Procédures sévères

Une tumeur est greffée dans le cerveau de chaque souris, puis retirée trois semaines plus tard au cours d'une seconde opération qui enlève un morceau de crâne, remplacé par une lame de verre laissée en place jusqu'à la mise à mort. 60 souris nues, immunodéficientes pour ne pas rejeter les cellules tumorales humaines, sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Entre les deux chirurgies, elles reçoivent jusqu'à cinq séances d'imagerie précédées chacune d'une injection dans l'abdomen, puis un suivi au microscope à huit temps sur une semaine. Le porteur décrit une tumeur dont les symptômes sont levés par l'opération et des injections "parfaitement maitrisées", pour un projet dont la gravité déclarée est la plus élevée de l'échelle.

Objectifs

La chirurgie correspond au premier traitement des patients atteints de tumeurs cérébrales, même si elle est le plus souvent imparfaite et laisse systématiquement quelques cellules tumorales qui doivent être traitées par des thérapies complémentaires (radiothérapie et chimiothérapie). Etrangement, la plupart des études in vivo chez l'animal n'incluent pas cette chirurgie. Ainsi, les conséquences de l'opération, telles que la cicatrisation du tissu cérébral après l'opération, sont mal connues et rarement prises en compte chez l'animal. Or, la chirurgie impacte forcément l'efficacité des traitements complémentaires (tels que les chimiothérapies) délivrés par voie intraveineuse après l'opération. Pour les recherches qui tentent de développer des thérapies innovantes incluant des agents de chimiothérapie, il paraît pertinent et nécessaire de mieux prendre en considération la situation post-opératoire. C'est pourquoi dans ce projet, nous proposons d'étudier par microscopie de fluorescence les modifications du tissu cérébral survenant après l'extraction de la tumeur et leurs conséquences. Notamment, nous souhaitons : 1-étudier la structure et la perméabilité des vaisseaux sanguins cérébraux lors de la "cicatrisation" après chirurgie ; 2-étudier la reprise/recroissance de la tumeur à partir des cellules tumorales laissées après chirurgie ; 3-évaluer l'impact sur la distribution intracérébrale de molécules fluorescentes administrées par voie intraveineuse. Nous prévoyons de travailler avec 5 molécules fluorescentes de taille variable qui seront administrées par voie intraveineuse et nous comparerons comment elles se répartissent dans les vaisseaux sanguins cérébraux, dans les cellules tumorales restantes et dans le cerveau sain. Les méthodes mises en œuvre dans ce projet et utilisées dans des projets précédents, sont parfaitement maitrisées. Le projet se déroulera sur 2 établissements distincts (Etablissement Utilisateur 1 : hébergement, chirurgies, injection d'agents fluorescents, imagerie de fluorescence, ; Etablissement Utilisateur 2 : imagerie par production et émission de lumière)

Bénéfices attendus

L'efficacité des thérapies anticancéreuses (agents de chimiothérapie, thérapies ciblées, ...) administrées par voie orale ou intraveineuse, est directement dépendante de la quantité d'agent thérapeutique capable d'atteindre les cellules tumorales dans le cerveau. La chirurgie, qui vise à ôter la tumeur, n'est jamais complète et laisse toujours quelques cellules tumorales à l'origine d'une reprise de la tumeur. Ce sont ces cellules "restantes" que ciblent les chimiothérapies complémentaires : il faut donc que les médicaments injectés par voie intraveineuse soient capables de les atteindre pour les détruire. Dans ce contexte, ce projet permettra de mieux comprendre la "cicatrisation" post-opératoire, et de décrire la distribution des agents de chimiothérapie, administrés après chirurgie, en fonction de leur taille. Ces éléments de connaissance sont indispensables pour nos travaux futurs qui visent à développer et optimiser de nouvelles thérapies pour les tumeurs cérébrales: ces données ouvriront des pistes de réflexion et fourniront des arguments solides concernant le "meilleur timing" pour l'administration de substances actives après chirurgie.

Procédures

Pour chaque souris, nous réaliserons une greffe de tumeur par injection de cellules tumorales dans le cerveau (1ère chirurgie d'environ 30 minutes) puis environ 3 semaines après, la tumeur formée sera ôtée par chirurgie (2ème chirurgie d'environ 30 minutes). La deuxième chirurgie nécessite d'ôter une partie de l'os du crâne (= appelée volet osseux pour permettre d'accéder à la tumeur) et en fin de chirurgie, l'os manquant sera remplacé par une lame de verre très fine pour permettre les observations du cerveau en microscopie de fluorescence. La fenêtre en verre restera positionnée jusqu'à la mise à mort des animaux. Les animaux feront l'objet de plusieurs analyses en imagerie : entre la 1ère et la 2ème chirurgie, des imageries basées sur la lumière émise par les cellules tumorales appelée bioluminescence (environ 10 minutes, répétées maximum 5 fois sur 3 semaines) nécessiteront l'injection intrapéritonéale d'un produit de contraste (appelé luciférine) avant chaque acquisition ; après la 2ème chirurgie, des molécules fluorescentes seront injectées par voie intraveineuses (1 injection 1 fois) et un suivi par microscopie sera réalisé à différents temps (avant injection, 5 min, 1h, 4h, 24h, 48h, 72h et 168h après injection puis 1 à 2 fois / semaine pour une partie des animaux)

Impact sur les animaux

La première nuisance attendue correspond au développement d'une tumeur cérébrale qui peut induire des symptômes cliniques. Mais, l'expérience montre que l'intervention chirurgicale suffisamment anticipée (environ 3 semaines après la greffe de cellules tumorales) permet de lever ces symptômes. Les chirurgies et l'imagerie par émission de lumière (bioluminescence) se feront sous anesthésie chimique. Nous privilégierons l'anesthésie gazeuse lors des imageries en microscopie de fluorescence. L'imagerie par bioluminescence nécessite un transport des animaux dont les conditions ont été optimisées lors de projets précédents afin de réduire l'inconfort et le stress des souris. Le cycle jour/nuit de l'animalerie étant inversé, la gêne occasionnée par les expérimentations diurnes sera faible, les animaux étant ainsi manipulés durant leur phase d'activité. Les injections en intraveineuse, effectuées dans la veine de la queue à l'aide d'aiguilles très fines, sont parfaitement maitrisées, ce qui permet d'éviter les risques d'extravasation notamment lors des injections d'agent anticancéreux.

Devenir

La fin de l'expérimentation correspond soit à un temps de prélèvement des échantillons, soit à l'atteinte d'un point limite, ce qui se traduit par la mise à mort pour tous les animaux.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est dans ce contexte pas possible puisque la chirurgie des tumeurs cérébrales et l'analyse de ses conséquences, notamment sur le devenir d'agents thérapeutiques, ne peuvent être étudiées qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Grâce au suivi par imagerie, nous sommes en mesure d'évaluer les événements au cours du temps. A ce stade, nous ne pouvons pas prédire si des différences faibles, modérées, ou fortes entre les différents lots et/ou au cours du temps seront observées. C'est pourquoi, nous prévoyons un maximum de 10 animaux / lot mais les expérimentations seront conduites par palier. Ainsi, pour l'étape 1, une appréciation intermédiaire des effets au bout de 4 animaux par lot (étape 1a) permettra d'ajuster la démarche en poursuivant uniquement pour les lots/les temps d'analyses/les paramètres les plus pertinents (étape 1b) selon un principe go/no go ("go" si une différence perçue doit être confirmée / "no go" si on ne constate aucune différence ou si une différence très évidente apparaît). L'étape 2 comparant la biodistribution et les effets des formes libre ou encapsulée d'agent anticancéreux ne sera conduite que si elle reste pertinente au regard des résultats de l'étape 1. Parmi les différents paramètres (longueur et ramification du réseau vasculaire, intensité de fluorescence proportion de surface fluorescente, etc…) obtenus à partir des analyses d'images de fluorescence acquises au cours du temps, ceux qui paraitront les plus pertinents feront l'objet d'une comparaison statistique.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux, pendant l'hébergement, au moment des chirurgies et des imageries, et lors du transport entre les 2 établissements utilisateurs. Hébergement à 5 souris / cage jusqu'à la pose de la fenêtre crânienne puis hébergement individuel pour garantir le bien-être optimal des souris ; température et hygrométrie contrôlées, eau et nourriture ad libitum, enrichissement sous forme de sopalin et de bâtonnets en bois à ronger. Pour prévenir la douleur liée aux interventions chirurgicales et au stress engendré par la contention, les animaux seront anesthésiés. Chirurgies : anesthésie locale et analgésie pré-, per-, et post-opératoire. Protection des yeux par du gel ophtalmique. Température de l'animal maintenue par tapis chauffant. Micro-saignements stoppés à l'aide de cotons hémostatiques. Au réveil : Maintien au chaud dans une cage propre ; administration d'eau sucrée et accès à quelques croquettes humidifiées placées directement dans la cage pour faciliter la réhydratation et la récupération. Après chirurgie : nettoyage quotidien de la zone incisée. Observation quotidienne du comportement naturel et face à l'expérimentateur pour évaluer la douleur et le stress ; mesure quotidienne du poids ; alimentation, hydratation, motricité et coordination. Quel que soit le groupe, la mise à mort sera pratiquée dès atteinte des points limites définis (perte de poids et problème de motricité essentiellement). Transport : à pied entre les 2 établissements d'expérimentation dans une cage à couvercle filtrant. Les cages seront placées dans un sac isotherme pour les isoler de l'environnement extérieur, et selon la température extérieure, des ‘bouillottes’ préalablement chauffées pourront être disposées sous la cage pour éviter des variations de température liées aux conditions climatiques.

Choix des espèces

Dans les études menées en oncologie, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles murins (souris et rats). Les souris constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibiltié et de leur facilité de manipulation. Les souris nue sont classiquement utilisées dans le cas de greffes de cellules tumorales humaines : du fait de leur immunodéficience il n'y a ainsi pas de rejet du greffon tumoral implanté. Nous utiliserons des souris femelles et mâles, puisque les paramètres à étudier sont a priori indépendants du sexe.

Déjà lésés à la moelle épinière et porteurs d'un capteur télémétrique au titre d'un projet antérieur, 30 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ce volet ajoute deux séances d'anesthésie gazeuse de quarante-cinq minutes pour une imagerie par résonance magnétique, à vingt-quatre heures d'intervalle. La paralysie du train arrière impose une vidange manuelle de la vessie une à quatre fois par jour, un isolement de sept jours après l'opération et une antibiothérapie contre les infections urinaires, contraintes que le porteur détaille avec précision. Sur le remplacement, il affirme qu'il n'existe pas de modélisation du système sérotoninergique capable de prédire les effets de la lésion.

Objectifs

Les lésions de la moelle épinière (LM) sont un problème de santé important dans le monde, touchant des individus jeunes et en bonne santé. Outre les déficits sensoriels et moteurs bien connus et identifiés, les sujets présentent une altération majeure du contrôle du système nerveux autonome. Les symptômes comprennent des troubles cardiovasculaires, une thermorégulation dysfonctionnelle et la présence de dysréflexie autonome (épisodes soudains d'hypertension et de bradycardie pouvant mettre en jeu le pronostic vital). Ces troubles sévères contribuent à 40 % des décès chez les patients. Les conséquences sur la qualité et l’espérance de vie sont extrêmement préjudiciables, impliquant une réelle prise en charge. Chez les rats spinaux, l'administration quotidienne pendant 28 jrs d'un agoniste sérotoninergique (5-HT) favorise la récupération motrice. Outre ce rôle démontré, la 5-HT joue également un rôle omniprésent dans le système cardiovasculaire puisqu'elle module, entre-autre, le tonus des vaisseaux sanguins ou la rythmicité cardiaque. Le précédent projet montre des données préliminaires très encourageantes et met en évidence une amélioration importante des fonctions cardiovasculaires. Si les résultats sont prometteurs et pourraient être utilisés dans de prochaines études cliniques, il nous faut maintenant compléter ces données sur des données physiologiques. Nous savons (bibliographie) que les rats ayant subi une lésion de moelle en T5 présentent un remodelage des neurones sympathiques post-ganglionnaires innervant le cœur. Nous comparerons donc des individus contrôles, traités avec du NaCl et traités avec notre molécule sérotoninergique. De même, nous savons que les troubles cardiovasculaires provoquent des modifications sur la physiologie d’organe tel que le cœur mais aussi le rein (directement impliqué dans la régulation de la pression artérielle). Nous souhaitons comparer, là encore, des individus contrôles, traités avec du NaCl et traités avec notre molécule sérotoninergique. Si nous avions dans un premier temps envisager de faire un avenant au projet précédent, il s’avère que l’utilisation de capteurs de télémétrie (utilisés pour suivre les paramètres cardiovasculaires) est incompatible avec une IRM et que le traçage des neurones innervant le cœur demandait une 3ème chirurgie, peu éthique pour les animaux (procédure sévère). Nous avons donc décidé de déposer un nouveau projet éthique pour compléter nos données déjà récoltées.

Bénéfices attendus

Les lésions hautes de la moelle épinière présentent une incidence dramatique sur tous les aspects de la vie quotidienne individuelle. Outre les déficits sensori-moteurs, des troubles cardio-vasculaires importants sont présents chez ces individus. Certains troubles comme les dysreflexies autonomes (épisodes soudains d'hypertension et de bradycardie réflexive) peuvent mettre en jeu le pronostic vital du patient. Une précédente étude de notre équipe a montré l'implication de molécules agissant sur le système sérotoninergique et leur capacité à restaurer en partie l’impact de ces troubles. Notre projet pourra permettre une avancée dans le traitement des patients.

Procédures

Les animaux seront issus d'une précédentes DAP (projet multi-sites). Ils seront tous (30) anesthésiés 1h30 environ en deux sessions séparés de 24h pour subir une imagerie (projet éthique 2/2). Toutes les anesthésies seront gazeuses (isoflurane).

Impact sur les animaux

Tous les animaux subiront une chirurgie pouvant induire de la douleur et 30 d'entre eux, en subiront une 2ème. Ces chirurgies peuvent induire de la douleur. De plus, la lésion de la moelle épinière (2ème chirurgie de la procédure 2) va induire chez les animaux les mêmes problèmes que ceux rencontrés par les patients ; des difficultés locomotrices du train arrière pouvant être largement compensées par les pattes avant et une cage d'hébergement adaptée en hauteur et des problèmes cardiovasculaires (tachycardie et hypotension orthostatique). 20 animaux seront insolés pendant les 7 jours post-opératoires afin d'assurer leur soins postopératoires dans de bonnes conditions. Les injections quotidiennes ne doivent pas induire de douleurs (fait sous la lésion – absence d’intégration sensorielle) mais induisent un stress limité (duo d’expérimentateurs durant toute la durée). Le test de marche sur le tapis roulant peut induire un stress à l’animal. Enfin, les sessions d’IRM ne devraient pas induire de nuisances, néanmoins, les animaux seront anesthésiés environ 1h30 en 2 sessions de 45 minutes.

Devenir

Nous avons besoin des tissus pour faire des analyses de remodelage de l'innervation d'organes cibles

Remplacement

Ce projet éthique s'inscrit dans un projet scientifique plus vaste où des études préliminaires ont mis en évidence l'implication du système sérotoninergique (5-HT) dans les épisodes cardiovasculaires dysfonctionnels qui apparaissent à la suite d'une lésion haute de la moelle épinière. L’organisation du système sérotoninergique est complexe avec de nombreux types ou sous-types de récepteurs différents qui se retrouvent à plusieurs niveaux tant centraux que périphérique. Il n'existe pas de modélisation de ce système qui permettrait de prédire les effets de la lésion dans notre modèle

Réduction

Nous avons déterminé le n des lots en fonction des premiers résultats obtenus dans le précédent projet. Nous ferons une comparaison pour savoir si nous avons un des différences entre les lots. Il va falloir n=7 animaux par lots (avec ce nombre, nous avons été en mesure de faire des statistiques claires lors de notre précédent projet éthique). Toutefois, la complexité de l'expérimentation nous oblige à prévoir une marge d'erreur que nous aimerions ne pas avoir à utiliser (n=10 animaux par sexe).

Raffinement

Les soins post-opératoires (lésion de moelle) sont basés sur notre expérience de cette technique ainsi que sur des publications de raffinement écrites par les quelques équipes travaillant sur des sujets similaires au nôtre. Il a été validé par la structure de bien-être animale et nos vétérinaires. Les animaux sont anesthésiés par voie gazeuse(isofluorane). Nous utilisons une analgésie multimodale pour les 2 chirurgies pendant 3 jours minimum. Pour la phase post-lésionnel, nous avons adapté les cages qui ont été usinées à façon pour s'adapter à la paralysie des animaux (eau proche du sol, mangeoire basse, tapis souple agrippant dans la cage pour aider à la mobilité, alimentation liquide pendant 4 jours post-opératoires pour pallier aux problèmes gastriques, vidange manuelle de la vessie de 1 à 4 fois par jour en fonction de la récupération des animaux et antibiothérapie post-opératoire pour éviter les infections urinaires. Des points limites stricts ont été mis en place avec l'aide de l'équipe vétérinaire.

Choix des espèces

Le rongeur est un modèle facile à héberger, dont la reproduction est rapide et dont la physiologique reste malgré ses différences proches de celle l'humain. Le rat est particulièrement compatible avec notre projet car sa taille supérieure à celle de la souris permet de faciliter les chirurgies. De plus il existe de nombreux points communs entre le rat et l'humain quant à la réparation cellulaire de la moelle épinière. Enfin nous avons choisi le même modèle que sur l'ensemble des précédents projets éthiques. Les animaux du projet précédent sont implantés (capteur télémétrique) à 225-275gr soit à 7/8 semaines d'âge environ. Afin de rester au plus proche de ce qui est fait sur le premier projet, nous commencerons ce projet avec des animaux du même âge.

Vingt souris de ce projet passeront ensuite dans un projet de formation interne aux gestes techniques, ce qui évite au laboratoire d'en commander pour cet usage. 300 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 280 d'entre elles tuées à l'issue parce qu'elles auront reçu des candidats médicaments dont l'innocuité n'est pas garantie. Un traumatisme crânien leur est infligé par chirurgie, de quarante à soixante minutes par animal, pour provoquer une immunodépression, avant l'installation d'une pneumonie bactérienne par voie intratrachéale, puis l'administration de composés immunomodulateurs et des prélèvements de sang répétés. Le porteur relève que cette chirurgie peut entraîner une fracture du crâne, de la douleur et des convulsions, et juge la souris "indispensable" faute de pouvoir recréer in vitro une immunodépression post-traumatique.

Objectifs

La pneumonie acquise à l'hôpital (PAH) est une maladie infectieuse préoccupante dans le monde et la cause la plus fréquente d'infections associées aux soins. La PAH est la principale complication enregistrée dans les unités de soins intensifs à la suite d'un traumatisme sévère provoquant une immunodépression. C'est la principale cause de consommation d'antibiotiques et est fréquemment induite par des agents pathogènes résistants aux médicaments. De nouvelles stratégies alternatives plus efficaces sont donc nécessaires pour favoriser la guérison des patients et lutter contre l'antibiorésistance. Notre projet vise à déterminer les effets de composés immunomodulateurs sur le système immunitaire afin de surmonter cette immunodépression post-traumatique et prévenir les complications liées aux infections bactériennes.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’établir la fonctionnalité de composés immunomodulateurs sur l’immunodépression post-traumatique dans un modèle se rapprochant le plus possible de l’humain. En utilisant des souris au système immunitaire humanisé, nous mettons à disposition des chercheurs un modèle permettant d'étudier les mécanismes immunitaires induits lors de l’installation d’une immunodépression post-traumatique et les potentiels effets thérapeutiques de candidats médicaments avec davantage de spécificité de l'espèce utilisatrice de ces futurs traitements : l'Homme.

Procédures

Nous induirons une immunodépression en provoquant un traumatisme crânien (procédure chirurgicale, une fois/animal, durée environ 40-60 minutes). Après ou non l’induction de l’immunodépression, une pneumonie bactérienne est induite par administration intratrachéale (une fois/animal, durée environ 10 minutes). Injections par voie intraveineuse peuvent être envisagées : 2 fois maximum. Chaque injection dure entre 10 et 15 secondes. Des candidats médicaments seront administrés par voie pulmonaire, orale ou injectable pour évaluer leurs activités thérapeutiques. Le suivi de l’état de santé des animaux se fera par score clinique (aspect des poils, mobilité, état corporel, …). Afin de suivre l'évolution de la pathologie et d'objectiver les effets des molécules à visées thérapeutiques, des prises de sang seront réalisées. Les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids de l’animal selon un schéma établi et une limite fixée. La répartition des prélèvements dépendra du vétérinaire et figurera dans le protocole d’étude.

Impact sur les animaux

Des nuisances peuvent être induites par les injections, l’administrations de traitements, les effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques et/ou les prélèvements sanguins. Pour le modèle de traumatisme crânien, la constatation d'une complication (fracture osseuse) peut être observée entrainant de la douleur, ainsi que des convulsions. Cette douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer. Suite aux traumatismes primaires et à l’infection secondaire, une perte de poids transitoire (< 2 jours) et modérée (< 10%) est observée, sans perte de motricité. Après 2 jours, les souris reprennent une courbe de poids normale.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés car ils auront reçu des candidats médicaments pour lesquels un impact négatif sur la santé des souris ne peut être exclu. Des souris issues de ce projet pourront être réutilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris », sous réserve d’un avis vétérinaire favorable et à condition qu'elles n'aient pas subit de geste plus sévère qu'une injection hydrodynamique. Cette réutilisation permet de ne pas commander des souris spécifiquement pour la Formation mais d’utiliser nos souris déjà présentes.

Remplacement

Les tests in vitro seront envisagés si ceux-ci sont appropriés. Néanmoins, il n'est actuellement pas possible de recréer in vitro un environnement complexe comme le système immunitaire et de reproduire une immunodépression post-traumatique, tout en objectivant les effets potentiellement toxiques d’une molécule en développement. La souris constitue donc un modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable pour le développement et la mise au point de thérapies innovantes pour les patients..

Réduction

Un total de 300 souris seront utilisées, couvrant une période de 3 ans et permettant de réaliser environ 2 études précliniques de 50 souris par an. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum en se basant sur des tests statistiques.

Raffinement

En début d'étude et tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum sauf si le protocole d’étude nécessite un jeûne de nourriture. La durée de ce jeûne ne pourra dépasser 12 heures par semaine avec un maximum de 6h consécutives. L’eau ne sera jamais retirée des cages. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. Les souris seront hébergées dans une atmosphère disposant d’un cycle lumière-obscurité, d’une température et d’une hygrométrie contrôlés en permanence. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle de scores appliquée dès le premier geste invasif. Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction du score clinique et/ou de la perte de poids mais également en cas de fracture du crâne, convulsions post-traumatisme, difficultés respiratoires sévères en lien avec la pneumonie/l'inflammation pulmonaire, état de choc en lien avec l'évolution du sepsis.

Choix des espèces

90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement dans du gène de la souris par son équivalent humain permet la création de lignées humanisées. Pour les souris non humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 6 semaines, animaux matures d’un point de vue physiologique. Pour les souris humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 8 semaines, première apparition des cellules immunitaires humaines dans le sang.

Six macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacun subissant une chirurgie d'implantation de huit heures puis trente-six séances d'enregistrement pouvant durer huit heures chacune, sur une chaise de contention à laquelle il aura été entraîné pendant au moins un mois. S'y ajoutent deux ventriculographies de trois heures, une à deux IRM, un scanner, jusqu'à trois radiographies et des injections de pénicilline destinées à déclencher les crises d'épilepsie, avec à la clé une perte de poids sur sept jours, une parésie transitoire, des vocalisations anormales et des crises persistantes. Tous sont tués sans réveil pour prélever leur cerveau et mesurer les lésions laissées par le dispositif de refroidissement. Le bénéfice avancé, un système assez économe pour tenir sur une batterie implantable comparable à un pacemaker, reste à démontrer, quand les crises provoquées et les heures de contention sont acquises.

Objectifs

L’épilepsie, qui touche 1% de la population, constitue un problème de santé majeur. En dépit de nombreuses avancées thérapeutiques, seules 30% des épilepsies pharmaco-résistantes (celles qui ne répondent pas aux médicaments) sont opérables et cette option n’est envisageable que si le foyer épileptique se situe dans une zone accessible du cerveau Dans les autres cas, une autre approche thérapeutique alternative est l’arrêt des crises d’épilepsie par refroidissement du foyer épileptique. Ce phénomène, connu depuis les années 1930, a été validé chez le rongeur et testé chez le primate à l’aide de dispositifs de refroidissement appliqués à la surface du cerveau. Le présent projet a pour objectif d’appliquer cette principe de refroidissement uniquement au moment qui précède l’arrivée d’une crise épileptique sur un modèle de primate. La technique de refroidissement a l’avantage d’être réversible et d’être une procédure peu invasive, mais elle doit encore être affinée en vue d’une application thérapeutique. A ce jour, aucune étude n'a mis en évidence la possibilité d’utiliser la prédiction des crises d’épilepsie comme déclencheur du traitement en boucle fermée de l’épilepsie pharmaco-résistante. L’objectif scientifique de cette étude est donc de développer les algorithmes de prévision des crises épileptiques pour une administration en boucle fermée du refroidissement localisée. Ses algorithmes seront capables de détecter le risque de la émergence d’une crise d’épilepsie et de l’inhiber en activant un refroidissement localisé de la zone épileptogène.

Bénéfices attendus

A ce jour aucune étude n’a présenté une évidence incontestable que la prédiction où les pronostics des crises épileptiques est possible au-delà de l’occurrence par chance. Les pronostics générés vont produire des périodes de haute ou base probabilité d’occurrence des crises. Nous souhaitons tester l’efficacité des algorithmes via le refroidissement pendant ces périodes de haute probabilité des crises et non pas pendant les périodes de crises réels. L’hypothèse est que les effets du traitement vont être supérieurs s’ils sont appliqués en dehors des crises épileptiques convulsives déjà établies. Les bénéfices directs seront la réduction de la puissance nécessaire pour refroidir et le dosage de la quantité du froid à livrer. Avec une réduction de la quantité d’énergie nécessaire pour produire le froid, le système pourrait finalement être compatible avec une batterie implantable type « pacemaker ». Les rendements actuelles en utilisant une approche continue, ne permettent pas avoir une batterie implante à long terme. L’utilisation du refroidissement représente aussi un avantage considérable sur les systèmes actuels parce que son effet est plus important et rapide que la stimulation électrique. Les algorithmes vont être adaptés pour mieux répondre aux taches des pronostics des crises épileptiques. Ils vont être comparés à l’état de l’art et seront peu gourmands en consommation électrique. Ces algorithmes vont être évalués en utilisant un modèle de primates non humains épileptiques avec la possibilité d’optimiser les algorithmes dans le temps. Le refroidissement du foyer épileptogène est une manière efficace d’arrêter les crises, comme nous sommes en train de le démontrer dans nos études en cours. Ces modèles précliniques permettront de tester facilement l’efficacité des algorithmes pour prédire l’occurrence des crises et l’effet thérapeutique du refroidissement pendant les périodes de haut risque de crises. Les bénéfices attendus sont le développement des algorithmes de prévision des crises utilisables sur des systèmes en boucle fermée et aussi de valider l’hypothèse du départ sur la nécessité de diminuer le refroidissement pour aboutir à l’arrêt des crises.

Procédures

Imagerie par IRM : 1 à 2 d’une heure chacune ; Imagerie par CT scan : 1 de 30 minutes ; Radiographie X : 1 à 3 de 30 minutes ; Ventriculographie : 2 de 3 heures ; Chirurgie implantation : Implantation de dispositif, durée 8 heures ; Prélèvements sanguins : maximum 2 avec des prélèvements additionnels si complication infectieuse ; Séances d’enregistrement par condition :12 injections sans refroidissement, 12 injections avec refroidissement intermittent « aléatoire », 12 injections avec refroidissement en boucle fermée soit 36 au total chacun durant un maximum de 8 heures.

Impact sur les animaux

• Perte de poids post-opératoire : 7 jours • Douleur transitoire post opératoire : 1 jour • Stress pendant séance d’habituation : jusqu’à l’habituation • Position anormale (dos voûté) : post opératoire immédiat post anesthésie générale • Vocalisation anormale pendant la séance d’enregistrement : jusqu’à l’habituation • Signes neurologiques: parésie post opératoire transitoire : 5-7 jour post opératoire • Crises épileptiques post opératoires ou persistantes légères (mâchonnements, salivation, mouvements répétitives de tête) : 1-2 heures après séance pénicilline

Devenir

A la fin des expérimentations et à la suite d’une procédure sans réveil, nous allons euthanasier les animaux et prélever leur cerveau pour analyser le degré de lésion produit par le dispositif refroidissant et le refroidissement en vue d’un passage à un dispositif implantable chez l’homme.

Remplacement

Le remplacement des modèles animaux en générale et des modèles primates en particulier n’est pas possible pour atteindre les objectifs du projet. Les modèles in vitro comme les tranches de tissus cérébrale ne permettent pas de tester un implant préclinique complet qui a pour vocation de préfigurer le futur implant humain. Dans le projet, une partie des éléments de l’implant et certaines expérimentations ont pu être menées in vitro, notamment les tests de biocompatibilité permettant d’éviter l’utilisation d’animaux. Les primates non humains (PNH) sont les modèles idéaux pour tester les dispositifs cliniques pour l’épilepsie pour la similitude existante entre la structure du cerveau humain et celle du PNH. De plus, la génération des états épileptiques et des crises sont similaires aux phénomènes observés chez le patient épileptique

Réduction

Un nombre maximal de 6 primates non humain est estimé dans ce projet pour obtenir des résultats statistiquement fiables et exploitables du fait notamment de la variabilité interindividuelle. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, chaque animal sera son propre contrôle. L’analyse statistique sera effectuée par des tests non paramétriques appariés, afin de mesurer la différence des moyennes avant et après traitement sans présomption initiale d’une distribution normale de la population (précédés par des tests de normalité). Toutefois dans le respect de la règle de « réduction » des 3R, le nombre d’animaux pourra être réduit jusqu’au 50% si les résultats obtenus sur les premiers animaux ne sont pas concluants ce qui provoquera l’arrêt des expérimentations ou bien si l’effet est suffisamment important pour obtenir des résultats statistiquement fiables avec la première moitié des animaux. Tous les efforts seront faits par les expérimentateurs pour réduire le nombre d’animaux mis en expérimentation tout en permettant d’atteindre l’objective scientifique.

Raffinement

L’état clinique des animaux sera régulièrement observé. Dès que l’animal manifestera l’une de ces réactions négatives spécifiques leur surveillance sera renforcée: La surveillance renforcée consistera à trois observations par jour et pourra s’étendre à un accompagnement continu. Pendant cette mise en observation, le protocole de recherche sera interrompu et un protocole de soins sera mis en place. Le vétérinaire de l’installation sera alerté sans délai afin de décider de la mise en œuvre des traitements médicaux appropriés : 1. Traitement antidouleur dès les premiers signes de douleur. 2. Traitement Antiépileptique si nécessaire: 3. Anesthésie général pour tout soin, procédure chirurgicale, prise du sang ou imagerie. 4. Soins de la plaie chirurgicale post opératoire et suivi : si signes d’infection présentes, les soins locaux seront augmentés en fréquence et une thérapeutique antibiotique sera mise en place 5. Entrainement a la chaise de contention pédant au moins 1 mois. L’animal doit rester calmement assis sur la contention pour la durée de la séance. 6. Les primates qui ne reproduiront pas les crises attendues, seront sortis de l’étude par anticipation. Les animaux isolés gardent un contact tactile, visuel et olfactif avec leurs congénères ; l'enrichissement environnemental est augmenté (plus de jouets, friandises, ....) et les contacts avec les expérimentateurs accrus.

Choix des espèces

L’utilisation de primates non humains (PNH) dans l’étape finale d’évaluation préclinique est nécessaire avant un usage clinique chez l’Homme pour valider la sécurité et l’efficacité du dispositif. En effet, les PNH ont un cerveau semblable à l’Homme aussi bien sur le plan anatomique que fonctionnel (structure cellulaire, communication et connectivité neuronales, capacités cognitives etc…). En effet, un modèle alternatif ex vivo permettant d’obtenir toutes les données biologiques n’existe pas. De plus les PNH peuvent reproduire des crises d’épilepsie pharmaco résistantes similaires aux crises hippocampiques chez le patient. Notre protocole expérimental vise à arrêter les crises en utilisant des moyens implantables, comme dans un futur système clinique. Règlementairement, Le modèle animal peut être à l’origine d’essais expérimentaux nécessaires avant une expérimentation humaine. Les PNH servent donc, bien souvent, de tremplin avant une application chez l’homme. Les dispositifs médicaux implantables font l’objet de procédures d’évaluation rigoureuse avant de recevoir une autorisation de mise sur le marché. Depuis les années 80, dans tous les pays du Monde, sous la pression des politiques et de la société, une procédure, la « nouvelle approche », s’est progressivement imposée, qui codifie très précisément les différentes étapes de l’évaluation, in vitro, chez l’animal et en clinique pour permettre la mise sur le marché. Chacune de ces étapes, chacun des tests requis connaît des limites, mais au final, le système apparaît efficace, le nombre d’accidents étant particulièrement réduit, eu égard au nombre d’utilisation des dispositifs. Ce projet nécessite de travailler avec des animaux d’un âge supérieur à 40 mois et un poids de +/- 7-10 kg, afin de pouvoir faciliter la manipulation et l’entrainement comportemental des sujets adultes.

1 680 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent jusqu'à quatre injections de collagène et de lipopolysaccharide qui déclenchent une arthrite, et une partie d'entre elles des nanoparticules fluorescentes suivies de cinq séances d'imagerie sous anesthésie générale, à deux, six, dix-huit, vingt-quatre et quarante-huit heures, avec un transport en voiture entre deux établissements. L'enjeu est de savoir où ces nanoparticules se logent dans le corps et si la chaleur qu'elles dégagent sous infrarouge tue les cellules responsables de l'inflammation articulaire. Le porteur affirme que le recours à un modèle animal est "obligatoire", les études in vitro ne suffisant pas selon lui à conclure sur l'effet thérapeutique.

Objectifs

La polyarthrite rhumatoïde est une maladie auto-immune caractérisée par une inflammation chronique des articulations conduisant à une destruction de structures (cartilage, os) et une déformation articulaire. Aujourd’hui pour soulager les patients, des immunosuppresseurs (molécules inactivant la réponse immunitaire) sont souvent prescrits ; s’ils peuvent réussir à réduire l’inflammation locale ils ne sont pas spécifiques et sont donc responsables d’effets indésirables sur l’ensemble de l’organisme. Par ailleurs, aucun traitement aujourd’hui n’est suffisant pour induire une stabilisation complète et durable de la maladie. C’est pourquoi de nouvelles pistes de traitement émergent. En particulier, réussir à éliminer les cellules responsables de l’inflammation de l’articulation apparait comme une stratégie thérapeutique prometteuse. Dans ce contexte, notre objectif, dans ce projet multi-sites, est de cibler les cellules responsables de l’inflammation articulaire avec des nanoparticules aux propriétés photothermiques afin de les supprimer. En réponse à une stimulation lumineuse dans le proche infrarouge, les nanoparticules photothermiques produisent de la chaleur qui provoque la mort des cellules les ayant internalisées. Ainsi en développant des nanoparticules qui ne sont prises en charge que par les cellules pathologiques de l’arthrite puis en activant ces nanoparticules avec un rayonnement approprié nous pouvons espérer supprimer les cellules pathologiques et réduire les signes de la maladie. Il est important de noter que l’activation lumineuse est sans danger pour les tissus environnants et l’ensemble de l’organisme son impact serait ainsi restreint aux seules cellules pathologiques ayant internalisé les particules. Après une pré-sélection de nanoparticules candidates in vitro nous étudierons leur localisation dans l'organisme après leur administration (imagerie réalisée dans un établissement partenaire) et leurs propriétés thérapeutiques dans un modèle animal. Nous travaillerons avec un modèle utilisé depuis des décennies : l’injection de collagène chez la souris, provoquant le développement d’une maladie proche de la polyarthrite humaine. Les souris recevront ensuite des injections de nanoparticules qui seront rendues fluorescentes pour être suivies dans l'organisme ou qui seront activés avec un rayonnement lumineux avant de suivre, à l’aide d’une grille d’atteinte articulaire préétablie, l’évolution de la maladie et conclure sur un bénéfice thérapeutique.

Bénéfices attendus

Nos nanoparticules photothermiques ciblées aux cellules responsables de l’inflammation articulaire pourraient constituer une innovation thérapeutique qui enrichira l’arsenal des outils disponibles pour soigner l’arthrite. Seules ou en combinaison avec d’autres stratégies, nos nanoparticules pourraient permettre d’espérer à terme réussir à stabiliser chez les patients la progression de la maladie. Par ailleurs, notre stratégie thérapeutique de suppression par effet de photothermie de cellules inflammatoires (production de chaleur par les nanoparticules conduisant à la mort des cellules les ayant internalisées) est polyvalente puisque ces cellules sont impliquées dans d’autres maladies inflammatoires et auto-immunes. Ainsi, si notre stratégie se confirme prometteuse dans le contexte de la polyarthrite rhumatoïde nous pourrons envisager l’adapter et la transposer à d’autres maladies.

Procédures

Les animaux inclus dans cette étude recevront au plus : quatre injections (Etablissement utilisateur (EU) n°1) de réactifs induisant l'inflammation réalisées sous anesthésie d’une durée de 10 minutes et une autre injection (geste rapide de moins d’une minute) réalisée sans anesthésie. Ensuite, pour un premier groupe de souris après leur répartition dans un groupe de traitement, les animaux recevront une ou quatre injection(s) de nanoparticules thérapeutiques par voie intraveineuse sous anesthésie générale (Etablissement utilisateur (EU) n°1) d’une durée d’une minute complétée par une anesthésie locale au niveau du point d’injection. Chaque injection de nanoparticule sera suivie 20 heures plus tard de l’application, sous anesthésie générale, d’un rayonnement infrarouge de 10 minutes, non invasif (Etablissement utilisateur (EU) n°1). Afin de suivre la progression de la maladie, 2 fois par semaine, les animaux seront pesés, l’aspect des pattes sera surveillé et l’épaisseur des chevilles de pattes arrière mesurée. Pour suivre certains marqueurs de la maladie, 3 prélèvements de sang sont prévus sous anesthésie générale d’une durée de 10 minutes. En parallèle, pour un deuxième groupe de souris, des animaux, qui auront développé la maladie suite à l'injection du réactif induisant l'inflammation articulaire, recevront une injection de nanoparticules fluorescentes par voie intraveineuse sous anesthésie générale d’une durée d’une minute complétée par une anesthésie locale au niveau du point d’injection (Etablissement utilisateur (EU) n°1). Puis, un suivi, sous anesthésie générale, par imagerie (2h, 6h, 18h 24h et 48h) de la localisation des nanoparticules fluorescentes dans l'organisme sera réalisé (Etablissement utilisateur (EU) n°2).

Impact sur les animaux

1-Injections de collagène/lipopolysaccharide (LPS). Ces injections (induction de la pathologie) peuvent être source de stress et occasionner un oedème modéré et un inconfort transitoire (2 jours). Enfin, une lésion cutanée locale (type ulcère) peut apparaître. Ces injections sont responsables d’une inflammation au niveau des articulations et d’une réaction auto-immunitaire qui conduisent au développement progressif de la maladie. 2-Développement de l’arthrite. Si les premiers signes cliniques d’arthrite sont perçus par l’expérimentateur entre 21 et 28 jours après la première injection de collagène, le processus d’inflammation initié par les injections de collagène peut être source de souffrance pour l’animal dès le tout début de l’expérimentation. Les souris peuvent être sujettes à différents symptômes proches des manifestations humaines de la pathologie : les animaux peuvent souffrir d’inconfort, de douleur, de handicap et éprouver des difficultés à se déplacer (inflamamtion articulaire). La pathologie peut s’accompagner d’autres signes de mauvaise santé générale (pelage terne, perte de poids…). 3-Administration de nanoparticules et application locale d’un rayonnement proche infra-rouge. L’administration de nanoparticules sera réalisée par voie intraveineuse peuvt être source de stress. Elles seront réalisées par un personnel formé et habitué à effectuer le geste technique associé. L’application locale sur les articulations d’un rayonnement proche infrarouge 20 heures après l’injection des nanoparticules est nécessaire à leur activation. L’application du rayonnement ne devrait ni être source de souffrance pour l’animal ni responsable d’altérations des tissus environnants : seules les cellules ayant internalisé les nanoparticules photothermiques seront impactées par le rayonnement. Puissance du rayonnement choisie pour ne pas causer de lésions cutanée. 4- Prélèvements sanguins. Ils seront de volume adapté à leur fréquence pour laisser le temps à l’entièreté du volume sanguin de se régénérer entre deux prélèvements donc effet très limité sur la santé de l’animal. 5- Transport : Le transport entre les EU partenaires pourra générer un stress léger de courte durée (transport< 15min) 6- Suivi par imagerie des nanoparticules fluorescentes. Le dispositif d'imagerie est adapté à une utilisation préclinique, ne causera pas de souffrance, la fréquence de son utilisation (5 fois en 48h) est d'ailleurs inférieure à celle maximale recommandée (6 fois/24h).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure après la réalisation sous anesthésie d’un prélèvement sanguin terminal nécessaire pour analyser les effets de la nanoparticule candidate sur la progression de la maladie.

Remplacement

Des études in vitro seront réalisées pour sélectionner des nanoparticules candidates non toxiques. Ces études sont une première étape mais ne suffisent pas pour conclure sur l’effet thérapeutique des nanoparticules. En effet, le recours à un modèle animal dans lequel les cellules immunitaires interagissent de manière complexe au sein d’organes organisés est nécessaire. Il existe différents modèles d’arthrite (dont le modèle induit au collagène que nous avons choisi) qui se rapprochent de la pathologie humaine de la polyarthrite rhumatoïde. Le recours à ce genre de modèle animal est obligatoire car c’est un outil qui permet d’étudier les éventuels bénéfices thérapeutiques de la nanoparticule à différents niveaux (état général des animaux, apparence des articulations, analyses sanguines…).

Réduction

Le nombre de souris utilisées dans chaque groupe de ce projet a été réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats interprétables et reproductibles. Nous évaluerons dans une étude pilote quel protocole d’injection de collagène induit l’arthrite dans notre établissement avec une bonne incidence puis sur des animaux malades nous évaluerons l’efficacité du traitement par photothermie à l’aide de tests statistiques adaptés. Il est prévu de réaliser chaque protocole thérapeutique ou de suivi de la répartition dans l'organisme des nanoparticules fluorescence 4 fois afin de s’assurer que les effets observés soient constants et reproductibles d’une expérimentation à l’autre. Pour chaque condition testée, au plus 10 animaux seront inclus par expérimentations pour atteindre au plus 40 souris par groupe. Si dès la troisième répétition d’expérience des effets sont mis en évidence par les tests statistiques alors nous ne réaliserons pas la quatrième répétition, ce qui réduira le nombre d’animaux utilisés. Les résultats seront analysés à l’aide de tests statistiques adéquats qui permettront de mettre en évidence sur tous les paramètres étudiés des différences entre les groupes de souris et de conclure quant à l’efficacité thérapeutique du traitement photothermique.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans l'EUn°1, dans l'EUn°2 et pendant le transport par groupes dans des cages enrichies avec l’ajout de matériel de nidification et de bâtons à ronger. Pendant le transport (

Choix des espèces

Les souris (Mus musculus) sont des mammifères dont le système immunitaire est très proche du système immunitaire humain. Il existe par ailleurs chez la souris plusieurs modèles déjà établis d’arthrite dont les caractéristiques sont proches de la polyarthrite rhumatoïde humaine. En particulier le modèle d’induction de l’arthrite par injection de collagène chez des souris âgées de 6 à 8 semaines est un modèle largement utilisé. C’est ce modèle que nous mettrons en place dans cette étude.

Injectées de cellules cancéreuses, observées par imagerie sous anesthésie une à deux heures, opérées jusqu'à une heure, puis perfusées par le cœur, 1 860 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Les tumeurs pulmonaires forment des nodules qui peuvent causer douleurs, difficultés respiratoires, prostration et arrêt du toilettage, et les immunothérapies testées peuvent déclencher inflammation et auto-immunité comme chez l'être humain. Le porteur attend de ces travaux une meilleure connaissance du rôle de vaisseaux particuliers dans l'entrée des lymphocytes dans les tumeurs, et renvoie à plus long terme la proposition de nouvelles stratégies thérapeutiques. Toutes sont tuées pour prélever tumeurs et organes, ou à l'issue d'une chirurgie qui, écrit-il, ne permet pas de les réutiliser.

Objectifs

Les traitements par immunothérapie anti-cancéreuse ont révolutionné le traitement de nombreux cancers. Malheureusement, ces traitements ne sont pas efficaces chez tous les patients. Les vaisseaux à endothélium épais associés aux tumeurs (TA-HEV) sont des vaisseaux sanguins particuliers présents dans les tumeurs murines et humaines. Ils sont les portes d’entrées majeures des lymphocytes dans les tumeurs. Ces lymphocytes sont des cellules immunitaires capables de tuer les cellules cancéreuses. De plus, un traitement qui permet d'augmenter ces vaisseaux TA-HEV induit une meilleure réponse aux traitements par immunothérapie chez la souris. De nouveaux traitements par immunothérapie semblent prometteurs et l’objectif de ce projet est d’étudier le rôle des TA-HEV dans la réponse à ces traitements afin d'améliorer la prise en charge des patients atteints de cancer.

Bénéfices attendus

Nous attendons de ce projet d’une part de révéler dans le cadre de ces nouveaux traitements par immunothérapie le rôle des vaisseaux TA-HEV dans la réponse immune anti-tumorale . Ce projet permettra donc à court terme d’améliorer nos connaissances sur le rôle des vaisseaux TA-HEV et à plus long terme de proposer des nouvelles stratégies thérapeutiques basées sur la modulation des vaisseaux TA-HEV afin d’améliorer la prise en charge des patients atteints de cancers.

Procédures

Des animaux subiront une injection sous analgésie locale (1-2 minutes), puis quatre injections (environ 10 secondes par injection). Des animaux subiront une injection sous anesthésie (2- 3 minutes) ainsi que trois injections (environ 10 secondes par injection). Des animaux subiront en plus, 1 heure avant leur mise à mort, une injection sous analgésie locale (1-2 minutes). Des animaux seront anesthésiés puis subiront une chirurgie (1 heure maximum). Des animaux subiront sous anesthésie générale une perfusion intracardiaque. Des animaux seront observées par imagerie sous anesthésie générale (1 à 2 heures).

Impact sur les animaux

Pour les modèles de développement de tumeurs au niveau des poumons, l’injection des cellules tumorales peut induire une douleur modérée et la contention de l'animal pour cette injection peut entrainer du stress. L’évolution du cancer se manifeste par une apparition de nodules au niveau des poumons ce qui peut causer des douleurs, des difficultés respiratoires et une dégradation de l’état des animaux (absence de toilettage, prostration, lenteur dans les mouvements…). Pour les modèles de tumeurs développées, l’injection des cellules tumorales peut provoquer du stress chez l'animal. Le développement tumoral peut aussi causer des douleurs et une dégradation visible de l’état des animaux (absence de toilettage, prostration, lenteur dans les mouvements…). Les traitements d'immunothérapie peuvent avoir des effets indésirables identiques à ceux observés chez l'homme avec une inflammation et une auto-immunité.

Devenir

L’ensemble des animaux est mis à mort pour des prélèvements de tumeurs ou d’organes ou bien à l’issue d’une chirurgie couplée ou non à de la microscopie ne permettant pas de réutilisation des animaux.

Remplacement

Les procédures réalisées sur l’animal ne peuvent pas être remplacées par des méthodes expérimentales alternatives. En effet, il n’est pas possible à l’heure actuelle de mimer in vitro une réponse immunitaire anti tumorale de façon satisfaisante et l'induction de vaisseaux HEV n'est pas réalisable in vitro. Par conséquent, l’étude du recrutement des lymphocytes dans les tumeurs par les TA-HEV n’est actuellement possible qu’in vivo chez l’humain et l’animal.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé pour chaque expérience a été déterminé à partir de nos études antérieures et de la littérature scientifique. Il est de 15 animaux maximum pour chaque groupe afin d’avoir un nombre suffisant d’animaux pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives. Le projet est conçu avec une hiérarchie des procédures où la réalisation d’une procédure ultérieure n’est possible que si les résultats des procédures précédentes le justifient.

Raffinement

La stratégie de raffinement se base premièrement sur une connaissance approfondie du développement tumoral des modèles. Le suivi des animaux sera réalisé quotidiennement par les expérimentateurs ou les soigneurs spécialement formés pour le suivi de différents paramètres anticipant des points limites. Les méthodes d’expérimentation et d’hébergement sont optimisées pour réduire au maximum le stress et la douleur causés par les procédures. Notamment les injections qui sont réalisées sous anesthésie locale avec un matériel de contention dédié et optimisé pour ces injections. Les injections ont été optimisées pour réduire au maximum le temps de contention et le stress des animaux. Les chirurgies se font sous anesthésie générale avec une prise en charge de la douleur avec injection pré anesthésique d’un analgésique et avec un maintien de la température et de l'hydratation de l'animal. Enfin, les procédures mentionnées ont déjà été évaluées et font l’objet d’une réflexion continue sur de potentielles modifications pour réduire au maximum la douleur et le stress des animaux.

Choix des espèces

La souris est un organisme modèle génétiquement proche de l’être humain, ce qui en fait un modèle préclinique de choix très utilisé dans les domaines de la cancérologie et de l’immunologie. L'étude des HEV nécessite aussi l'utilisation d'un modèle mammifère, les ganglions lymphatiques n'étant apparus que tardivement au cours de l'évolution. De plus, quasiment toutes les expériences dont découle ce projet ont été menées chez la souris précedemment. Des souris âgées de 6 à 10 semaines seront utilisées car à ce stade, ces animaux ont un système immunitaire mature. De plus, il s’agit des stades de développement communément utilisés pour les modèles utilisés dans cette étude.

Quatre injections de collagène et de lipopolysaccharide provoquent chez les souris une arthrite qui peut s'accompagner de douleur, de handicap et de difficultés à se déplacer. 1 680 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, avec ensuite jusqu'à quatre injections intraveineuses de nanoparticules, autant de séances de rayonnement infrarouge et trois prélèvements de sang sous anesthésie. Le porteur écrit que l'activation lumineuse est sans danger et que le rayonnement ne devrait pas faire souffrir l'animal, tout en précisant qu'aucun antidouleur ne pourra être administré parce qu'il risquerait de fausser les résultats. Toutes sont tuées à la fin, après un prélèvement sanguin terminal.

Objectifs

La polyarthrite rhumatoïde est une maladie auto-immune caractérisée par une inflammation chronique des articulations conduisant à une destruction de structures (cartilage, os) et une déformation articulaire. Aujourd’hui pour soulager les patients, des immunosuppresseurs (molécules inactivant la réponse immunitaire) sont souvent prescrits ; s’ils peuvent réussir à réduire l’inflammation locale ils ne sont pas spécifiques et sont donc responsables d’effets indésirables sur l’ensemble de l’organisme. Par ailleurs, aucun traitement aujourd’hui n’est suffisant pour induire une stabilisation complète et durable de la maladie. C’est pourquoi de nouvelles pistes de traitement émergent. En particulier, réussir à éliminer les cellules responsables de l’inflammation de l’articulation apparait comme une stratégie thérapeutique prometteuse. Dans ce contexte, notre objectif, dans ce projet multi-sites, est de cibler les cellules responsables de l’inflammation articulaire avec des nanoparticules aux propriétés photothermiques afin de les supprimer. En réponse à une stimulation lumineuse dans le proche infrarouge, les nanoparticules photothermiques produisent de la chaleur qui provoque la mort des cellules les ayant internalisées. Ainsi en développant des nanoparticules qui ne sont prises en charge que par les cellules pathologiques de l’arthrite puis en activant ces nanoparticules avec un rayonnement approprié nous pouvons espérer supprimer les cellules pathologiques et réduire les signes de la maladie. Il est important de noter que l’activation lumineuse est sans danger pour les tissus environnants et l’ensemble de l’organisme son impact serait ainsi restreint aux seules cellules pathologiques ayant internalisé les particules. Après une pré-sélection de nanoparticules candidates in vitro nous étudierons leur localisation dans l'organisme après leur administration (imagerie réalisée dans un établissement partenaire) et leurs propriétés thérapeutiques dans un modèle animal. Nous travaillerons avec un modèle utilisé depuis des décennies : l’injection de collagène chez la souris, provoquant le développement d’une maladie proche de la polyarthrite humaine. Les souris recevront ensuite des injections de nanoparticules qui seront rendues fluorescentes pour être suivies dans l'organisme ou qui seront activés avec un rayonnement lumineux avant de suivre, à l’aide d’une grille d’atteinte articulaire préétablie, l’évolution de la maladie et conclure sur un bénéfice thérapeutique.

Bénéfices attendus

Nos nanoparticules photothermiques ciblées aux cellules responsables de l’inflammation articulaire pourraient constituer une innovation thérapeutique qui enrichira l’arsenal des outils disponibles pour soigner l’arthrite. Seules ou en combinaison avec d’autres stratégies, nos nanoparticules pourraient permettre d’espérer à terme réussir à stabiliser chez les patients la progression de la maladie. Par ailleurs, notre stratégie thérapeutique de suppression par effet de photothermie de cellules inflammatoires (production de chaleur par les nanoparticules conduisant à la mort des cellules les ayant internalisées) est polyvalente puisque ces cellules sont impliquées dans d’autres maladies inflammatoires et auto-immunes. Ainsi, si notre stratégie se confirme prometteuse dans le contexte de la polyarthrite rhumatoïde nous pourrons envisager l’adapter et la transposer à d’autres maladies.

Procédures

Les animaux inclus dans cette étude recevront au plus : quatre injections (Etablissement utilisateur (EU) n°1) de réactifs induisant l'inflammation réalisées sous anesthésie d’une durée de 10 minutes et une autre injection (geste rapide de moins d’une minute) réalisée sans anesthésie. Ensuite, pour un premier groupe de souris après leur répartition dans un groupe de traitement, les animaux recevront une ou quatre injection(s) de nanoparticules thérapeutiques par voie intraveineuse sous anesthésie générale (Etablissement utilisateur (EU) n°1) d’une durée d’une minute complétée par une anesthésie locale au niveau du point d’injection. Chaque injection de nanoparticule sera suivie 20 heures plus tard de l’application, sous anesthésie générale, d’un rayonnement infrarouge de 10 minutes, non invasif (Etablissement utilisateur (EU) n°1). Afin de suivre la progression de la maladie, 2 fois par semaine, les animaux seront pesés, l’aspect des pattes sera surveillé et l’épaisseur des chevilles de pattes arrière mesurée. Pour suivre certains marqueurs de la maladie, 3 prélèvements de sang sont prévus sous anesthésie générale d’une durée de 10 minutes. En parallèle, pour un deuxième groupe de souris, des animaux, qui auront développé la maladie suite à l'injection du réactif induisant l'inflammation articulaire, recevront une injection de nanoparticules fluorescentes par voie intraveineuse sous anesthésie générale d’une durée d’une minute complétée par une anesthésie locale au niveau du point d’injection (Etablissement utilisateur (EU) n°1). Puis, un suivi, sous anesthésie générale, par imagerie (2h, 6h, 18h 24h et 48h) de la localisation des nanoparticules fluorescentes dans l'organisme sera réalisé (Etablissement utilisateur (EU) n°2).

Impact sur les animaux

1-Injections de collagène/lipopolysaccharide (LPS). Ces injections (induction de la pathologie) peuvent être source de stress et occasionner un oedème modéré et un inconfort transitoire (2 jours). Enfin, une lésion cutanée locale (type ulcère) peut apparaître. Ces injections sont responsables d’une inflammation au niveau des articulations et d’une réaction auto-immunitaire qui conduisent au développement progressif de la maladie. 2-Développement de l’arthrite. Si les premiers signes cliniques d’arthrite sont perçus par l’expérimentateur entre 21 et 28 jours après la première injection de collagène, le processus d’inflammation initié par les injections de collagène peut être source de souffrance pour l’animal dès le tout début de l’expérimentation. Les souris peuvent être sujettes à différents symptômes proches des manifestations humaines de la pathologie : les animaux peuvent souffrir d’inconfort, de douleur, de handicap et éprouver des difficultés à se déplacer (inflamamtion articulaire). La pathologie peut s’accompagner d’autres signes de mauvaise santé générale (pelage terne, perte de poids…). 3-Administration de nanoparticules et application locale d’un rayonnement proche infra-rouge. L’administration de nanoparticules sera réalisée par voie intraveineuse peuvt être source de stress. Elles seront réalisées par un personnel formé et habitué à effectuer le geste technique associé. L’application locale sur les articulations d’un rayonnement proche infrarouge 20 heures après l’injection des nanoparticules est nécessaire à leur activation. L’application du rayonnement ne devrait ni être source de souffrance pour l’animal ni responsable d’altérations des tissus environnants : seules les cellules ayant internalisé les nanoparticules photothermiques seront impactées par le rayonnement. Puissance du rayonnement choisie pour ne pas causer de lésions cutanée. 4- Prélèvements sanguins. Ils seront de volume adapté à leur fréquence pour laisser le temps à l’entièreté du volume sanguin de se régénérer entre deux prélèvements donc effet très limité sur la santé de l’animal. 5- Transport : Le transport entre les EU partenaires pourra générer un stress léger de courte durée (transport< 15min) 6- Suivi par imagerie des nanoparticules fluorescentes. Le dispositif d'imagerie est adapté à une utilisation préclinique, ne causera pas de souffrance, la fréquence de son utilisation (5 fois en 48h) est d'ailleurs inférieure à celle maximale recommandée (6 fois/24h).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure après la réalisation sous anesthésie d’un prélèvement sanguin terminal nécessaire pour analyser les effets de la nanoparticule candidate sur la progression de la maladie.

Remplacement

Des études in vitro seront réalisées pour sélectionner des nanoparticules candidates non toxiques. Ces études sont une première étape mais ne suffisent pas pour conclure sur l’effet thérapeutique des nanoparticules. En effet, le recours à un modèle animal dans lequel les cellules immunitaires interagissent de manière complexe au sein d’organes organisés est nécessaire. Il existe différents modèles d’arthrite (dont le modèle induit au collagène que nous avons choisi) qui se rapprochent de la pathologie humaine de la polyarthrite rhumatoïde. Le recours à ce genre de modèle animal est obligatoire car c’est un outil qui permet d’étudier les éventuels bénéfices thérapeutiques de la nanoparticule à différents niveaux (état général des animaux, apparence des articulations, analyses sanguines…).

Réduction

Le nombre de souris utilisées dans chaque groupe de ce projet a été réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats interprétables et reproductibles. Nous évaluerons dans une étude pilote quel protocole d’injection de collagène induit l’arthrite dans notre établissement avec une bonne incidence puis sur des animaux malades nous évaluerons l’efficacité du traitement par photothermie à l’aide de tests statistiques adaptés. Il est prévu de réaliser chaque protocole thérapeutique ou de suivi de la répartition dans l'organisme des nanoparticules fluorescence 4 fois afin de s’assurer que les effets observés soient constants et reproductibles d’une expérimentation à l’autre. Pour chaque condition testée, au plus 10 animaux seront inclus par expérimentations pour atteindre au plus 40 souris par groupe. Si dès la troisième répétition d’expérience des effets sont mis en évidence par les tests statistiques alors nous ne réaliserons pas la quatrième répétition, ce qui réduira le nombre d’animaux utilisés. Les résultats seront analysés à l’aide de tests statistiques adéquats qui permettront de mettre en évidence sur tous les paramètres étudiés des différences entre les groupes de souris et de conclure quant à l’efficacité thérapeutique du traitement photothermique.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans l'EUn°1, dans l'EUn°2 et pendant le transport par groupes dans des cages enrichies avec l’ajout de matériel de nidification et de bâtons à ronger. Pendant le transport (

Choix des espèces

Les souris (Mus musculus) sont des mammifères dont le système immunitaire est très proche du système immunitaire humain. Il existe par ailleurs chez la souris plusieurs modèles déjà établis d’arthrite dont les caractéristiques sont proches de la polyarthrite rhumatoïde humaine. En particulier le modèle d’induction de l’arthrite par injection de collagène chez des souris âgées de 6 à 8 semaines est un modèle largement utilisé. C’est ce modèle que nous mettrons en place dans cette étude.