation de molécules pouvant soulager ces millers de personnes en France attends de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin
Procédures
Lors des différentes procédures les animaux seront soumis à une chirurgie (sous anesthésie et analgésie) afin d'implanter les électrodes nécessaires pour mesurer la sensibilité viscérale des animaux. La chirurgie dure environ 20 minutes par animal et ces derniers sont observés quotidiennement puis sacrifiés après 3 jours. Les animaux seront également soumis à des injections en intra-veineuse d'une durée de 30 secondes des différentes molécules analgésiques à tester. Selon la molécule à tester, un prélèvement sanguin pourra être réalisé au cours ou à la fin de la procédure expérimentale. La fréquence et le volume dépendront de l'étude. Cependant, les prélèvements seront effectués en total respect de la réglementation internationale et européenne. Les volumes et fréquences des prélèvements seront déterminées selon la publication internationale. Le site de prélèvement sera soit la veine caudale soit la veine jugulaire (sous anesthésie et pour une durée de 5 minutes d'induction de l'anesthésie et 30 secondes de prélèvements). Un prélèvement tissulaire post-mortem, à la fin de l’expérience, sera réalisé. Pour l'une des inductions de la pathologie, les animaux auront une injection de cellules en intra-veineuse.
Impact sur les animaux
Les différentes procédures induisent chacune de la douleur chez l'animal de façon transitoire. Cependant, nous ne pouvons utiliser de médication puisque la pathologie que nous souhaitons mimer est une pathologie inflammatoire. De plus, l’utilisation de médication pourrait interférer avec l’effet de la molécule testée. Durant toute la période d’expérimentation l’état général des animaux sera observé quotidiennement (évaluation du poids, présence de sang dans les fèces, déshydratation…). Des effets secondaires liés à la colite pourront être observés comme de la perte de poids, de la diarrhée ou de la douleur. D'autres effets secondaires pourraient apparaitre suite à la chirurgie tels que l'infection, la douleur et la perte d'appétit/déshydratation. Lors du test de la sensibilité viscérale de l'animal, de la douleur pourra être ressentie ainsi que du stress du à la contention de l'animal.
Devenir
L'ensemble des animaux seront sacrifiés à la fin de chaque procédure afin de réaliser des prélèvements tissulaires post-mortem.
Remplacement
Les méthodes alternatives, permettant une évaluation du statut douloureux de l'animal sont peu représentatives de la pathologie humaine. Ainsi, ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques pour les douleurs viscérales. De plus, la douleur et l'inflammation sont des réactions intégrées de l'organisme entier impossible à reproduire in vitro dans leur intégralité.
Réduction
Une veille bibliographique est/sera effectuée pour éviter de refaire des expérimentations déjà réalisées par d'autres équipes. De plus, le nombre d'animaux (12 souris par groupe) a été consciencieusement établit avec le minimum nécessaire pour l'obtention de résultats statistiquement significatifs (en prenant en compte la variabilité interindividuelle). Tout au long des différentes procédures les animaux seront observés et pesés. La présence de sang dans les selles et le comportement/aspect général de l'animal seront également analysés. Cette méthode non-invasive permettra donc de suivre au cours du temps, sur un même animal, évolution de la pathologie. Nous avons déterminé le nombre d'animaux par lot grâce à l'utilisation d'un test statistique. Cela nous a permis de déterminer qu'un minimum de 12 animaux par lot est nécessaire pour détecter des différences significatives entre les groupes expérimentaux.
Raffinement
Afin de suivre la directive européenne 2010/63/UE, un enrichissement sera rajouté aux animaux. A savoir, des igloos et des carrés de coton pur ou du papier absorbant permettant aux animaux de faire une nidation. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Durant toute la période d’expérimentation, l’état général des animaux sera observé au minimum une fois par jour. Pour chaque procédure des points limites ont été défini pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera euthanasié s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure. Les points limites seront : altérations des fonctions normales (impossibilité d'uriner, de s'alimenter, ...), vocalisation, tremblements, une perte de pôids élévée (mais
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris âgées d’au moins 8 semaines car nous souhaitons utiliser des animaux adultes et matures. De plus, c'est l'âge utilisé classiquement dans la littérature pour ces modèles. Nous avons opté pour le modèle murin car les modèles de colite induite ont été largement décrits et validés dans cette espèce, offrant ainsi une base solide et bien documentée pour l'étude des mécanismes inflammatoires et des réponses immunitaires associés à la pathologie.
Mise en place d’un modèle primate non humain de peste pulmonaire et étude d’un vaccin anti-peste.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Exposés au bacille de la peste par aérosol ou par sonde endotrachéale, 104 macaques à longue queue subissent des procédures dont 82 classées au niveau de souffrance le plus élevé. Ils reçoivent jusqu'à quatorze prélèvements sanguins, autant de prélèvements nasopharyngés, rectaux et de fèces, jusqu'à trois scanners du thorax, un ou deux lavages broncho-alvéolaires, et entre dix et trente anesthésies chacun. Le porteur attend une fièvre dès le deuxième jour, des signes de pneumonie dès le troisième, une anorexie et un état léthargique, et prévoit un hébergement individuel après l'exposition au bacille. Cent d'entre eux sont tués parce que la bactérie représente un risque pour la santé humaine, les quatre restants, qui n'auront reçu que le vaccin ou une bactérie non pathogène, pouvant être réutilisés dans d'autres protocoles après avis vétérinaire.
Objectifs
Au cours de l’histoire, les trois grandes épidémies de peste ont fait jusqu’à 100 millions de morts. Le bacille à l’origine de la peste, Yersinia pestis, est responsable des différentes formes de peste (bubonique, pulmonaire, septicémique, méningée et digestive), selon la voie d’entrée du bacille (bactérie de forme allongée)) dans l’organisme du patient. La peste reste mortelle de nos jours dans le monde, les derniers décès reportés datant de moins d’un an. Bien qu’il existe des traitements antibiotiques relativement efficaces contre la plupart des formes de la peste, le risque d’émergence de bacilles multirésistants aux antibiotiques posent des problèmes de santé publique. Il existe un vaccin commercial, mais celui-ci n’est pas homologué en France du fait de ses nombreux effets secondaires. À ce titre, le développement d’un nouveau vaccin oral contre Y.pestis est primordial. Les objectifs du projet sont donc de : *mettre en place un modèle de peste pulmonaire avec Y. pestis chez le primate non humain *déterminer la dose optimale de vaccin requise pour induire une réponse immunitaire maximale pour un bon niveau de sécurité, *Démontrer l’innocuité et l’efficacité du vaccin contre la peste pulmonaire
Bénéfices attendus
La recherche d’un vaccin efficace et sûr contre la peste est un enjeu de sécurité et de santé majeur. A court terme, ce projet permettra de disposer d’un modèle pertinent pour évaluer l’efficacité d’un vaccin contre la peste. A plus long terme, le vaccin développé dans ce projet sera utile non seulement pour lutter contre les épidémies récurrentes et peut s’avérer être la seule alternative possible face à l’émergence de bactéries multirésistantes.
Procédures
*Prélèvement de sang, jusqu’à 1 fois par jour pendant la première semaine puis une fois par semaine pendant 7 semaines (max : 14). Un prélèvement de sang prend environ 2 minutes par animal. *Prélèvement de fluides nasopharyngés et rectaux et prélèvement de fèces, jusqu’à 1 fois par jour pendant la première semaine puis une fois par semaine pendant 7 semaines (max 14). Ces prélèvements prennent environ 5 minutes en tout. *Imagerie de type scanner du thorax seront réalisées (maximum 3/animal). Ceci prend environ 20 minutes. *Suivi quotidien des animaux (incluant un suivi vigile, un suivi anesthesié, une pesée, les contrôles des paramètres de santé de l’animal (respiration, fréquence cardiaque, oxymétrie etc…). Jusqu’à 5 fois par semaine. Ce nombre pourra être adapté si l’animal montre des signes de mauvaise santé. Ceci est réalisé sur animal anesthésié et prend environ 5 minutes. *Exposition des animaux par voie aérosol : une fois par animal. Ceci est réalisé sur un animal anesthsié à l’aide soit d’un masque positionné sur la bouche et le nez de l’animal ou soit à l’aide d’une boite d’aérosolisation dans laquelle est positionnée la tête de l’animal. Ceci prend environ 20 minutes. *Exposition par voie endotrachéale : une fois par animal. Ceci est réalisé sur animal anesthésié à l’aide d’une sonde à ballonnet. Ceci prend environ 15 minutes par animal. *Vaccination orale : une fois par animal. Ceci est réalisé sur animal anesthésié à l’aide d’une sonde gastrique utilisable en clinique humaine. Ceci prend environ 10 minutes par animal. Toutes ces manipulations seront effectués sur des animaux anesthésiés. Le nombre d’anesthésie est variable car les animaux ne seront pas observés pendant le même temps à différentes étapes du projet. Cela peut varier entre environ 10 et 30 fois par animal répartis sur des temps allant de quelques jours à plusieurs mois. Le temps que dure l’anesthésie est également variable et ira de 10 minutes (prélèvements habituels + contrôles de l’état de santé) à 30 minutes environ (imagerie).
Impact sur les animaux
La peste pulmonaire chez le modèle primate non humain est proche de ce qui a été documenté chez l’homme et est donc potentiellement mortelle si elle évolue sans traitement. Dans les deux jours post infection, il est attendu que les animaux développent une fièvre. Dès le troisième jour, des symptômes semblables à une pneumonie (sans toux) seront détectables. Une anorexie et un état léthargique pourront accompagner ce stade. Des atteintes du foie et de la rate sont possibles et seront surveillées. Les animaux vont également subir des anesthésies répétées qui pourront se traduire par une légère déshydratation qui sera surveillée et compensée au besoin. Enfin, un ou deux lavages broncho-alvéolaire pourront être réalisés chez les animaux anesthésiés afin de suivre la présence de la bactérie directement dans le poumon. Afin de limiter l’inconfort lié à cette procédure le nombre de ces procédure a été limité au minimum et un traitement symptomatique pourra être utilisé le cas écéhant. Par ailleurs, l’hébergement individuel des animaux, qui aura lieu uniquement après exposition au bacille pourrait entrainer un stress qui sera compensé par un programme défini par la cellule « bien-être animal » de l’établissement par l’enrichissement de leur milieu de vie. D’après les résultats obtenus chez la souris, il n’est pas attendu que le vaccin provoque de nuisance.
Devenir
Du fait que la pathologie a des conséquences importantes pour les animaux et que le bacille représente un risque pour la santé humaine, tous les animaux qui recevront la bactérie seront euthanasiés. Les animaux ayant reçu soit une bactérie non pathogène, soit le vaccin mais n’ayant pas reçu la bactérie pourront être réutilisés dans d’autres protocoles après un avis vétérinaire favorable.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative non animale pour réaliser ce projet. L’objectif est de mettre en place un modèle cliniquement cohérent d’infection par Y. pestis pour évaluer la protection induite par un vaccin. Ce type d’évaluation nécessite un organisme entier car les atteintes sont multiples et réparties sur plusieurs organes. Le modèle choisi doit permettre d’étudier les différentes composantes des réponses immunitaires (humorale et cellulaire). Enfin, la recherche d’effets secondaires indésirables consécutifs à la vaccination demande un modèle suffisamment proche de l’homme pour espérer une bonne représentation de ce qui sera observé. A ce titre, et en l’état actuel des connaissances, ces différents éléments ne peuvent pas encore être étudiés in vitro, in silico (à l’aide d’une modélisation mathématique) ou ex vivo (en dehors de l’organisme). Toutefois, cette phase préclinique de test du vaccin ainsi que l’établissement du modèle reposent sur l’analyse d’un ensemble de publications scientifiques reconnues et dont une bonne partie repose sur des résultats obtenus chez la souris.
Réduction
L’établissement de la dose vaccinale suit une méthode éprouvée dans la littérature scientifique ce qui permettra une approche statistique robuste en utilisant le moins d’animaux possible. La mise en place du modèle d’infection par Y. pestis repose sur une méthode déjà publiée. Cette méthode permettra de ne pas utiliser plus d’animaux que nécessaire car nous attendrons d’avoir les résultats d’une étape avant de passer à la suivante. De ce fait, le nombre d’animaux inclus pourra être revu à la baisse. Cette méthode a été démontrée comme statistiquement robuste en utilisant le minimum d’animaux. Enfin, lors de la vérification de la réponse vaccinale, le nombre d’animaux retenu par groupe a été limité au minimum permettant une comparaison des résultats obtenus par l’utilisation de tests statistiques bien établis et démontrant ainsi l’efficacité du candidat vaccin testé.
Raffinement
L’ensemble des procédures seront effectuées sur des animaux anesthésiés. Les animaux seront suivis quotidiennement par du personnel formé et des mesures seront réalisées à chaque anesthésie en plus des mesures de température toute les deux heures grâce à la puce implantée à l’animal avant le début de l’expérimentation. Des points limites basé sur la bibliographie ont été établis par les vétérinaires de l’installation et le responsable de la cellule locale du bien-être animal avant le début des expérimentations animales. Ceux-ci seront adaptés au fur et à mesure de l’établissement du modèle afin de suivre de près l’évolution clinique des animaux et de proposer une approche prédictive qui servira d’aide à la décision de mise en place de mesure limitant la souffrance et à la décision d’euthanasie.
Choix des espèces
Considérant toutes les contraintes énumérées ci-dessus, le primate non humain a été choisi comme modèle d’étude pour ce projet. Les macaques cynomolgus ont été sélectionnés pour plusieurs raisons : • Leur sensibilité à l’infection par Y.pestis. • Ils réunissent les éléments nécessaires à l’évaluation de vaccins : leurs réponses immunitaires et vaccinales sont similaires à celles de l’homme, et les techniques et outils d’exploration de la réponse immunitaire et de la réponse vaccinale sont disponibles et maitrisés chez ces espèces, contrairement à d’autres modèles d’infections respiratoires régulièrement utilisées comme le rat ou la souris. • Ils ont déjà fait l’objet de quelques publications scientifiques qui détaillent des symptômes et des atteintes semblables à ce qui est observé chez l’homme. Les animaux devront être adultes: les objectifs du projet sont de mettre en place un modèle de peste pulmonaire et d’étudier la protection par un candidat vaccin contre Y. pestis. De ce point de vue, il est donc primordial que les animaux disposent d’un système immunitaire et d’un système respiratoire pleinement mature. Le système immunitaire et le volume des poumons évoluent en fonction du stade de développement et de l’âge des animaux. Nous utiliserons donc des animaux adultes d’âge et de poids semblables.
Evaluation de nouveaux traitements dans le cancer du foie chez l’enfant
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
La souche retenue est fortement immunodéprimée, ce qui lui permet de développer les tumeurs implantées, et les animaux greffés sont des souriceaux très jeunes, choisis pour approcher l'âge des enfants atteints d'hépatoblastome. 1 100 souris vont être utilisées, 1 000 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 100 un niveau léger. Des cellules tumorales leur sont implantées dans le foie après incision de la paroi ventrale, puis elles reçoivent un traitement deux fois par semaine et passent trois fois par semaine en imagerie de bioluminescence. Le porteur écrit que la majorité des nuisances n'aura pas d'effet puisque les souris sont manipulées sous anesthésie, et l'effectif de 1 100 comprend les mères, tuées elles aussi pour le prélèvement des tumeurs.
Objectifs
L’hépatoblastome est le cancer primaire du foie le plus fréquent chez l’enfant de moins de 5 ans. Le traitement de référence utilise une chimiothérapie à l’aide d’un agent anticancéreux utilisé à l’hôpital mais qui est très toxique et ne permet pas de guérir tous les enfants. L’hépatoblastome est un cancer caractérisé par des mutations bien connues mais les mécanismes biologiques responsables de son émergence après la naissance chez l’Homme restent très mal comprises. La disponibilité d’un modèle de cancer du foie chez la souris très jeune permet de mimer la maladie observée chez les enfants et d’étudier les mécanismes moléculaires à l’origine de son apparition. Il permet également de tester l’efficacité de candidats médicaments dans un contexte physiopathologique plus en adéquation avec le très jeune âge des patients atteints de ce cancer.
Bénéfices attendus
Montrer que ces cellules d’hépatoblastomes répondent à une chimiothérapie et donc que ce modèle animal est utile pour tester de futurs médicaments. Disposer d’un modèle chez la souris très jeune qui permette d’étudier avec plus d’exactitude les mécanismes à l’origine de ce cancer pédiatrique.
Procédures
Implantation de cellules tumorales dans le foie après une incision de la peau au niveau ventral (1 seule incision et implantation, 10 minutes). Points de sutures au niveau ventral (3 points de sutures, 10 minutes). Administration de médicaments 2 fois par semaine (20 secondes par injection). Mesure de la tumeur par imagerie à bioluminescence 3 fois par semaine (10 minutes par analyse). Pesée des souris deux fois par semaine (20 secondes par pesée).
Impact sur les animaux
Les nuisances sont la manipulation des cages et des souris, l’injection de cellules et de solutions chimiques avec une aiguille, un stress lors de manipulations répétées, une légère douleur au point de piqure, une légère douleur liée au medicament injecté, une légère sensation de froid lors du nettoyage de la peau à l’alcool. Certains animaux seront traités par une solution de médicament déjà administré à des enfants hospitalisés et dont les effets sont bien connus. Cependant, comme les souris sont manipulées sous anesthésie, la majorité de ces nuisances n’aura pas d’effet sur les animaux.
Devenir
Les 1100 animaux (souris greffées et leurs mères) seront euthanasiées afin de procéder au prélèvement des tumeurs et leur analyse par des approches cellulaires, moléculaires et histologiques.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative à la réalisation de ce projet, c’est-à-dire un système biologique qui reproduit partiellement ou entièrement les conditions cliniques, analytique et moléculaire de notre objet d'étude. II est impossible d'obtenir les informations fournies dans cette étude sans l'utilisation de cette souche de souris. Les conclusions recherchées ne peuvent être obtenues par des modèles alternatifs d'étude en boite de culture, car ces derniers ne reconstituent pas de manière optimale la complexité, la communication et la diversité d’interactions entre les cellules normales et les cellules tumorales dans un animal entier.
Réduction
Nos effectifs sont déterminés et nos résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Pour des raisons de réduction, nous utiliserons à la fois des mâles et des femelles.
Raffinement
Concernant l’objectif de réduction de la souffrance, la douleur et l’angoisse infligées aux animaux, les souris seront hébergées en animalerie, suivies quotidiennement pour détecter d’éventuels signes cliniques par du personnel qualifié. Les procédures expérimentales seront réalisées sous anesthésie pour empêcher la douleur et le stress. Un analgésique sera utilisé 30 min avant toute opération. Les animaux sont hébergés en cages à raison de 3 mères et de 12 souriceaux par cage. Les conditions d’hébergements sont adaptées à la forte immunodépression de ces animaux : cages, nourritures et litières sont stérilisées. En cas de besoin et pour le bien-être des animaux, nous ajouterons de la nourriture humidifiée/ou du gel nutritif dans les cages ou feront des injections intrapéritonéales de sérum physiologique. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu en l’occurrence des nids de Woodwoll. En ce qui concerne les données de comportement et de physiologie, l’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Si pour une raison quelconque, un animal est considéré comme en souffrance, il sera traité par des analgésiques. S’il n’y a pas d’amélioration, il sera euthanasié sans attendre. Enfin, nous appliquerons les points limites stricts et spécifiques du projet.
Choix des espèces
1. La souche de souris choisie est largement utilisée dans la recherche sur le cancer en raison de sa capacité à développer le processus étudié du fait de sa forte immunodépression. 2. L’expérience d’utilisation des chercheurs demandeurs. 3. Nous utiliserons des souris très jeunes pour mimer le plus justement possible le contexte de la maladie chez les enfants très jeunes.
Utilisation de nouveaux outils moléculaires visant à retarder le déclin cognitif dans un modèle de souris Alzheimer 2/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour tester si trois molécules candidates retardent le déclin cognitif de souris modifiées pour modéliser la maladie d'Alzheimer, 555 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacune subit une chirurgie stéréotaxique d'environ quarante-cinq minutes pour l'injection d'un virus dans le cerveau, puis des tests comportementaux quotidiens de un à huit jours, dont un conditionnement à la peur par chocs électriques d'une seconde à 0,4 mA. Le porteur qualifie cette douleur de "fugace" et affirme qu'elle n'induit "aucune douleur ni mal-être durables", alors que l'ensemble du projet est déclaré en gravité sévère. Les souris modélisant la maladie sont testées entre quatre et six mois puis entre huit et onze mois, et leur cerveau est prélevé pour vérifier la localisation de l'injection.
Objectifs
La maladie d’Alzheimer est une pathologie neurodégénérative, touchant environ un million de personnes en France. On estime environ 225 500 nouveaux cas diagnostiqués chaque année. A l’heure actuelle, il existe quatre traitements disponibles dont la Rivastigmine et la Mémantine. Néanmoins, ces molécules ne traitent que les symptômes de la maladie d’Alzheimer et ne permettent pas de guérir ou de stopper la progression de la maladie. Au bout de quelque années ces traitements deviennent donc inefficaces et la balance bénéfices/risques n’est plus positive dû aux effets secondaires de ces molécules (troubles digestifs, cardiovasculaire, insomnie etc.). Comprendre et traiter les mécanismes sous-jacents à la maladie d’Alzheimer est donc d’intérêt public. La maladie d’Alzheimer se caractérise par un déficit précoce de la mémoire épisodique, qui permet la mémorisation de nos expériences passées. Ce type de mémoire repose en partie sur le processus de pattern separation, qui permet la discrimination de souvenirs plus ou moins similaires. Des défauts en pattern separation ont été observés chez des patients atteints de la maladie d’Alzheimer ainsi que chez les modèles animaux de cette pathologie. De plus, la mémoire de travail (court terme ; ex : retenir un numéro de téléphone) est une des premières atteintes dans la maladie d’Alzheimer. Ces troubles cognitifs sont associés à une dysfonction précoce du cortex et de l’hippocampe, impliqués respectivement dans la modulation de la mémoire de travail et du pattern separation. Notre équipe a récemment découvert des molécules qui améliorent le pattern separation chez la souris adulte saine, sans aucun effet délétère. Nous souhaitons maintenant tester l’effet de ces molécules dans des tests comportementaux permettant d’évaluer le pattern separation et la mémoire de travail, chez des souris transgéniques modèle pour la maladie d’Alzheimer. Les expériences seront réalisées dans 2 établissements utilisateurs différents. L’ensemble de ces analyses comportementales nous permettra de tester et valider l’effet nos molécules candidates sur l’amélioration de la mémoire dans des modèles murins sain et de vieillissement pathologique, afin de retarder le déclin cognitif des souris modélisant la maladie d’Alzheimer.
Bénéfices attendus
Nos résultats préliminaires montrent que les souris non-transgéniques injectées avec un virus exprimant une de nos molécules candidates, ont une amélioration du pattern separation par rapport aux souris contrôles. Ainsi, en injectant les souris modélisant la maladie d’Alzheimer avec ce même virus à 4-5 mois ou 8-9 mois, nous espérons retarder l’apparition du déclin cognitif précoce (6 mois) ou retarder son évolution (10 mois). En testant 3 molécules candidates, nous espérons identifier le meilleur candidat afin de restaurer à la fois le pattern separation et la mémoire de travail affectés chez les souris modélisant la maladie d’Alzheimer. Ce projet permettra donc la mise en évidence et la caractérisation de molécules pouvant retarder le déclin cognitif, nous offrant ainsi de nouvelles pistes thérapeutiques. Les résultats obtenus nous permettrons d’avoir une meilleure connaissance des mécanismes moléculaires et cellulaires engagés dans la maladie d’Alzheimer.
Procédures
Nous souhaitons tester des molécules candidates chez la souris adultes et les utiliser ensuite chez des souris modélisant la maladie d'Alzheimer, afin de retarder le déclin cognitif. Pour se faire, nous injecterons directement dans le cerveau des virus non-infectieux qui vont permettre l'expression de molécules candidates. Les animaux seront injectés sous anesthésie avec un volume très restreint de virus (maximum 1µl). La durée de la chirurgie est d'environ 45 minutes. Une fois injectés, les capacités cognitives des animaux seront testées quotidiennement avec des tests comportementaux évaluant la mémoire épisodique et la mémoire de travail. Le test de conditionnement à la peur peut générer de la douleur (faible et brève) et de la peur. Ces tests comportementaux sont d’une durée allant de 1 à 8 jours. Le cerveau des animaux sera finalement prélevé pour vérifier la localisation de l'injection et la présence de la molécule candidate injectée.
Impact sur les animaux
1) Nous devons pratiquer une chirurgie stéréotaxique pour injecter des virus dans une zone précise du cerveau, impliquée dans le pattern separation. Cette chirurgie, rapide et standardisée entraîne une douleur post-opératoire légère pendant environ 48h, qui sera suivie et contrôlée. Les virus injectés n’ont aucun effet dommageable connu ou prévisible sur l’animal. 2) L’évaluation des capacités cognitives de nos souris nécessite l’utilisation de tests comportementaux. Le test de conditionnement à la peur nécessite l’utilisation de charges électriques très brèves et de faible intensité, suffisants pour intaurer de la peur uniquement liée au contexte du test et de la douleur fugace chez l’animal, mais n’induisant aucune douleur ni mal-être durables.
Devenir
A l’issu de chaque procédure les animaux seront euthanasiés et seront utilisés pour des analyses biochimiques ou histologiques.
Remplacement
Ce projet s’intègre dans un projet plus global combinant différents travaux de recherche complémentaires allant de l’étude biochimique ou biomoléculaire au comportement. Beaucoup d’études « in-vitro » sont donc effectuées sur des cellules en culture en amont de l’utilisation de lignées d’animaux pour limiter au maximum leur utilisation. De plus, ce projet fait suite à un projet déjà réalisé dans le laboratoire pour lequel des données préliminaires sur animaux sains sont encourageantes. L'évaluation de la cognition et de la mémoire doit se faire via des études comportementales qui ne peuvent se faire que sur des animaux.
Réduction
Afin d’utiliser le nombre minimal d'animaux mais de garantir la validité scientifique et statistique des résultats, nous avons évalué via la bibliographie et une étude empirique qu’un nombre minimum de 15 animaux par groupe est nécessaire pour nos tests comportementaux. Par ailleurs, nous utiliserons les mêmes animaux pour tous les tests comportementaux avec une évaluation de l’état de l’animal avant le début de chaque test. Dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés lors des tests comportementaux, nous n’utiliserons qu’un groupe contrôle pour les tests concernant les souris modèle pour la maladie d’Alzheimer, ce qui nous permet de passer de 7 groupes de souris à 4 groupes.
Raffinement
Pour améliorer au maximum le bien-être des animaux, toutes les mesures sont mises en place tout au long du projet. Les animaux provenant de notre institut sont tous transportés entre les établissements, qui se trouvent dans le même bâtiment, sur des chariots en limitant au maximum bruits et secousses. Le transport est réalisé au moins une semaine avant le début des expérimentations pour permettre une acclimatation des animaux à leur nouvel environnement et réduire les biais expérimentaux liés au stress du transport. De plus, les animaux seront placés dans la salle de test 30 minutes avant le début des tests comportementaux pour les acclimater. Les animaux sont élevés en cage collective enrichie avec un nid végétal (carrés de cellulose + papier kraft), surveillés régulièrement et des points limites de l’établissement et du projet suffisamment précoces ont été mis en place. De plus concernant la chirurgie, un anti-inflammatoire et un anesthésique local sont administrés avant la chirurgie ainsi qu’un anesthésique gazeux pendant la chirurgie. Nous effectuons également un suivi post-opératoire biquotidien pendant 48h (weekend compris), pour lequel nous avons établi des points limites précoces et des mesures conservatoires adaptées à chaque point limite (e.g. administration d’un antalgique si l’animal est prostré, désinfection d’une plaie paraissant infectée, injection de glucose si l’animal perd trop de poids malgré la nourriture humide mise à disposition dans sa cage, chambre de réveil chauffée à 30°C, etc…). Nos animaux sont habitués à la manipulation 7 jours avant le début des tests comportementaux et ils sont pesés et observés tous les jours lorsqu’ils sont en test comportemental. Si une perte de poids et/ou l’animal paraît faible, froid, prostré etc., de la nourriture humidifiée est mise à disposition dans la cage. Si l’état de l’animal se dégrade, nous effectuons une injection de glucose 5% et nous demandons l’avis du vétérinaire référent. Pour réduire la peur et la douleur dans le test du conditionnement à la peur, le choc électrique est réduit à une durée (1 sec) et une intensité (0.4 mA) minimales.
Choix des espèces
Nous avons choisi d’utiliser la souris, animal pour lequel la manipulation génétique est possible, ce qui permet de produire des modèles mimant les pathologies humaines telles que la maladie d’Alzheimer. Les lignées sélectionnées pour notre projet sont déjà bien référencées et caractérisées. De plus, notre laboratoire possède une expertise et le matériel nécessaire pour étudier le pattern separation et la mémoire de travail chez la souris, ce qui facilitera la mise en place des tests comportementaux chez ces lignées murines. Nous avons choisi d'utiliser 3 stades de développement. Pour la mise en place du test comportemental permettant d’évaluer le pattern separation, nous utiliserons des souris saines âgées de 4 à 6 mois. Les souris modèles pour la maladie d’Alzheimer seront testées au même stade ainsi qu’à un stade subséquent (8 à 11 mois). Les souris saines dans lesquelles nous évaluerons l’effet des molécules candidates sur le pattern separation seront testées à 6-10 semaines.
Mise en place d’un modèle murin de xénogreffe orthotopique de glioblastome 3/3
- Recherche appliquée
- Cancers
Une tumeur cérébrale humaine implantée dans la boîte crânienne au cours d'une chirurgie de trente minutes, puis quatre semaines d'imagerie hebdomadaire sous anesthésie et des transports en voiture entre trois établissements : 307 souris subissent ce protocole, 60 tuées sans réveil, 188 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 59 un niveau sévère. Cent d'entre elles sont gardées vivantes pour la formation du personnel, les autres tuées aux points limites ou en fin de projet. L'objectif déclaré est de mettre au point un modèle pour tester la réoxygénation des tumeurs et leur sensibilisation à la radiothérapie, bénéfice que le porteur formule au conditionnel en deux lignes. Ce troisième volet reprend le même effectif de 307 souris que le volet précédent, publié le même jour, sans que la répartition entre les deux soit expliquée.
Objectifs
Le glioblastome multiforme est la tumeur cérébrale primitive la plus fréquente et la plus agressive chez l’adulte. La médiane de survie globale varie de 15 à 18 mois et le taux de survie à 5 ans n’excède pas 5%. Le traitement de référence consiste en la chirurgie la plus complète possible suivie de l’association d’une radiothérapie et d’une chimiothérapie par le témozolomide. Malgré ce protocole thérapeutique, la majorité des patients rechute dans un délai médian de 8-9 mois. Il est donc aujourd’hui indispensable d’améliorer ce protocole. Dans cette démarche, il est connu que les glioblastomes sont caractérisés comme des tumeurs résistantes à l’irradiation. Cette résistance repose en partie sur le manque d’oxygène (hypoxie) au cœur de la tumeur et il a été démontré dans de nombreuses études que l’oxygénation des tissus représente un facteur prédictif de réponse à l’irradiation. Dans ce contexte, ce projet aura comme objectif la mise au point d’un modèle orthotopique de glioblastome, c’est-à-dire l’induction d’une tumeur au sein même de la cavité crânienne chez la souris afin d’évaluer la réoxygénation cellulaire et la radiosensibilisation et ainsi d’améliorer la survie des patients atteints de glioblastome. Ce projet se déroulera dans 3 établissement utilisateurs.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait contribuer à optimiser le traitement actuel des patients atteints de glioblastome en sensibilisant les tumeurs aux effets de la radiothérapie pour améliorer la survie de ces patients.
Procédures
A) Dans l’Etablissement Utilisateur (EU) 1/3 nous ferons une Chirurgie 1 : une injection analgésique d’une minute sur animal vigile, puis une anesthésie générale gazeuse, suivie d’une chirurgie de 30 minutes avec une injection d’une minute et suture sous anesthésie générale et locale. B) Dans l’EU 2/3 nous ferons une Imagerie 1 : une injection d’une minute sur animal vigile, puis imagerie de 30 minutes sous anesthésie générale pour l’observation de la croissance tumorale. Puis, une injection sur animal sur animal vigile, suivi 24h après d'une imagerie de 15 minutes sous anesthésie générale. Cette procédure sera réalisée à raison d’une fois par semaine pendant 4 semaines. C) Dans l’EU 2/3 nous ferons une Imagerie 2 : Imagerie sous anesthésie générale de 2 heures pour l’observation de la croissance tumorale et de l’hypoxie à raison d’une fois par semaine pendant 4 semaines. D) Dans l’EU 2/3 nous ferons une Chirurgie 2 : une injection d’une minute d’un anesthésique général sur animal vigile, puis des injections d’une minute d’un anesthésique local et d'un analgésique, puis une chirurgie de 2 minutes, suivi d’une perfusion de 5 minutes. E) Dans l’EU 3/3 nous ferons une Imagerie 3 : Imagerie sous anesthésie générale de 90 minutes pour l’observation de l’hypoxie à raison d’une fois par semaine pendant 4 semaines. F) Dans l'EU 2/3 un groupe subira les procédures A et F. Un autre subira les procédures A, puis B, suivi D puis F. Un autre subira les procédures A, puis C, suivi D puis F. Un autre subira les procédures : A, puis C, D et E puis F. G) Dans l’EU 1/3 et 2/3 nous ferons injection d’une minute sur animal vigile à raison d’une fois par semaine pendant 4 semaines.
Impact sur les animaux
La mise en place des modèles pourra induire des douleurs/infections suite à la chirurgie associée à une potentielle perte de poids transitoire et une déshydratation. Le transport des animaux entre les trois EU pourra induire un stress. Les injections nécessaires à l’imagerie pourront entrainer un stress chez l’animal se traduisant par des problèmes respiratoires. Les suivis par imagerie pourront induire du stress suite aux anesthésies répétées. La croissance des tumeurs pourra entrainer une perte de poids excessive et des effets neurologiques.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort lorsque les points limites sont atteints ou à la fin du projet, sauf les animaux utilisés pour la formation ou le maintien des compétences du personnel.
Remplacement
Les études préliminaires réalisés sur cellules cancéreuses ont permis de valider 2 types de cellules pour notre modèle de glioblastome chez la souris. Ce modèle chez l’animal permet de mimer au plus proche la complexité d'un environnement tumoral chez l'individu (vascularisation, inflammation…).
Réduction
Les études préliminaires sur cellules ont également permis de réduire le nombre de lignées à 2 afin de réduire le nombre de groupe utilisant des animaux. La mise en place du modèle permettra également de réduire le nombre d’animaux utilisées dans de futurs projets étudiant l’amélioration de la radiothérapie sur un modèle de glioblastome. Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé avec suffisamment d’animaux pour pouvoir réaliser une analyse statistique pertinente par les 2 méthodes d’imagerie décrites. Ce projet utilise des méthodes d’imagerie non-invasives permettant de suivre un même animal au cours du temps réduisant le nombre d’animaux
Raffinement
Chaque protocole expérimental prend en compte un potentiel impact sur la souffrance animale et différents critères ont été établis pour justifier un arrêt de l'expérience en cours. Les animaux seront hébergés à 5-8 souris par cage (souris issues de différents groupes de traitement), dans des cages à couvercle filtrant avec de la litière, des frisures de papier kraft, des tubes de coton (nidification), des bâtons et des tunnels. Les procédures expérimentales seront réalisées par des manipulateurs expérimentés. Les animaux seront acclimatés à leur hébergement deux semaines avant de démarrer les procédures. Des anesthésies et des analgésies sont appliquées dès que possible pour éviter tout risque de stress et de souffrance. Des points limites ont été établis pour éviter toute souffrance animale et seront évalués 3 fois par semaine. Si une souris présentait des signes d’effet(s) secondaire(s) ou de symptômes révélant un inconfort ou l’apparition de douleur, le vétérinaire désigné sera contacté pour venir voir les animaux, poser un diagnostic et mettre en place les mesures correctives adaptées. Les méthodes d’imagerie utilisées sont reconnues non-invasives et non-irradiantes. Les animaux seront transportés en voiture entre les trois Etablissements Utilisateur (temps maximum de 10 minutes entre les EU1 et EU2 et de 30 minutes entre les EU2 et EU3). Pour cela, les animaux seront mis dans des boites de transport avec un filtre sanitaire, de la nourriture, de l’eau gélifiée, des frisures de papier et du matériel de nidification avec ajout de chaufferettes sous les boites.
Choix des espèces
La souris représente l’espèce la plus utilisée en expérimentation en oncologie. La raison la plus importante du choix de la souris pour notre étude est sa similitude avec les organismes humains en ce qui concerne l’anatomie, la physiologie et la génétique. Le modèle de souris choisi permettra l’implantation de lignées cancéreuses humaines et le développement des tumeurs orthotopiques. Les animaux utilisés seront adultes c’est-à-dire à partir de 6/8 semaines car ils possèdent un poids et un développement optimales pour les actes subit (chirurgie, injections…).
Mise en place d’un modèle murin de xénogreffe orthotopique de glioblastome 2/3
- Recherche appliquée
- Cancers
La souche de souris retenue est choisie pour accepter l'implantation de lignées de glioblastome humain à l'intérieur de la boîte crânienne. 307 souris y sont utilisées, 60 opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil, 188 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 59 un niveau sévère. Après une chirurgie crânienne de trente minutes, chacune passe par des séances hebdomadaires d'imagerie sous anesthésie générale pendant quatre semaines, jusqu'à deux heures par séance, la croissance de la tumeur pouvant entraîner une perte de poids marquée et des effets neurologiques. Cent souris sont gardées vivantes au terme du projet, pour la formation et le maintien des compétences du personnel.
Objectifs
Le glioblastome multiforme est la tumeur cérébrale primitive la plus fréquente et la plus agressive chez l’adulte. La médiane de survie globale varie de 15 à 18 mois et le taux de survie à 5 ans n’excède pas 5%. Le traitement de référence consiste en la chirurgie la plus complète possible suivie de l’association d’une radiothérapie et d’une chimiothérapie par le témozolomide. Malgré ce protocole thérapeutique, la majorité des patients rechute dans un délai médian de 8-9 mois. Il est donc aujourd’hui indispensable d’améliorer ce protocole. Dans cette démarche, il est connu que les glioblastomes sont caractérisés comme des tumeurs résistantes à l’irradiation. Cette résistance repose en partie sur le manque d’oxygène (hypoxie) au cœur de la tumeur et il a été démontré dans de nombreuses études que l’oxygénation des tissus représente un facteur prédictif de réponse à l’irradiation. Dans ce contexte, ce projet aura comme objectif la mise au point d’un modèle orthotopique de glioblastome, c’est-à-dire l’induction d’une tumeur au sein même de la cavité crânienne chez la souris afin d’évaluer la réoxygénation cellulaire et la radiosensibilisation et ainsi d’améliorer la survie des patients atteints de glioblastome. Ce projet se déroulera dans 3 établissement utilisateurs.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait contribuer à optimiser le traitement actuel des patients atteints de glioblastome en sensibilisant les tumeurs aux effets de la radiothérapie pour améliorer la survie de ces patients.
Procédures
A) Dans l’Etablissement Utilisateur (EU) 1/3 nous ferons une Chirurgie 1 : une injection analgésique d’une minute sur animal vigile, puis une anesthésie générale gazeuse, suivie d’une chirurgie de 30 minutes avec une injection d’une minute et suture sous anesthésie générale et locale. B) Dans l’EU 2/3 nous ferons une Imagerie 1 : une injection d’une minute sur animal vigile, puis imagerie de 30 minutes sous anesthésie générale pour l’observation de la croissance tumorale. Puis, une injection sur animal sur animal vigile, suivi 24h après d'une imagerie de 15 minutes sous anesthésie générale. Cette procédure sera réalisée à raison d’une fois par semaine pendant 4 semaines. C) Dans l’EU 2/3 nous ferons une Imagerie 2 : Imagerie sous anesthésie générale de 2 heures pour l’observation de la croissance tumorale et de l’hypoxie à raison d’une fois par semaine pendant 4 semaines. D) Dans l’EU 2/3 nous ferons une Chirurgie 2 : une injection d’une minute d’un anesthésique général sur animal vigile, puis des injections d’une minute d’un anesthésique local et d'un analgésique, puis une chirurgie de 2 minutes, suivi d’une perfusion de 5 minutes. E) Dans l’EU 3/3 nous ferons une Imagerie 3 : Imagerie sous anesthésie générale de 90 minutes pour l’observation de l’hypoxie à raison d’une fois par semaine pendant 4 semaines. F) Dans l'EU 2/3 un groupe subira les procédures A et F. Un autre subira les procédures A, puis B, suivi D puis F. Un autre subira les procédures A, puis C, suivi D puis F. Un autre subira les procédures : A, puis C, D et E puis F. G) ) Dans l’EU 1/3 et 2/3 nous ferons injection d’une minute sur animal vigile à raison d’une fois par semaine pendant 4 semaines.
Impact sur les animaux
La mise en place des modèles pourra induire des douleurs/infections suite à la chirurgie associée à une potentielle perte de poids transitoire et une déshydratation. Le transport des animaux entre les trois EU pourra induire un stress. Les injections nécessaires à l’imagerie pourront entrainer un stress chez l’animal se traduisant par des problèmes respiratoires. Les suivis par imagerie pourront induire du stress suite aux anesthésies répétées. La croissance des tumeurs pourra entrainer une perte de poids excessive et des effets neurologiques.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort lorsque les points limites sont atteints ou à la fin du projet, sauf les animaux utilisés pour la formation ou le maintien des compétences du personnel.
Remplacement
Les études préliminaires réalisés sur cellules cancéreuses ont permis de valider 2 types de cellules pour notre modèle de glioblastome chez la souris. Ce modèle chez l’animal permet de mimer au plus proche la complexité d'un environnement tumoral chez l'individu (vascularisation, inflammation…).
Réduction
Les études préliminaires sur cellules ont également permis de réduire le nombre de lignées à 2 afin de réduire le nombre de groupe utilisant des animaux. La mise en place du modèle permettra également de réduire le nombre d’animaux utilisées dans de futurs projets étudiant l’amélioration de la radiothérapie sur un modèle de glioblastome. Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé avec suffisamment d’animaux pour pouvoir réaliser une analyse statistique pertinente par les 2 méthodes d’imagerie décrites. Ce projet utilise des méthodes d’imagerie non-invasives permettant de suivre un même animal au cours du temps réduisant le nombre d’animaux.
Raffinement
Chaque protocole expérimental prend en compte un potentiel impact sur la souffrance animale et différents critères ont été établis pour justifier un arrêt de l'expérience en cours. Les animaux seront hébergés à 5-8 souris par cage (souris issues de différents groupes de traitement), dans des cages à couvercle filtrant avec de la litière, des frisures de papier kraft, des tubes de coton (nidification), des bâtons et des tunnels. Les procédures expérimentales seront réalisées par des manipulateurs expérimentés. Les animaux seront acclimatés à leur hébergement deux semaines avant de démarrer les procédures. Des anesthésies et des analgésies sont appliquées dès que possible pour éviter tout risque de stress et de souffrance. Des points limites ont été établis pour éviter toute souffrance animale et seront évalués 3 fois par semaine. Si une souris présentait des signes d’effet(s) secondaire(s) ou de symptômes révélant un inconfort ou l’apparition de douleur, le vétérinaire désigné sera contacté pour venir voir les animaux, poser un diagnostic et mettre en place les mesures correctives adaptées. Les méthodes d’imagerie utilisées sont reconnues non-invasives et non-irradiantes. Les animaux seront transportés en voiture entre les trois Etablissements Utilisateur (temps maximum de 10 minutes entre les EU1 et EU2 et de 30 minutes entre les EU2 et EU3). Pour cela, les animaux seront mis dans des boites de transport avec un filtre sanitaire, de la nourriture, de l’eau gélifiée, des frisures de papier et du matériel de nidification avec ajout de chaufferettes sous les boites.
Choix des espèces
La souris représente l’espèce la plus utilisée en expérimentation en oncologie. La raison la plus importante du choix de la souris pour notre étude est sa similitude avec les organismes humains en ce qui concerne l’anatomie, la physiologie et la génétique. Le modèle de souris choisi permettra l’implantation de lignées cancéreuses humaines et le développement des tumeurs orthotopiques. Les animaux utilisés seront adultes c’est-à-dire à partir de 6/8 semaines car ils possèdent un poids et un développement optimales pour les actes subit (chirurgie, injections…).
Cathétérisme Vasculaire chez les rongeurs et administration par voie parentérale. Application à des études d’évaluation d’efficacité de composés innovants dans des modèles d’inflammation aigue, ou de défaillance hépatique aigue ou chroniques (ALF et ACLF)
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Rats : 4140
Le choc, la détresse cardio-respiratoire et les troubles de la thermorégulation servent ici de critères de point limite, et une partie des animaux les atteindra assez tôt pour être tuée avant terme. 4 440 souris et 4 140 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, 2 360 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 6 220 un niveau sévère. Un cathéter veineux leur est posé sous anesthésie, puis vient un gavage d'un agent toxique pour le foie deux à trois fois par semaine pendant dix semaines pour installer une cirrhose, avant une injection qui déclenche la défaillance hépatique aiguë. Le porteur écrit vouloir "reproduire une gravité qui sera jugée sévère" tout en maintenant les animaux dans un état qu'il estime acceptable, et renvoie au conditionnel les solutions thérapeutiques qu'il espère proposer aux patients.
Objectifs
La défaillance hépatique aigue ou acute-on-chronic liver failure (ACLF) est un syndrome fulminant qui survient de manière aiguë, chez des patients qui souffrent d'une maladie hépatique chronique qui peut avoir différentes origines (virales,métabolique, ou médicamenteuse). La défaillance aigue généralement en raison d'un événement précipitant, et qui évolue rapidement vers une défaillance de multiples organes Elle survient chez environ 30% des patients hospitalisés atteints de cirrhose et est associée à un taux de mortalité à 28 jours qui varie entre 20% et 70% selon le grade de l’ACLF. L'objectif de ce projet est d'instrumentaliser des voies veineuses chez le rongeur et de les utiliser dans nos modèles pré établis pour évaluer l'efficacité de produits nouveaux. Nous sommes effectivement contraints à effctuer des administrations soit en bolus unique, en admnistration répétées ou perfusions lentes, des composés que nous étudions. Les modèles intrumentés par un cathéter posé en voie veineuse ( dits cathétérisés) seront employés dans des modèles que nous avons déjà développés (modèles d'infammation aigue au LPS, de stress oxydatif à l'acétaminophène ou au pyrazole, ou d'alcoolisation massive produisant une translocation bactérienne ) sur des animaux sains,ou dejà atteints d'une maladie hépatique. dans le traitement des patients qui subissent cet évènement aigu.
Bénéfices attendus
Lors d’épisodes ACLF, il est nécessaire de prendre en charge les patients pour les défaillances multiples le plus précocement possible pour préserver le capital hépatocytaire qui subsiste, et qui peut se révéler être vital lors de la survenue d’un second épisode d’ACLF Aujourd’hui les traitements employés agissent sur les symptômes tels que la pression portale, l’infection, l’hémorragie digestive ou le syndrome hépato-rénal à l’aide de corticoïdes par exemple de manière à préserver les chances d’éligibilité à la transplantation. Les solutions thérapeutiques que nous espérons proposer visent à agir simultanément sur les différentes voies qui sont à l’origine des défaillances multiples donc sur les mécanismes à l’origine des effets fulminants observés. (Infection, inflammation, immunité et métabolisme). A ces bénéfices attendus lors du déroulement de nos projets, nous avons ajouté la voie veineuse d’administration des composé étudiés qui reflète davantage la situation majoritairement vécue en clinique humaine
Procédures
Selon les procédures concernées, les gestes techniques pratiqués pourront être un peu différents : • Pour les opérations chirurgicales de pose du cathéter, les animaux seront anesthésiés au masque (anesthésie volatile au gaz) et ils recevront successivement : • 1 injection unique avant l’opération d’un médicament anti-douleur (=analgésique) • 1 injection de solution physiologique qui prévient la déshydratation fréquente lors de la chirurgie • 1 aspersion locale de médicament anti-douleur à l’emplacement de l’incision. • 3 injections par jour d’un médicament anti-douleur au cours des 3 jours qui suivent l’opération. • Pour les phases d’induction de la cirrhose hépatique Les animaux qui recevront par gavages un agent chimique toxique pour le foie (2 fois par semaine à 2mL/kg pour les rats et 3 fois par semaine pour les souris), pendant 10 semaines successives. Chaque manipulation de l’animal dure environ 15 secondes. Les animaux subiront un prélèvement sanguin sous anesthésie volatile (prélèvement intermédiaire et final ; la durée totale de chaque prélèvement dure environ 2 minutes. • Pour la phase de déclenchement de la défaillance hépatique Les animaux recevront une injection intrapéritonéale à 5mL/kg pour les rats et 10mL/kg pour les souris. Durée du geste y compris contention est de15 secondes • Pour les études pharmacocinétiques Les animaux subiront des micro-prélèvements intermédiaires au niveau du cathéter sans introduction d’aiguille en conditions vigiles au nombre de 6 pour les rats et 3 pour les souris. Durée y compris la contention de l’animal 15 secondes Les animaux subiront des prélèvements terminaux sous anesthésie gazeuse. Durée y compris l’anesthésie : 2 minutes
Impact sur les animaux
La défaillance hépatique aigue du patient cirrhotique représente un évènement grave, sa survie est engagée. Le modèle d’étude développé chez la souris ou le rat présente manifestement des signes cliniques d’inconfort. On s’attend à observer des animaux en état de choc et de détresse cardio-respiratoire, avec des épisodes de troubles de la régulation de la température corporelle. Les effets cités sont observés de manière plus ou moins prononcée, ces signes constituent les critères d’atteinte des points limites. Certains animaux présenteront ces symptômes à des stades qui nécessiteront un point d’arrêt anticipé. Pour évaluer les effets de nos composés, nous nous fixons comme objectif de reproduire une gravité qui sera jugée sévère mais qui permette de maintenir des animaux dans un état acceptable du point de vue éthique et conservant toute pertinence scientifique.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort car il est indispensable de recueillir les organes en vue d'analyses d'expression de gènes ( transcriptomique) , ou de proteine ( histologie)
Remplacement
La possibilité de disposer d’un modèle animal qui permet d’évaluer les effets des nouveaux composés sur tous les aspects d'une pathologie présente chez l’homme constitue une étape clé dans la lutte contre ces maladies et font de nos modèles des outils translationnels très pertinents. Bien qu'une première phase de sélection des meilleurs composés soit effectuée sur des modèles acellulaires ou cellulaires, contribuant ainsi à l’utilisation de méthodes alternatives visant à remplacer partiellement l’utilisation des animaux comme nous le rappelle la règle des 3R’s, l’évaluation finale du potentiel thérapeutique des produits dans des modèles animaux reste cependant nécessaire. Le recours à l'emploi d’un animal vivant permet d’évaluer la réelle efficacité des composés dans un système biologique complexe et «global », capable de métaboliser les pricipes actifs donc de déceler les effets secondaires, capable d'activer toutes les voies de signalisation qui participent à la caractérisation de ce modèle. Son remplacement à ce stade du projet scientifique (phase pré clinique) n'est pas envisageable dans une système biologique isolé ou cellulaire qui quelque soit sa nature ne pourra apporter tous les enseignements issus de l'expérimentation in vivo.
Réduction
La stratégie de réduction consiste à ne réaliser que les essais avec les composés les plus prometteurs ayant satisfait aux étapes de sélection préliminaires in vitro. La réduction du nombre d'animaux est motivée par la longueur/lourdeur des procédures expérimentales, cela nous a conduit lors d'essais pilotes ou préliminaires de cibler le juste nombre d'individus nécessaires à l'obtention de résultats pertinents. Les paramètres que nous étudions in vivo (bio marqueurs, induction/répression de gènes, effets histologiques etc) doivent être pertinents. Nous écartons les paramètres peu représentatifs et peu discriminants statistiquement qui nécessiteraient des effectifs trop importants. Nous disposons de données expérimentales ou publiées dans la littérature sur les paramètres biologiques ou biomarqueurs les plus pertinents et "robustes". Des approches statistiques permettent d'affiner les effectifs et donc de réduire les nombres d'animaux.
Raffinement
Les rats sont hébergés par paires ou trios, les souris peuvent être gardées en groupes sociaux plus importants (5 ou 6 par cage). L’enrichissement du milieu est systématisé par l’apport de dispositifs permettant aux animaux de ronger (blocs ou billes des bois), un apport de coton compressé permet de maintenir l’instinct de création du nid, des tunnels en polycarbonate transparent teintés en rouge sont placés dans les cages pour apporter un espace simulant la dissimulation et favorisant le maintien de l’instinct grégaire des rats. Nous avons opté pour la pose de cathéters qui offrent un accès à l’aide d’un bouton métallique bouché par un obturateur aimanté qui présente l’avantage de pouvoir faire cohabiter les animaux dans une même cage sans crainte d’arrachage du cathéter par les congénères, cela constitue une amélioration significative du bien-être des animaux. L'établissement de points limites dans ce modèle expérimental de défaillance hépatique nous permet d'écarter tout individu susceptible de subir un inconfort trop important ou de la douleur. Bien conscient que nous développons dans ce projet des modèles sévères, nous nous efforçons d'avoir recours à des moyens analgésiques adaptés et non confondants. La pathologie et les mécanismes qui la déclenchent sont en partie connus, l'emballement inflammatoire en est une composante, le recours à des moyens de lutte contre la douleur peut introduire un biais expérimental ; une étape de validation s’impose pour chaque situation.
Choix des espèces
La littérature scientifique, est riche sur la cirrhose du foie, les espèces employées à ce stade de la recherche sont les rongeurs qui sont de bons répondeurs aux stimuli métaboliques, et constituent modèles et des moyens vivants de valider l’efficacité d’une nouvelle molécule dans le traitement de la pathologie étudiée. Les méthodes chirurgicales de pose de cathéters chez les souris et rats sont parfaitement décrites et idéalement adaptées à l'utilisation de ces espèces dans ce projet. Les rats sont de jeunes adultes de 6 à 7 semaines d’âge, les souris sont-elles âgées de 8 à 10 semaines , elle ont alors un poids qui permettent une manipulation plus aisée ( environ 25gr)
Etude des interactions hôtes-pathogènes et de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le contexte de tuberculose
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Infectées par Mycobacterium tuberculosis par voie intranasale ou intraveineuse, puis gavées ou injectées cinq à sept jours par semaine pendant trois à huit semaines, ces souris peuvent aussi recevoir un second agent pathogène. 6 704 souris vont être utilisées, 5 028 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 1 676 un niveau sévère. Le porteur affirme que la surveillance biquotidienne permet "l'arrêt total des souffrances de l'animal par sa mise à mort", tout en jugeant "indispensable" d'observer chez les souris infectées par Plasmodium au moins deux signes de neuropaludisme, ataxie, hémiplégie ou tétraplégie, spasmes, coma. Toutes sont tuées par dislocation cervicale en fin d'expérience, pour le prélèvement d'organes.
Objectifs
Le projet présente trois objectifs distincts: - étudier l'effet de composés (médicaments, substances chimiques ou produits biologiques) à visée thérapeutique contre la tuberculose. - évaluer la pathogénicité de différentes souches bactériennes de Mycobacterium tuberculosis sauvages ou mutantes, ainsi que la contribution de l'hôte à la pathogénicité des mycobactéries in vivo chez la souris. - étudier l'évolution de la co-infection (par un agent pathogène secondaire) dans un modèle de souris infectée de manière latente par M. tuberculosis.
Bénéfices attendus
Selon les estimations de l’Organisation Mondiale de la Santé, 9,9 millions de personnes ont développé la tuberculose dans le monde, et 1,3 million de personnes sont mortes de la tuberculose en 2023 (dont 214 000 présentaient également une infection à VIH). À l’échelle mondiale, la tuberculose est la 13e cause de mortalité et la deuxième due à une maladie infectieuse, derrière la COVID-19. Cette évolution est principalement liée à la recrudescence de la tuberculose chez des patients immunodéprimés, ainsi qu'à l’émergence des souches résistantes aux antibiotiques. Dans ce contexte, nos projets visent à identifier de nouveaux composés à visée thérapeutique efficaces sur les souches multiresistantes et à comprendre les mécanismes fondamentaux de l'interaction de l'hôte avec les mycobactéries, afin de comprendre tous les mécanismes responsables de l’infection, mais également de caractériser et étudier l'impact d'une co-infection chez la souris atteinte d'une tuberculose latente.
Procédures
Selon leur formulation, les composés peuvent être administrés quotidiennement (5 à 7 jours par semaine) par gavage (durée d'intervention : 1 minute) ou voie intrapéritonéale (durée d'intervention : 30 secondes) ou une fois par semaine par voie intraveineuse (dans la veine caudale - durée d'intervention : 2 minute) aux souris non-anesthésiées, pendant 3 à 8 semaines. L’administration par voie endotrachéale (durée d'intervention : 3 minute) ou intranasale (durée d'intervention : 1 minute) peut également être utilisée 3 à 5 fois par semaine et pendant 1 à 3 semaines sur souris préalablement anesthésiées. L'infection des souris avec les différents agents pathogènes est réalisée par voie intranasale (durée d'intervention : 1 minute) sous anesthésie ou par voie intraveineuse (durée d'intervention : 2 minute), intrapéritonéale (durée d'intervention : 30 secondes) ou sous cutanée (durée d'intervention : 1 minute) sur animaux vigiles. Dans le cadre des expériences de co-infections, les animaux seront infectés à deux reprises, (i) avec Mycobacterium tuberculosis (ou BCG) (durée d'intervention : 1 minute), puis (ii) un des autres pathogènes étudiés (durée d'intervention : 1 minute).
Impact sur les animaux
Lors des expériences de surinfection, des signes cliniques graves pourraient etre observés. Des points limites basés sur l’apparence et le comportement des souris sont observés quotidiennement, afin de détecter le plus tôt possible une éventuelle morbidité. Une grille de signes cliniques est utilisée et le « score de douleur » permet de déterminer le niveau de souffrance de l’animal. Les animaux présentant des signes cliniques défavorables (score supérieur à 5) sont euthanasiés. Dans cette procédure, la perte de poids constitue le point limite majeur pris en compte. L’évolution du poids est suivie au minimum 2 fois par semaine. Une perte de poids > 20%, seule, entraine l’euthanasie de la souris. La prostration est également un des indicateurs de douleur pertinent dans le cas d’infection de certaines souris transgéniques. Lors de l'infection par Plasmodium, la mise à mort fait suite à l'observation de deux symptômes caractéristiques du neuropaludisme : ataxie, hémi ou tétraplégie, spasmes, coma pour les souris infectées par Plasmodium berghei ANKA. Aussi, il est indispensable pour l'étude du neuropaludisme d'observer au moins ces deux signes cliniques, la pathologie étant cérébrale et ne pouvant être diagnostiquée que par ces signes. Néanmoins, l'apparition de ces signes cliniques étant dans une fenêtre connue (6 à 10 jours après infection), les animaux seront surveillés toutes les demi-journées, permettant l'arrêt total des souffrances de l'animal par sa mise à mort.
Devenir
Pour chaque procédure, les animaux sont euthanasiés par dislocation cervicale en fin d'expérience pour effectuer le prélèvement de différents organes pour analyse.
Remplacement
Aucun modèle expérimental in vitro ne permet d'englober tous les aspects de l'interaction hôte-pathogène qui aboutissent à la tuberculose pulmonaire évolutive, ni de reproduire la physiopathologie de l’infection respiratoire, ni d’étudier les mécanismes de défense contre l’infection. Seules les études in vivo permettent de déterminer l'efficacité de composés face à une épreuve virulente de M. tuberculosis. Et l’efficacité chez la souris constitue un pré-requis avant toute phase clinique sur l'homme. De nombreux aspects de la pathogénicité étant comparables entre l’homme et la souris, il est ainsi admis que la souris constitue un modèle incontournable pour le suivi de la réplication du bacille tuberculeux in vivo et l’étude de l’interaction entre l’hôte et les mycobactéries. Les différentes stratégies innovantes de vaccination contre les mycobactéries pathogènes peuvent être évaluées et validées chez la souris qui, infectée efficacement par des souches de M. tuberculosis pathogènes humaines, développe une tuberculose pulmonaire.
Réduction
Les expériences sont répétées en triplicate sur 4 animaux par groupe expérimental. Les résultats sont analysés statistiquement avec le test de Student. Afin de réduire le nombre d'animaux, une partie des organes est également utilisée et analysée par histologie ou par FACS, afin de visualiser la localisation des bactéries dans différents types cellulaires.
Raffinement
De façon à réduire le stress, l'inconfort et la douleur, les souris sont anesthésiées au moment des différentes administrations invasives. De plus, la surveillance sera accrue, 2 à 3 fois par semaine ou quotidienne, selon les procédures. L'apparence physique, l'alimentation et le comportement des animaux seront surveillés, afin de détecter le plus tot possible une éventuelle morbidité. Une grille de signes cliniques a été établie et est utilisée pour évaluer un "score" de douleur et permet d'évaluer le niveau de souffrance des animaux. Les animaux présentant des signes cliniques défavorables (score supérieur à 5) seront euthanasiées. Les souris seront euthanasiées au maximum 10 semaines post-infection, i.e. avant l'apparition des signes de morbidité, sur la base des connaissances de la souche de M.tuberculosis de type sauvage qui est la plus pathogène parmi les mycobactéries que nous étudions. Si des signes de morbidité étaient observés, les points de cinétiques serons revus et réajustés, les individus seront euthanasiés et les analyses prévues réalisées plus précocément par rapport à celles initialement prévues. Le cas échéant les souris sont préalablement anesthésiées: - à l’aide d’une solution d’isoflurane (2%) par la voie aérosol. Les souris sont placées par série de 4 dans une boite d'induction étanche en plexiglas avec joint (L21,8*l12,8*H12,9 (3,6 l)) pendant environ 5 à 10 minutes où elles respirent les vapeurs d’isoflurane. La durée d'anesthésie est d'environ 1 minute. - par injection intrapéritonéale d'une solution contenant 1 mg/ml de Xylazine (Rompun®) ou Diazépam et 10 mg/ml de Kétamine (Clorketam 1000-Vétoquinol®), préparée en PBS. 50 à 100 μl de ce mélange est administré pour 10 g de souris (soit 5 à 10 mg/kg de Xylazine et 80 à 100 mg/kg de Kétamine). La durée d'anesthésie est d'environ 20 minutes.
Choix des espèces
1)La possibilité d’induction d’une tuberculose chronique chez la souris par des souches de M. tuberculosis pathogènes pour l’homme et la pertinence de ce modèle expérimental en ce qui concerne l’évolution de la maladie, 2)L’existence de nombreuses similitudes de l’immunité anti-mycobactérienne entre l’homme et la souris, 3)Les nombreuses connaissances disponibles pour cette espèce, font de ce modèle expérimental un système de choix qui permet d’éviter le recours aux espèces plus sensibles. Les animaux utilisés sont âgés de 6 à 10 semaines au moment de l'infection par M. tuberculosis. Cet intervalle d’âge permet d’avoir un système immunitaire optimal.