Procédures sévères
Prévention du sepsis par intervention pharmacologique dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
Pour tester si l'inhibition de modulateurs de l'autophagie prévient le sepsis, 2 430 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 810 d'entre elles et sévère pour 1 620. Chaque animal subit une ligature et ponction du cæcum, une chirurgie d'environ vingt minutes qui déclenche une infection généralisée, puis reçoit quatre ou cinq injections, une mesure de pression artérielle et une échocardiographie sous anesthésie. Le porteur énumère les atteintes attendues du sepsis, dysfonction d'organes, hypotension, altération de la coagulation et de la thermorégulation, et prévoit une chirurgie terminale pour une partie des souris. Il annonce un score de sepsis murin pour fixer les points limites avant que l'animal ne se retrouve en sepsis sévère, alors que 1 620 souris sont déjà déclarées en souffrance sévère.
Objectifs
La septicémie est la complication la plus grave des infections. Elle peut survenir de manière imprévisible lors de n'importe quelle infection bactérienne ou virale. Le sepsis se développe en raison d'une dysrégulation des défenses de l'organisme contre l'infection, entrainant le plus souvent un excès d'inflammation qui, à son tour, perturbe le fonctionnement des différents organes (https solidaires-sante.gouv.fr). Nous avons démontré, in vitro et in vivo, que des modulateurs de l'autophagie (processus naturel que les cellules de notre corps utilisent pour nettoyer et recycler leurs composants endommages ou inutiles), libérés par les cellules et les organes, sont impliqués dans un réflexe primitif de la faim, stimulant le comportement alimentaire par des mécanismes périphériques. L'inhibition de ces modulateurs, chez la souris, induit la perte de poids et réduit l'apport alimentaire. Nous avons également démontré que la neutralisation de ces modulateurs induit l'activation du flux autophagique dans des modèles de toxicité chronique du foie. Sur la base de ces observations, l'objectif de ce projet est de déterminer si l'inhibition de ces modulateurs de l'autophagie peut prévenir la septicémie chez un modèle murin approprie, la ligature et ponction du caecum (CLP).
Bénéfices attendus
Chaque année, le sepsis frappe près de 50 millions de personnes à travers le monde, affectant plus de 40% d'entre elles qui sont des enfants de moins de 5 ans. Bien que le sepsis impacte de manière significative les nations pauvres et émergentes, il demeure également l'une des principales causes de décès dans les pays développés. Globalement, le sepsis est responsable de plus de 11 millions de décès annuels, avec la particularité que la majorité de ces tragédies pourrait être évitée. En Europe, le sepsis est estimé causer près de 700 000 décès chaque année, dont environ 57 000 en France. Ce projet revêt une importance cruciale, car il vise à valider une nouvelle stratégie thérapeutique contre le sepsis dans un modèle préclinique exhaustif, reproduisant fidèlement l'évolution clinique de la maladie. En parallèle, il offrira une opportunité précieuse pour approfondir notre compréhension des mécanismes physiopathologiques liés au sepsis, qui demeurent insuffisamment caractérisés jusqu'à présent.
Procédures
Tous les animaux du projet seront soumis une seule fois à une chirurgie induisant le sepsis, via la ligature et ponction du cæcum (CLP; durée environ 20 minutes/souris). L’acte chirurgical sera réalisé sous anesthésie et analgésie. Tous les animaux recevront des injections sous-cutanées (quelques secondes). Tous les traitements seront administrés par voie intra-péritonéale, sous cutanée ou intra-veineuse. Selon les procédures chaque animal recevra soit 5 ou 4 injections (quelques secondes). L'injection intraveineuse sera effectuée en plaçant l'animal dans un dispositif de contention et la procédure durera moins d'une minute. L'examen non invasif de la pression artérielle sera effectué sans anesthésie et durera environ 15 minutes. L'échocardiographie nécessite une anesthésie légère et dure environ 15 minutes. Les trois dernières techniques décrites sont des procédures « légères » au cours desquelles les animaux sont soumis à un stress minimal de courte durée. Une partie des animaux subira une chirurgie terminale sous anesthésie et analgésie d’une durée de 20 minutes et seront euthanasiés sans réveil. Les prélèvements seront effectués après l’euthanasie des animaux.
Impact sur les animaux
Des infections pourraient se produire au niveau des sites des injections. Les souris qui seront soumises aux injections subiront un stress lié à la contention de courte durée. Tous les animaux du projet seront soumis à une chirurgie induisant le sepsis, via la ligature et ponction du cæcum (CLP) qui sera effectuée sous anesthésie et analgésie. Les nuisances/effets indésirables induits par le sepsis peuvent être : Inflammation systémique, dysfonction d'organes, altération de la coagulation, hypotension, altération de la barrière intestinale ; dysfonction immunitaire et l’altération de la thermorégulation. Les sites des injections ou le site d'incision chirurgicale pourraient s’infecter. Il pourrait y avoir une mauvaise cicatrisation de la plaie chirurgicale. Une dessiccation des tissus et un inconfort pourraient être observés. L'anesthésie peut entraîner différents effets indésirables comme une dépression respiratoire, une hypothermie, et des troubles du réveil.
Devenir
Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.
Remplacement
Le sepsis est le résultat d'une réponse immunitaire incontrolée à une infection. Cette situation découle d'une série d'événements complexes, comprenant l'activation des cellules immunitaires et la libération de cytokines, l'activation des voies de coagulation, ainsi qu'un dysfonctionnement endothélial, qui ensemble contribuent à la défaillance d'organes. Actuellement, il est impossible de reproduire de manière fidèle en laboratoire la complexité et les conséquences du sepsis. C'est pourquoi l'utilisation d'animaux vivants demeure impérative pour étudier cette pathologie.
Réduction
Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 2430 souris. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront réalisés afin d’avoir une interprétation fiable des résultats. L’étude sera arrêtée si la procédure initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum ; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (anesthésie/analgésie des animaux, utilisation de lampes chauffantes...). Les animaux seront observés régulièrement afin de respecter leur bien-être. Le comportement général des animaux sera suivi. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces, seront appliqués afin de limiter la douleur des animaux à leur minimum. Le MSS ou score de sepsis murin sera utilisé pour évaluer l'état clinique des souris atteintes d'un sepsis. Nous nous baserons sur ce score pour définir nos point limites avant que l’animal se retrouve dans un état de sepsis sévère. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques : - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Nous utiliserons des souris immunocompétentes. Les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.
Oncologie : modèles d’étude précliniques de cachexie
- Recherche appliquée
- Cancers
Rats : 600
1 200 souris et 600 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent des injections de cellules tumorales sous anesthésie, puis des substances administrées jusqu'à quatre fois par jour, des mesures de poids et de tumeur jusqu'à trois fois par semaine, une imagerie hebdomadaire et, le cas échéant, jusqu'à sept séances de radiothérapie par semaine pendant quatre semaines. Le porteur annonce une période maximale de nuisance de un à deux jours et écrit que la distension de la peau par la tumeur n'est associée ni à des douleurs ni à des démangeaisons, dans un projet dont l'ensemble des procédures est classé sévère. L'objet réel est d'induire une cachexie chez ces rongeurs puis d'évaluer sur eux des substances déjà décrites comme anti-cancéreuses ou anti-cachexie, et de produire des modèles pour des études de pharmacologie ultérieures.
Objectifs
Le cancer est un problème de santé publique majeur et représente la deuxième cause de décès dans le monde. On estime que près de la moitié des patients atteints de cancer développent un syndrome de cachexie, pouvant être associé à de l’anorexie, résultant en une perte progressive de tissu adipeux et de masse musculaire. La cachexie est un syndrome inflammatoire sévère et a un impact conséquent sur la qualité de vie des patients et même leur survie. En effet, on estime à environ 20% la mortalité directe induite par une cachexie chez les patients atteints d'un cancer. De plus, certains traitements anti-cancéreux, comme les chimiothérapies ou d’autres molécules, peuvent elle-même induire un syndrome de cachexie. Cette problématique de santé publique nécessite de mettre en place des modèles d’étude pertinents afin de pouvoir proposer des solutions adaptées d’un point de vue thérapeutique. Les modèles animaux de cancer demeurent des éléments critiques dans la compréhension de la physiopathologie du cancer, l’identification de nouveaux candidats médicaments et la compréhension des mécanismes de résistance. L’objectif est d’induire une cachexie chez des rongeurs par des traitements anticancéreux ou par l’’administration des cellules tumorales afin de pouvoir évaluer des traitements permettant de contrer ces nuisances.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de valider des substances pharmacologiques décrites comme anti-cancéreuses ou anti-cachexie dans différentes indications tumorales. Ce projet permettra aussi d’évaluer de nouvelles molécules avec un fort potentiel anti-tumoral. En effet, à l'heure actuelle, il n'existe pas de traitements curatifs pour lutter contre la cachexie induite par des tumeurs ou médicamenteuse. De plus, il permettra aussi d'évaluer l'expression de certains biomarqueurs en amont d'une étude de pharmacologie ou de générer des modèles animaux.
Procédures
Les animaux subiront une anesthésie d’environ 5 min pendant laquelle ils subiront une injection rapide (
Impact sur les animaux
La croissance de la tumeur peut dans certains cas s’associer à une perte d'activité normale à travers une diminution de la locomotion, en particulier si la tumeur atteint les points limites. Cependant la période maximale de nuisance sera de 1 à 2 jours. L’évolution du volume tumoral entrainera une distension de la peau, n’étant pas associée à des douleurs ou démangeaisons. Il est aussi possible, que la progression tumorale entraîne une perte de poids. Les traitements (administration orales, injections, application topique) pourront induire un stress léger. Les mesures de poids et de volume tumoral nécessitent une contention et pourraient entraîner un stress léger, et qui diminue avec l’habituation. Le jour de la randomisation, les animaux seront mis avec de nouveaux congénères pouvant engendrer un stress de 1-2 jours.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin d’étude car les animaux présentent des tumeurs ou une cachexie importante non traitable. Cela ne permet pas un maintien des animaux en vie dans de bonnes conditions de santé.
Remplacement
Ce modèle ne peut pas être remplacé par des méthodes alternatives car l'induction de tumeur ou l’administration de substances s'accompagne de modifications physiopathologiques et micro-environnementales spécifiques ne pouvant actuellement pas être reproduites in-vitro, ces modifications étant nécessaires pour l'étude d'efficacité d'anticancéreux ou de solutions nutritive ou anti-cachexie. De plus, les traitements utilisés subissent toutes les différentes phases incluant administration, distribution, métabolisme et élimination, étapes ne pouvant être reproduites in-vitro.
Réduction
Des analyses in-vitro pourront être réalisées en amont de l'étude permettent de sélectionner des lignées/types de cellules présentant une sensibilité à la substance d'essai afin de limiter le nombre d'animaux. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque test sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet, la comparaison par rapport à une substance de référence, et un effectif suffisant de façon à obtenir une puissance statistique suffisante pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des tests. Dans cet objectif, une analyse sera réalisée afin d’estimer le nombre d’animaux nécessaire pour observer une diminution du volume tumoral mesuré d'au moins 50%.
Raffinement
Le raffinement des méthodes expérimentales afin de réduire au maximum la souffrance animale est mis en œuvre grâce à l'utilisation de points limites clairement établis, permettant d'euthanasier tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse. Le programme d’anesthésie, d’analgésie et d'asepsie (incluant oxygène à concentration ajustable et des tapis chauffants) est défini en accord avec un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. Il est aussi mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de jouets, litière, objets de nidification, objets à ronger ou mastiquer, présence de congénères... En cas de doute, une évaluation approfondie sera réalisée quotidiennement jusqu’à normalisation ou jusqu’à atteinte des points limites. Tous les points limites et leur cotation sont décrits dans un formulaire interne. Cette observation inclut une surveillance de l'aspect général, l’aspect du pelage, des yeux, la posture, les réactions de l’animal sous stimulation, la respiration l’appétit, l’état d’hydratation, les tremblements ou convulsions… Une évaluation interne incluant la cellule de bien-être animal pourra permettre de réévaluer et d’adapter à posteriori la catégorie si nécessaire.
Choix des espèces
Les rongeurs rats et souris demeurent essentiel pour étudier les tumeurs in vivo et comprendre les mécanismes moléculaires de la pathogenèse du cancer. En effet, les tumeurs présentent une accumulation de multiples aberrations génétiques qui transforment les cellules, entraînant une croissance anormale, une prolifération et des métastases des cellules. Il n’est pas possible de reproduire ces éléments in vitro car requiert un système complexe comme les modèles animaux. La majorité des animaux seront utilisés à partir de 5 semaines développement que ce soit des rats ou des souris. À ce stade, leur système immunitaire et métabolique est suffisamment développé, ce qui permet d'observer les effets de la cachexie sans interférences dues à une immaturité ou à des modifications métaboliques liées à l'âge. Dans certains cadres, les animaux pourront être utilisés avant sevrage pour des modèles génétiques ou de tumeurs pédiatriques.
De nouveaux régulateurs impliqués dans l’établissement de la tolérance immunitaire dans le thymus
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
La paralysie part de la queue et remonte le long de la moelle épinière, et le porteur limite la procédure à trente jours pour cette raison. 660 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère, dont 570 en sévère, toutes tuées pour analyse. Elles reçoivent des injections sous-cutanées et intraveineuses sous anesthésie gazeuse pour induire une sclérose en plaques, ou des cellules tumorales injectées sur chaque flanc suivies de quatre injections de traitement, avec une mesure quotidienne des tumeurs et une mise à mort au vingt-et-unième jour parce que le modèle devient létal au-delà de trente jours. L'objectif déclaré est d'identifier deux régulateurs de l'éducation des lymphocytes T, avec un bénéfice renvoyé au conditionnel face à une immunothérapie qui, selon le porteur, n'est efficace que chez 20 % des patients.
Objectifs
Les lymphocytes T sont un sous-type de globules blancs qui combattent les virus, les bactéries ou encore les cancers. Ces lymphocytes sont éduqués à ne pas reconnaître nos propres tissus comme des éléments étrangers dans un organe du système immunitaire appelé le thymus. Des dérégulations dans leur éducation peuvent conduire à des maladies auto-immunes comme la sclérose en plaques ou le diabète de type 1, mais également impacter l’efficacité de la réponse antitumorale. Dans le thymus, les cellules épithéliales médullaires thymiques, appelées mTEC, sont critiques à l’éducation des lymphocytes T. L’identification de régulateurs de l'éducation des lymphocytes T constitue un défi majeur pour améliorer notre compréhension des mécanismes impliqués dans la protection contre les maladies auto-immunes et les cancers. Dans ce contexte, notre équipe a identifié deux nouveaux régulateurs associés au développement de la sclérose en plaques. Nous avons alors émis l’hypothèse que ces facteurs pourraient contribuer à l’éducation des lymphocytes T. Notre projet visera à 1) caractériser le rôle de ces facteurs dans la protection contre des pathologies auto immunes à l’aide d’un modèle murin de sclérose en plaques ; 2) analyser l’impact de ces facteurs sur l'éducation des lymphocytes T et 3) déterminer l’impact de la déficience de ces facteurs sur la réponse antitumorale. En résumé, l’ensemble de ces travaux de recherche permettra de mettre en évidence la fonction de ces nouveaux facteurs clé dans la protection contre des maladies auto-immunes et l’éradication des tumeurs.
Bénéfices attendus
Les maladies auto-immunes touchent 5 à 10% de la population mondiale. Cependant, face à la complexité de ces maladies, il n’existe actuellement aucun traitement permettant de guérir les patients atteints. Par ailleurs, un défaut d’éducation des lymphocytes T peut également impacter l’efficacité de la réponse antitumorale. La stratégie actuelle utilisée pour booster la réponse des lymphocytes T contre la tumeur est basée sur l’utilisation d’anticorps : l’immunothérapie. Cependant, elle n’est efficace que chez seulement 20% des patients. Identifier les régulateurs de l'éducation des lymphocytes T pourrait constituer une nouvelle stratégie pour améliorer l’éradication des tumeurs et la protection contre les maladies auto-immunes. Ce projet pourrait démontrer que ces régulateurs sont critiques dans la lutte contre des maladies auto-immunes comme la sclérose en plaques et à plus long terme pourrait orienter les médecins vers des tests génétiques plus précis pour un meilleur diagnostic. De plus, ces régulateurs pourraient être impliqués dans l’efficacité de la réponse anti tumorale dans des contextes de tumeurs comme le mélanome ou le fibrosarcome. Notre approche de ciblage de ces régulateurs en combinaison avec une immunothérapie basée sur l’utilisation d’anticorps devrait améliorer l’efficacité des agents thérapeutiques pour améliorer la réponse anti tumorale.
Procédures
Les animaux recevront une injection sous cutanée sous anesthésie gazeuse générale combinée a une injection sous cutanée d’analgésique (3 minutes par animal). Pour le protocole de sclérose en plaque, ces souris recevront en plus deux injections intraveineuse (3 minutes par animal) sous anesthésie gazeuse générale. Pour les deux types de tumeurs, les souris recevront sur chaque flanc des cellules tumorales par injection sous-cutanée sous anesthésie gazeuse générale (2 injections simultanées, pour une intervention d’environ 3 minutes par animal). Les souris recevront également 4 injections intra-péritonéales de traitement anti-tumoral (30 secondes par injection). Les tumeurs seront mesurées tous les jours post-injection sous anesthésie gazeuse générale (2 minutes par animal).
Impact sur les animaux
Les injections sous-cutanées et intraveineuses seront réalisées sous anesthésie générale légère par anesthésie gazeuse générale minimisant le stress, l'inconfort et la douleur liés à ces injections. Concernant le modèle de sclérose en plaque, la maladie peut générer des nuisances importantes caractérisées par la paralysie progressive de l’animal en commençant par la queue et remontant le long de la moelle épinière. Pour limiter la durée de souffrance des animaux, ces derniers seront suivis quotidiennement et la procédure n’excèdera pas les 30 jours. Concernant le modèle de sclérose en plaques ainsi que l’immunisation, l’injection sous-cutanée peut éventuellement générer une inflammation locale, qui sera surveillée attentivement de manière quotidienne. La probabilité d’apparition de ces nuisances et leur intensité sont susceptibles d’augmenter progressivement au cours de la procédure et devront être contrôlés. Concernant les modèles de cancer, la maladie peut générer des nuisances caractérisées par un inconfort, une douleur prolongée. Ce modèle pouvant être létal au-delà de 30 jours, les souris seront suivies, mises à mort et analysées à un temps de 21 jours dans le cadre de ce projet. Les nuisances possibles sont : un stress lié à la manipulation, une perte de poids, une gêne à la mobilité, une douleur.
Devenir
Les animaux d'intérêt générés seront mis à mort pour l'analyse à la fin des procédures.
Remplacement
A ce jour, aucune alternative non animale ne permet d’étudier la tolérance immunitaire et les cellules épithéliales thymiques. De plus, cette étude prend place dans un contexte pathologique, à savoir les pathologies auto-immunes et le cancer dans notre cas. Notre projet nécessite une approche in vivo afin de mettre en relation les différentes composantes tissulaires et cellulaires impliquées dans la réponse étudiée.
Réduction
Nous essaierons autant que possible de réduire le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la reproductibilité et la fiabilité des résultats. Le choix du nombre animaux est réalisé en prenant en considération la variabilité interindividuelle, la variabilité de réponse au traitement antitumoral et la variabilité de prise et de pousse des cellules tumorales afin de réduire le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la reproductibilité et la fiabilité des résultats. Ainsi, des cohortes de 4 à 5 animaux par groupe, selon les procédures, seront utilisées avec un total de trois expériences indépendantes. Afin de réduire le nombre de souris contrôles utilisées, un maximum de groupes différents seront constitués lors d’une même expérience. Afin d’éviter les biais expérimentaux, les animaux seront randomisés en aveugle dans les différents groupes de traitement par un expérimentateur tiers.
Raffinement
Afin de réduire les nuisances, plusieurs mesures seront prises. Du coton pour confectionner des nids est introduit dans chaque cage. Les animaleries bénéficient d'une température régulée à 21°C, d'une hygrométrie contrôlée, ainsi que d'une photopériode contrôlée. Concernant le stress de manipulation, les animaux seront manipulés par un seul expérimentateur par lignée sauf pour l’étape de randomisation dans les groupes. Les animaux seront soumis à une anesthésie gazeuse générale avant chaque injection et mesure. Les animaux bénéficieront par ailleurs d’une surveillance quotidienne dès le début des procédures expérimentales afin d’identifier tout signe de gêne ou de douleur à l’aide d’une grille d’évaluation, à l’apparition de signes de douleurs des analgésiques seront administrés. En cas de faiblesse pouvant altérer la prise alimentaire ou de perte de poids importante, une alimentation hydratée spécifique sera déposée dans le fond de la cage. Dans le cas du modèle de sclérose en plaques, les souris seront suivies quotidiennement et l’avancement de la pathologie sera mesuré à l’aide d’une grille constatant le niveau de paralysie de l’animal pouvant induire une augmentation de la surveillance à deux fois par jour.
Choix des espèces
L’espèce murine a permis de développer de nombreux modèles génétiquement modifiés. La génétique de la souris est bien connue et étudiée depuis longtemps. De plus, la souris est le modèle de base pour étudier le système immunitaire et en particulier le thymus. Ce modèle animal couramment utilisé permet grâce à des techniques d’ingénierie génétique de cibler un gène précis dans un type cellulaire spécifique afin d’étudier sa fonction. Les souris seront utilisées entre 6 et 12 semaines, correspondant à un stade développemental de jeune adulte. A ce stade, le thymus des souris est pleinement développé et atteint sa taille et sa fonctionnalité maximale.
Effet de l’inhibition spécifique d’Ezh2 sur la calcification valvulaire aortique
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Privés des cinq sixièmes de leurs reins en trente minutes d'opération, contrôlés quatre semaines plus tard par prélèvement sanguin pour vérifier que l'insuffisance rénale s'est bien installée, puis gavés et échographiés cinq fois, 315 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère. La néphrectomie concerne 288 d'entre eux et le porteur la classe sévère, avec une perte de poids attendue après l'opération. L'objectif déclaré est de tester si le blocage d'une enzyme, Ezh2, ralentit la calcification de la valve aortique, sur la base de résultats obtenus in vitro et non publiés. Les rats qui perdent 20 % de leur poids ou dont le score de suivi dépasse 5 sont tués par surdose anesthésique, les autres à l'issue du protocole pour le prélèvement de leurs organes.
Objectifs
Le rétrécissement aortique calcifié (RAC) est la valvulopathie la plus fréquente dans les pays occidentaux et sa prévalence augmente avec l’âge. Elle est caractérisée par une calcification progressive des tissus de la valve aortique. Cependant, il n’existe actuellement aucun traitement pharmacologique permettant de stopper le développement de la maladie. La seule issue thérapeutique consiste en une intervention chirurgicale de remplacement de la valve aortique ou en l’implantation d’une prothèse biologique dans la valve aortique par voie percutanée (TAVI). Nos travaux préliminaires sur modèles cellulaires, au laboratoire, ont montré l'intérêt du ciblage thérapeutique d’une enzyme spécifique appelée Ezh2, afin de réduire les phénomènes inflammatoires liés à la formation de calcifications dans la valve aortique. L’objectif central de ce projet est de comprendre le rôle de cette enzyme dans les processus associés à la calcification valvulaire aortique dans le contexte du RAC, en travaillant sur un organisme biologique complet.
Bénéfices attendus
Dans cette étude nous souhaitons démontrer l'intérêt thérapeutique du ciblage de notre enzyme d'intérêt, Ezh2, pour réduire et ralentir le développement des calcifications valvulaires aortique associées au développement du rétrécissement aortique calcifié.
Procédures
1. Pour l’étude cinétique, prélèvement répété (4 fois par rats) de sang, pour effectuer la cinétique des différentes doses de notre traitement administré par gavage, animal vigile mais contentionné, durée du prélèvement par animal = 1minute, classe modérée 2. Néphrectomie des 5/6ème, durée 30 minutes, classée sévère, une fois au cours de l’étude 3. Pour s’assurer de l’induction de l’insuffisance rénale chronique (IRC), un prélèvement sanguin sera réalisé à la 4ème semaine post-néphrectomie afin de mesurer les paramètres plasmatiques de la dysfonction rénale (créatinine, urée) pour n=288 rats, classe modérée 4. Échocardiographie, 30minutes, classée légère, 5 fois au cours de l’étude.
Impact sur les animaux
Les prélèvements sanguins entraineront de la fatigue et l’administration du traitement par gavage une prostration de l’animal. La procédure de néphrectomie des 5/6ème est classée sévère. Une perte du poids corporel est attendu après la procédure.
Devenir
Mise à mort dans l'objectif de prélever les organes afin d'étudier sur le plan histologique les effets de la maladie et la réponse aux différents agents pharmacologiques utilisés. Cela permettra de mieux comprendre le développement du rétrécissement aortique et les effets des substances utilisés pour lutter contre le processus pathologique de la maladie.
Remplacement
Des résultats non publiés de notre laboratoire ont montré que le ciblage, in vitro, de l’enzyme épigénétique Ezh2 dans les cellules inflammatoires permet de réduire leur potentiel participant au développement de la calcification de la valve aortique. Dans cette étude nous voulons évaluer, in vivo, dans un système biologique entier, l'effet du ciblage spécifique d'Ezh2 sur les processus associés au développement du RAC. De plus, travailler sur modèle animal est une étape indispensable si l’on souhaite développer par la suite un médicament chez l’Homme.
Réduction
Pour réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires à cette étude nous avons mis en place une stratégie d’optimisation des prélèvements et des analyses ex vivo durant la procédure et au moment de la mise à mort. Des mesures non-invasives de la fonction cardiaque ainsi que des analyses histologiques seront mises en place. Le choix des inhibiteurs pharmacologiques de Ezh2 est issu d'expériences préalablement réalisées dans des modèles cellulaires de rétrécissement aortique calcifié. A l'aide d’un logiciel qui s'appuie sur la variabilité statistique des résultats obtenus le nombre d'animaux nécessaire est ajusté. Des animaux des deux sexes seront utilisés dans nos procédures afin de s'affranchir d'un effet du genre.
Raffinement
Les animaux sont hébergés aux normes requises et un enrichissement des cages est mis en place. Des points limites adaptés grâce à notre grille de score s’appuyant sur le comportement de l’animal, son apparence, sa perte de poids (≥20%) et des signes cliniques spécifiques associés à une stratégie d’anesthésie, d'analgésie et de réhydratation seront mise en place avec un suivi quotidien du bien-être animal. Si les points limites sont atteints ou si la somme des paramètres de suivi atteint un score supérieur à 5, la méthode mise à mort prévue est la surdose anesthésique. Pour permettre une meilleure récupération après la chirurgie, l’animal sera placé sous lampe chauffante jusqu’à son réveil dans une cage contenant de la nourriture en gel. Par ailleurs les expérimentateurs auront des contacts pluri hebdomadaires avec les animaux afin de tendre à une habituation.
Choix des espèces
Le choix du rat Sprague Dawley se justifie par l’expérience du laboratoire à la fois pour la chirurgie de néphrectomie mais également pour l’étude des fonctions cardiaque par échocardiographie. Par ailleurs, le rapprochement des espèces humaines et des rongeurs sur le plan phylogénétique rend pertinent le choix de cette espèce en garantissant une bonne extrapolation des résultats chez l’homme. Nous allons inclure des rats mâle et femelle (sexe ratio 1/1) de 10 semaines pour l'étude. La taille des rats à cet âge permet une réalisation facilitée des chirurgies et correspond à un âge habituel dans la littérature pour l'induction du modèle.
Influence de la fréquence de prise alimentaire, pendant les périodes diurnes et nocturnes, sur les paramètres métaboliques de rats obèses.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Soumis à un régime hyperlipidique pendant vingt-huit semaines, hébergés seuls en cage et placés en cycle lumineux inversé, 336 rats subissent des procédures d'un niveau de souffrance sévère et sont tous tués pour le prélèvement de leurs organes. Ils subissent des prélèvements sanguins à la onzième puis à la vingt-troisième semaine de régime, pendant un test de tolérance au glucose. L'objectif déclaré est de mesurer si une alimentation restreinte à quelques heures par jour corrige les dérèglements métaboliques, avec des retombées annoncées pour le travail de nuit et le décalage horaire. Le porteur reconnaît que l'isolement et le régime gras peuvent altérer la masse et la force musculaires des rats, et indique qu'un effectif de 30 est "correct" pour l'analyse statistique dans ce domaine, alors que le projet en compte 336.
Objectifs
L’étude de la destructuration pathologique de l’organisation circadienne de l’organisme, se traduit à long terme par des troubles cliniques sévères (perturbations du sommeil, altérations métaboliques). Notre objectif principal va être d’étudier les voies par lesquelles les horloges principales et secondaires contrôlent la rythmicité des processus physiologique.
Bénéfices attendus
Ce projet s’inscrit dans le cadre de la recherche sur l’obésité et le diabète. La prévalence de l’obésité est en constante augmentation au niveau mondial (OMS), de même que les maladies qui lui sont associées (maladies cardiovasculaires, diabète...). Le concept de chronobésité, rattachée aux pathologies diabétiques et obésités, découle de l’hypothèse selon laquelle une désynchronisation chronique du cycle veille-sommeil et des rythmes circadiens (cycle d’environ 24 heures) favoriserait la surcharge lipidique. Les rythmes circadiens sont contrôlés par des oscillations moléculaires que l'on nomme "horloges". L'horloge circadienne principale se situe dans le cerveau, au niveau de l'hypothalamus, elle est synchronisée essentiellement par la lumière, mais également par d'autres facteurs (comportementaux, pharmacologiques ou nutritionnels). En plus de cette horloge principale, des horloges secondaires situées dans les organes périphériques (foie, tissus adipeux, coeur) interviennent également dans le contrôle des rythmes circadiens. Le rythme des prises alimentaires serait régulé par une horloge alimentaire, une meilleure connaissance de la synchronisation alimentaire ouvrira la voie à de nouvelles approches thérapeutiques permettant de corriger les anomalies circadiennes délétères liées aux pathologies métaboliques telles que l’obésité et le diabète. Elle permettrait également de prévenir les troubles métaboliques induits par les désynchronisations dues aux modes de vie actuels (travail de nuit, travail posté, décalage horaire). Les stratégies employées devraient mettre à profit l’effet synchroniseur d'une planification et d'une composition des repas optimisées. Pour mener à bien cette étude, les rats seront soumis à un cycle inversé de 12h/12h : 7h00-19h00 (période nocturne ou d’activité) et 19h00-7h00 (période diurne ou de repos) qui nous permettra d’étudier le rôle de l’horloge alimentaire sur l’impact des désordres métaboliques.
Procédures
De jeunes rats agés de 4 semaines seront soumis à un régime hyperlipidique pour induire une obésité et une insulino-résistance pendant 28 semaines. Les animaux subiront des prélèvements sanguins à la 11ème et 23 ème semaine de régime pendant le test de tolérance au glucose.
Impact sur les animaux
Un stress lié à l'isolement des animaux et un effet délétère à long terme qui peut survenirsur la masse et la force musculaire des rats soumis au régime hyperlipidique.
Devenir
Mise à mort pour prélèvements d'organes.
Remplacement
Dans le cadre de notre projet, nous devons avoir recours à un modèle animal pour mimer et pour mesurer les effets bénéfiques que l’on peut attendre d’un changement de pratique alimentaire telle que l’alimentation limitée dans le temps (TRF :Time Restricted Feeding). L’utilisation d‘un modèle animal est incontournable. En effet, ce type de projet ne peut en aucun cas être remplacé par des expériences in vitro. Nous avons besoin d’étudier des paramètres comportementaux et de physiologie intégrée qui implique les interactions entre les nombreux organes et que l’on ne peut pas modéliser in vitro.
Réduction
Cette étude ne peut être remplacée par d’autres moyens que les modèles animaux, car nous regardons les dialogues inter-organes avec comme résultante le taux de glucose sanguin, nous utiliserons le minimum de rats nécessaire en respectant le bien-être animal (raffinement des procédures, amélioration de leur environnement). Le nombre d’animaux est minimisé et nous effectuerons les différentes expérimentations sur des mêmes groupes de rats tant que celles-ci se révèlent non invasives et peu douloureuses : IPGTT, ITT, PPT et GTT. Les animaux seront leur propre contrôle, cela nous permet ainsi de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Dans le domaine de l'étude d’une désynchronisation des repas, un n de 30 est correct pour l'analyse statistique : Utilisation du Test de Student et du Test ANOVA. Il n’existe pas de modèles in vitro permettant ce type d’analyse. En vue d’appliquer les réglementations Européennes en termes de réduction.
Raffinement
Le soin apporté aux animaux par le personnel animalier et les responsables du projet a pour but d’améliorer le bien-être des rats. De réduire, supprimer ou soulager les douleurs. Les causes de souffrance et de stress pourraient provenir du régime alimentaire hyperlipidique ou de l’isolement. Le milieu de vie en cage d’hébergement est enrichi en bâtons de bois. Le suivi des animaux se fait individuellement (manipulation 5jours/7, suivi du poids corporel) tout au long de l’étude jusqu’à la mise à mort. Le mal être inattendue d’un animal est pris en charge selon les points limites établis et à une utilisation des procédures réglementaires et à la mise à mort. Ce suivi permet de valider les résultats scientifiques
Choix des espèces
Le rat Sprague Dawley développe une obésité sous régime hyper lipidique (5524cal/g) ce régime modélise plus fidèlement les apports caloriques actuels chez l’homme, sans pour autant induire de diabète de type 2. Il est également important de noter que des « sous-groupes » d’animaux apparaîtront au sein de ces animaux, en effet certains prendront du poids suite à la consommation du régime, alors que d’autres se maintiendront à un poids normal, présentant une résistance à l’induction de l’obésité par le régime. Pour ce projet, les changements métaboliques attendus (prise alimentaire, prise de poids, glycémie, insulinémie), les organes impliqués (intestin, cerveau, muscles, foie, tissus adipeux) et le fluide biologique (LCR) sont tels que nous sommes contraints d'avoir recours à un modèle préclinique proche des pathologies métaboliques humaines telles que l’obésité. Les rats Sprague Dawley arriveront à l’animalerie à l’âge de 3 semaines (jeunes sevrés), ils auront une semaine d’habituation à l’animalerie. Ils seront utilisés à l’âge de 4 semaines.Ils seront mis en cage individuellement pour obtenir une obésité juvénile avec prise de poids corporel et de masse grasse, ils seront soumis à deux régimes hyperlipidiques . Un autre groupe de rats du même âge auront une nourriture standard ad libitum. L’objectif est également de vérifier l’efficacité du TRF (Time Restricted Feeding), une approche diététique où l’apport calorique est réduit à quelques heures sans altérer l'apport quotidien en qualité ou en quantité de nutriments afin de lutter contre l’obésité et les troubles métaboliques. Pendant toute la durée de l’étude. Ils seront en cycle inversé et ils seront utilisés pour l’expérimentation à l’âge de 11 semaines.
Mise en évidence du rôle des projections glutamatergiques et dopaminergiques mésocorticales dans le déclin cognitif lié à l’âge dans un modèle murin.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
554 souris sont opérées du cerveau pour recevoir un virus, une substance toxique destinée à léser une région cérébrale ou une fibre optique implantée. Les 712 souris du projet, dont 544 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère et 168 d'un niveau modéré, sont ensuite placées seules dans une boîte où elles doivent accomplir une tâche visuelle pour obtenir leur nourriture, puis toutes tuées pour conserver leurs tissus cérébraux. L'objectif déclaré est de comprendre le déclin cognitif lié à l'âge, en comparant des souris de trois à six mois, de dix à treize mois et de dix-huit à vingt-deux mois. Le porteur reconnaît que l'hébergement individuel stresse ces animaux sociaux, écrit que les souris ne subissent pas de restriction alimentaire, et ne précise ni la substance toxique employée ni la région du cerveau lésée.
Objectifs
La prévention du déclin cognitif dans une population où les gens vivent de plus en plus longtemps est un défi majeur de santé publique. Le déclin cognitif lié à l'âge avancé est associé à une diminution de la flexibilité et du contrôle adaptatif du comportement. Les principaux objectifs de ce projet consistent à élucider les mécanismes de la détérioration de la cognition avec l'âge, et à tester diverses approches pour la ralentir dans un modèle murin. À cette fin, nous étudions les projections neuronales, connues pour être impliquées dans le déclin cognitif. Les études seront menées sur des souris adultes, d'âge moyen et âgées.
Bénéfices attendus
Au cours des deux dernières décennies, l'espérance de vie a augmenté de plus de six ans, principalement en raison d'une baisse des taux de mortalité plutôt que d'une prolongation des années vécues sans handicap. Par conséquent, améliorer la qualité de vie des personnes âgées est devenu un défi majeur en matière de santé, nécessitant une compréhension approfondie de la biologie du vieillissement. De plus, le taux de vieillissement cognitif sain varie considérablement entre les individus, ce qui soulève la question: pourquoi certaines personnes montrent-elles des signes de déclin cognitif plus tôt que d'autres? Cette variabilité est un axe majeur des recherches actuelles et constitue la base de ce projet. Ce projet vise à caractériser le rôle des différentes projections neuronales dans la flexibilité cognitive et la variabilité des performances comportementales chez les individus en fonction du sexe et de l'âge, dans un modèle murin. Comprendre ces mécanismes aidera à expliquer pourquoi certains individus maintiennent une flexibilité cognitive tandis que d'autres subissent un déclin plus prononcé. De plus, cette recherche explore la possibilité d'améliorer la flexibilité cognitive chez les animaux âgés par le biais de la stimulation ciblée des projections neuronales. Si ces interventions s'avèrent efficaces, elles pourraient ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques pour améliorer la santé cognitive chez les personnes âgées.
Procédures
La plupart de souris (N=554) subira une chirurgie au niveau de leur cerveau pour soit injecter un virus (afin de cibler des groupes spécifiques de neurones), soit injecter une substance toxique (pour léser une partie du cerveau), soit implanter une fibre optique. Ces chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et avec une analgésie appropriée. Ensuite, toutes les souris (N=712) devront accomplir une tâche visuelle dans une boîte conçue spécialement pour cette expérience. Après la tâche comportementale, toutes les souris (N=712) seront euthanasiées par une méthode réglementaire effectuée sous anesthésie et analgésie.
Impact sur les animaux
La chirurgie entraîne un risque de douleur et de déshydratation pour les animaux, ainsi qu'un risque de perte de poids qui peut encore se présenter. Pendant la chirurgie, les animaux seront anesthésiés, ce qui comporte un risque de douleur, d'hypothermie, d'arrêt cardio-respiratoire, de déshydratation et d'yeux secs. Après la chirurgie, les souris auront soit des points de suture sur le dessur de leur tête, soit une fibre optique implantée, À la fois après la chirurgie et pendant la tâche comportementale, l'animal vivra à hébergement individuel. Cela peut causer du stress pour l'animal, car les souris sont des animaux sociaux et préfèrent vivre en groupe. De plus, pendant la tâche comportementale, les animaux ne sont pas soumis à une restriction alimentaire, mais pour obtenir de la nourriture, ils doivent accomplir la tâche.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l'expérience car les tissus cérébraux doivent être préservés pour une analyse ultérieure.
Remplacement
Le modèle murin est crucial pour notre projet car il offre des avantages uniques qui ne peuvent être remplacés. Nous devons étudier le fonctionnement du cerveau dans des situations complexes impliquant le comportement et l'activité des neurones. Ce sont des aspects que nous ne pouvons pas pleinement comprendre en étudiant simplement des cellules en culture ou en utilisant d'autres méthodes ne faisant pas intervenir un animal vivant. Ainsi, l'utilisation des souris nous permet d'explorer à la fois la biologie du cerveau et son impact sur le comportement de manière détaillée et complète.
Réduction
Nous utilisons des boîtes automatisées, ce qui est une stratégie clé pour réduire le nombre d'animaux nécessaires à l'expérience. Ces systèmes automatisés permettent de recueillir un volume important de données (des milliers d'essais par animal), dans une période de temps relativement court. En maximisant les informations recueillies auprès de chaque sujet, l'étude atteint un niveau plus élevé de puissance statistique, réduisant ainsi le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement fiables. De plus, des tests statistiques rigoureux sont employés pour garantir la fiabilité et la validité des données, contribuant à la réduction du nombre d'animaux nécessaires tout en maintenant la rigueur scientifique. En tenant compte de l'expérience précédente en laboratoire et de la signification statistique, le nombre total d'animaux nécessaire est 712.
Raffinement
Après leur arrivée dans l'animalerie, les animaux provenant de l’extérieur bénéficieront d'une période d'acclimatation d'au moins 5 jours. Pendant la tâche comportementale, les animaux résideront dans une cage non standard avec du matériel de nidification approprié et de l'eau à volonté. Ils auront également accès à la nourriture à tout moment, mais devront effectuer une tâche visuelle pour l'obtenir (il n'y a pas de limite au nombre de fois qu'ils peuvent le faire). L'accès constant à la tâche comportementale servira d'enrichissement supplémentaire. Cette approche réduira le besoin de manipulation directe par l'expérimentateur, minimisant ainsi le stress potentiel pour les animaux. À tout autre moment, les animaux seront hébergés dans des cages standard avec enrichissement, alimentation et abreuvement à volonté. Les animaux seront surveillés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. Toute procédure chirurgicale nécessaire sera effectuée avec le plus grand soin pour le bien-être des animaux, en utilisant une anesthésie générale appropriée et en administrant des analgésiques avant et après l'intervention pour leur confort. Une signalétique spécifique sera utilisée pour les animaux en expérimentation, permettant une surveillance adaptée en fonction des points limites définis à chaque étape de la procédure pour garantir leur bien-être. Des critères d'arrêt ou des points limites ont été déterminés pour chaque étape de la procédure expérimentale.
Choix des espèces
Ce projet vise à étudier comment certaines connexions cérébrales influencent le déclin mental lié à l'âge et si les activer directement peut y remédier. Nous utiliserons des souris génétiquement modifiées pour cibler ces connexions spécifiques. Notre modèle de souris est particulièrement pertinent car il permet d'étudier les changements cognitifs liés à l'âge de manière précise. Nous diviserons les souris en quatre groupes pour différentes manipulations. Nous comparerons les performances de souris adultes (3 à 6 mois) et âgées (18 à 22 mois) dans des tests de flexibilité cognitive. Pour comprendre à quel âge surviennent les changements cognitifs, nous inclurons également des souris d'âge moyen (10 à 13 mois). Ainsi, notre étude couvrira trois stades de développement différents. En fonction des résultats obtenus pendant la tâche cognitive, nous sélectionnerons deux groupes d’âge avec les différences de performance les plus marquées pour des manipulations supplémentaires, incluant des techniques anatomiques et optogénétiques spécifiques. Cela nous permettra d'approfondir notre compréhension des mécanismes neuronaux impliqués dans le vieillissement cognitif.
Mise en place et caractérisation phénotypique d’un modèle murin d’encéphalopathie du prématuré.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Système nerveux
Des souriceaux reçoivent dès leurs premiers jours de vie une injection intrapéritonéale d'extrait bactérien destinée à reproduire l'encéphalopathie du prématuré, puis subissent deux chirurgies de quarante-cinq minutes pour la pose de prothèses de contention de la tête. 2 160 souris sont concernées, 1 120 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère et 1 040 d'un niveau modéré, toutes tuées pour prélever leurs tissus. Le porteur annonce des déficits fonctionnels et cognitifs parmi les effets attendus, et décrit par ailleurs les nuisances de l'imagerie et des tests comportementaux comme un simple stress lié à la manipulation, à l'isolement et à la nouveauté, sans préciser lesquels de ces tests seront pratiqués. Il affirme que ces modèles inflammatoires reproduisent "parfaitement" les caractéristiques de la pathologie humaine.
Objectifs
Une naissance est considérée comme prématurée lorsqu’elle intervient avant 37 semaines et se positionne comme un véritable problème de santé mondiale avec une incidence de 15 millions de cas par an. La prématurité est notamment associée à un large spectre d’altérations globales du développement se manifestant sous la forme de troubles moteurs, sensitif (e.g. vision), d’une altération des fonctions cognitives ou encore de troubles de l’attention et de l’hyperactivité. Ces déficits neurologiques qui peuvent demeurer observables jusqu’à l’âge adulte sont caractérisés au niveau morphologique par un ensemble d’anomalies cérébrales qui sont regroupées sous le nom d’encéphalopathie du prématuré.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales pour mieux comprendre différentes pathologies neurodéveloppementales humaines. Les procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, l’étude phénotypique de l’encéphalpathie du prématuré doit s’effectuer sur des modèles in vivo. De plus, les méthodes ex vivo de ce projet seront réalisées en parallèle afin de réduire le nombre d’animaux et pour mieux caractériser les processus moléculaires et cellulaires sous-jacents.
Procédures
L’ensemble des souriceaux recevront une injection intra péritonéale d'un extrait de proteine bactérienne afin de reproduire l’encéphalopathie du prématuré (N =2160). Aux jours post-nataux (P) 3, 5, 7, 10, 15, 30 et 60 une imagerie par résonance magnétique (50 minutes maximum, n = 420) et une imagerie fonctionnelle échographique (1 heure maximum, n = 420) seront réalisées avec une injection intraveineuse de l'agent de contraste au préalable. La méthode la plus efficiente pour cette administration sera évaluée dans une procédure de mise au point (40 souriceaux seront concernés par cette procédure de mise au point). Deux procédures chirurgicales d’une durée de 45 minutes seront réalisées afin de poser des prothèses de contention qui permettront d’éviter les artéfacts de mouvements de la tête lors des acquisitions en imagerie fonctionnelle échographique (n = 420) et en microscopie (n = 280). Les tests comportementaux seront réalisées de manière longitudinale à P3, P5, P7, P10, P15, P30 et P60 (n = 240).
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient : Pour toutes les procédures : une perte de poids, des douleurs post-opératoires, du stress, des déficits fonctionnels et/ou cognitifs. Lors des tests comportementaux, les animaux peuvent être soumis à un stress dû à la manipulation, l’isolement ainsi qu’à la nouveauté. Durant les examens d’imagerie, les animaux peuvent subirent un stress dû à la manipulation. Tous les animaux auront un suivi attentif et régulier par l’expérimentateur et le personnel animalier qualifié notamment grâce à la prise journalière du poids des animaux, leur observation dans la cage en s’assurant de leur bien-être (prise alimentaire et boisson).
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure afin de générer des tissus permettant des observations sur des coupes de tissu.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement de différentes pathologies humaines (encéphalopathie du prématuré, inflammation).
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. Dans chaque phase du projet, le minimum d'animaux a été prévu afin d'arriver à des résultats qui soient en adéquation avec ceux prévus lors de ce projet. Le nombre d’animaux pour chaque étude a été défini à partir de l’expertise au sein du laboratoire et des données de la littérature. De plus, les analyses comportementales et les analyses morphologiques ne seront pas réalisées chez les mêmes animaux pour éviter la récupération fonctionnelle et donc le biaisement des résultats. Aussi, le projet comporte deux procédures de mise au point qui permet de s’assurer que les suivantes seront réalisées de la meilleure façon. Ce point limitera l’utilisation d’animaux pour des expériences qui ne marcheraient pas. Enfin, l’effet sexe sera observé, ce qui permettra de limiter l’utilisation d’animaux pour des résultats qui seraient biaisés par ce paramètre.
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés et analgésiés avant, pendant et après chaque procédure le nécessitant. Au cours de l’intervention chirurgicale (pose du support de tête pour limiter les mouvements de la tête lors des examens d'imagerie), les paramètres vitaux de l’animal seront surveillés et optimisés tout au long de la procédure. Les yeux des souris seront couverts avec du gel oculaire afin de ne pas les éblouir avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir de la déshydratation. Après l’intervention chirurgicale, les animaux seront surveillés jusqu’à leur réveil. Pour optimiser le réveil de l’animal, la cage de réveil chauffée. De la nourriture humidifiée sera déposée dans la cage pour un accès plus simple à l’alimentation après la chirurgie.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine du développement et les techniques employées sont bien connues. De plus, la souche utilisé dans ce projet est également utilisée comme fond génétique de plusieurs lignées génétiquement modifiées utilisées au laboratoire et qui pourront, plus tard, être éventuellement utilisées dans le cadre de ce projet. L’anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme. Par ailleurs, les modèles d’encéphalopathie du prématurés induits par des stimuli inflammatoires sont très souvent utilisés car ils reproduisent parfaitement les caractéristiques de la pathologie humaine, ce qui en fait un modèle d’étude robuste. De même, il est admis que l’inflammation systémique induit des changements au sein du compartiment vasculaire comme dans ses interactions avec les cellules qui l’entourent. Cet ensemble de connaissances et les acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rendent cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Les procédures sont basées sur un stimulus inflammatoire à partir du premier jour post natal. Il est donc nécessaire de se procurer des femelles gestantes en amont afin de limiter le stress du voyage aux nouveau-nés. Le stade de développement de ces femelles est de 2 à 5 mois car nous devons attendre leur maturité sexuelle. La procédure de mise au point engendrera une évaluation comportementale au 7ème jour post natal chez les souriceaux. A ce même stade, une mise au point du protocole d’injection de l’agent de contraste pour les examens d'imagerie sera réalisée. En effet, cet agent de contraste nécessite d’être injecté en intraveineuse mais la voie habituellement utilisée (dans la veine caudale de la queue) n’est pas réalisable à ce stade de développement précoce. Une analyse microscopique sur coupes de tissus prélevés au 15e jour post natal permettra de voir si le modèle récapitule bien l’atteinte la plus décrite dans l’encéphalopathie du prématuré. De plus, au cours du développement physiologique et pathologique chez la souris, les changements fonctionnels, morphologiques comme les processus cellulaires et moléculaires en jeu s’opère très rapidement. De ce fait, une analyse à de nombreux stades de développement (jours poast nataux 3 / 5 / 7 / 10 / 15 / 30 / 60) est nécessaire afin d’identifier des différences dans le développement des différents groupes.
Evaluation du remodelage et restructuration cardio-vasculaire du rat lésé médullaire (T4) et traitement sérotoninergique (1/2)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tués pour prélever leurs tissus et mesurer le remodelage de l'innervation du cœur, 36 rats subissent des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Trente d'entre eux sont opérés deux fois, la seconde intervention lésant la moelle épinière au niveau thoracique, ce qui provoque une paralysie du train arrière, une tachycardie et une hypotension orthostatique, avant un test de marche sur tapis roulant chaque semaine. Vingt rats sont isolés la semaine qui suit l'opération, la vessie vidée à la main une à quatre fois par jour, reçoivent une injection sous-cutanée quotidienne pendant vingt-huit jours et sont anesthésiés une heure trente pour une imagerie. Le porteur justifie la mise à mort par le "besoin" des tissus et annonce que les résultats pourraient servir à de prochaines études cliniques.
Objectifs
Les lésions de la moelle épinière (LM) sont un problème de santé important dans le monde, touchant des individus jeunes et en bonne santé. Outre les déficits sensoriels et moteurs bien connus et identifiés, les sujets présentent une altération majeure du contrôle du système nerveux autonome. Les symptômes comprennent des troubles cardiovasculaires, une thermorégulation dysfonctionnelle et la présence de dysréflexie autonome (épisodes soudains d'hypertension et de bradycardie pouvant mettre en jeu le pronostic vital). Ces troubles sévères contribuent à 40 % des décès chez les patients. Les conséquences sur la qualité et l’espérance de vie sont extrêmement préjudiciables, impliquant une réelle prise en charge. Chez les rats spinaux, l'administration quotidienne pendant 28 jrs d'un agoniste sérotoninergique (5-HT) favorise la récupération motrice. Outre ce rôle démontré, la 5-HT joue également un rôle omniprésent dans le système cardiovasculaire puisqu'elle module, entre-autre, le tonus des vaisseaux sanguins ou la rythmicité cardiaque. Le précédent projet montre des données préliminaires très encourageantes et met en évidence une amélioration importante des fonctions cardiovasculaires. Si les résultats sont prometteurs et pourraient être utilisés dans de prochaines études cliniques, il nous faut maintenant compléter ces données sur des données physiologiques. Nous savons (bibliographie) que les rats ayant subi une lésion de moelle en T5 présentent un remodelage des neurones sympathiques post-ganglionnaires innervant le cœur. Nous comparerons donc des individus contrôles, traités avec du NaCl et traités avec notre molécule sérotoninergique à l’aide de système d’imagerie médicale type IRM afin de savoir l’impact de notre traitement sur ce remodelage.
Bénéfices attendus
Les lésions hautes de la moelle épinière présentent une incidence dramatique sur tous les aspects de la vie quotidienne individuelle. Outre les déficits sensori-moteurs, des troubles cardio-vasculaires importants sont présents chez ces individus. Certains troubles comme les dysreflexies autonomes (épisodes soudains d'hypertension et de bradycardie réflexive) peuvent mettre en jeu le pronostic vital du patient. Une précédente étude de notre équipe a montré l'implication de molécules agissant sur le système sérotoninergique et leur capacité à restaurer en partie l’impact de ces troubles. Notre projet pourra permettre une avancée dans le traitement des patients.
Procédures
6 animaux subiront une chirurgie d’environ 30 minutes. 30 animaux subiront deux chirurgies successives (une de 30 minutes puis une 2ème 10 jours après de 45 minutes).20 animaux auront une injection sous-cutanée tous les jours pendant 28 jours (4 semaines) puis seront de nouveau anesthésiés 1h30 environ en deux sessions séparés de 24h pour subir une imagerie (projet éthique 2/2) avant une dernière anesthésie avant euthanasie pour prélèvement. Sauf l’anesthésie avant euthanasie, toutes les anesthésies seront gazeuses (isoflurane). Les 30 animaux subissant les 2 chirurgies, seront soumis à un test de marche sur un tapis roulant de 5 minutes maximum. Ce test aura lieu toutes les semaines de l'expérimentation soit 4 fois (J7, J14,J21 et J28).
Impact sur les animaux
Tous les animaux subiront une chirurgie pouvant induire de la douleur et 30 d'entre eux, en subiront une 2ème. Ces chirurgies peuvent induire de la douleur. De plus, la lésion de la moelle épinière (2ème chirurgie de la procédure 2) va induire chez les animaux les mêmes problèmes que ceux rencontrés par les patients ; des difficultés locomotrices du train arrière pouvant être largement compensées par les pattes avant et une cage d'hébergement adaptée en hauteur et des problèmes cardiovasculaires (tachycardie et hypotension orthostatique). 20 animaux seront insolés pendant les 7 jours post-opératoires afin d'assurer leur soins postopératoires dans de bonnes conditions. Les injections quotidiennes ne doivent pas induire de douleurs (fait sous la lésion – absence d’intégration sensorielle) mais induisent un stress limité (duo d’expérimentateurs durant toute la durée). Le test de marche sur le tapis roulant peut induire un stress à l’animal. Enfin, les sessions d’IRM ne devraient pas induire de nuisances, néanmoins, les animaux seront anesthésiés environ 1h30 en 2 sessions de 45 minutes.
Devenir
Nous avons besoin des tissus pour faire des analyses de remodelage de l'innervation d'organes cibles
Remplacement
Ce projet éthique s'inscrit dans un projet scientifique plus vaste où des études préliminaires ont mis en évidence l'implication du système sérotoninergique (5-HT) dans les épisodes cardiovasculaires dysfonctionnels qui apparaissent à la suite d'une lésion haute de la moelle épinière. L’organisation du système sérotoninergique est complexe avec de nombreux types ou sous-types de récepteurs différents qui se retrouvent à plusieurs niveaux tant centraux que périphérique. Il n'existe pas de modélisation de ce système qui permettrait de prédire les effets de la lésion dans notre modèle
Réduction
Nous avons déterminé le n des lots en fonction des premiers résultats obtenus dans le précédent projet. Nous ferons une comparaison pour savoir si nous avons un des différences entre les lots. Il va falloir n=7 animaux par lots (avec ce nombre, nous avons été en mesure de faire des statistiques claires lors de notre précédent projet éthique). Toutefois, la complexité de l'expérimentation nous oblige à prévoir une marge d'erreur que nous aimerions ne pas avoir à utiliser (n=10 animaux par sexe).
Raffinement
Les soins post-opératoires (lésion de moelle) sont basés sur notre expérience de cette technique ainsi que sur des publications de raffinement écrites par les quelques équipes travaillant sur des sujets similaires au nôtre. Il a été validé par la structure de bien-être animale et nos vétérinaires. Les animaux sont anesthésiés par voie gazeuse(isofluorane). Nous utilisons une analgésie multimodale pour les 2 chirurgies pendant 3 jours minimum. Pour la phase post-lésionnel, nous avons adapté les cages qui ont été usinées à façon pour s'adapter à la paralysie des animaux (eau proche du sol, mangeoire basse, tapis souple agrippant dans la cage pour aider à la mobilité, alimentation liquide pendant 4 jours post-opératoires pour pallier aux problèmes gastriques, vidange manuelle de la vessie de 1 à 4 fois par jour en fonction de la récupération des animaux et antibiothérapie post-opératoire pour éviter les infections urinaires. Des points limites stricts ont été mis en place avec l'aide de l'équipe vétérinaire.
Choix des espèces
Le rongeur est un modèle facile à héberger, dont la reproduction est rapide et dont la physiologique reste malgré ses différences proches de celle l'humain. Le rat est particulièrement compatible avec notre projet car sa taille supérieure à celle de la souris permet de faciliter les chirurgies. De plus il existe de nombreux points commun entre le rat et l'humain quant à la réparation cellulaire de la moelle épinière. Enfin nous avons choisi le même modèle que sur l'ensemble des précédents projets éthiques. Les animaux du projet précédent sont implantés (capteur télémétrique) à 225-275gr soit à 7/8 semaines d'âge environ. Afin de rester au plus proche de ce qui est fait sur le premier projet, nous commencerons ce projet avec des animaux du même âge.
Rôle du facteur de transcription Foxk1 dans le mécanisme de tolérance périphérique exercée par les lymphocytes T régulateurs
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Gavées au tamoxifène deux fois par semaine pendant trente jours puis injectées par voie intraveineuse de lymphocytes T modifiés, 805 souris subissent des procédures d'un niveau de souffrance sévère et sont toutes tuées pour analyser leurs organes lymphoïdes. Une partie développe des signes d'auto-immunité, perte d'appétit, perte de poids et perte de sociabilité avec ses congénères. L'objectif déclaré est de savoir si l'absence d'un facteur de transcription rompt la tolérance immunitaire et déclenche une auto-immunité. Le porteur cale sa surveillance sur un taux de survie de 10 % à cinquante jours observé dans un modèle voisin, annonce qu'il tuera les souris avant la phase très sévère de la maladie, et écrit qu'il limitera leurs douleurs dans la mesure où celles-ci n'affectent pas les mesures qu'il veut réaliser.
Objectifs
La réponse immunitaire adaptative dépend fortement de l'immunité médiée par les lymphocytes T. Les cellules T conventionnelles (Tconv), peuvent reconnaître le non-soi et éliminer les cellules infectées et les cellules cancéreuses. La sélection thymique garantit que les lymphocytes T qui atteignent les organes lymphoïdes secondaires reconnaissent les pathogènes mais sont tolérés vis-à-vis du soi. Cependant, même si plus de 95 % des lymphocytes T sont supprimés dans le thymus au cours de la maturation, la tolérance centrale reste un processus imparfait, principalement en raison de l'expression incomplète, dans le thymus, de l'ensemble des antigènes du soi. C'est pourquoi il existe des mécanismes de tolérance périphérique, notamment des cellules T régulatrices (Treg), un sous-ensemble de cellules CD4+ exprimant le facteur de transcription FOXP3 qui peut supprimer l'activation des cellules T auto-réactives en périphérie. La tolérance est un processus essentiel à l'équilibre immunitaire normal et, lorsqu'elle est rompue, l'auto-immunité peut se développer. Le facteur de transcription appelé Foxk1 a été identifié comme un acteur clé de la régulation des cellules T, et possiblement des cellules Treg. Dans ce cadre, Le projet vise donc à caractériser le rôle d'un nouveau facteur de transcription dans les cellules Treg, et à déterminer si son absence induit une rupture de tolérance et conduit à de l’auto-immunité.
Bénéfices attendus
Un défi important dans la recherche biomédicale actuelle et son application pharmaceutique en immunologie est d'identifier les points de contrôle et les mécanismes moléculaires qui peuvent être ciblés pour contrôler les cellules T, et modifier leurs fonctions et leur devenir, afin de mieux contrôler les réponses auto-immunes. Dans ce contexte, la reprogrammation du métabolisme des cellules T apparaît comme une voie alternative et prometteuse pour moduler les réponses des cellules T. Ainsi, le projet présenté ici explore cette possibilité en se concentrant sur un nouveau facteur de transcription. Celui-ci constitue un candidat prometteur qui, en contrôlant le métabolisme des cellules T régulatrices pourrait donc faire l'objet d'une intervention pharmaceutique visant à réduire les dommages de pathologies auto-immunes. Par ailleurs et au-delà de ce facteur de transcription, ce projet constitue une preuve de principe pour cibler les effecteurs impliqués dans les programmes métaboliques, offrant de nouvelles opportunités thérapeutiques pour reprogrammer les cellules T auto-réactives.
Procédures
Les animaux impliqués dans ce projet seront traités au Tamoxifene par gavage (deux fois par semaine pendant 30 jours. temps de procédure: quelques minutes pour chaque souris) ou par l’utilisation de croquettes dédiées. La période d’administration s’étalera sur 50 jours. Des cellules T modifiées seront injectées par voie intraveineuse (1 seule injetion, temps de procedure: quelques secondes) sur souris anesthésiées par anesthésie gazeuse afin de déterminer leur effet in vivo. Une seule injection sera effectuée par souris, la procédure ne durera que quelques minutes.
Impact sur les animaux
Du fait des protocoles envisagés, des nuisances sont attendues sur les animaux. Certains lots d’animaux pourront développer des signes d’auto-immunité, conduisant à une perte d’appétit, une perte de poids et perte de sociabilité vis-à-vis des congénères.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés afin d'analyser l’impact de la délétion du gène Foxk1, les infiltrats cellulaires aux seins des organes lymphoïdes seront analysés. De manière générale, le suivie de la réponse immunitaire et en particulier des lymphocytes T, objet de l'étude, nécessite l'euthanasie des animaux à l'issue des procédures.
Remplacement
Il n’existe à ce jour aucune alternative à l’expérimentation animale lorsqu’il s’agit de modéliser les processus complexes de développement de la réponse immunitaire dans un auto-immun. Afin d’étudier de nouvelles approches d’immunothérapie, l’utilisation de modèles murins est cruciale.
Réduction
Nous souhaitons étudier des populations cellulaires dont certaines sont rares mais dont la distribution suit une loi normale N ( μ = 15, σ = 3). Sur la base de nos expériences antérieures et des données de littérature, nous savons que des groupes de maximum 6 animaux, analysés avec le test two-tailed student’s test with welch’s correction nous permettent d’obtenir des résultats significatifs et doivent être réalisés en duplicat pour être publiables. La validité statistique des résultats (différence significative entre les groupes) sera évaluée par les tests statistiques suivants : two-tailed student’s test with welch’s correction ANOVA et/ou Mann Whitney.
Raffinement
Toutes les procédures expérimentales du projet sont réalisées en tenant compte du bien-être animal dans le strict respect des réglementations en vigueur et en étroite collaboration avec la structure du bien-être animal de notre établissement. Les expérimentations seront optimisées dans l’optique de réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, la douleur ou l'angoisse subie par les souris afin d'obtenir des données fiables. Le nombre d’animaux adultes par cage sera au maximum de 5. Les animaux sont hébergés dans des cages dont la surface est de 500 cm2. L’état de santé des souris sera quotidiennement surveillé par du personnel compétent afin de déceler le plus précocement une altération du bien- être animal. Nous évaluerons la survie des souris en nous basant sur un taux de survie de 10% à 50 jours observé dans un modèle similaire de maladie auto-immune (Shi et al, 2019 ; Zhenh et al 2013).Tout au long de ces 50 jours (voir également fichier Annexe 1, les souris seront évaluées tous les 3 jours pendant les 20 premiers jours puis et tous les 2 jours pendant les 30 jours suivants ; Le poids, la posture, l’aspect de la peau, l’activité d’exploration et la mobilité, l’aspect du pelage et le comportement avec ses congénères seront évalués. Le score cumulatif obtenu permettra de définir des points limites précoces. En fonction du score, l’animal pourra être isolé, son environnement sera enrichi (nourriture en gel sur la litière, dome/maison) et des analgésiques/antalgiques (Acétaminophène) pourront lui être administrés afin de réduire la douleur jusqu’à sa mise à mort. Nous mettrons donc en place des actions pour limiter les douleurs de l’animal dans la mesure où celles-ci n’impactent pas les mesures expérimentales que nous voulons réaliser (ex : perte de poids, peau irritée, etc..). Pour un score > ou = 5 au cours de 2 observations successives (soit sur 4 jours), l’animal sera euthanasié est décompté comme succombant à la maladie. Les animaux survivants seront euthanasiés à l’issue des 50 jours. Dans la plupart de nos expériences outre la courbe de survie, nous suivrons nos animaux suivant la même grille de score tous les 3 jours pendant les 20 premiers jours puis et tous les 2 jours pendant les 10 jours suivants et mettrons à mort nos souris avant la phase très sévère de la maladie dans les 30-40 premiers jours théoriques du développement de la maladie. Les souris seront également mises sous anesthésie gazeuse lors des procédures de transfert adoptif.
Choix des espèces
Mus musculus, mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme, animal de petite taille et à reproduction rapide, bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. Le système immunitaire adaptatif caractérisé par la présence de lymphocytes B et T en interaction avec les cellules dendritiques est issu de l’hématopoïèse laquelle est observée chez les vertébrés uniquement et sur le plan immunitaire, il existe de nombreuses similarités entre l’homme et le modèle souris. Les techniques de mutagénèses conditionnelles ne sont disponibles que chez les souris et sont validées pour les études physiopathologiques de gènes. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude soit riche d’enseignements permettant d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces, avec des applications cliniques potentielles pour l’homme. Par ailleurs, la taille, la rapidité du cycle de reproduction et la génétique de la souris en font le modèle le mieux approprié pour les études envisagées les animaux adultes seront utilisés à 8 semaines.
Titre du projetExploration de nouveaux agents thérapeutiques pour la maladie de Niemann-Pick type C avec un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2 070 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever des tissus, et chacune passe d'abord par une biopsie de la queue à six jours, un génotypage que le porteur qualifie lui-même d'invasif. 1 150 sont soumises à des procédures d'un niveau de souffrance léger, 340 modéré, 580 sévère. Un groupe reçoit une injection dans les deux yeux sous anesthésie, avec un risque de lésions oculaires, un autre une injection intrapéritonéale par jour pendant quatre semaines, pouvant provoquer inflammations et lésions locales. Les souris atteintes de la maladie de Niemann-Pick perdent l'équilibre et la coordination, tremblent et maigrissent à partir de six semaines, et le porteur revendique d'avoir choisi la lignée aux symptômes les plus précoces pour que les animaux "souffrent moins" en étant gardés moins longtemps.
Objectifs
La maladie génétique rare étudiée se manifeste par des symptômes métaboliques et neurologiques très variés. Elle est difficile à diagnostiquer et d’évolution fatale. Actuellement, il n'y a pas de traitement curatif. Le but principal de ce projet est de mieux comprendre l'effet de molécules potentiellement thérapeutiques sur l'accumulation pathologique de cholestérol dans cette maladie en utilisant des souris comme modèle expérimental. Deuxièment, l'objectif est de décrire plus précisément les changements pathologiques de ce modèle murin, à l'âge de 10 semaine, stade tardif de la maladie.
Bénéfices attendus
Il s'agit de valider in vivo l'effet de candidat médicament dans un modèle murin de maladie génétique d'accumulations pathologiques de lipides, et à la fois d'obtenir des connaissances approfondies du modèle à 10 semaines.
Procédures
Un groupe d'animaux anesthésiés 10 minutes recevra une injection unique dans l'oeil qui permet de cibler et délivrer une molécule aux neurones de la rétine par une voie modérement invasive. Le deuxième groupe d'animaux vigiles recevra une injection une fois par jour d'une molécule thérapeutique pendant 4 semaines. Pour constituer les groupes expérimentaux, tous les animaux seront génotypés par un génotypage de type "invasif", en biopsiant la queue des souris vers l'âge de 6 jours.
Impact sur les animaux
Les injections intraoculaires bilatérales sous anesthésie générale peuvent générer un inconfort passager, et potentiellement un risque de lésions oculaires. Les injections intrapéritonéales répétées peuvent stresser les souris et provoquer des inflammations ou des lésions locales qu'il faudra surveiller Quant aux souris âgées de 10 semaines, elles développent des symptômes neurologiques (pertes d'équilibre et coordination, tremblements) accompagnés d’un amaigrissement à partir de 6 semaines d'âge.
Devenir
Les souris sont mises à mort pour prélever des tissus.
Remplacement
Nous sommes obligés d'utiliser des animaux pour étudier les effets de molécules comme therapeutiques dans la maladie. Ces mécanismes dépendent d’interactions complexes entre une multitude de types cellulaires hautement spécialisés qui ne peuvent pas être imitées par des modèles alternatifs in vitro.
Réduction
Nous utilisons mâles et femelles pour réduire de moitié le nombre de souris. Et chaque souris est son propre contrôle et permet ainsi de réduire encore de moitié le nombre d'animaux. Le nombre d'animaux a été établi pour permettre d'obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes.
Raffinement
Les conditions d'hébergement des souris seront raffinées : les souris d'une même portée seront gardées ensemble après le sevrage jusqu’au moment de leur mise à mort et les cages sont enrichies avec du matériel de nidation et de barreaux à ronger. Elles seront nourries avec des bouchons ainsi qu’une forme gélifiée (pour faciliter la préhension) du même aliment, placés directement dans la litière pour faciliter l’accès aux souris si elles présentent des troubles locomoteurs. Les souris seront maniées à l'aide d'un tunnel de manipulation. Un suivi clinique quotidien sera assuré (ouverture de la cage pour l’examen du comportement locomoteur), ainsi que celui du poid. Une partie des injections sera réalisée sous anesthésie gazeuse. Nous avons aussi établi des points-limites permettant de soustaire l'animal à la souffrance.
Choix des espèces
La souris représente un modèle animal bien établi et reconnu pour étudier la rétine des mammifères et ses maladies. Il existe d’autres lignées murines et félines avec des mutations naturelles ou induites dans le même gène. Nous préférons utiliser la lignée choisie car elle développe les symptômes plus tôt et plus rapidement. Par conséquent, les souris souffrent moins que dans les autres modèles, qui ont besoin d'être maintenus plus longtemps. Dans l'étude de candidat médicament, les animaux seront utilisés à 4 semaines, soit après le sevrage et ne présenteront pas encore de symptôme de la maladie. Pour étudier et décrire les changements pathologiques très tardifs de la maladie, nous utiliserons des animaux âgés de 7 et 10 semaines.
Etude pilote: Effet du sumatriptan sur l’allodynie provoquée par des injections répétées de substances inflammatoires
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une canule est implantée à travers l'os du crâne, juste au-dessus des méninges, pour y déposer des substances inflammatoires douze fois en quatre semaines. 30 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélever le cerveau et d'autres organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque injection est suivie de l'application de filaments de von Frey sur la face toutes les quarante-cinq minutes pendant trois heures, et les rats vivent seuls en cage pendant six semaines parce qu'ils s'arrachent mutuellement les canules. Le porteur qualifie cette douleur de modérée et souligne que l'animal peut se soustraire à la stimulation, quand le projet est lui-même déclaré en gravité sévère.
Objectifs
L’objectif du projet est de développer un nouveau modèle de migraine qui nous permettrait de tester sur plusieurs semaines différentes molécules pharmacologiques comme traitements de la migraine. Avant de pouvoir commencer une étude pharmacologique où de nouvelles molécules seront testées, nous devons être sûrs d’avoir un modèle stable à travers le temps. C’est pourquoi nous souhaitons réaliser une étude pilote qui nous permettra de tester le modèle et de s’assurer qu’il répond aux molécules couramment utilisées pour traiter la migraine, à savoir les triptans. Pour cela, nous souhaitons mimer la phase de « mal de tête » (céphalée), en injectant des substances inflammatoires à la surface des méninges. En effet, pendant cette phase, la douleur ne peut être déclenchée qu’au niveau des méninges puisqu’il n’existe pas de récepteurs à la douleur dans le cerveau. L’hypothèse actuelle est que cette douleur est la conséquence d’une inflammation provoquée par des molécules (histamine, bradykinine, sérotonine, prostaglandines…) libérées par les fibres nerveuses au niveau des méninges. Une fois cette phase réalisée, nous testerons l’efficacité des triptans dans ce modèle. Nous évaluerons les effets de cette molécule au niveau du comportement, mais également en utilisant des marqueurs d’activation neuronale chez le rat mâle.
Bénéfices attendus
Cette étude pilote nous permettra d’étudier à plus long terme (sur 5 semaines au total) l’effet des injections répétées des substances inflammatoires. Notre hypothèse est que nous aurons une allodynie stable suite à la première semaine d’injection que nous entretiendrons par 1à 2 injections de substances inflammatoires par semaine, ce qui nous permettra de tester des substances pharmacologiques qui pourraient apporter une nouvelle réponse thérapeutique aux patients migraineux. Dans cette première étude, nous validerons notre modèle par l’étude de l’efficacité des triptans (traitement de référence des crises de migraine) au cours du temps.
Procédures
Les animaux seront soumis à 1 intervention chirurgicale qui consiste à implanter une canule juste au-dessus des méninges en passant à travers l’os du crâne, pour appliquer à la surface des méninges des substances chimiques, ce qui permettra de mimer ce qui se passe pendant les crises de migraines. Les chirurgies sont réalisées chez les animaux anesthésiés. Chaque chirurgie dure environ 30 à 45 min. L’injection de ces molécules sur les méninges permet de mimer les crises de migraine: 12 injections sur 4 semaines (au maximum) ; l'injection se fait sous anesthésie brève et dure moins de 2 min ; réveil des animaux en 5 min. La mesure de la sensibilité cutanée se fait par l'application de filaments fins sur la peau de l'animal sur la face toutes les 45 min pendant 3 h après l'injection des molécules sur la dure-mère (chaque application dure 3 secondes). Les jours entre les injections, la mesure se fait une fois.
Impact sur les animaux
Nous réalisons une procédure chirurgicale (implantation de la canule). La douleur est prise en charge en post-opératoire. Par ailleurs, nous utilisons un modèle de migraine qui provoque une douleur modérée de l’animal. Cette douleur n’empêche pas les mouvements de l’animal. Enfin, les stimulations mécaniques avec les filaments fins induisent un retrait de la face signe d’une douleur modérée. L’animal peut échapper à cette stimulation puisqu’il n’est pas en contention. Cette stimulation dure 3 secondes maximum. Un dernier effet indésirable est l’obligation de séparer les animaux (un par cage) après la chirurgie pour la mise en place de la canule. En effet, si les animaux restent ensemble, ils arrachent les canules. Ils sont donc seuls dans une cage pendant 6 semaines.
Devenir
La procédure ne permet pas de réutiliser les animaux. En effet, elle se termine par des études immunohistochimiques qui nécessitent de prélever le cerveau ainsi que d'autres organes pouvant servir à d'autres études : les animaux seront donc mis à mort à la fin de la procédure.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. En effet il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique simultanément.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum. Huit animaux par groupe est le nombre d'animaux nécessaire pour permettre de mettre en évidence une différence statistique entre eux. Cependant, l’expérience montre qu'un certain nombre d'échecs est rencontré lors des études qui incluent une chirurgie (perforation des méninges, anesthésie, canules bouchées, échec de l'habituation) soit des échecs dans environ 20% des cas, ce qui nous amène à prendre 10 animaux par groupe. Pour réduire le nombre d’animaux, cette étude ne sera réalisée que chez les mâles puisque c’est une étude pilote pour valider le modèle. Par ailleurs des études antérieures nous ont montré que l’injection de ces substances induisaient le même effet chez les mâles et les femelles. Une fois les animaux mis à mort, un maximum d'organes sera prélevé et stocké afin d'être utilisés pour ce projet ou pour d'autres études. Cela évitera de mettre à mort de nouveaux animaux pour ces autres études.
Raffinement
Les nuisances identifiées sur le bien-être des animaux sont : la douleur engendrée par la chirurgie, la douleur engendrée dans le cadre du modèle, et la séparation des animaux après la mise en place de la canule sur les méninges. Afin de réduire la douleur de la chirurgie, un traitement avec un antalgique est donné pendant 3 jours. Pour éviter le dessèchement de la cornée pendant la chirurgie, la cornée est protégée par de la vaseline pendant toute cette étape. Concernant la douleur générée par l’application des filaments de Von Frey, nous limitons les stimulations en durée et en intensité au minimum et l’animal a la possibilité d’échapper à la stimulation puisqu’il est libre de ses mouvements. Pour améliorer le bien-être des animaux après la chirurgie, les cages sont enrichies à l'aide de rouleaux permettant aux animaux de se cacher avant la chirurgie. Après l’implantation de la canule, les animaux seront seuls dans une cage pour éviter de s’arracher les canules. Les rouleaux seront remplacés (risque d’arracher la canule) par des feuilles de sopalin blanc et des lanières de papier kraft pour permettre aux animaux de faire un nid.
Choix des espèces
La souche Sprague-Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Les animaux seront âgés de 6-8 semaines pour la comparaison avec les autres données de la littérature : les rats sont considérés comme adultes.
Role de MUC1 dans la progression tumorale et la chimioresistance dans un modèle murin de cancer du poumon
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Anesthésiées, tondues sur le flanc, injectées de cellules cancéreuses, 360 souris entrent dans un protocole de vingt à vingt-quatre jours classé au niveau de souffrance sévère. Dès que la tumeur atteint le volume fixé, 120 reçoivent une chimiothérapie au platine chaque jour pendant six jours, 240 une injection dans la tumeur tous les quatre jours, dont 120 les deux traitements à la suite. Toutes sont pesées deux fois par semaine et leurs tumeurs mesurées au pied à coulisse sur animal vigile, cinq minutes par mesure, le porteur écrivant qu'aucune analgésie n'est préconisée aux doses utilisées et que le développement tumoral ne devrait pas gêner leurs déplacements. Toutes sont tuées à la fin pour récupérer les échantillons qui permettront de juger de l'effet des traitements.
Objectifs
Le cancer du poumon (dont 85% sont des cancers bronchiques dits non à petites cellules ou NSCLC) reste la 1ère cause de mortalité par cancer dans les pays développés avec plus d’1 million de décès par an dans le monde. Le traitement de 1ère intention des NSCLC se fait par chirurgie mais un 1/3 des patients présente des stades trop avancés de la maladie rendant ainsi l’ablation de la tumeur impossible. La chimiothérapie (utilisation de sels de platine) représente une facette essentielle dans la prise en charge des patients atteints de cette pathologie. Même si ces agents anticancéreux éliminent une grande majorité des cellules tumorales pulmonaires, il est fréquent qu’une proportion d’entre elles résiste favorisant ainsi l’apparition de récidives et de métastases. Dans ce contexte, des analyses sur des cohortes de patients ont montré que dans de nombreuses tumeurs présentant une résistance à la chimiothérapie le gène codant une protéine particulière était surexprimé. Cette protéine, la mucine 1, est notamment impliquée dans la protection des cellules en contact avec le milieu extérieur contre toutes sortes d’agressions. Dans ce projet, nous nous intéresserons donc à la mucine 1. Dans le cancer du poumon, elle est surexprimée dans 60-80% des adénocarcinomes en comparaison avec un poumon sain. Les données de la littérature montrent que la surexpression de la mucine 1 est associée à la progression tumorale, aux phénomènes de chimiorésistance et la mise en place d’un microenvironnement immunosuppresseur (qui supprime la réponse immunitaire face à la tumeur). De ces observations, nous avons émis l’hypothèse que la mucine 1 pourrait être impliquée dans les phénomènes de chimiorésistance au cisplatine et interviendrait également sur les propriétés des cellules cancéreuses pulmonaires et sur le microenvironnement tumoral. Afin de valider cette hypothèse, nous étudierons le rôle de la mucine 1 sur les propriétés et le microenvironnement des cellules cancéreuses pulmonaires et nous évaluerons de nouvelles pistes thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de tester le bénéfice de nouvelles stratégies thérapeutiques associant des inhibiteurs oligonucléotidiques à des agents de chimiothérapie conventionnelle.
Procédures
Ce projet se déroulera en deux parties. Cependant, plusieurs étapes sont communes à l’ensemble des parties. L’ensemble des animaux (360) sera soumis à une anesthésie par injection (durée 20 min) afin, dans un premier temps de tondre une partie de leur pelage au niveau du flanc où ils recevront une injection de cellules cancéreuses (durée injection : 30 sec). Dès que le volume tumoral défini pour intervention sera atteint, une partie des animaux (120) recevront une injection d'un agent de chimiothérapie tous les jours pendant 6 jours (durée : 1 min). L'autre partie des animaux (240) recevront dans un premier temps une injection dans la tumeur de notre traitement d'intérêt à raison d'une injection tous les 4 jours jusqu'à la fin du protocole (durée : 1 min). En addition de ce traitement, 120 animaux seront en plus traités par la suite avec l'agent de chimiothérapie tous les jours pendant 6 jours (durée : 1 min). L'ensemble des animaux (360) seront pesés deux fois par semaine (durée : 2 min par animal) et la taille des tumeurs sera mesurée par l’utilisation d’un pied à coulisse (sur animaux vigiles, durée : 5min/intervention). De plus, pour 120 animaux, l'évolution de la tumeur sera également évaluée par imagerie. Pour cela les animaux seront anesthésiés par voie gazeuse et une molécule facilitant la lecture de l'imagerie sera injectée (durée anesthésie : 20-30 min, durée injection : 30 sec). La durée maximale des manipulations sera de 24 jours pour 240 animaux et de 20 jours pour 120 animaux et ce, dépendamment du type de cellules tumorales injectées.
Impact sur les animaux
Les procédures que nous prévoyons de réaliser pourraient être à l’origine d’un stress lié à la manipulation. L’injection des cellules et/ou de la luciférine pourrait entraîner un stress ou une douleur chez les animaux. Pour limiter le stress des animaux, ces derniers seront anesthésiés lors de ces étapes de la procédure. Aux sites où les cellules seront injectées, le développement des tumeurs ne devrait pas entraver la liberté de mouvement des souris, cependant si cette liberté était altérée, une mise à mort des animaux sera réalisée. Les doses d'agent de chimiothérapie et du traitement d'intérêt utilisés dans ce protocole ne sont pas décrits dans la littérature comme susceptibles d’induire des effets indésirables (toxicité) sur les animaux. De même, aucune analgésie encadrant leurs injections intra-tumorales n’est préconisée au vu des doses utilisées. Le suivi régulier des animaux permettra de pallier toute souffrance ou détresse ressenties par ces derniers.
Devenir
TDans ce projet, nous étudions l'effet d'une nouvelle combinaison de traitements sur des tumeurs établies. Afin de mieux comprendre l'impact de nos traitements sur l'organisme, nous devrons récupérer différents échantillons nécessitant la mise à mort des animaux.
Remplacement
Les modèles utilisés dans ce projet ne nécessitent pas de mises au point car elles utilisent des procédures couramment décrites dans la littérature. De plus, les sélections de Gapmers ont été réalisés sur des modèles in vitro de manière à remplacer la mise au point sur les animaux. Cependant, les processus étudiés dans ce projet mettent en jeu de nombreux types cellulaires (cellules tumorales et celles du microenvironnement dont celles du système immunitaire), leur étude en concomitance ne peut se concevoir que sur un organisme entier d’où ce recours à l’expérimentation animale.
Réduction
Pour la reproductibilité, les expériences seront répétées au moins 3 fois. Les courbes de survie seront établies grâce à un test statistique spécifique dont la fiabilité prévoit des échantillons d’une taille minimum de 30 animaux. Pour cela, des groupes de 10 animaux sont prévus. Les différences significatives entre les courbes de survie des animaux des groupes traités ou non seront analysées par un test statistique adapté aux données. Les différences significatives entre les courbes de survie des animaux des groupes traités ou non seront analysées par un test statistique adapté aux données.
Raffinement
Lors de l’expérimentation, les animaux seront anesthésiés avant toute procédure pouvant provoquer un stress, une angoisse ou une souffrance. Les animaux seront ensuite suivis quotidiennement de manière à pouvoir détecter le plus rapidement possible tout signe de souffrance ou d’angoisse. Les animaux sont hébergés dans des cages individuelles en groupes sociaux enrichies avec des cotons de nidification et dans des conditions classiques de stabulation. Avant toute manipulation, les animaux seront acclimatés de 7 à 10 jours dans leur salle d’hébergement. Des points limite de douleur ont été déterminés préalablement au projet. La mise à mort sera réalisée à distance des autres animaux.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme espèce animale repose sur la grande disponibilité des outils moléculaires (anticorps spécifiques pour l’immunohistochimie, le western blot et la cytométrie en flux, souches animales adaptées, amorces et sondes spécifiques pour la RT-qPCR) permettant de mener à bien ce projet. De plus, cette espèce est l’une des mieux caractérisée au niveau immunologique. Nous pouvons également bénéficier de modèles immunodéficients largement décrits dans la littérature qui sont essentiels au bon déroulé de notre projet. En nous basant sur les données de la littérature concernant les modèles que nous souhaitons étudier, nous utiliserons des souris âgées de 4 à 8 semaines pour le premier modèle et de 6 à 10 semaines pour le second modèle.