Procédures sévères
Etude des effets du vieillissement et de candidats-médicaments sur la régénérescence de l’axe moteur périphérique dans un modèle murin de compression nerveuse.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Si l'analgésique administré ne suffit pas, l'animal est mis à mort. 1 824 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacune subit sous anesthésie une chirurgie de trente minutes qui comprime et lèse le nerf sciatique, puis une injection quotidienne pendant 28 ou 42 jours et deux électromyographies, le porteur reconnaissant que la lésion "provoquera de la souffrance" et que la pesée quotidienne y ajoute du stress. Deux questions justifient ces 1 824 souris, l'effet de candidats-médicaments et celui du vieillissement sur la repousse nerveuse, et le seul bénéfice annoncé tient dans la poursuite du développement de ces molécules si les résultats sont positifs.
Objectifs
Les atteintes de l’axe moteur, telles que la perte des axones et des neurones moteurs ainsi que la dénervation musculaire, sont à l’origine des maladies neuromusculaires. Des études montrent que dans certaines maladies neuromusculaires, comme la sclérose latérale amyotrophique, les neurones moteurs encore fonctionnels sont capables de compenser cette perte en créant de nouveaux prolongements axonaux et une réinnervation partielle. Ces mécanismes compensatoires sont induits par des voies de signalisations pro-régénératives : on parle de régénérescence de l’axe moteur. Ici, nous avons 2 objectifs : 1) étudier les effets de différents candidats-médicaments pour leur capacité à promouvoir la régénérescence de l’axe moteur après compression/lésion du nerf sciatique. 2) étudier l'effet du vieillissement sur la capacité à promouvoir la régénérescence de l’axe moteur après compression/lésion du nerf sciatique. Pour cela, nous utiliserons un modèle murin de lésion mécanique du nerf sciatique. En effet, la souris possède un système moteur complexe présentant de fortes similitudes avec le système moteur humain. Une lésion du nerf sciatique va en effet conduire à une dénervation musculaire et à une dégénérescence wallérienne, comme chez les humains. Le système moteur des souris est capable de régénérescence après lésion. Seulement 10 jours après la lésion, les souris présentent des signes de récupération fonctionnelle ainsi que réinnervation du muscle. La souris est donc un modèle approprié permettant la mise en place de protocoles expérimentaux courts, efficaces, simples et reproductibles.
Bénéfices attendus
Le projet s'intégre dans la phase préclinique du développement de candidats-médicaments pour des maladies invalidantes. En cas de résultats positifs, le développement du ou des candidats médicaments pourra se poursuivre.
Procédures
L'ensemble des animaux de ce projet subiront la procédure décrite: une chirurgie (1 fois, 30 minutes maximum), sous anesthésie générale, et une analgésie systémique et une analgésie locale. Leur état clinique sera surveillé pendant cinq jours postopératoire pour détecter un effet indésirable ou des signes de souffrance. La procédure 1 inclue des traitements chroniques (une fois par jour, pendant 28 jours, d'une durée de 30 secondes maximum). La procédure 2 inclue des traitements chroniques (une fois par jour, pendant 42 jours, d'une durée de 30 secondes maximum). Les enregistrements électromyographiques (EMG) auront lieu à 2 reprises (J14 et J21 pour la procédure 1, et J35 et J42 pour la procédure 2). Ceux-ci durent maximum 30 minutes, et seront réalisés sous anésthésie générale. En fin de procédure, les animaux seront mis à mort.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une chirurgie et une lésion mécanique du nerf sciatique. Cette lésion provoquera de la souffrance. Le traitement quotidien des souris peut induire un stress, particulièrement lors des premières administrations. Des mesures électromyographiques seront réalisées sous anesthésies. De plus, la mesure quotidienne des poids des animaux peut également engendrer un stress chez les animaux.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de collecter des tissus pour des analyses complémentaires (histologie).
Remplacement
Les processus de dénervation et réinnervation impliquent l'interaction de plusieurs types cellulaires (motoneurons, cellules de l'immunité et cellules de Schwann) dans différentes structures (moelle épinière, nerf sciatique, muscle). Ce degré de complexité ne peut être atteint qu’avec un modèle animal.
Réduction
Le nombre de souris (n par expérience) a été optimisé pour assurer l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Des études antérieures disponibles dans la littérature scientifique ainsi que l’expérience du porteur du projet suggèrent un nombre minimal de 12 souris par groupe, afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs (puissance: 80%, seuil de significativité à 5%, effect un effet de 25% et un écart type de 15%). Ainsi, pour ce projet, nous travaillerons avec n=12 souris par groupe pour détecter d’éventuel effets significatifs de candidats médicaments dans un modèle animal de lésion mécanique du nerf sciatique.
Raffinement
Le raffinement sera basé sur : (i) la présence d’objets d'enrichissement (papiers pour nids, tunnels en carton), (ii) des approches d'analgésies quand nécessaire, (iii) et le contrôle strict des paramètres physiologiques des animaux (poids, température corporelle). Les animaux seront hébergés par 4 au maximum, avec accès ad libitum à l'eau et à la nourriture. La souffrance des animaux sera limitée au maximum grâce à la recherche quotidienne de signes indicateurs de souffrances. Le projet a défini des points limites. Si un de ces points limites est atteint, le responsable de l’étude sera informé et l’animal sera mis à mort. Si des signes de souffrances sont détectés, le responsable de l’étude sera informé, et un analgésique (buprénorphine, 0.1 mg/kg) sera administré. Dans le cas où le traitement analgésique se révèlerait être inefficace, l’animal sera mis à mort.
Choix des espèces
La souris possède un système moteur complexe présentant de fortes similitudes avec le système moteur humain. Une semaine après la lésion du nerf, les souris présentent les premiers signes de réinnervation musculaire. La réinnervation et la récupération fonctionnelle est observable à partir de 10 jours après la lésion. La souris est donc un modèle approprié permettant la mise en place de protocoles expérimentaux courts, efficaces, simples et reproductibles. Nous utiliserons dans ce projet des souris. Afin de pouvoir évaluer l'effet du veillissement sur les procéssus de récupération fonctionnelle après une lésion du nerf, nous utiliserons des animaux âgés de 2, 12, 15 et 18 mois. Afin de tester l'efficacité de différents candidats-médicaments, nous utiliserons des animaux de 2 mois.
Evaluation de l’efficacité de lots de produit pharmaceutique d’une molécule thérapeutique dirigée contre une toxine végétale en vue de sa mise sur le marché
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Toutes tuées à l'issue, sans réutilisation possible parce que leur corps contient la toxine, 2 500 souris vont être intoxiquées par une toxine végétale classée parmi les agents de bioterrorisme aux États-Unis. 2 100 sont soumises à des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 400 à un niveau sévère. Chaque animal reçoit sous anesthésie une injection de toxine puis d'anticorps, avec deux prélèvements de sang, les effets attendus allant de la perte de poids et de la mobilité réduite aux difficultés respiratoires et aux douleurs liées à la destruction des tissus, jusqu'à la mort. Aucun anti-inflammatoire n'est administré, le porteur indiquant qu'il perturberait la survie et l'effet des molécules testées, et le même projet revendique comme second objectif de démontrer la corrélation avec une technique in vitro afin de remplacer "dès que possible" ce test sur les souris.
Objectifs
La toxine d’origine végétale, cible de ce projet, est classée dans la liste des agents bioterroristes des CDC (Centers for Diseases Control and Prevention) aux Etats-Unis. Sa disponibilité dans la nature et sa facilité d’extraction font de cette toxine une arme de bioterrorisme, et de nombreuses tentatives ayant pour objectifs son utilisation à des fins malveillantes ont été répertoriées notamment en France à Paris en 2018 ainsi qu’en Allemagne à Cologne en 2023. A ce jour, aucun traitement n’est disponible commercialement. Une contre-mesure médicale a été développée et il est maintenant nécessaire d’utiliser un test de contrôle de qualité pour garantir que chaque lot de produit pharmaceutique fini possède les caractéristiques d’efficacité revendiquées. Le projet présente deux objectifs majeurs : 1) Contrôler l’efficacité de lots de produits pharmaceutiques administrés à la dose cible dans un modèle in vivo, à la suite d’une intoxication avec la toxine végétale. Ce premier objectif va permettre le contrôle qualité de l’efficacité et donc la libération de lots de produits pharmaceutiques selon les exigences réglementaires. 2) Le deuxième objectif est de répondre à la demande globale de remplacement des techniques de contrôle de qualité de l’efficacité in vivo (seule technique pertinente aujourd’hui pour la toxine) par une technique in vitro. Il est indispensable, pour sa recevabilité réglementaire, de démontrer que la technique in vitro est fortement corrélée avec la technique in vivo pour le contrôle de l’efficacité thérapeutique des lots de produit pharmaceutique. Le prérequis de cette démarche de remplacement est donc de disposer d’un nombre de données vivo/vitro suffisantes pour démontrer la corrélation des techniques nécessaire au dépôt du dossier d’enregistrement.
Bénéfices attendus
L’objectif premier du projet est de contrôler l’efficacité de différents lots de produit pharmaceutique d’une molécule thérapeutique en utilisant un modèle murin d’intoxication par une toxine végétale. Dans le contexte de la classification de cette toxine végétale comme agent de bioterrorisme et l’absence de traitement, le bénéfice attendu est la mise sur le marché d’un traitement contre les intoxications à cette toxine. Cette technique in vivo d’intoxication dans le modèle murin, seule technique fiable pour contrôler l’efficacité d’une molécule thérapeutique contre cette toxine, va permettre de répondre aux requis réglementaires de contrôle de l’efficacité du produit pharmaceutique dans le cadre de l’enregistrement de cette molécule thérapeutique et sa mise sur le marché. De plus, elle permettra la libération des lots de produits pharmaceutiques de cette molécule thérapeutique au cours des années. Le second objectif du projet est de démontrer la corrélation des techniques vivo/vitro pour la mesure de l’efficacité de lots de produits pharmaceutiques. Le bénéfice attendu de cet objectif est de pouvoir remplacer, dès que possible, la technique in vivo par une technique in vitro. Plusieurs techniques sont en cours d’évaluation et les mesures obtenues in vitro seront comparées, pour les mêmes échantillons, aux données obtenues par le modèle de référence in vivo. Si l’une des techniques in vitro démontre une corrélation suffisamment robuste avec les données de la technique in vivo, et si ce niveau de corrélation est accepté par les autorités réglementaires, elle sera alors utilisée en remplacement de la technique in vivo.
Procédures
Des prélèvements de sang et des injections (intoxication à la toxine et administration des anticorps) seront réalisés sur les animaux. Ces manipulations pouvant entrainer des perturbations du bien-être animal, elles seront réalisées sur des animaux anesthésiées. Les prélèvements sanguins seront au nombre de deux et seront réalisés rapidement (30 à 60 secondes). Le volume prélevé sera adapté au poids de l’animal et toujours réalisé sur animaux anesthésiés. L’intoxication et l’administration des anticorps ne sera réalisé qu’une seule fois et ce fera de manière rapide (30 à 60 secondes).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables (douleur et stress) liés aux gestes associés à la procédure (injections et/ou prélèvements) seront limités car réalisés sous anesthésie générale. Les effets indésirables associés à l’intoxication sont une perte de poids, une mobilité réduite, des difficultés respiratoires ainsi que des douleurs associées aux destructions tissulaires en lien avec les effets de la toxine pouvant entraîner la mort de l’animal. Ces effets indésirables sont pris en compte dans la définition des points limites. L’objectif premier de ce projet étant le contrôle qualité d’une contre-mesure médicale, à priori efficace. La majorité des souris seront traitées avec cette contre-mesure, limitant les effets de l’administration de la toxine.
Devenir
A la fin de cette procédure, l’ensemble des animaux seront euthanasiés. Les animaux ne peuvent être réutilisés dans une autre procédure étant donné la présence de la toxine.
Remplacement
A ce jour, aucun modèle in vitro ou in silico n’est capable de prédire à 100% l’efficacité des molécules thérapeutiques lors de l’intoxication par cette toxine végétale. En effet, il existe des disparités entre les résultats obtenus par les méthodes actuelles in vitro et ceux obtenus in vivo. Nous avons ainsi pu observer qu’une molécule apportant une très bonne neutralisation à l’échelle d’une lignée cellulaire dans le modèle in vitro avait une efficacité très modérée in vivo. Ainsi, les mécanismes d’action des molécules thérapeutiques contre cette toxine peuvent être multiples et un effet à l’échelle cellulaire ne reflète pas toujours un effet sur un organisme entier. A ce jour, il est donc nécessaire de passer par des modèles plus complexes pour contrôler l’efficacité de lots de produit pharmaceutique, prenant en compte la distribution de la toxine comme celle de la molécule thérapeutique, la réponse inflammatoire et immunitaire, comme c’est le cas avec des modèles murins. Le deuxième objectif de ce projet est de démontrer la corrélation entre la technique de contrôle de l’efficacité in vivo et de nouvelles techniques in vitro. Si la corrélation est suffisante aux requis réglementaires, la technique in vivo sera remplacée par une technique in vitro pour le contrôle de l’efficacité des lots de produit pharmaceutique.
Réduction
Objectif 1 : Le nombre d’animaux utilisés pour contrôler chaque lot de produit pharmaceutique doit correspondre au nombre permettant de conclure que l’échantillon contrôlé a bien une efficacité supérieure à la spécification et différente du groupe placébo. La détermination de ce nombre minimum d’animaux a fait l’objet d’une analyse biostatistique qui tient compte les différentes variables du modèle. Cette analyse a permis de déterminer le nombre minimal d’animaux par groupe nécessaire pour comparer les taux de survie obtenus lors d’un test in vivo à la spécification d’efficacité du produit avec un niveau de confiance minimal requis réglementairement. Objectif 2 : Le nombre d’animaux utilisés pour démontrer la corrélation entre les techniques vivo/vitro doit correspondre au nombre permettant de s’assurer que la technique in vitro est fiable et robuste pour contrôler l’efficacité des lots de produit pharmaceutique. La détermination de ce nombre minimum d’animaux a fait l’objet d’une analyse biostatistique qui tient compte les différentes variables du modèle. Cette analyse a permis de déterminer le nombre minimal d’animaux par groupe nécessaire pour réaliser les analyses de corrélations entre les techniques vivo/vitro avec un niveau de confiance minimal requis réglementairement. Objectif 1 & 2 : Les groupes placébo seront mutualisés. Un seul groupe placébo sera utilisé pour chaque phase expérimentale incluant des groupes répondant à l’objectif 1 (avec plusieurs lots de produit pharmaceutique) et des groupes répondant à l’objectif 2 (avec plusieurs lots de corrélation).
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cage collective afin de favoriser les relations sociales. Une hutte en carton ainsi qu’une feuille de cellulose seront également ajoutées pour maximiser le bien-être des animaux et leur permettre de faire leur nid. Les animaux seront également observés quotidiennement durant toute la durée des essais, et lors de l’ensemble des procédures par du personnel qualifié. L’ensemble des procédures sera réalisé sur animaux anesthésiés. Les points limites déterminés pour ces essais (notamment les signes cliniques) nous serviront à nous assurer du bien-être des animaux, et nous permettront d’éviter une souffrance trop importante. Lors des essais avec la toxine, des aliments hydratés seront ajoutés dans la cage pour éviter la déshydratation des animaux. L’utilisation d’anti-inflammatoires est impossible, du fait de leurs effets potentiels sur la survie et sur l’effet thérapeutique des molécules testées.
Choix des espèces
Le modèle murin est majoritairement utilisé et a été amplement validé pour l’évaluation d’activité de différentes contre-mesures médicales contre ricinecette toxine. Les souris utilisées sont adultes car elles possèdent à cet âge-là un système immunitaire mature. La facilité d’élevage et de manipulation des souris font de ces animaux un modèle adéquat pour faire ces essais. Par ailleurs, la petite taille des souris fait utiliser une dose de toxine qui est très inférieure à la dose toxique chez l’homme, ce qui constitue un facteur de sécurité pour les opérateurs qui manipulent la toxine.
Isolement et revivification des souches de Toxoplasma gondii en modèle murin
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Pour isoler et caractériser les souches de Toxoplasma gondii circulant chez l'humain et dans la faune, 640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 540 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacune reçoit dans l'abdomen une inoculation de l'échantillon à tester, puis un ou deux prélèvements de sang et de sécrétions sous anesthésie. Le porteur reconnaît que la culture cellulaire permet de cultiver le toxoplasme, tout en la jugeant moins sensible, et la réserve aux prélèvements qu'il ne considère pas comme précieux. Il écrit que dans la majorité des cas les souris ne présentent aucun effet indésirable, tout en décrivant une fièvre de quelques heures et "parfois mort rapide durant la nuit en cas d'infection sévère".
Objectifs
La détection et l'étude des souches de toxoplasme circulant chez l'humain et au sein de la faune sauvage et domestique se justifie par un intérêt épidémiologique (caractérisation génétique permettant de connaître la circulation des souches du parasite dans le contexte d'une seule santé : One Health). Dans ce cadre, l'isolement de ces souches ne peut se faire de manière satisfaisante que sur modèle murin en laboratoire, la culture cellulaire étant significativement moins sensible, et plus sujette aux contaminations.
Bénéfices attendus
Un des objectifs du projet est de mieux connaître l’épidémiologie des souches de toxoplasmes en France métropolitaine et DOM-TOM et d’étudier ainsi la biodiversité de T. gondii à des fins de santé publique. Pour cela, ce projet vise à collecter les souches issues des prélèvements cliniques, de les caractériser (d’un point de vue phénotypique et génotypique), les comparer aux souches circulant dans le monde et le cas échéant, alerter les autorités sanitaires de la survenue de cas groupés dus à des génotypes identiques ou voisins. Ces travaux incluent également une comparaison des souches humaines avec celles isolées dans l’environnement (notamment les souches isolées des animaux impliqués dans la transmission de la maladie).
Procédures
Les interventions qui peuvent causer des nuisances sont: (1) l'inoculation en intrapéritonéale de l'échantillon, qui peut causer une gêne sur un laps de temps très court; (2) et le prélèvement sanguin et autres sécretions en lien avec l'infection, réalisé sur l’animal sous anésthésie, qui peut causer un stress de quelques secondes lié à la contention. Ces interventions sont réalisées une seule fois, à l'exception des sécretions en lien avec l'infection, qui peuvent etre réalisées jusqu'à deux fois.
Impact sur les animaux
Dans la majorité des cas, les souris ne présentent aucun effet indésirable. Dans une minorité de cas où les souris présenteraient des symptomes, les seules nuisances sont liées à l'infection (animal fièvreux durant quelques heures maximum et parfois mort rapide durant la nuit en cas d'infection sévère).
Devenir
Les animaux ayant été infectés par un agent pathogène, les souris devront être systèmatiquement euthanasiées en fin de procédure.
Remplacement
La culture cellulaire est possible pour le toxoplasme, mais elle est de moindre sensibilité que l’isolement chez la souris. Elle sera réalisée lorsque les prélèvements auront été réalisées dans des conditions proches de l'asepsie et que les prélèvements n'auront pas été considérés comme précieux (prélèvements précieux : prélèvements humains et prélèvements d'animaux pour lesquelles peu de données existent).
Réduction
L'optimisation du protocole a permis de réduire le nombre de souris utilisées de 6 à 3 sans nuire à la réussite de l’isolement de souches.
Raffinement
Les 2 à 3 souris inoculées en fonction de la procédure sont hébergées dans des cages pouvant contenir 5 à 6 souris d’après les normes en vigueur. Les souris font l’objet d’un enrichissement dès leur mise en cage et jusqu’à la fin de l’expérimentation. Dans les cas où la souche infectante montre des signes de virulence, une grille de score de la douleur, établie dans le cadre du projet, est suivie pour définir les interventions ou point limites à appliquer. Ces interventions incluent, le cas échéant, l'administration d'un traitement antidouleur, l'augmentation de la fréquence d’observation (deux à trois fois par jour au lieu d’une seule) et l'euthanasie des animaux si le score de la douleur correspond au point limite atteint. Tous les prélèvements seront réalisés sous anesthésie générale.
Choix des espèces
Les souris (Mus musculus) sont l’animal de choix pour l’isolement du parasite. Mis à part le chat domestique, la souris représente l'espèce animale de laboratoire la plus adaptée pour l'isolement de souches de toxoplasmes (le modèle rat par exemple ne permet pas cet isolement). Elle est utilisée par l'ensemble des équipes de recherche internationale qui travaille sur l'isolement du toxoplasme. Des souris femelles à partir de 4 à 8 semaines sont utilisées afin de permettre l'inoculation des prélèvements. L’âge des animaux utilisés dans nos procédures correspond à une taille et un poids de l’animal minimums pour lequel l’injection du volume d’inoculum envisagé est bien toléré.
Impact de la douleur neuropathique sur l’activation des circuits neuronaux par les opiacés
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 840 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une lésion partielle du nerf sciatique, posée en dix minutes de chirurgie, leur inflige une douleur neuropathique non réversible, avec une hypersensibilité persistante au froid et au toucher, puis elles reçoivent jusqu'à neuf injections quotidiennes de morphine ou d'une molécule ciblant les hétéromères mu-delta. Cette douleur ne peut pas être évitée, indique le porteur, puisqu'elle est l'objet même de l'étude, qui vise à cartographier les circuits neuronaux activés par les opiacés. Il justifie la mise à mort par le seul besoin de prélèvements, et affirme que l'effet analgésique ne peut être évalué que sur un "organisme entier et vivant".
Objectifs
La douleur neuropathique affecte 8 à 10% de la population et, dans nombre de cas, est réfractaire aux traitements actuellement disponibles y compris les opiacés forts, tels que la morphine, ciblant le récepteur opioïde mu. L'association des récepteurs opioïdes mu avec les récepteurs opioïdes delta génère une nouvelle entité fonctionnelle appelée hétéromères opioïdes mu-delta. Les données de la littérature indiquent que l'activation de ces hétéromères induit une analgésie associée à moins d'effets indésirables. Notre projet a pour but d'identifier les circuits neuronaux activés en réponse à une administration aiguë ou répétée d'une molécule ciblant les hétéromères mu-delta et de les comparer à ceux activés par la morphine, molécule de référence en clinique, pour en identifier les spécificités. L'activation neuronale et les concentrations en neurotransmetteurs seront évaluées en souris neuropathiques ou en condition contrôle. L'utilisation de lignées de souris n'exprimant qu'un seul récepteur permettra de s’assurer que les molécules testées n’ont pas d’effet sur les récepteurs individuels non associés en hétéromères mu-delta. L'objectif est de mieux comprendre les modifications se mettant en place dans la condition neuropathique et leur impact sur l'efficacité des traitements analgésiques pour proposer, à terme, des stratégies plus efficaces
Bénéfices attendus
Les résultats attendus de ce projet permettront une meilleure connaissance de l'impact de la condition neuropathique sur l'activation des réseaux neuronaux par les opiacés. Ils apporteront des informations complémentaires dans le cas de la morphine, opiacé de référence dont l'efficacité est faible en condition neuropathique. ils permettront ensuite d'établir les spécificités associées au maintien de l'effet analgésique pour ce qui concerne le ligand ciblant les hétéromères mu-delta. Ils prendront en compte les différences liées au sexe dans les effets des opiacés et les mécanismes qui sous-tendent la douleur neuropathique.
Procédures
Un groupe de souris adultes sera testé quotidiennement pendant 10 secondes sur une durée de 5 jours puis subira une chirurgie d'une durée de 10 minutes. Il recevra après la chirurgie une injection quotidienne de 10 secondes pendant 8 jours et sera testé 14 fois dans un test de 10 secondes (soit au total moins de 4 minutes de test et moins de 2 minutes d’injection sur une période de 35 jours). Un deuxième groupe de souris adultes subira une chirurgie d'une durée de 10 minutes et recevra 2 injections de 10 secondes a 30 ou 90 minutes d’intervalle (soit 20 secondes d’injection au total) sur une periode de 20 jours. Un troisième groupe de souris adultes subira une chirurgie d'une durée de 10 minutes et recevra 9 injections quotidiennes de 10 secondes (soit au total 1, 5 minutes d’injection) sur une periode de 28 jours
Impact sur les animaux
La lésion partielle du nerf sciatique induit une douleur de type neuropathique non réversible qui se traduit par une allodynie au froid et une allodynie mécanique persistentes. Ceci ne peut être éviter puisque le sujet de l’étude est précisément de caractériser les changements associés à cette douleur et leur impact sur analgésique des composés testés. Les souris génétiquement modifiées utilisées dans ce projet ne présentent pas de phénotype dommageable. Les injections intrapéritonéales peuvent occasionnellement entrainer un léger saignement.
Devenir
mise à mort pour prélèvement.
Remplacement
L'effet analgésique ne peut être évalué que sur organisme entier et vivant. Le modèle murin est un bon prédicteur des réponses analgésiques chez l'homme. Il permet aussi l'accès à des modifications génétiques essentielles à la caractérisation des composés telles les souris n'exprimant qu'un seul récepteur opioïde pour établir le profil de sélectivité de l'action des composés testés.
Réduction
Une veille de la littérature sera effectuée durant toute la durée du projet afin de s'assurer du caractère original des expériences proposées et d'intégrer toute nouvelle donnée qui permettrait de réduire le nombre de paramètres à tester. Des expériences pilote sur des groupes d'animaux de taille réduite seront menées pour toute mise au point de protocole et le nombre d'animaux a été déterminé par une approche statistique.
Raffinement
Les conditions d’hébergement et de manipulation des animaux sont optimisées pour respecter les besoins d'interaction sociale et reduire le stress des animaux. Les procédures invasives sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie. Des points limites sont établis pour chaque procédure pour prévenir toute souffrance inutile. S’ils sont atteints, l’animal est mis à mort en concertation avec la vétérinaire et/ou la SBEA. Une veille de la littérature et la participation à de séminaires dans le cadre de la formation continue en expérimentation animale permettent d'intégrer aux procédures tout nouvel élément contribuant au bien-être animal.
Choix des espèces
l'espèce animale a été choisie car (1) ces animaux peuvent être modifiés génétiquement et (2) cette espèce est un modèle validé du comportement humain pour les questions abordées dans ce projet. L'étude sera réalisées sur des souris adultes agées d'au moins 6 semaines.
Etudes précliniques non-réglementaire d’une immunothérapie des muqueuses avec l’IgA pour le traitement du cancer colorectal
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
620 souris subissent une greffe de cellules tumorales dans le caecum puis l'ablation d'une partie de cet organe, sur les 1 240 utilisées pour tester l'efficacité du médicament. 1 330 souris vont être utilisées en tout, toutes tuées à l'issue, dont 1 240 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Trois d'entre elles sont utilisées pour former le personnel aux gestes de chirurgie, et une cohorte est tuée chaque semaine de la troisième à la huitième pour observer la prise tumorale et l'apparition de métastases. Le porteur écrit que les traitements "n'entraineront pas de douleur supérieure à celle d'une piqure d'aiguille", alors que 1 240 souris sont déclarées en souffrance sévère.
Objectifs
Le cancer colorectal est le second cancer, en terme de fréquence, chez la femme (après le cancer du sein) et le troisième chez l'homme (après le cancer du poumon et celui de la prostate). Les cancers coliques ont une fréquence élevée en France : chaque jour, 100 personnes apprennent qu'elles ont un cancer colorectal. Plus exactement, on découvre 33 000 nouveaux cas par an, et 16 000 personnes en meurent. Chez les non-fumeurs, il est la deuxième cause de mortalité par cancer. Les hommes sont un peu plus touchés que les femmes (taux d'incidence de 40 et 27 pour 100000, respectivement). Aux Etats-Unis, le cancer colorectal est la deuxième cause majeure de décès par cancer et le troisième par ordre de fréquence chez l’homme et chez la femme. L’arrivée des thérapies ciblées représente une nouvelle avancée, avec notamment les anticorps permettant de bloquer la formation de petits vaisseaux sanguins destinés à fournir à la tumeur l’énergie dont elle a besoin pour grossir. Celle-ci est alors privée des nutriments indispensables à sa croissance et régresse. Une autre approche ciblée concerne les tumeurs qui surexpriment un facteur de croissance cellulaire. Les premiers résultats montrent qu’associées à la chimiothérapie, ces molécules augmentent le taux de réponse des patients. Elles font actuellement l’objet de nombreuses études. Mais beaucoup d’études ciblent l’environnement de la tumeur afin de bloquer son développement mais pas la tumeur directement. Aujourd’hui, dans le cas du cancer colorectal, trop peu de molécules thérapeutiques ciblent directement des marqueurs exprimés sur les cellules cancéreuses car leur profil d’expression et leur fonctionnalité varient fortement en fonction des mutations accumulées dans les cellules cancéreuses.
Bénéfices attendus
Nous développons une nouvelle approche d'immunothérapie orale qui montre des résultats prometteurs dans la réduction des tumeurs locales. L'efficacité du médicament est l'élément critique pour l'adoption d'un nouveau médicament, mais la voie d'administration l'est tout autant : en prenant le produit par voie orale, le patient redevient acteur de son long parcours de soins et il n'a plus besoin de se déplacer à l'hôpital pour poursuivre son traitement. L'impact sur l'amélioration de la qualité de vie du patient sera considérable, lorsque le médicament sera approuvé et utilisé. Concernant le coût de traitement, il sera diminué de toute la partie de la prise en charge hospitalière et du transport du patient jusqu'au centre de soins. À mesure que le coût des soins dans les hôpitaux augmente, il est de plus en plus nécessaire de trouver des alternatives économiques pour toujours garantir la même qualité de soins au patient. Maintenir les patients à domicile en leur permettant de poursuivre leur traitement à distance améliore considérablement l'accès aux soins pour les patients vivant dans des zones rurales dépourvues d'infrastructures médicales importantes (Hôpitaux universitaires, centres de recherche contre le cancer de pointe, centres d'investigation clinique pour les essais cliniques). De plus, les traitements contre le cancer sont généralement extrêmement toxiques, constituant un challenge pour les médecins prescripteurs qui doivent trouver le meilleur équilibre entre bénéfice thérapeutique et tolérance pour le patient. Les effets secondaires nombreux et variés selon les conditions physiologiques du patient rendent le parcours de soins du patient extrêmement difficile à vivre. A cela s'ajoute la lourdeur d'un traitement qui nécessite une administration régulière à l'hôpital (parfois chaque semaine), souvent pendant de longues heures (4 à 6 heures) voire des jours, par perfusion sous contrôle médical. Pour le bien-être du patient, l'administration orale d'un traitement anticancéreux représentera une révolution et une amélioration sans précédent de sa qualité de vie. Enfin, notre démarche s’inscrit dans le contexte du traitement d’indications orphelines telles que les lésions précancéreuses de la muqueuse buccale, qui laissent, par définition, les patients sans aucune chance de traitement.
Procédures
4 animaux vont avoir une greffe sous-cutanée au niveau du flanc sous anesthésie. Chaque semaine durant 10 semaines, ils seront suivis par imagerie sous anesthésie, ils seront pesés et auront un prélèvement de sang toutes les 2 semaines. 32 animaux vont recevoir une greffe dans le caecum. Les souris seront anesthésiées et pesées. Chaque semaine, ils seront suivis en imagerie. Ils auront également un prélèvement de sang toutes les 2 semaines. Dès la 3ème semaine et jusqu’à la 8ème, 4 animaux seront euthanasiés par semaine pour observer la prise tumorale et l’apparition de métastases. 3 animaux seront utilisés pour la formation du personnel par une vétérinaire aux gestes techniques de chirurgie. Pour les tests d’efficacité du médicament, 1240 animaux recevront une greffe. Dans ce groupe, la moitié des animaux (soit 620) auront une résection caecale. Pour chaque groupe, différentes posologies de traitements par gavage et/ou injections seront administrées. Le suivi sera réalisé en imagerie et par observation quotidienne de l’état général des animaux en accord avec une grille de score et le bien-être animal.
Impact sur les animaux
L’injection en sous-cutanée des cellules cancéreuses, l’analyse par imagerie de l’animal vont entrainer au réveil de l’animal un léger stress. Les gestes de chirurgie entrainent au réveil des animaux de l'inconfort et du stress malgré la prise en charge de la douleur avec l'analgésie et des anti-inflammatoire. Cette douleur résultante peut être observée pendant 48h. Les traitements n’entraineront pas de douleur supérieure à celle d’une piqure d’aiguille. Elles entraineront un léger stress sur les animaux sur la durée de la contention comme lors des gavages.
Devenir
Après le traitement, chaque cohorte sera mise à mort à un temps donné afin de prélever les organes (caecum, foie, poumon…) pour observer la présence de tumeur au niveau du caecum et la présence de métastases dans les autres organes. En parallèle, des analyses permettront d’observer les populations immunitaires recrutées au niveau de la tumeur mais aussi des autres organes permettant de valider l’action des anticorps médicaments.
Remplacement
Des tests sur cellules ont été au préalable effectués afin d’évaluer le potentiel thérapeutique de notre traitement cependant le recours unique à des techniques sur cellule ou sur organes isolés est impossible car le développement tumoral et le suivi du traitement nécessité la prise en compte de l'organisme entier. En effet, les différents traitements doivent être testés dans le contexte d'un organisme entier afin d'évaluer leur efficacité, notamment dans le cadre d'une admnistration orale. De plus, le candidat médicament nécessite pour son fonctionnement le recrutement de l'ensemble des cellules du système immunitaire (muqueux et sanguins). Enfin, ces techniques in vivo nous permettent de vérifier l’accessibilité de notre traitement à la tumeur tissulaire ou aux métastases à distance du site primaire tumoral et du site d’absorption de notre molécule.
Réduction
Afin de tester ces différentes conditions de manière fiable, il faut un nombre suffisant d’animaux afin d’obtenir des résultats robustes nous permettant de passer à des études pré-cliniques réglementaires puis cliniques chez l’Homme. La 1ère procédure permettra de valider la croissance de la lignée cellulaire tumorale humaine dans un modèle de souris immunodéprimée et de valider le suivi de la prise tumorale par imagerie préclinique. La 2ème procédure permettra de déterminer la vitesse de croissance et le temps d'apparition de métastases de la greffe tumorale par imagerie et de suivre la colonisation métastatique. L'utilisation de l'imagerie permet de suivre un même animal de manière non invasive et tout au long du développpement tumoral, et d'anticiper l'apparition de foyers tumoraux non détectables par d'autres techniques. Il sera ainsi possible de réaliser des groupes d'animaux ayant les mêmes caractéristiques pour tester nos traitement saugmentant la robustesse de nos résultats et ainsi réduire le nombre d'animaux utilisés. La 3ème procédure correspond à la formation de notre personnel auprès d'une vétérinaire référente. Pour limiter le nombre d’animaux utilisés lors de cette formation, le geste technique sera tout d’abord appris sur essais cadavériques avec des animaux surnuméraires provenant des élevages de l’animalerie et devant être euthanasiés. Lors de la 4ème étude, le nombre d’animaux est imposé par la société partenaire certifiant les études pécliniques réglementaires afin de consituter le dossier pour aboutir in fine à des essais cliniques.
Raffinement
Afin de limiter le stress des animaux, ils seront manipulés régulièrement lors du change et des surveillances afin de les habituer aux différentes manipulations. Les procédures de chirurgie seront réalisées selon les dernières recommandations nationales avec une anesthésie stable et contrôlée avec prise de la douleur avec analgésie et anesthésie locale. Tout est mis en place pour garantir l'absence de contamination des animaux lors des gestes de chirurgie. Une bonne prise en charge de la douleur post-chirurgie sera effectuée pour le bien-être des animaux. Lors des procédures de chirurgie et d’imagerie les animaux seront maintenus sur tapis chauffant à 37°C. Pour éviter toute sécheresse oculaire du gel ophtalmique sera appliqué.
Choix des espèces
L’espèce a été choisie pour son temps de gestation court et elle possède un système immunitaire proche de celui de l’Homme. Les lignées murines immunodéficientes permettent de greffer des cellules tumorales d'origine humaine pour étudier la prolifération et le traitement. Les greffes tumorales seront réalisées sur des animaux jeunes (entre 2 et 4 mois), âge auquel la prise de greffe est optimal chez ces animaux.
Evaluation de l’effet d’agents thérapeutiques relargués par des biomatériaux sur la récidive tumorale dans un modèle d’ostéosarcome induit par allogreffe para-tibiale chez le rat.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Des cris ou une agitation pendant les traitements et les prélèvements de sang comptent parmi les effets attendus, et tout rat atteignant un point limite est mis à mort. 1000 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacun subit deux opérations, l'injection de cellules cancéreuses le long du tibia pour provoquer un ostéosarcome puis le retrait de la masse tumorale, avec des injections hebdomadaires et des prélèvements de sang sur animal éveillé. Le porteur fixe cet effectif à partir de son historique, deux études par an sur cinq ans à dix rats par condition, soit un nombre d'animaux calé sur son volume d'activité prévu.
Objectifs
L'ostéosarcome est un cancer des os rare mais agressif, touchant principalement les enfants et les jeunes adultes. Son traitement actuel, combinant chirurgie et chimiothérapie, entraîne souvent des effets secondaires désagréables impactant fortement la qualité de vie des patients. De plus, l’efficacité des agents thérapeutiques administrés par voie sanguine est limitée : les médicaments administrés ont du mal à atteindre la tumeur à cause de sa structure et de sa location particulière, souvent située en profondeur près de l’os. Notre projet vise à améliorer l’administration d’agents thérapeutiques en utilisant des matériaux spéciaux—qu’on appelle biomatériaux—innovants. L’idée est de délivrer les agents thérapeutiques directement dans la zone tumorale après son retrait chirurgical, assurant une action plus ciblée contre la tumeur osseuse tout en réduisant les effets secondaires dans le reste du corps. Pour tester cette approche, nous utiliserons un modèle animal pertinent : des cellules cancéreuses seront injectées le long du tibia de rats sains, créant un "modèle" de la maladie qui reproduit fidèlement le développement de l'ostéosarcome humain. Ce modèle nous permettra d'étudier la progression du cancer et l'efficacité de biomatériaux thérapeutiques dans des conditions proches de celles observées chez les patients. Ces expériences sur les animaux constituent une étape cruciale avant les essais cliniques chez l'homme. Les résultats de cette étude permettront de proposer aux professionnels de santé et aux patients un éventail de stratégies thérapeutiques plus ciblées, plus performantes et mieux tolérées, contribuant ainsi à améliorer la prise en charge médicale et la qualité de vie des patients atteints de ce cancer osseux.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet se mesurent à plusieurs niveaux. A court terme, ce projet nous permettra d'obtenir des informations cruciales sur (i) les mécanismes impliqués dans le traitement des tumeurs osseuses et leur réapparition ; (ii) si les agents thérapeutiques étudiés sont bien tolérés par le corps ou s’ils sont toxiques ; (iii) comment les agents thérapeutiques et leur mode d’administration affectent : l’os, la zone autour de la tumeur, et le corps entier. A plus long terme, ce projet permettra (i) d’acquérir des connaissances approfondies sur les changements physiologiques survenant lors de la réapparition de la tumeur ; (ii) de contribuer à l’amélioration de méthodes diagnostics robustes et précoces grâce à une meilleure compréhension des mécanismes tumoraux ; (iii) de mettre en place des traitements ciblés et personnalisés, adaptés au stade de développement tumoral ; (iv) de développer de nouveaux modes d'administration locale d'agents thérapeutiques pour limiter les effets secondaires sur tout le corps et augmenter leur efficacité si la tumeur revient. Ces bénéfices à court et long termes contribueront ainsi de manière significative à l'amélioration de la prise en charge thérapeutique des patients atteints de tumeurs malignes des os.
Procédures
La procedure comporte deux interventions chirurgicales : - Injection de cellules tumorales sur le tibia : durée de l'opération 15-30 minutes. - Retrait de la masse tumorale : durée de l'opération 30-45 minutes. Les interventions chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale et avec une gestion appropriée de la douleur pré et post-opératoire. Des radiographies seront prises au moment de la chirurgie, les animaux seront anesthésiés et la procédure durera 5 à 10 minutes. Des traitements sont réalisés par injections 1 fois par semaine. Chaque injection dure 1 à 5 min, et est réalisée sur animal anesthésie. Des prélèvements sanguins pourront être réalisés, ces prélèvement auront lieu sur animal éveillé, dureront moins de 5 min par animal, et pourront être répétés une fois par semaine.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables susceptibles d’être observés seront anticipés au plus juste en fonction des informations préalablement transmises avant toute mise en oeuvre du projet. Plus précisément, nous surveillerons l'état général et clinique des animaux de façon quotidienne pour estimer une éventuelle gêne ou douleur occasionnée par les manipulations effectuées. La réalisation de la chirurgie au moment du retrait de la tumeur pourra s’accompagner d’une possible réaction inflammatoire transitoire au niveau du site de l’incision. Les effets indésirables attendus sur les animaux peuvent être un traumatisme exprimé par des cris ou une agitation pendant l’administration des traitements ou le prélèvement de sang, et une inflammation au niveau du site d’injection.
Devenir
A l’issue de la procédure tous les animaux seront humainement euthanasiés et autopsiés minutieusement. Les organes d'intérêts, dont les pièces osseuses, seront prélevés. Les prélèvements sanguins seront utilisés pour doser les agents thérapeutiques et/ou évaluer leur toxicité et/ou évaluer les modifications induites par leur administration. Les organes seront également utilisés pour doser les composés et / ou réaliser des analyses histopathologiques et d’imagerie.
Remplacement
De manière systématique, les agents thérapeutiques évalués in vivo ont fait l'objet de tests préliminaires in vitro. Cependant, le cancer étant une pathologie complexe, il n'existe à ce jour aucune méthode alternative à l'expérimentation animale pour évaluer l'influence de différents types cellulaires du tissu osseux dans le développement de tumeurs. Les tests in vitro actuels permettent de prédire le devenir des agents thérapeutiques testés, mais ne renseignent pas sur leurs effets au niveau de l'ensemble des organes, tissus et cellules d'un organisme, ni sur les échanges pouvant se mettre en place entre la tumeur et les tissus environnants. Ces mécanismes extrêmement complexes ne pouvant pas être mimés par des modèles simples de culture in vitro, il n'existe malheureusement pas de méthode alternative à l'expérimentation animale pour évaluer le développement tumoral osseux et l'efficacité d'agents thérapeutiques ciblés. L'utilisation d'animaux est donc indispensable pour atteindre les objectifs de ce projet.
Réduction
Le nombre d'animaux impliqués dans les procédures sera réduit au strict minimum, tout en assurant l'obtention de résultats statistiquement exploitables et fiables. Cette approche permettra de tirer des conclusions solides et définitives, sans nécessiter la répétition du protocole au cours du présent projet. Nous utiliserons également des cellules tumorales bien caractérisées afin de réduire autant que possible la variabilité inter-individus connue en cancérologie. Etant donné la variabilité inter-individus du développement tumoral et des réponses aux agents thérapeutiques, 10 animaux au maximum par condition testée sont prévus afin d’assurer un nombre minimum d’animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le bien-être animal. Ce nombre d’animaux a été déterminé grâce à nos données historiques et l’utilisation de chaque animal a été optimisée (analyses et recueil de données longitudinales, études pilotes…) tout en limitant les contraintes au maximum. Bien que des groupes de contrôle soient nécessaires pour chaque étude, le nombre d'animaux dans ces groupes pourra être ajusté en fonction des résultats historiques et des données obtenues au cours de l'étude. Cette flexibilité permettra de réduire encore davantage le nombre d'animaux utilisés sans compromettre la qualité des résultats. Selon notre historique, nous estimons mener 2 études par an, soit avoir besoin au maximum de 1000 rats sur les 5 années du projet.
Raffinement
Les animaux seront stabulés en groupe dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat n'induisant pas de stress, et dans des conditions d’hébergement optimisées pour le projet (ajout d’un enrichissement augmenté tels que tunnel et/ou bâton ou bille de bois). L'état général et clinique des animaux sera surveillé de façon quotidienne et sera spécifiquement axée sur l’apparition (i) d’effets secondaires engendrés par les agents thérapeutiques évalués, s’ils sont connus (exemple : spasmes, inflammation locale…), (ii) de signes de douleur occasionnée par la prolifération ou l’exérèse tumorale (exemple : troubles de la locomotion, plaie, inflammation locale..), (iii) de signes de stress dus aux prélèvements de sang. Ces évaluations permettront de minimiser la douleur et tout facteur agissant sur le bien-être animal. Un protocole analgésique et/ou antalgique sera mis en place le jour des injections des cellules tumorales et du retrait de la tumeur en pré- et postopératoire. Outre la gestion de l'analgésie, les allogreffes et les exérèses seront pratiquées sous anesthésie gazeuse, et après analgésie locale au niveau du site d’injection des cellules ou avant l’ouverture du plan musculaire dans le cas d’exérèse. Les animaux seront maintenus un minimum de temps en situation d’inconfort lors de leur manipulation. Enfin, tout animal ayant atteint un ou plusieurs points limites sera humainement euthanasié.
Choix des espèces
Le rat a été choisi pour ce projet car ce mammifère présente des caractéristiques physiopathologiques et réponses tissulaires notamment au niveau osseux, proches de celles observées chez l'homme. Ces rongeurs, étant fréquemment utilisés à des fins de recherche, permettent de transposer assez facilement les résultats à l'homme, par simples approches/méthodes statistiques. Par ailleurs, leur taille permet d’obtenir un volume suffisant de sang parfaitement analysables. Enfin, les données obtenues chez ces animaux permettent de calculer facilement les doses administrables à l’homme prévues dans le cadre de premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux agents thérapeutiques. Nous utiliserons des rats jeunes car l'ostéosarcome est une tumeur qui affecte principalement les adolescents et les jeunes adultes.
L’Influence du Système Nerveux Périphérique sur les Pancréatites
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
Huit injections de céruléine par jour, une cinquantaine au total sur cinq à sept semaines, provoquent chez les souris une pancréatite chronique. 234 souris vont être utilisées, dont 180 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue puis disséquées pour prélever le ganglion cœliaque et le pancréas. Les résultats attendus portent sur les mécanismes de l'innervation tumorale, les applications médicales dans le traitement du cancer étant renvoyées au plus long terme. Le porteur écrit que la pancréatite ainsi provoquée "ne cause pas d'inconfort observable chez l'animal", alors que 180 souris sont déclarées en souffrance sévère.
Objectifs
Dans nos recherches récentes, nous avons examiné l'influence du système nerveux périphérique (SNP), en particulier la croissance des nerfs autour des tumeurs, sur le développement du cancer du pancréas et des pancréatites chroniques. Nous avons découvert que les fibres nerveuses subissent un remodelage spécifique et progressif au cours de ces pathologies, et que la suppression de ces nerfs peut affecter leur progression. Il est maintenant crucial de comprendre les mécanismes derrière ces changements des fibres nerveuses et d'explorer d'autres aspects du SNP. Pour cela, nous avons identifié des paires de molécules (ligands et récepteurs) qui jouent un rôle dans ce processus, tant du côté des nerfs que des cellules environnantes dans la tumeur. Parmi ces paires de molécules, nous avons repéré plusieurs candidats importants qui pourraient influencer l'innervation (croissance des nerfs).
Bénéfices attendus
A court terme, les résultats de ce projet augmenteront nos connaissances sur les mécanismes fondamentaux régulant l’innervation tumorale. A plus long terme, les résultats pourraient avoir des applications médicales concrètes dans le traitement du cancer.
Procédures
Les animaux recevront des injections dans le ventre sur une période de 5 à 7 semaines. Il y aura une cinquantaine d'injections pendant cette période, chaque injection dure environ 2 secondes.
Impact sur les animaux
Les injections intrapéritonéales peuvent causer de la douleur suite à la pénétration de la peau avec l’aiguille au moment de l’injection. Des aiguilles à insuline sont utilisées, la douleur de l’injection IP est donc légère et furtive. Pour les injections de céruléine, les souris sont injectées 8 fois par jour. Ces injections entraînent progressivement une pancréatite chronique qui ne cause pas d'inconfort observable chez l'animal. Nous avons observé qu'il est plus stressant pour les souris d'être anesthésiées plusieurs fois par jour durant la procédure. Une analgésie locale est effectuée aux sites d’injection avec de la lidocaïne sous forme de gel dermique. Une grille de score servira de repère pour vérifier l’état de l’animal.
Devenir
Ces animaux ne peuvent être réutilisés pour d’autres procédures. Par conséquent, à la fin de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés puis disséqués pour récupérer différents organes tels que le ganglion coeliaque et le pancréas, afin d’être analysés.
Remplacement
Les souris sont particulièrement pertinentes pour notre étude car elles développent des pancréatites de manière similaire aux humains, et les modèles murins de pancréatite et de tumeurs pancréatiques sont bien établis et largement acceptés. Cette similarité permet d'obtenir des résultats plus pertinents pour la compréhension des maladies humaines. Par conséquent, l'utilisation de souris, qu'elles soient sauvages ou génétiquement modifiées, est cruciale pour étudier de manière intégrée les interactions entre les cellules tumorales et le système nerveux périphérique, ce qui est essentiel pour notre projet. Il n’existe pas d’alternative non animal pour ce modèle.
Réduction
Des stratégies sont mises en place afin de limiter l'utilisation d'animaux tout en obtenant suffisamment de données pour répondre aux questions liées à l'étude. Ainsi, l’élaboration précise des protocoles et le choix pertinent des contrôles sont des éléments déterminants. Par ailleurs, l’utilisation d’outils statistiques permet d’estimer au mieux le nombre d’animaux nécessaire, afin de comparer de façon significative 2 groupes de petite taille (4 à 8 animaux). Le nombre d’individus à avoir par lot est fixé à 5 animaux par groupe. Toutefois, 20 % des animaux peuvent ne pas être analysables à cause de la perte de matériel biologique au cours des différentes étapes réalisées entre la procédure expérimentale et l’observation. Nous avons donc besoin de 6 animaux par groupe. Le contrôle des paramètres environnementaux et du statut sanitaire des animaux permet également de limiter la variabilité des résultats expérimentaux obtenus, réduisant ainsi le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement valables. Les procédures décrites sont appliquées depuis plusieurs années au sein de l’institut et sont maîtrisées par les expérimentateurs. Nous avons donc l'expérience nécessaire concernant la réalisation des procédures et l’évaluation de l'impact sanitaire sur les animaux. La qualité de notre plan expérimental ainsi que l’étude détaillée du nombre d’animaux nécessaires pour obtenir un résultat scientifique statistiquement valable nous permettent d’optimiser le nombre d’animaux utilisés. Ce projet nécessitera au maximum 234 souris.
Raffinement
Les souris utilisées dans ce projet seront élevées en groupes sociaux, avec un nombre maximal de 5 individus par cage d’une surface de 500 cm², dans un environnement enrichi pour optimiser les conditions d’hébergement et favoriser un comportement normal, afin de diminuer au maximum le stress des animaux. Les enrichissements varient au sein de l’animalerie en fonction des périodes (cotons, dômes, tubes en carton, barrettes de bois, etc.). Il y a toujours au minimum deux types d’enrichissement disponibles pour pouvoir alterner. Les souris boivent et se nourrissent ad libitum. Les élevages sont effectués au sein de notre établissement agréé, où 5 personnes sont dédiées à l’organisation et à l’entretien des élevages. Ainsi, l’état sanitaire et environnemental des animaux est contrôlé quotidiennement. De plus, une analgésie est administrée lorsque les expériences ou l'état des animaux le nécessitent.
Choix des espèces
Les souris sont particulièrement pertinentes pour notre étude car elles développent des pancréatites de manière similaire aux humains, et les modèles murins de pancréatite et de tumeurs pancréatiques sont bien établis et largement acceptés. Cette similarité permet d'obtenir des résultats plus pertinents pour la compréhension des maladies humaines. Par conséquent, l'utilisation de souris, qu'elles soient sauvages ou génétiquement modifiées, est cruciale pour étudier de manière intégrée les interactions entre les cellules tumorales et le système nerveux périphérique, ce qui est essentiel pour notre projet. Il n’existe pas d’alternative non animal pour ce modèle. Nos expériences seront réalisées sur des souris âgées de 8 à 14 semaines car nous travaillons sur la physiologie d’animaux
Mise en place d’un modèle murin de xénogreffe orthotopique de glioblastome 1/3
- Recherche appliquée
- Cancers
Opérées du crâne pendant trente minutes pour qu'une tumeur humaine de glioblastome soit implantée dans leur cerveau, puis transportées en voiture entre trois établissements, 307 souris passent ensuite en imagerie sous anesthésie une fois par semaine pendant quatre semaines, jusqu'à deux heures par séance. Les procédures vont du niveau de souffrance modéré pour 188 d'entre elles au niveau sévère pour 59, et 60 sont opérées puis tuées sans réveil. Le porteur indique que la croissance de la tumeur peut entraîner une perte de poids excessive et des effets neurologiques, et que les anesthésies répétées sont une source de stress. Toutes sont tuées quand les points limites sont atteints ou à la fin du projet, sauf une centaine d'entre elles, gardées pour la formation et le maintien des compétences du personnel.
Objectifs
Le glioblastome multiforme est la tumeur cérébrale primitive la plus fréquente et la plus agressive chez l’adulte. La médiane de survie globale varie de 15 à 18 mois et le taux de survie à 5 ans n’excède pas 5%. Le traitement de référence consiste en la chirurgie la plus complète possible suivie de l’association d’une radiothérapie et d’une chimiothérapie par le témozolomide. Malgré ce protocole thérapeutique, la majorité des patients rechute dans un délai médian de 8-9 mois. Il est donc aujourd’hui indispensable d’améliorer ce protocole. Dans cette démarche, il est connu que les glioblastomes sont caractérisés comme des tumeurs résistantes à l’irradiation. Cette résistance repose en partie sur le manque d’oxygène (hypoxie) au cœur de la tumeur et il a été démontré dans de nombreuses études que l’oxygénation des tissus représente un facteur prédictif de réponse à l’irradiation. Dans ce contexte, ce projet aura comme objectif la mise au point d’un modèle orthotopique de glioblastome, c’est-à-dire l’induction d’une tumeur au sein même de la cavité crânienne chez la souris afin d’évaluer la réoxygénation cellulaire et la radiosensibilisation et ainsi d’améliorer la survie des patients atteints de glioblastome. Ce projet se déroulera dans 2 établissement utilisateurs.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait contribuer à optimiser le traitement actuel des patients atteints de glioblastome en sensibilisant les tumeurs aux effets de la radiothérapie pour améliorer la survie de ces patients.
Procédures
A) Dans l’Etablissement Utilisateur (EU) 1/3 nous ferons une Chirurgie 1 : une injection analgésique d’une minute sur animal vigile, puis une anesthésie générale gazeuse, suivie d’une chirurgie de 30 minutes avec une injection d’une minute et suture sous anesthésie générale et locale. B) Dans l’EU 2/3 nous ferons une Imagerie 1 : une injection d’une minute sur animal vigile, puis imagerie de 30 minutes sous anesthésie générale pour l’observation de la croissance tumorale. Puis, une injection sur animal sur animal vigile, suivi 24h après d'une imagerie de 15 minutes sous anesthésie générale. Cette procédure sera réalisée à raison d’une fois par semaine pendant 4 semaines. C) Dans l’EU 2/3 nous ferons une Imagerie 2 : Imagerie sous anesthésie générale de 2 heures pour l’observation de la croissance tumorale et de l’hypoxie à raison d’une fois par semaine pendant 4 semaines. D) Dans l’EU 2/3 nous ferons une Chirurgie 2 : une injection d’une minute d’un anesthésique général sur animal vigile, puis des injections d’une minute d’un anesthésique local et d'un analgésique, puis une chirurgie de 2 minutes, suivi d’une perfusion de 5 minutes. E) Dans l’EU 3/3 nous ferons une Imagerie 3 : Imagerie sous anesthésie générale de 90 minutes pour l’observation de l’hypoxie à raison d’une fois par semaine pendant 4 semaines. F) Dans l'EU 2/3 un groupe subira les procédures A et F. Un autre subira les procédures A, puis B, suivi D puis F. Un autre subira les procédures A, puis C, suivi D puis F. Un autre subira les procédures : A, puis C, D et E puis F. G) Dans l’EU 1/3 et 2/3 nous ferons injection d’une minute sur animal vigile à raison d’une fois par semaine pendant 4 semaines.
Impact sur les animaux
La mise en place des modèles pourra induire des douleurs/infections suite à la chirurgie associée à une potentielle perte de poids transitoire et une déshydratation. Le transport des animaux entre les trois EU pourra induire un stress. Les injections nécessaires à l’imagerie pourront entrainer un stress chez l’animal se traduisant par des problèmes respiratoires. Les suivis par imagerie pourront induire du stress suite aux anesthésies répétées. La croissance des tumeurs pourra entrainer une perte de poids excessive et des effets neurologiques.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort lorsque les points limites sont atteints ou à la fin du projet, sauf les animaux utilisés pour la formation ou le maintien des compétences du personnel.
Remplacement
Les études préliminaires réalisés sur cellules cancéreuses ont permis de valider 2 types de cellules pour notre modèle de glioblastome chez la souris. Ce modèle chez l’animal permet de mimer au plus proche la complexité d'un environnement tumoral chez l'individu (vascularisation, inflammation…).
Réduction
Les études préliminaires sur cellules ont également permis de réduire le nombre de lignées à 2 afin de réduire le nombre de groupe utilisant des animaux. La mise en place du modèle permettra également de réduire le nombre d’animaux utilisées dans de futurs projets étudiant l’amélioration de la radiothérapie sur un modèle de glioblastome. Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé avec suffisamment d’animaux pour pouvoir réaliser une analyse statistique pertinente par les 2 méthodes d’imagerie décrites. Ce projet utilise des méthodes d’imagerie non-invasives permettant de suivre un même animal au cours du temps réduisant le nombre d’animaux
Raffinement
Chaque protocole expérimental prend en compte un potentiel impact sur la souffrance animale et différents critères ont été établis pour justifier un arrêt de l'expérience en cours. Les animaux seront hébergés à 5-8 souris par cage (souris issues de différents groupes de traitement), dans des cages à couvercle filtrant avec de la litière, des frisures de papier kraft, des tubes de coton (nidification), des bâtons et des tunnels. Les procédures expérimentales seront réalisées par des manipulateurs expérimentés. Les animaux seront acclimatés à leur hébergement deux semaines avant de démarrer les procédures. Des anesthésies et des analgésies sont appliquées dès que possible pour éviter tout risque de stress et de souffrance. Des points limites ont été établis pour éviter toute souffrance animale et seront évalués 3 fois par semaine. Si une souris présentait des signes d’effet(s) secondaire(s) ou de symptômes révélant un inconfort ou l’apparition de douleur, le vétérinaire désigné sera contacté pour venir voir les animaux, poser un diagnostic et mettre en place les mesures correctives adaptées. Les méthodes d’imagerie utilisées sont reconnues non-invasives et non-irradiantes. Les animaux seront transportés en voiture entre les trois Etablissements Utilisateur (temps maximum de 10 minutes entre les EU1 et EU2 et de 30 minutes entre les EU2 et EU3). Pour cela, les animaux seront mis dans des boites de transport avec un filtre sanitaire, de la nourriture, de l’eau gélifiée, des frisures de papier et du matériel de nidification avec ajout de chaufferettes sous les boites.
Choix des espèces
La souris représente l’espèce la plus utilisée en expérimentation en oncologie. La raison la plus importante du choix de la souris pour notre étude est sa similitude avec les organismes humains en ce qui concerne l’anatomie, la physiologie et la génétique. Le modèle de souris choisi permettra l’implantation de lignées cancéreuses humaines et le développement des tumeurs orthotopiques. Les animaux utilisés seront adultes c’est-à-dire à partir de 6/8 semaines car ils possèdent un poids et un développement optimales pour les actes subit (chirurgie, injections…).
Evaluation de l’efficacité de l’ORFADIN pour le traitement du cancer pancréatique avec des métastases
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Greffées de cellules tumorales dans la rate au cours d'une chirurgie de vingt-cinq minutes, puis suivies par imagerie sous anesthésie, 191 souris vont être utilisées, dont 161 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une partie reçoit trois injections de chimiothérapie par semaine pendant deux semaines. L'objet est d'évaluer un médicament commercialisé depuis 2001 pour une maladie héréditaire du foie, l'ORFADIN, contre le cancer du pancréas métastatique, les résultats devant être intégrés à un brevet protégeant cette nouvelle indication. Le porteur indique que l'usage d'anti-inflammatoires et de morphiniques est "proscrit" dans ce protocole parce qu'ils modifient le métabolisme tumoral, la seule réponse prévue à la douleur étant alors la mise à mort de l'animal, par dislocation cervicale.
Objectifs
L'ORFADIN est un médicament utilisé en clinique depuis 2001 pour le traitement d’une maladie héréditaire du foie engendrée par la dégradation incomplète de la tyrosine, un acide aminé apporté par les protéines alimentaires. Des travaux de l’équipe montrent que la voie de dégradation de la tyrosine par les cellules métastatiques est exacerbée et qu’elle est essentielle à leur survie et à leur expansion (in vitro). Le but de ce projet est d’évaluer l’efficacité de l’inhibition de la dégradation de la tyrosine par l’ORFADIN et/ou de l’apport de tyrosine par l’alimentation (i.e. régime déficient en tyrosine) dans le traitement du cancer du pancréas avec des métastases. Ce projet comportera 3 objectifs : Obj. 1 : Evaluer l’efficacité de l'ORFADIN associé ou non à la chimiothérapie, le FOLFIRINOX (abréviation FFX utilisée dans la suite de la saisine) dans le traitement des métastases du foie : - administré seul l’ORFADIN prolonge-t-il l’effet de la chimiothérapie sur les métastases, - combiné à la chimiothérapie est-il plus efficace que la chimiothérapie, - si ce schéma thérapeutique est poursuivi par l’administration d’ORFADIN, maintient-on l'effet anti-métastatique du traitement combiné ? - combiné à un régime sans tyrosine, le traitement combiné ORFADIN+chimiothérapie est-il plus efficace ? Obj. 2 : Evaluer l’efficacité de l'ORFADIN associé ou non au FFX dans le traitement des tumeurs primaires pancréatiques. Les 3 questions posées dans l’objectif 1 seront adressées afin d’évaluer l'efficacité des différents schémas thérapeutiques sur la progression/régression de la tumeur pancréatique. Obj. 3 : Etude de la toxicité de l'ORFADIN. Les modèles expérimentaux utilisés seront des souris développant des métastases du foie (Obj.1 et 3) et des souris développant des tumeurs pancréatiques (Obj. 2 et 3).
Bénéfices attendus
Cette étude pré-clinique a pour but de confirmer l’efficacité de l'ORFADIN associé ou non au FFX dans le traitement des cancers pancréatiques avec des métastases et d’évaluer la toxicité de ce traitement combiné. Les résultats obtenus permettront seront inclus dans le brevet visant à protéger l’utilisation de l’ORFADIN pour le traitement du cancer pancréatique avec des métastases. Elle permettra également de proposer un essai clinique aux patients atteints de cancer pancréatique avec des métastases, qui sont actuellement inéligibles à la chirurgie, seul traitement curatif disponible en clinique.
Procédures
Les souris de la procédure 1 seront soumises à une procédure chirurgicale de greffes de cellules tumorales dans la rate, une seule procédure chirurgicale par souris sera effectuée. Cette procédure chirurgicale durera 25 min max. (temps d'endormissement, chirurgie et réveil de l'animal). Les souris traitées au FOLFIRINOX recevront 3 injections par semaine de cette combinaison de chimiothérapie et ce pendant 2 semaines. La durée de ce geste est de 1-2 min. Le suivi de l’évolution des métastases du foie par de l’imagerie en bioluminescence a une durée estimée par animal de 15 min (temps d'endormissement, imagerie et réveil de l'animal).
Impact sur les animaux
Les nuisances subies par les animaux sont pour la procédure 1 : avant l’acte chirurgical : contention et injections sous-cutanées d’antalgique et d’anesthésique local qui peuvent générer un léger stress ; au cours de l’acte chirurgical : l’anesthésie gazeuse peut engendrer une hypothermie et une détresse respiratoire si elle est mal contrôlée ; en post-chirurgie : des complications post-opératoires (rupture des points de sutures, infection de la plaie) peuvent survenir et engendrer de la douleur qui doit être rapidement prise en charge ; les animaux devront être isolés de leurs congénères ce qui génère un stress. Pour les procédures 1 et 2, les nuisances au cours du développement de la tumeur primaire et des métastases sont les suivantes : douleur, perte de poids, mobilité réduite, apparences et/ou comportements anormaux, celles-ci sont grâce à notre expertise du modèle rapidement détectées et en fonction du score déterminé, la procédure adaptée sera mise en œuvre.
Devenir
Afin d'évaluer la prise métastatique au sein du foie et la régression de la tumeur primaire en fonction des traitements administrés aux animaux, ceux ci seront euthanasiés par dislocation cervicale et autopsiés.
Remplacement
Le recours à des animaux est absolument indispensable pour mener à bien ce projet qui vise à inhiber le dialogue entre les cellules cancéreuses des métastases de foie et les cellules du foie avoisinantes. Ceci, en utilisant un médicament déjà sur le marché pour une autre indication thérapeutique que le cancer du pancréas, et à évaluer son effet anti-cancéreux sur la tumeur du pancréas et sur les métastases du foie, et sa toxicité sur les organes sains. Ce projet fait suite à des expériences de culture de cellules de métastases de foie cultivées avec des cellules de foie validant la pertinence d’inhiber le dialogue entre ces deux types cellulaires pour limiter l’expansion des métastases. Ainsi, il est à présent nécessaire de démontrer au sein d’un hôte vigile, porteur de métastases et avec des fonctions du foie non-altérées, qu’un médicament associé ou non à un régime alimentaire spécifique, combiné à la chimiothérapie de référence des patients, permettrait de réduire la progression des métastases sans entrainer d’importants effets secondaires, qui ne peuvent être appréhendés que sur des modèles animaux de cancer pancréatique avec des métastases.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention d’un effet anti-tumoral significatif de chaque traitement par rapport aux animaux non-traités a été défini en utilisant le test statistique d’analyse de la variance suivi de comparaisons multiples. La diminution attendue de l’incidence/taille des tumeurs primaires/métastases et les différences inter-individuelles ont été estimées sur la base de données bibliographiques et de résultats antérieurs de l’équipe. Ainsi, pour la procédure 1, le nombre d’animaux nécessaire est de 13/groupe alors que pour la procédure 2, il est de 10/groupe.
Raffinement
Les personnes compétentes (formations en expérimentation animale + chirurgie) réaliseront les injections d’antalgiques pré et post-opératoires et de l’anesthésique local avant l’incision, l’incision et l’injection des cellules tumorales dans la rate. Ceci afin d’éviter toutes complications post-opératoires et limiter ainsi le nombre d’animaux à opérer. Une grille de points limites sera quotidiennement remplie pour chaque modèle : souris avec une tumeur pancréatique ou des métastases dans le foie, et des mesures adéquates seront prises : euthanasie directe si nécessaire car l’utilisation d’anti-inflammatoires non stéroïdien ou de dérivé morphinique pour limiter la douleur est proscrite dans le cadre de ce protocole. En effet, les données bibliographiques montrent que leur administration altère le métabolisme tumoral, limite la croissance tumorale et/ou potentialise l’action de la chimiothérapie. Un enrichissement matériel de l’environnement des animaux (cocon, nid, maisonnette, etc…) est mis en place dans toutes les cages afin que les souris expriment un répertoire diversifié de comportements normaux.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris, modèle d'étude de référence dans le domaine du cancer pancréatique et dont les caractéristiques morphologiques et génétiques des tumeurs récapitulent fidèlement la maladie chez l’homme. De plus, cette espèce se caractérise par de nombreux avantages, notamment leur développement rapide, une descendance nombreuse et une facilité d’entretien et d’élevage. Les souris développant des tumeurs pancréatiques seront traitées ou non dès l’âge de 6 semaines pour une durée de 4 semaines. Elles seront euthanasiées au stade de jeune adulte (environ 10 semaines après la naissance), stade à partir duquel les tumeurs prélevées sont dites de haut grade, comme la majorité des tumeurs pancréatiques diagnostiquée chez les patients. Ce dernier argument est requis pour notre étude qui vise à améliorer à terme l’efficacité des traitements des tumeurs pancréatiques à fort potentiel métastatique . L'implantation des cellules tumorales dans la rate des souris saines, seront réalisées chez des souris âgées de 5 semaines, puis traitées ou non pendant 4 semaines, la semaine suivant l'implantation. Elles auront un âge similaire aux souris avec tumeur pancréatique lorsque les traitements débuteront, à ce stade, l’impact du métabolisme sur la progression métastatique ne sera pas impacté par une prise de poids ou tout autre facteur lié au vieillissement de l’animal. Elles seront euthanasiées au même âge que les souris avec des tumeurs pancréatiques.
Régulation de la réponse de la microglie aux cytokines et de la clairance des dépôts amyloïdes et des agrégats de tau par le remodelage des glycanes sulfatés
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
Environ 80 % des souris porteuses du gène Tau sont mortes à l'âge de 12 mois, et leur faiblesse des pattes évolue vers une paralysie entre 7 et 10 mois, avec une posture voûtée et des difficultés à s'alimenter. 2300 souris, dont des souris porteuses des gènes hAPP ou Tau liés à la maladie d'Alzheimer, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère : toutes ont le bout de la queue coupé sous anesthésie pour le génotypage, et 366 sont destinées aux expériences sur cinq ans. Chez les petits de femelles porteuses du gène hAPP, la mortalité atteint environ 15 % sur les six premiers mois. Le porteur écrit pourtant que les lignées utilisées "ne présentent aucun problème physique ou physiologique". Toutes les souris sont tuées à la fin du protocole, après anesthésie et analgésie, sans que le texte précise le rôle des souris génotypées au-delà des 366 destinées aux expériences.
Objectifs
Le projet de recherche vise à comprendre comment les molécules cérébrales appelées glycanes sulfatés régulent l'élimination des substances responsables de la maladie d'Alzheimer par les cellules immunitaires du cerveau dans des modèles de souris. Nous étudierons si un modèle de souris dont le gène d'une enzyme dégradant les glycanes sulfatés est augmenté ou un modèle de souris dont le gène d'une enzyme générant des glycanes sulfatés n'est pas fonctionnel dans les cellules immunitaires du cerveau, serait bénéfique pour l'élimination des substances responsables de la maladie d'Alzheimer in vivo. Des études animales sont nécessaires pour examiner ces possibilités de limiter la progression de la maladie par l'augmentation d'une enzyme de dégradation des glycanes sulfatés ou par l'élimination d'une enzyme génératrice ou d'une molécule de protéine présentatrice dans de cerveau de modèles murins de la maladie d'Alzheimer.
Bénéfices attendus
La modification des glycanes sulfatés dans les cellules immunitaires du cerveau in vivo aura un impact sur la recherche en matière de neuroinflammation et de neurodégénérescence. L'analyse des rôles régulateurs des glycanes sulfatés nous permettra de comprendre en détails les mécanismes moléculaires par lesquels les cellules immunitaires cérébrales éliminent les substances responsables dans le cerveau de la maladie d'Alzheimer. Notre analyse des cellules immunitaires du cerveau in vitro est applicable au criblage de composés chimiques susceptibles de potentialiser le traitement thérapeutique des patients affectés par la neurodégénérescence. Les résultats du profilage de l'expression des gènes et de la mise en évidence d'une expression génétique altérée permettraient de découvrir de nouvelles cibles pharmacologiques impliquées dans la cause de la maladie d'Alzheimer. Nos données déjà obtenues montrent que l'augmentation d'une enzyme dégradant les glycanes sulfatés améliore l'élimination des maladies cérébrales responsables de la maladie in vitro, indiquant la faisabilité du projet proposé et ouvrant la voie à de nouvelles approches pour contrôler les causes de la maladie d'Alzheimer. Les concepts innovants concernant la modification des glycanes sulfatés dans le cerveau seront étendus à un autre modèle murin de la maladie d'Alzheimer appelé tauopathie. Dans l'ensemble, notre objectif ultime est de développer une nouvelle stratégie de traitement de la maladie d'Alzheimer, afin de contribuer à l'amélioration de la santé et du bien-être, ainsi qu'au bien-être social et économique. Il s'inscrit dans la priorité nationale « Plan maladies neurodégénératives ».
Procédures
Le bout de la queue (
Impact sur les animaux
Les modèles de souris de la maladie d'Alzheimer, que nous utiliserons dans ce projet, présentent des déficits de la mémoire spatiale et de l'apprentissage. Les petits nés de femelles porteuses du gène responsable de la maladie, appelé hAPP, ont un taux de mortalité d'environ 15 % au cours des six premiers mois de leur vie. Environ 80 % des souris porteuses d'un autre gène responsable de la maladie, appelé Tau, meurent à l'âge de 12 mois, avec la survie médiane d'environ 9 mois. Elles présentent une rétraction des pattes lorsqu'elles sont soulevées par la queue, suivie d'une faiblesse des pattes. Ces déficits moteurs évoluent vers une paralysie à l'âge de 7 à 10 mois, avec une posture voûtée et des difficultés à s'alimenter. Une légère diminution du poids est observée à l'âge de 11 mois. La coupe de la queue pour le génotypage entrainent une douleur légère de courte durée. Les souris seront mises à mort après anesthésie et analgésie.
Devenir
Pendant la durée de la procédure, les animaux sont maintenus en vie. Puis, à la fin du protocole, toutes les souris sont euthanasiées selon la procédure.
Remplacement
Des lignées de cellules immunitaires cérébrales de souris immortalisées et des essais biochimiques et biologiques seront utilisés en parallèle dans le laboratoire. Les objectifs du projet proposé sont d'étudier les effets bénéfiques d'une enzyme de dégradation des glycanes sulfatés sur les fonctions des cellules immunitaires cérébrales et d'examiner si l'augmentation d'une enzyme de dégradation des glycanes sulfatés pourrait réduire la masse des matériaux responsables de la maladie dans le cerveau des souris modèles de la maladie d'Alzheimer in vivo en facilitant l'activité soutenue des cellules immunitaires cérébrales au fil du temps. Dans cette phase, l'utilisation d'animaux est essentielle.
Réduction
Le nombre de souris est réduit en utilisant chaque hémi-cerveau pour deux expériences différentes. Le nombre de souris par groupe est réduit au minimum afin de garder une analyse statistique fiable. Ce plan expérimental a déjà été publié dans la littérature ce qui permet de réduire au minimum statistique le nombre d'animaux nécessaires à l'étude.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupe de cinq dans un milieu enrichi (un bâton, un tunnel ou dôme ou papier craft) dans des cages de taille suffisante et avec un accès libre à l’eau et à la nourriture. Le bien-être des animaux sera surveillé tous les jours. Les différentes lignées utilisées dans nos procédures ne présentent aucun problème physique ou physiologique. L’ensemble des expérimentations est mené par du personnel qualifié et formé afin d’éviter tout stress ou inconfort de l’animal avec une attention particulière sur la gestion de la douleur. Nous serons attentifs à observer si les animaux souffrent ou présentent un comportement anormal en lien avec le responsable du bien-être animal en observant les paramètres cliniques suivants Les points limites : -Perte de poids rapide 15 à 20% en quelque jours, longue période de perte de poids -Poil hérissé, dos rond, abdomen distendu ou léthargie -Diarrhée -Toux, râles, respiration pénible, écoulements nasaux -Signes d’atteinte du Système nerveux central -Tout autre signe clinique, jugé par le technicien expérimenté Ce suivi sera réalisé en lien avec le responsable du bien-être animal. Les animaux présentant un de ces critères seront mises à mort.
Choix des espèces
La souris est l'animal classiquement utilisé pour les études sur la maladie d'Alzheimer. Les modèles murins de la maladie d'Alzheimer sont largement utilisés pour les études de recherche fondamentale. De plus, de nombreux outils sont disponibles chez la souris (anticorps, kit et appareil), permettant une exploitation maximale des tissus obtenus. Des souris âgées de 3 mois, 6-9 mois et 15-18 mois seront utilisées. Dans le modèle de souris de la maladie d'Alzheimer, qui surexprime le gène responsable de la maladie, appelé hAPP, les niveaux de matériaux responsables de la maladie dans une région particulière du cerveau, importante pour la mémoire, commencent à augmenter vers l'âge de 6 semaines. Les substances pathogènes deviennent évidentes dans les régions particulières du cerveau nécessaires à la mémoire. Ce phénotype est progressif, avec des pics importants à l'âge de 8-10 mois. Une augmentation significative de l'activation des cellules immunitaires du cerveau a été observée dans ces régions à l'âge de 6-9 mois. Dans le modèle de souris qui exprime l’autre gène responsable de la maladie, appelé Tau, les matériaux responsables de la maladie qui affectent directement les cellules neuronales et provoquent une perte de mémoire commencent à apparaître vers l'âge de 6 mois. Ces phénotypes ont fait l'objet de nombreuses publications dans le monde entier et ont permis d'accumuler des données utiles pour l'étude de la maladie d'Alzheimer.
Evaluation de l’effet neuroprotecteur de la photobiomodulation sur des modèles murins de la maladie de Huntington.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
366 souris, de deux souches porteuses de la maladie de Huntington et de souches témoins, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau. Cinq jours par semaine, elles sont immobilisées 90 secondes pour un traitement de la tête par la lumière, avec des prises de sang éveillées tous les quinze jours, des IRM sous anesthésie jusqu'à une fois par mois et des tests de mouvement et de mémoire que le texte ne nomme pas. Si cette première partie est concluante, une seconde ajoute une chirurgie de 90 minutes pour implanter une source de lumière dans le cerveau. Dans les deux parties, les souris sont tuées dès que leurs symptômes moteurs évoluent "au-delà d'une gêne modérée". Le porteur compte parmi les bénéfices des "publications scientifiques et présentations en congrès", et renvoie un éventuel essai clinique à des "études complémentaires". Il présente aussi la seconde partie comme un moyen de limiter "le nombre de gros mammifères" d'une étude ultérieure.
Objectifs
Des études ont démontré que la lumière ralentie la maladie de Parkinson. La maladie de Huntington touche 6000 personnes en France. C’est une maladie génétique rare qui se traduit par la mort de neurones. Les symptômes handicapent grandement le quotidien des patients, et la maladie n’a pas à ce jour de traitement . La maladie de Huntington présente des similarités avec la maladie de Parkinson. Les objectifs de ce projet sont 1. d’évaluer sur des modèles souris de la maladie de Huntington si un traitement par la lumière permet de ralentir le développement de la maladie, au même titre que pour la maladie de Parkinson et 2. de préciser la région du cerveau la plus à même de recevoir le traitement.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet permettra d’évaluer si le traitement par la lumière protège les neurones, comme cela a été observé dans la maladie de Parkinson. Les travaux seront aussi valorisés au travers de publications scientifiques et présentations en congrès. La deuxième partie du projet permettra de préciser les régions du cerveau les plus appropriées pour recevoir le traitement par la lumière. Si l’effet de protection des neurones par la lumière est avéré, comme il l’a précédemment été pour la maladie de Parkinson, des études complémentaires pouvant conduire jusqu’à un essai clinique, porteur d’espoir pour les patients, seront envisagées.
Procédures
Dans la première procédure, les animaux subiront une contention 5 jours par semaine de 90 secondes afin de permettre le traitement. Les animaux sont préalablement habitués à cette contention. Le traitement est indolore, et n’induit pas de gêne ou inconfort. Pour évaluer l’effet du traitement nous mesurerons les mouvements des animaux et leur mémoire (tests n’excédant pas 15 minutes) et feront des IRM réguliers (n’excédant pas 1 heure) : initialement puis pour les plus fréquents tous les mois (pour les animaux dont l’espérance de vie est réduite), et tous les 3-4 mois pour les animaux avec une espérance de vie normale. Les IRM seront réalisées sous anesthésie générale. Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles seront effectués tous les 15 jours. Si besoin un prélèvement de queue de quelques millimètres pourra être réalisé de facçon unique sur animal anesthésié pour sa caractérisation génétique. Les animaux seront euthanasiés sous anesthésie générale avec administration préalable d’antalgique dès que les symptômes moteurs de la maladie évolueront au delà d’une gêne modérée. Si l’efficacité du traitement est concluante, la deuxième partie du projet nécessitera une chirurgie (maximum 90 minutes) pour placer un implant délivrant de la lumière directement dans le cerveau, pour définir quelle région est la plus appropriée pour recevoir le traitement. Le traitement, permis par l’implant ne nécessitera plus de contention car la lumière sera contrôlé à distance. Les animaux seront évalués comme précédemment (même fréquence et durée pour les prélèvements sanguins, l’IRM et les tests comportementaux), et euthanasiés sous anesthésie générale avec administration préalable d’antalgique dès que les symptômes moteurs de la maladie évolueront au-delà d’une gêne modérée.
Impact sur les animaux
Certains modèles animaux Huntington utilisés conduisent naturellement à une perte progressive des possibilités de mouvement de l’animal ; l’animal se nourrit et boit moins facilement et perd du poids progressivement. Certains animaux ont une durée de vie plus courte que la normale, et ne peuvent plus se déplacer correctement en fin de vie. La contention pour illuminer la tête des animaux ainsi que la réalisation des tests comportementaux peut engendrer de façon temporaire, le temps que l’animal s’habitue à l’expérimentateur, à une peur légère. Le traitement en lui-même n’induit ni chaleur, ni douleur. La chirurgie induit de façon temporaire (24-48h) et maitrisée une douleur modérée du fait des points de suture. Par expérience, les animaux tolèrent ensuite bien le dispositif qui est adapté à leur morphologie.
Devenir
Les animaux subiront un traitement par la lumière pour évaluer si cela permet de limiter le développement de la maladie de Huntington. Si les animaux de mise au point n’ont pas besoin d’être euthanasiés pour les mises au point sur pièce anatomique, ils seront utilisés dans les mises au point de la procédure 2. A l’issue de ces procédures, et en compléments des évaluations et de l’imagerie, les animaux seront euthanasiés pour récupérer leur cerveau pour évaluer si le traitement a protégé les neurones.
Remplacement
La littérature permet de savoir que le traitement par la lumière est efficace dans la maladie de Parkinson. C’est un élément très encourageant pour espérer obtenir des résultats positifs pour la maladie de Huntington, car ces 2 maladies ont de nombreux points communs. Les études des effets de la lumière sur des modèles cellulaires ont mis en évidence une difficulté de transposition des résultats obtenus sur les modèles physiologiques in vivo (absence d’effet, ou modalités d’illumination complètement différentes de celles effectives in vivo). Les effets du traitement par la lumière impliquent probablement un intermédiaire encore non identifié, et non présent dans les cultures de cellules, empêchant ainsi l’anticipation des effets de la lumière in vitro. L’évaluation des effets neuroprotecteurs du traitement dans le cadre de la maladie de Huntington nécessite donc une évaluation chez l’animal, d’autant plus pour mesurer l’impact sur les performances motrices et cognitives. Les modèles de souris étant bien décrits et facilement manipulables sont adaptés pour une première évaluation. Des souches de souris de même fond génétique sont utilisées pour les mises au point, car il n’est pas nécessaire d’utiliser une souche à phénotype dommageable pour mettre au point les différentes étapes de l’étude. La deuxième partie du projet permettra de limiter le nombre de gros mammifères qui seraient nécessaires dans une étude ultérieure.
Réduction
Les données seront analysées par des tests statistiques. Des animaux au phénotype non dommageable seront utilisés pour les mises au point afin d’optimiser l’utilisation des animaux Huntington. La phase de mise en place sera stoppée dès que toutes les procédures seront maitrisées et reproductibles sur 3 animaux consécutifs. Les animaux n’ayant pas besoin d’être euthanasiés à l’issue des mises au point de la première procédure seront utilisés pour la procédure 2. L’évaluation des effets du traitement nécessite 2 souches complémentaires de souris Huntington, et des contrôles associés au phénotype non dommageable. On estime à 10% le nombre de souris qui seront euthanasiées précocement ne permettant pas de recueillir les données de façon adéquate. Deux types distincts et incompatibles d’analyse des pièces anatomiques sont nécessaires. La deuxième partie du projet ne sera réalisée que si les résultats de la première partie sont concluants. Elle reproduira la première étude en comparant 3 régions du cerveau pouvant recevoir le traitement (traitement localisé). Le total maximal de souris nécessaires pour ce projet sera de 366.
Raffinement
Les animaux seront surveillés de façon journalière. Le traitement, les tests et l’IRM ne sont pas douloureux ; une habituation préalable à la contention et aux expérimentateurs permettra de réduire le stress des animaux. Les IRM seront effectuées sous anesthésie générale. Les animaux réintègreront leurs groupes sociaux dès les tests effectués. Dans la deuxième partie du projet, les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et traitement antalgique. De l’hydrogel sera mis dans la cage et les animaux pesés chaque semaine pour évaluer et limiter la perte de poids naturelle de ces souris (du fait de la maladie). Les euthanasies seront effectuées sous anesthésie générale et antalgie, dès que les points limites sont atteints permettant de limiter la durée pendant laquelle la souffrance due au phénotype dommageable atteint un stade sévère.
Choix des espèces
L’effet d’un traitement et son impact sur les mouvements, la mémoire et l’espérance de vie, ne peut s’évaluer que sur un organisme entier. Les souris sont des modèles bien connus, et une première évaluation ne nécessite pas d’organisme plus évolué. La littérature permet de bien connaitre les modèles d’étude, et d’adapter le protocole pour évaluer l’impact de notre traitement. Les animaux seront réceptionnés à l’âge de 3 semaines afin d’être sevrés, et de démarrer le traitement en phase précoce de développement de la maladie, l’espérance de vie étant assez courte (3 mois) pour l’une des souches, et les symptômes de la maladie apparaissant assez rapidement, comme c’est le cas dans la maladie humaine.
Approches thérapeutiques dans une maladie inflammatoire chronique (lupus érythémateux)
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
Toutes les souris sont tuées avant l'âge de quatorze semaines, avant que le lupus dont elles héritent n'atteigne le stade où il abîme sérieusement leur organisme. 720 souris femelles vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont tatouées sous anesthésie, reçoivent des injections dans le ventre trois fois par semaine pendant deux à quatre semaines ou un gavage quotidien pendant deux semaines, avec des prélèvements de sang à la joue ou dans l'œil et un prélèvement d'urine. Le porteur écrit que "ni douleur chronique, ni souffrance permanente, ni environnement angoissant ne sont attendus", pour un projet qu'il déclare lui-même en gravité sévère sur l'ensemble des 720 animaux.
Objectifs
Le projet a pour but de tester des approches thérapeutiques spécifiques contre une maladie inflammatoire chronique, complexe et autoimmune (quand le système immunitaire se retourne contre l'organisme lui-même) : le lupus érythémateux systémique (lupus). Les traitements actuellement utilisés dans cette maladie chez les patients ne sont pas spécifiques et ont de lourds effets secondaires. Il est donc important de développer des approches thérapeutiques innovantes pour améliorer la prise en charge des patients. Dans ce but, un modèle de souris qui développent spontanément cette maladie sera utilisé et des facteurs responsables de certains paramètres de la maladie seront ciblés. Les patients atteints de lupus développent des anticorps dirigés contre des molécules présentes dans l’organisme (autoanticorps). Ces autoanticorps activent des cellules du système immunitaire, ce qui va induire une inflammation importante dans tout le corps, et notamment au niveau des reins. Nous testerons ici des molécules permettant soit de diminuer la quantité d’anticorps, soit d’empêcher l’augmentation de la production de ces autoanticorps.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet se situent à deux niveaux. Le premier niveau concerne les connaissances scientifiques car le projet permettra d’accroître la compréhension du développement du lupus et les mécanismes de l’amplification de la maladie. Le deuxième niveau se situe au niveau de la santé humaine. En effet, la compréhension de ces mécanismes et la validation de nos cibles thérapeutiques dans le lupus permettra de développer de nouvelles approches thérapeutiques chez l’humain. Le but est d’améliorer la prise en charge des patients atteints de lupus qui n’ont pas accès à des traitements spécifiques dénués d’effets secondaires.
Procédures
Un génotype (gène mutant dans une lignée de souris) dommageable est utilisé dans le présent projet. Ces souris développent un lupus lorsqu’elles sont adultes qui ressemble à la maladie observée chez les patients qui se développe également chez des sujets adultes. Toutes les souris seront utilisées (et donc euthanasiées) avant de pouvoir développer une gravité de la maladie altérant leur état général. Tous les animaux seront tatoués sous anesthésie générale (acte durant 2 minutes). Des groupes/lots d’animaux éveillés recevront un traitement thérapeutique différent soit par des injections dans le ventre (15 secondes/injection) 3 fois par semaine sur une durée de 2 ou 4 semaines soit des administrations quotidiennes par voie orale (gavage - 30 secondes/gavage) pendant 2 semaines. Un prélèvement sanguin sera réalisé sur animal anesthésié avant le début des traitements soit au niveau de la joue soit au niveau de l’œil (2-3 minutes par prélèvement) ainsi qu’un prélèvement urinaire (1 à 2 minutes par prélèvement). Certains animaux auront un 2e prélèvement sanguin trois jours après l’administration d’un traitement.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables sur les animaux lors des procédures seront de plusieurs catégories : L’anesthésie générale peut induire un inconfort de 2-3 minutes au réveil (étourdissement). Les prélèvements sanguins peuvent induire une démangeaison le temps de la cicatrisation (moins de 24 heures). Un stress passager sera induit lors des contentions nécessaires aux actes. Une légère douleur brève de piqûre sera induite lors des injections intrapéritonéales (15 secondes). Un stress et un inconfort passager (30 secondes) seront induits lors des gavages. Les souris ayant la maladie (le lupus) développent des symptômes inflammatoires au niveau de la peau et des articulations ainsi qu’une insuffisance rénale entre 20 et 30 semaines d’âge qui peuvent modifier leur comportement. Toutes les procédures se terminent quand les souris ont l’âge de 14 semaines soit avant que ces symptômes ne se soient développés.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure pour analyse des tissus prélevés (reins, rate, ganglions) afin de déterminer les paramètres inflammatoires dans ces tissus.
Remplacement
Les études des maladies de systèmes (impactant différents organes) et de l’efficacité de leurs traitements (validés ou expérimentaux) nécessitent de pouvoir tester les hypothèses sur des organismes entiers vivant avant de pouvoir passer chez l’humain. La localisation et l’activation des cellules d’intérêt au cours du développement des maladies étudiées ne peuvent être observée que dans des organismes entiers. Les études in vitro (dans des sytèmes artificiels) ne permettent pas de reproduire la complexité des organismes ni des maladies étudiées. Malheureusement, aucune des technologies actuelles ne peut se substituer aux modèles animaux dans ce domaine. Nous ne pouvons donc pas utiliser d’autre approche que l’expérimentation animale pour les études visant à améliorer la prise en charge des patients.
Réduction
Le présent projet vise à tester différentes approches thérapeutiques qui ont été identifiées préalablement tant dans des modèles animaux que chez des patients. Cela a permis de réduire le nombre d’hypothèses de travail et donc de diminuer le nombre d’animaux prévus dans le présent projet. Le nombre d’animaux est calculé en fonction des besoins du projet afin de pouvoir conclure scientifiquement et cliniquement (être sûr des effets observés). Le but est de valider nos approches thérapeutiques afin de pouvoir les développer pour la pathologie humaine. Le nombre d’animaux utilisés est réduit au minimum mais est suffisant pour pouvoir obtenir des conclusions scientifiques solides.
Raffinement
Ni douleur chronique, ni souffrance permanente, ni environnement angoissant ne sont attendus dans les procédures du présent projet. Le modèle de lupus utilisé induit une maladie pouvant entraîner des douleurs inflammatoires passagères mais qui porte atteinte sérieusement à l’intégrité physique des animaux au-delà de 20 semaines d’âge. Tous les animaux seront utilisés avant d’atteindre l'âge de 15 semaines. Afin de s’assurer du bien-être des animaux et qu’aucun ne développe une atteinte sévère avant la fin des procédures, une grille de score clinique a été établie afin de suivre l’état général des animaux et d’identifier ceux nécessitant une intervention rapide d’interruption des procédures car ils auraient atteint les points limites déterminés. Cet examen clinique des animaux est réalisé trois fois par semaine. Les animaux n’ayant pas un score nul (mais inférieur au point limite) se verront apportés une attention particulière, notamment avec l’apport d’eau et de nourriture humide directement dans la cage afin d’optimiser leurs conditions d’hébergement. Par ailleurs, les animaux sont hébergés dans des conditions optimales pour atténuer tout stress, jamais isolés, toujours avec des accessoires d’enrichissements (cotons pour nidifier, jouets type maisonnette pour pouvoir se cacher) et sont observés quotidiennement.
Choix des espèces
Les études d’une approche thérapeutique innovante dans une pathologie humaine doivent être réalisées sur des modèles animaux afin de justifier le passage aux tests chez l’Homme. Notre projet s’inscrit dans cet objectif et toutes les mesures permettant de limiter le nombre d’animaux utilisés ainsi que les éventuelles souffrances subies par ces animaux seront entreprises. La souris est le seul modèle de mammifère pertinent pour les objectifs scientifiques de notre projet. Les souris du projet seront toutes des femelles adultes comme les patients humains qui sont à 90% des femmes en âge de procréer.