Procédures sévères
Compréhension des mécanismes immunitaires associés aux anticorps thérapeutiques dans un modèle d’infection respiratoire à Pseudomonas aeruginosa et évaluation d’une protection à long terme chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Infectées puis réinfectées par la bactérie Pseudomonas aeruginosa au moyen d'un cathéter introduit dans la trachée, 3 390 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue. 1 680 d'entre elles subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, les 1 710 autres un niveau léger. Le porteur écrit qu'aucun traitement antidouleur ni anti-inflammatoire ne peut être administré pendant l'évolution de la maladie, faute de quoi l'évaluation des traitements testés serait faussée, et décrit une inflammation et une gêne respiratoire douloureuses selon leur intensité. L'alternative aux antibiotiques que le projet dit vouloir ouvrir, des anticorps inhalés combinés à des immunomodulateurs, en reste au stade des données précliniques.
Objectifs
Les infections respiratoires provoquent le décès de plus de 3 millions de personnes chaque année dans le monde. Ces pneumonies bactériennes ou virales sont particulièrement problématiques du fait de l’augmentation importante des phénomènes de résistances aux chimiothérapies antimicrobiennes. Aujourd’hui, les anticorps sont administrés exclusivement par voie intraveineuse. Or, cette voie n’est pas appropriée pour le traitement des maladies pulmonaires. En effet, les anticorps ne diffusent pas passivement dans les différents compartiments de l’organisme. Après administration intraveineuse, seule une fraction négligeable de l’anticorps accède au territoire pulmonaire. Depuis plusieurs années, des données précliniques soutiennent l’intérêt de l’inhalation pour améliorer l’efficacité des anticorps. Cette voie d’administration est d’ores-et-déjà une référence pour l’utilisation de bronchodilatateurs ou de corticoïdes chez les patients atteints d’asthme ou de bronchopneumopathies obstructives. L’inhalation permet d’administrer d’a,nticorps directement dans le poumon, sous la forme d’un aérosol. Lors d’infections respiratoires, ceci permettrait une plus grande rapidité d’action des anticorps, une forte concentration à proximité de l’agent pathogène, tout en limitant le passage systémique et les potentiels effets secondaires des anticorps. Nous avons démontré que le processus d’aérosolisation permettait d’administrer des anticorps ayant conservé leurs propriétés physiques et immunologiques, grâce à l’utilisation de dispositifs médicaux adéquats et au développement de formulations spécifiques. Nous avons également démontré qu’un anticorps dirigé contre la bactérie Pseudomonas aeruginosa, responsable de pneumonies, administré par inhalation, atteignait les poumons en plus grande quantité comparativement à une administration par voie intraveineuse. Ceci est associé à une meilleur efficacité. Des études préliminaires ont montré qu'une administration pulmonaire unique d'un anticorps anti-microbien avec certains agents immunomodulateurs permet de protéger les individus face à une seconde infection. Ce projet vise donc à décrire et comprendre les réponses immunitaires anti-infectieuses à long terme induites par des anticorps administrés par voie pulmonaire en combinaison avec des agents immunomodulateurs afin de favoriser leur transfert vers la clinique.
Bénéfices attendus
Ce projet, basé sur des données préliminaires solides, vise à développer des stratégies thérapeutiques innovantes basées sur des combinaisons d’anticorps et d’immunomodulateurs inhalés pour induire une réponse à long terme contre des pathogènes respiratoires. Cette approche anticorps/immunomodulateurs offrirait une alternative thérapeutique aux antibiotiques/antiviraux, contre des pathogènes résistants, avec un effet durable permettant de prévenir les infections secondaires. Elles permettraient notamment de traiter les infections respiratoires à P. aeruginosa dans un contexte de bronchopneumopathies obstructives, de mucoviscidose et d’infections nosocomiales ou communautaires. Ces pathologies représentent un lourd tribut en termes de morbi/mortalité, perte de productivité et coût pour le système de santé. L’inhalation d’anticorps en combinaison avec des immunomodulateurs, pourrait offrir les avantages d’une nouvelle option thérapeutique face à l’antibiorésistance et d’un effet à long terme pour prévenir de nouvelles infections (chez un même individu) par ce pathogène, qui est rencontré à la fois lors d’infections respiratoires aigües mais aussi chroniques. Plus largement, l’inhalation d’anticorps en combinaison avec des immunomodulateurs pourraient être exploitée dans d’autres pathologies infectieuses respiratoires (infections à d’autres bactéries résistantes aux antibiotiques comme Klebsellia pneumoniae, Acinetobacter baumani ou d’autres infections virales comme le virus respiratoire syncitial, le SARS-CoV-2 ou le virus de la grippe). Les effets à court terme et à long terme des anticorps sont déjà documentés et utilisés pour le traitement de diverses pathologies. Il s’agit ici d’utiliser une voie optimale pour l’administration des anticorps à visée respiratoire (voie inhalée) et de potentialiser leurs effets en combinant les anticorps avec des immunomodulateurs pour en faire des médicaments plus efficaces contre la réapparition d’infections secondaires. La voie inhalée propose une administration non-invasive directement dans le territoire malade (poumon) pour une action rapide dans le tissu malade.
Procédures
_Infection et ré-infection par voie oro-trachéale : sous anesthésie générale, 1 fois, 1min _Administration des agents immunomodulateurs par voie intranasale : sous anesthésie générale, 1 fois, 20secondes _Administration de l’anticorps ou des agents immunomodulateurs par voie oro-trachéale : sous anesthésie générale, 1 fois, 1min _Administration des agents immunomodulateurs par voie intraveineuse : en tube à contention, 1 fois, 1min 30secondes _Administration des agents immunomodulateurs par voie orogastrique : en contention, 1 fois, 30secondes _Prélèvement de sang : sous anesthésie générale, 1 fois/semaine, 1min
Impact sur les animaux
Les infections peuvent générer une inflammation et une gêne respiratoire qui peuvent être douloureuses selon leurs intensités. Les animaux peuvent également présenter des douleurs associées à un stade avancé de la maladie. Aucun traitement antidouleur ou anti-inflammatoire ne peut malheureusement être envisagé pendant l’évolution de la maladie car ceci entrainerait un facteur confondant avec l’évaluation de l’efficacité des stratégies thérapeutiques et la compréhension des mécanismes inflammatoires/immunitaires associés. Les nuisances associées aux administrations des agents thérapeutiques/agent pathogène comprendront: le stress généré par l'anesthésie à l'isofluorane et la douleur associée à l'introduction d'un cathéter dans la trachée pour la voie orotrachéale; le stress généré par l'anesthésie à l'isofluorane et l'administration d'un bolus de 40µL pour la voie intranasale; le stress généré par la contention et la douleur associée à l'introduction d'une sonde de gavage dans l'œsophage pour la voie intragastrique; le stress généré par le maintien dans un tube à contention pour la voie intraveineuse.
Devenir
L’objectif de ce projet est d’améliorer nos connaissances dans les réponses immunitaires associées aux anticorps thérapeutiques/immunomodulateurs anti-infectieux inhalés. Ceci, afin d’améliorer leur transposabilité vers une utilisation clinique. Ainsi, à l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés et des prélèvements (lavages nasaux, broncho-alvéolaires / prélèvements des poumons, rate, ganglions drainant) seront réalisés afin d’analyser les dynamiques des populations immunitaires.
Remplacement
Jusqu’à présent, aucun système in vitro ne permet de reproduire les caractéristiques/processus associés aux infections respiratoires et le modèle murin constitue un modèle expérimental pertinent et nécessaire pour envisager des essais cliniques chez l’Homme. Les modèles murins d’infection à P. aeruginosa sont très bien décris dans la littérature et permettent de mimer les phénomènes observés chez l’Homme. Les outils moléculaires, permettant une meilleure compréhension des mécanismes immunitaires mis en jeu dans la protection à long terme induit par les Ac/immunomodulateurs, sont disponibles chez la souris.
Réduction
Le nombre d’animaux est optimisé en réalisant un maximum d’analyses sur chaque animal (cellules immunitaires, cytokines, expression des gènes, histologie, évaluation de la charge du pathogène, …). Les modèles murins d’infection à P. aeruginosa sont maitrisés par l’équipe et le porteur de ce projet, ce qui permet de limiter les étapes de mises au point. De plus, les expériences sont organisées avec des témoins choisis de sorte à limiter la répétition d’expériences. Un grand nombre de données ont déjà été générées permettant de réduire le choix des doses (bactérie et traitements) et des temps d’analyses. Nous utiliserons des outils statistiques adéquats. La souris est le modèle le plus adapté pour ces études précliniques car nous pouvons étudier la mécanistique de l’effet à long terme induit par les Ac/immunomodulateurs délivrés par voie pulmonaire avec des outils appropriés (cytométrie en flux, microscopie confocale, Luminex,….).
Raffinement
Tout au long du déroulement des expériences, une observation systématique de l’état clinique (selon notre score) des animaux sera réalisée de façon pluriquotidienne par les expérimentateurs afin de détecter au plus tôt une éventuelle souffrance animale et l’atteinte des points limites décrits. Ceci inclura une attention particulière à l’observation du poids de l'animal et d'un certains nombres de symptômes qui seront utilisés pour établir un score clinique. Si l’un des points limites est atteint, les souris seront euthanasiées par dislocation cervicale après anesthésie à l’isoflurane 2,5%. Un soin particulier sera apporté les 7 jours suivants une infection avec des visites biquotidiennes à l’animalerie. De la nourriture en gel sera déposée de manière préventive dans les cages pendant cette période afin de faciliter l’accès à l’eau et à la nourriture pour les animaux impactés par l’infection.
Choix des espèces
L'utilisation d'animaux dans cette étude est indispensable, car les réponses vaccinales font (1) intervenir un certain nombre de cellules immunitaires différentes, (2) sont directement liées au contexte inflammatoire de l’hôte et (3) dépendent de l’organe considéré et donc de la voie d’administration. Le modèle infectieux à Pseudomonas aeruginosa se caractérise par une réponse inflammatoire exacerbée rapide (1 à 3 jours). L’utilisation de la souris se justifie également d’un point de vue technique avec la disponibilité au sein du laboratoire de l’ensemble des réactifs/kits/consommables spécifiques de cette espèce permettant de caractériser les réponses immunitaires à long terme associée aux anticorps. Des animaux âgés de 6-8 semaines seront utilisés. Des individus plus jeunes (âges inférieurs à 6 semaines) sont à proscrire du fait du développement incomplet de leur système immunitaire, ce qui pourrait perturber l’évaluation des traitements. Des individus plus vieux (âges supérieurs à 12 semaines) sont également à proscrire du fait d’un poids souvent élevé incompatible avec certaines procédures. Ce facteur poids rend les animaux plus résistants à l’infection et là encore pourrait gêner la correcte évaluation de l’efficacité de la réponse immunitaire au traitement.
Etablissement du phénotypage de modèles de phase maniaque du trouble bipolaire chez la souris par injections répétées de stimulants 1/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
400 souris sont utilisées dans ce second établissement du projet, 320 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 80 un niveau modéré, toutes tuées et leur cerveau prélevé pour des études ultérieures. Injections répétées d'amphétamine ou d'un bloqueur du transporteur de la dopamine, contentions, isolement, six à huit tests comportementaux passés une fois chacun. Le projet vise l'acquisition par le laboratoire de méthodes d'étude de la phase maniaque du trouble bipolaire, aucun traitement n'étant évalué à ce stade. Le porteur écrit que le stress chez l'animal "comme modèle de pathologie psychiatrique humaine" repose sur l'observation du comportement, et qu'aucune méthode in vitro n'y répond.
Objectifs
Le trouble bipolaire est une cause d’invalidité majeure dans le monde avec plus de 45 millions de personnes atteintes. Il est caractérisé par une alternance entre des phases dépressives similaires à la dépression majeure et des phases maniaques présentant une élévation anormale de l’humeur ainsi que des altérations cognitives allant de la distractibilité à des comportements à risque. L’espérance de vie des patients est réduite en moyenne de 10 ans à cause du risque élevé de mort par suicide (1 patient sur 10) et de comorbidités (par exemple les troubles de l’addiction et de l’anxiété). Cependant, les mécanismes neurobiologiques ainsi que les éléments précipitant les différentes phases restent largement méconnus, à tel point qu’il n’existe pour l’instant pas de modèle expérimental récapitulant les principaux aspects de la maladie. Le but de ce projet est à court terme d’établir des méthodes d’étude de la phase maniaque du trouble bipolaire au niveau comportemental. En effet, notre laboratoire dispose déjà de l’expertise nécessaire pour étudier les phénotypes anxiodépressifs, mais pas des phénotypes maniaques inhérents au trouble bipolaire. Nous proposons donc ici d’établir des tests comportementaux pertinents pour des études ultérieures avec un modèle simple à mettre en œuvre avec administration d’un stimulant mimant certains aspects de la manie chez des souris des deux sexes. Ce projet se déroule dans deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Les études précliniques sont peu nombreuses sur le trouble bipolaire et sont critiques pour mieux comprendre sa neurobiologie et de nouvelles thérapies. Cette étude participera à établir de nouveaux tests comportementaux dans notre laboratoire pertinents pour développer de nouveaux modèles murins de trouble bipolaire, mais qui pourront aussi servir pour étudier d’autres pathologies étudiées dans notre équipe de recherche.
Procédures
Selon le groupe traité, 5 à 7 injections intrapéritonéales sont réalisées respectivement 1 jour sur 2 (GBR, un stimulant spécifique du transporteur de la dopamine) ou tous les jours (amphétamine). Les tests comportementaux ont pour objectif d'évaluer les comportements se rapprochant de la phase maniaque ou dépressive du trouble bipolaire. Chaque test n'a lieu qu'une seule fois (6 à 8 tests selon le groupe). Ils ne durent que 5 à 10 minutes par souris, en-dehors du test de préférence au sucrose (qui a lieu sur 5 jours) et du test du nid (qui a lieu sur 24h). Les deux premier groupes (80 animaux au total) seront réalisés dans l'EU1, le reste dans l'EU2.
Impact sur les animaux
Les injections intrapéritonéales (5 à 7 fois), sont espacées de 24h au moins, et les doses de GPR et AMPH sont modérées par rapport à celles utilisées dans la littérature. Elles peuvent provoquer une légère douleur au niveau du site d’injection. Les tests comportementaux sont couramment utilisés et peuvent provoquer un stress modéré en lien avec la manipulation, les contensions et l’isolement dans certains cas. Les stimulants eux-même peuvent générer de l’anxiété en lien avec leurs effets aigus et des phénotypes anxio-dépressifs en lien avec le sevrage.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés et les cerveaux seront récupérés pour des études ultérieures
Remplacement
Aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le stress chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant. L’étude de la réponse cérébrale et comportementale nécessite également l’utilisation d’animaux.
Réduction
Les effectifs sont optimisés, les analyses comportementales nécessitent une taille d’effectifs suffisante compte tenu de la variabilité inter-individuelle (n = 20 sujets en tenant compte de cette variabilité). Notre stratégie des 8 groupes suit une analyse statistique de puissance a priori : avec deux groupes (contrôles et stressés), un effet attendu modéré, on utilisera un test utilisé de manière standard dans la communauté scientifique.
Raffinement
Les conditions d’élevage des animaux seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement du milieu (cabanes plexiglass et cartons, tubes). Les animaux sont hébergés une semaine avant l’initiation des expériences. En cas d’hypothermie, chaque animal est placé sur une couverture thermorégulée pour éviter toute hypothermie. Les éxpérimentateurs sont experts dans la préhension et la contention des souris, et sont soucieux d’éviter tout stress inutile lors de la réalisation des procédures. La décision d’euthanasie est prise s’il n’y a pas d’amélioration au bout d’une semaine. Dans ce cas, une euthanasie (injection létale) sera réalisée afin d'éviter toute souffrance supplémentaire. Aucun transport d'animaux ne sera réalisé entre les deux sites.
Choix des espèces
Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, ainsi que l'expérience du laboratoire dans l'évaluation comportementale des rongeurs, l’implémentation de modèles de troubles de l’humeur, ainsi que la possibilité d’utiliser des vecteurs viraux permettant l’utilisation de l’optogénétique font de la souris le modèle le plus pertinent. Les techniques précédemment mentionnées seront mises en œuvre ultérieurement une fois les modèles mieux caractérisés. Les souris seront adultes, âgées de 8 semaines ou plus. Les modèles stimulants ayant été développé chez des animaux adultes et les patients étant typiquement diagnostiqués à l’âge adulte, nous nous focalisons sur le stade adulte dans un premier temps.
Utilisation systémique de cellules sanguines comme stratégie de délivrance d’une solution thérapeutique au muscle squelettique
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Cinq jours d'injections quotidiennes pour vider leur moelle osseuse, une greffe de moelle par voie intraveineuse le sixième jour sous anesthésie, jusqu'à cinq prises de sang, et pour certaines une injection de cardiotoxine qui lèse un muscle de la patte : 815 souris vont être utilisées, 455 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 360 un niveau léger. Le porteur indique que la greffe échoue dans environ 20 % des cas, la souris cessant alors de produire des cellules sanguines, s'affaiblissant et montrant des signes d'anémie avant sa mise à mort. Les gestes se répètent sur deux à cinq mois. Toutes sont tuées pour prélever muscles, rate, poumons et moelle, les géniteurs à 30 semaines, les femelles non génitrices dès la naissance.
Objectifs
Les dysfonctions et faiblesses musculaires, causées par des maladies héréditaires, le cancer ou le vieillissement, comptent parmi les problèmes de santé publique les plus dévastateurs. Un obstacle majeur au développement de thérapies musculaires est de parvenir à̀ délivrer les molécules thérapeutiques aux muscles, qui sont repartis dans tout l'organisme. Il est essentiel qu'un traitement puisse cibler efficacement tous les muscles affectés. Ce projet vise à̀ développer une nouvelle stratégie de délivrance musculaire, basée sur l'utilisation de cellules immunitaires modifiées pour fusionner à ces cellules musculaires. En effet, les cellules immunitaires ont la capacité naturelle d’atteindre tous les tissus de l’organisme, et dans la plupart des maladies musculaires, on observe une infiltration importante de cellules immunitaires au niveau des muscles. Ce projet utilise donc la capacité des cellules immunitaires à atteindre tous les muscles de l’organisme. En modifiant ces cellules pour les rendre capables de fusionner avec les cellules musculaires, nous cherchons à̀ générer un outil de délivrance qui puisse délivrer des traitements thérapeutiques aux muscles blessés. Cette approche est testée chez la souris, dans la lignée naturelle puis dans le modèle de myopathie de Duchenne, pour apporter une preuve de concept. Les cellules immunitaires modifiées sont administrées par une greffe de moelle osseuse, afin que tous les types cellulaires sanguins soient porteurs de cet outil thérapeutique de manière durable. Ceci permettra d’analyser la stratégie globale et d’identifier plus précisément quel type de cellules immunitaires sont importantes dans ce processus. Le projet permet de tester la capacité de fusion des cellules du sang génétiquement modifiées avec les fibres musculaires dans un contexte inflammatoire aigu (lésion) ainsi que dans un contexte inflammatoire chronique (modèle de myopathie). Il est important d'évaluer la fusion dans les deux contextes car il est bien documenté que les acteurs inflammatoires présents lors de la régénération musculaire, et la signature qui les accompagne, sont différents entre inflammation aigüe et chronique. On pourra ensuite utiliser cet outil dans le contexte thérapeutique en ajoutant une solution thérapeutique dans les cellules du sang afin qu’elle soit délivrée aux muscles dystrophiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de déterminer si l’utilisation du système immunitaire en tant que système de délivrance aux muscles squelettiques est une piste clinique pertinente. En effet, l’enjeu majeur est aujourd’hui la délivrance systémique des outils pour atteindre tous les muscles squelettiques afin les soigner. Nous pourrons montrer, non seulement la pertinence de cet outil in vivo pour une pathologie type dystrophie musculaire, la dystrophie de Duchenne, mais aussi ouvrir la voie pour d’autres dystrophies en adaptant la solution thérapeutique contenue dans le vecteur (les cellules du sang). Ce projet permettra aussi de comprendre plus précisément comment les différents types de cellules immunitaires thérapeutiques participent à la régénération en condition d’inflammation aigue (lésion) ou chronique (modèle de la myopathie de Duchenne), pour préciser les mécanismes de cette stratégie thérapeutique.
Procédures
Afin de réaliser la préparation des animaux pour la greffe de cellules souche de moelle osseuse, des injections auront lieu 1 fois par jour sur une durée de 5 jours sur animaux vigiles avec une contention maximum de 1 minute. Le sixième jour, la greffe de moelle est réalisée en injection intraveineuse sous anesthésie gazeuse (injection en 2 minutes, temps total d’anesthésie 10 minutes maximum avec endormissement) et anesthésie locale (gouttes anesthésiantes préalablement administrées). Par la suite, la prise de greffe est contrôlée par prélèvement sanguin sous anesthésie: 1 à 5 fois par individu dépendamment des procédures, en respectant le maximum de prélèvement de 7,5% du volume sanguin 1 fois par semaine maximum (durée totale maximum d’anesthésie 10 min avec endormissement). Deux procédures incluent l’injection d'une molécule provoquant une lésion musculaire et déclenchant la régénération musculaire. Cette injection est réalisée sous anesthésie gazeuse (injection en 30 secondes, temps total d'anésthésie 10 minutes maximum avec endormissement) avec administration préalable d’analgésique.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent présenter des signes de stress liés à leur manipulation lors des expérimentations et des pesées. Les procédures sont classées sévères de par la répétition des gestes expérimentaux sur une durée maximale de 2 ou 5 mois et la douleur que peut ressentir l’animal. Les souris peuvent présenter : - une sensibilité́ de la peau au niveau des zones d’injection pendant une durée de 5 jours. - une douleur de légère à modérée au niveau de l’œil pour une durée de 5 min minimisée par antalgique et anesthésique. - une perte de poids pendant 15 jours. - une douleur légère après la lésion musculaire au niveau de la patte minimisée par antalgique et une boiterie légère (quelques heures) du fait de la perte de volume musculaire localisée. L’utilisation d’un protocole de déplétion de moelle puis de greffe de moelle afin de reconstituer un système hématopoïétique « thérapeutique » comporte le risque que la greffe ne prenne pas. Ainsi parfois les cellules souches injectées ne parviennent pas à coloniser la niche et la souris ne produira plus de cellules sanguines nécessaires à sa survie (environ 20% des cas). Dans ce cas, l’animal s’affaiblit et montre des signes d’anémie par manque de globules rouges. Il est alors mis à mort dès la détection des points limite (suivi quotidien). Durant la période de reconstitution du système sanguin, le système immunitaire est affaibli, les souris sont donc manipulées en conditions stériles ainsi que nourries avec de la nourriture stérile afin d’éviter toute contamination. Le phénotype de la lignée génétiquement modifiée (modèle de la myopathie de Duchenne), n’induit pas de douleurs ni signes cliniques à l'âge choisi pour ce projet. Des difficultés de locomotion ou une gêne cardio-respiratoire peuvent apparaitre vers environ 18 mois après épuisement des capacités de régénération musculaire à cause des cycles de régénération musculaire réguliers dûs au phénotype (inflammation chronique). La lignée doit régulièrement être recroisée avec des souris de type naturel afin d’éviter la consanguinité. Il faudra alors réaliser des biopsies (queue) et identification par tatouage pour retrouver des couples homozygotes après les croisements.
Devenir
Pour chacune des procédures, on réalise des analyses histologiques des muscles concernés. Cela nécessite donc des prélèvements de muscles post mortem. On prélèvera également des organes impliqués dans le système immunitaire tels que la rate, les poumons, la moelle osseuse pour des analyses histologiques du devenir des cellules du système sanguin. Pour le maintien de lignée ainsi que la production, les géniteurs seront mis à mort post production ou dès qu’ils atteindront 30 semaines. Les femelles non génitrices seront mises à mort à la naissance et/ou pourront servir à d’autres équipes pour des prélèvements.
Remplacement
Une preuve de principe validant la stratégie a déjà été obtenue in vitro, et les constructions génétiques thérapeutiques sont toutes validées in vitro au préalable. Les validations comprennent : la validation de l’expression des gènes d’intérêt par les constructions dans un modèle hétérologue in vitro, l’infectiosité des lentivirus sur les cellules souches hématopoïétiques, l’expression par les promoteurs dans celles-ci, et enfin la viabilité des cellules souches lors de l’induction des gènes d’intérêts. Le projet vise maintenant à déterminer si une délivrance systémique de cellules sanguines modifiées peut permettre de cibler les muscles, ce qui doit nécessairement être réalisé in vivo chez l’animal. L’organisme de la souris pourra permettre de comprendre l’influence du micro-environnement de la lésion musculaire et l’implication des cellules en périphérie des muscles sur notre modèle thérapeutique.
Réduction
Pour les étapes impliquant la cardiotoxine, l’étude de la régénération musculaire se fait en comparant le muscle lésé, et celui en contralatéral, témoin. Cela permet de réduire le nombre de souris utilisées. Le calcul du nombre d’animaux par procédure s’appuie sur des analyses statistiques qui nous permettent d’avoir des résultats statistiquement significatifs. Par ailleurs, tout animal mis à mort peut être utilisé pour obtenir d'autres tissus pour d’autres projets de l’équipe ou de l’institut. En particulier les femelles produites lors de la formation des lots de souris modèle de la myopathie de Duchenne mâles mais non utilisées dans ce projet pourront être partagées avec des équipes de l’institut ne possédant pas de colonie.
Raffinement
Les protocoles choisis en priorité sont ceux qui limitent la douleur et l’inconfort de l’animal. Des analgésiques et des anesthésiants sont utilisés pour réduire au maximum la douleur et le stress de l’animal. Les manipulations pour les pesées seront effectuées avec l'utilisation de tunnel ou de préhension douce sur la main. Les premières étapes de ce projet permettront de préciser les conditions expérimentales de protocole (voie d’administration) afin de raffiner la méthode pour les étapes suivantes. Des enrichissements et de la nourriture stériles sont utilisés afin de réduire les risques notamment lors de la phase immunodéficiente. En particulier, une alimentation enrichie (graine de tournesol, gels) sera fournie aux animaux pour encourager la prise de poids. Des antibiotiques peuvent être administrés en cas d'infection sur consultation du vétérinaire référent. Une attention particulière pour des signes de douleur est portée aux animaux dans les deux jours qui suivent l’injection de cardiotoxine, ou dans les deux semaines qui suivent la greffe de moelle, afin de veiller aux points limites décrits. La lésion musculaire à la cardiotoxine est communément utilisée et est administrée en même temps qu’un antidouleur afin d’assurer le bien-être animal. Une régénération totale du muscle est attendue en deux semaines. Les animaux modèles de myopathie participeront au protocole avant l'apparition de signes cliniques liés à la maladie. Les prises de sang hebdomadaires seront réalisées conformément au respect des volumes sanguins : maximum 7,5% du volume sanguin total sera prélevé et une semaine de délai sera respectée pour la reconstitution du sang. Par exemple, pour une souris le volume sanguin total est en moyenne de 70-80 mL/kg soit une souris de 25g : vol sanguin 1,75 mL : vol prélevé max 131 µL. Le plan d’expérience a été assisté grâce à l’outil EDA (https://eda.nc3rs.org.uk) proposé par le nc3r.
Choix des espèces
Ce projet permet de tester l’efficacité de la stratégie de diffusion à l’échelle systémique de la solution thérapeutique. Il n’existe actuellement aucun moyen de reproduire cela in vitro, d’où l’utilisation de modèles animaux. La souris est couramment utilisée dans le domaine de l’immunologie pour des expériences de greffe de moelle osseuse et les protocoles associés à cette technique sont hautement normalisés. Le protocole suivi pour la préparation des cellules greffées est au plus proche de ce qui est actuellement utilisé en clinique. De plus, le modèle murin dystrophique sert couramment de modèle de dystrophie musculaire dans des études précliniques. En effet, les souris ont une organisation musculaire squelettique très similaire à celle de l’Homme . On dispose donc chez la souris de tous les éléments permettant de tester notre stratégie : des modèles de la myopathie de Duchenne et des techniques essentielles (greffe de moelle osseuse, modification de gènes, etc.). Les souris de type naturel seront utilisées entre 8 et 10 semaines en début de procédure. Tout d’abord, le développement musculaire chez la souris se termine vers 5 semaines. De plus, la déplétion de moëlle ne se réalise usuellement pas avant 8 semaines de vie minimum. Malgré leur utilisation en tant que modèle de maladie, les souris modèle de la myopathie de Duchenne se comportent normalement, elles peuvent commencer à avoir un phénotype dommageable aux alentours de leurs 18 mois. Les animaux géniteurs ou utilisés pour les procédures sont mis à mort au plus tard à 30 semaines. Cependant les animaux seront utilisés entre leurs 2 et 6 mois, période durant laquelle la régénération musculaire est la plus intense et bien avant l'épuisement des capacités de régénération, et donc une éventuelle apparition de signes cliniques . Pour les géniteurs ils seront gardés 30 semaines au maximum pour s’assurer de bonnes capacités de reproduction.
Etablissement du phénotypage de modèles de phase maniaque du trouble bipolaire chez la souris par injections répétées de stimulants 1/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Mettre au point des tests comportementaux dont le laboratoire déclare ne pas disposer mobilise 400 souris, 320 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 80 un niveau modéré, toutes tuées pour prélever leur cerveau. Cinq à sept injections intrapéritonéales d'amphétamine ou d'un stimulant du transporteur de la dopamine précèdent six à huit tests comportementaux, dont le test de préférence au sucrose sur cinq jours et le test du nid sur vingt-quatre heures. Le porteur indique que les stimulants peuvent provoquer de l'anxiété par leurs effets aigus, et des phénotypes anxio-dépressifs au sevrage. La mise à mort intervient en l'absence d'amélioration au bout d'une semaine, seule limite temporelle que le résumé oppose à la souffrance sévère déclarée pour 320 souris.
Objectifs
Le trouble bipolaire est une cause d’invalidité majeure dans le monde avec plus de 45 millions de personnes atteintes. Il est caractérisé par une alternance entre des phases dépressives similaires à la dépression majeure et des phases maniaques présentant une élévation anormale de l’humeur ainsi que des altérations cognitives allant de la distractibilité à des comportements à risque. L’espérance de vie des patients est réduite en moyenne de 10 ans à cause du risque élevé de mort par suicide (1 patient sur 10) et de comorbidités (par exemple les troubles de l’addiction et de l’anxiété). Cependant, les mécanismes neurobiologiques ainsi que les éléments précipitant les différentes phases restent largement méconnus, à tel point qu’il n’existe pour l’instant pas de modèle expérimental récapitulant les principaux aspects de la maladie. Le but de ce projet est à court terme d’établir des méthodes d’étude de la phase maniaque du trouble bipolaire au niveau comportemental. En effet, notre laboratoire dispose déjà de l’expertise nécessaire pour étudier les phénotypes anxiodépressifs, mais pas des phénotypes maniaques inhérents au trouble bipolaire. Nous proposons donc ici d’établir des tests comportementaux pertinents pour des études ultérieures avec un modèle simple à mettre en œuvre avec administration d’un stimulant mimant certains aspects de la manie chez des souris des deux sexes. Ce projet se déroule dans deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Les études précliniques sont peu nombreuses sur le trouble bipolaire et sont critiques pour mieux comprendre sa neurobiologie et de nouvelles thérapies. Cette étude participera à établir de nouveaux tests comportementaux dans notre laboratoire pertinents pour développer de nouveaux modèles murins de trouble bipolaire, mais qui pourront aussi servir pour étudier d’autres pathologies étudiées dans notre équipe de recherche.
Procédures
Selon le groupe traité, 5 à 7 injections intrapéritonéales sont réalisées respectivement 1 jour sur 2 (GBR, un stimulant spécifique du transporteur de la dopamine) ou tous les jours (amphétamine). Les tests comportementaux ont pour objectif d'évaluer les comportements se rapprochant de la phase maniaque ou dépressive du trouble bipolaire. Chaque test n'a lieu qu'une seule fois (6 à 8 tests selon le groupe). Ils ne durent que 5 à 10 minutes par souris, en-dehors du test de préférence au sucrose (qui a lieu sur 5 jours) et du test du nid (qui a lieu sur 24h). Les deux premier groupes (80 animaux au total) seront réalisés dans l'EU1, le reste dans l'EU2.
Impact sur les animaux
Les injections intrapéritonéales (5 à 7 fois), sont espacées de 24h au moins, et les doses de GPR et AMPH sont modérées par rapport à celles utilisées dans la littérature. Elles peuvent provoquer une légère douleur au niveau du site d’injection. Les tests comportementaux sont couramment utilisés et peuvent provoquer un stress modéré en lien avec la manipulation, les contensions et l’isolement dans certains cas. Les stimulants eux-même peuvent générer de l’anxiété en lien avec leurs effets aigus et des phénotypes anxio-dépressifs en lien avec le sevrage.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés et les cerveaux seront récupérés pour des études ultérieures
Remplacement
Aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le stress chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant. L’étude de la réponse cérébrale et comportementale nécessite également l’utilisation d’animaux.
Réduction
Les effectifs sont optimisés, les analyses comportementales nécessitent une taille d’effectifs suffisante compte tenu de la variabilité inter-individuelle (n = 20 sujets en tenant compte de cette variabilité). Notre stratégie des 8 groupes suit une analyse statistique de puissance a priori : avec deux groupes (contrôles et stressés), un effet attendu modéré, on utilisera un test utilisé de manière standard dans la communauté scientifique.
Raffinement
Les conditions d’élevage des animaux seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement du milieu (cabanes plexiglass et cartons, tubes). Les animaux sont hébergés une semaine avant l’initiation des expériences. En cas d’hypothermie, chaque animal est placé sur une couverture thermorégulée pour éviter toute hypothermie. Les éxpérimentateurs sont experts dans la préhension et la contention des souris, et sont soucieux d’éviter tout stress inutile lors de la réalisation des procédures. La décision d’euthanasie est prise s’il n’y a pas d’amélioration au bout d’une semaine. Dans ce cas, une euthanasie (injection létale) sera réalisée afin d'éviter toute souffrance supplémentaire. Aucun transport d'animaux ne sera réalisé entre les deux sites.
Choix des espèces
Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, ainsi que l'expérience du laboratoire dans l'évaluation comportementale des rongeurs, l’implémentation de modèles de troubles de l’humeur, ainsi que la possibilité d’utiliser des vecteurs viraux permettant l’utilisation de l’optogénétique font de la souris le modèle le plus pertinent. Les techniques précédemment mentionnées seront mises en œuvre ultérieurement une fois les modèles mieux caractérisés. Les souris seront adultes, âgées de 8 semaines ou plus. Les modèles stimulants ayant été développé chez des animaux adultes et les patients étant typiquement diagnostiqués à l’âge adulte, nous nous focalisons sur le stade adulte dans un premier temps.
Etude de la fonction des cellules endothéliales en contexte physiologique, de régénération du thymus et de dissémination leucémique.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Une partie des souris utilisées a 12 ou 18 mois, choisies pour leur involution thymique avancée, d'autres reçoivent une injection de cellules leucémiques. 295 souris vont être utilisées, 175 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 120 un niveau sévère, toutes tuées pour analyse. Deux séries de quatre injections quotidiennes éliminent un récepteur dans les cellules des vaisseaux sanguins, avant trois injections du ligand testé et des prises de sang sur animaux vigiles. Le porteur décrit une leucémie qui génère un inconfort et une douleur prolongée, précise que ce modèle est létal au-delà de 21 jours, et fixe la mise à mort au dixième jour au plus tard.
Objectifs
Notre projet de recherche porte sur la régulation du développement des lymphocytes T (LT). Les LT se développent au sein du thymus, hébergeant leur production et leur sélection. Or, le thymus est un organe extrêmement sensible aux perturbations de la physiologie tel que le vieillissement. En effet, avec l’âge, le thymus subit une réduction drastique en taille et en fonctionnalité. Ce processus résulte en une forte altération de la production de nouveaux LT, réduisant ainsi fortement leur renouvellement dans l’organisme. Ceci résulte en une susceptibilité accrue de l’organisme aux infections, aux pathologies auto-immunes et aux cancers. De manière intéressante, notre équipe a identifié que l’administration d’une protéine ligand-X capable de se fixer sur un récepteur-Y spécifique présent sur les cellules du thymus promeut la régénération de cet organe et la production des LT au cours de l'involution associée à l'âge. Nos résultats montrent que l’action de cette molécule est médiée par une amélioration du nombre et de la fonction des cellules des parois des vaisseaux sanguins. Ce projet s’intéresse à comprendre comment ce Ligand-X agit sur la fonction des cellules des parois des vaisseaux sanguins du thymus. Ainsi, le premier objectif de notre projet est de caractériser le rôle de l’axe ligand-X/ récepteur-Y dans la physiologie des cellules des parois des vaisseaux sanguins thymiques ainsi que de déterminer le rôle de ces cellules dans la régénération du thymus. De plus, puisque le ligand-X est important pour la fonction des cellules des parois des vaisseaux sanguins thymiques et que nos résultats démontrent que les cellules leucémiques produisent fortement cette protéine ligand-X, nous émettons l’hypothèse que l’axe ligand-X/récepteur-Y dans les cellules des parois des vaisseaux sanguins est impliqué dans la dissémination des cellules leucémiques. Ainsi, le deuxième objectif vise à démontrer et caractériser le rôle de cet axe dans les cellules des parois des vaisseaux sanguins thymiques au cours de la leucémie. Ce projet permettra d’évaluer le rôle de l’axe ligand-X/récepteur-Y dans la fonction des cellules des parois des vaisseaux sanguins thymiques en contexte physiologique, de régénération du thymus, de dissémination leucémique et de réponse vaccinale.
Bénéfices attendus
Du fait du vieillissement progressif de la population et de l’amélioration de l’espérance de vie, l’immunodéficience liée à l’âge, étroitement corrélée avec le processus d’involution thymique, devient une préoccupation de santé publique majeure. Notamment, de nombreuses études révèlent un lien étroit entre le vieillissement et l’incidence des cancers. Ainsi, notre projet est susceptible d’avoir des retombées majeures dans la compréhension et la lutte contre le vieillissement immunitaire. A moyen terme, notre étude évaluera le rôle des cellules des parois des vaisseaux sanguins thymiques et de l’axe ligand-X/récepteur-Y dans la régénération thymique. Par ailleurs, notre étude du rôle de l’axe ligand-X /récepteur-Y dans la dissémination leucémique permettra de mettre en avant une nouvelle cible thérapeutique, particulièrement en ciblant cet axe afin de limiter l’invasion dans les tissus. A plus long terme, nos études devraient participer au développement des thérapies promouvant le vieillissement en bonne santé en corrigeant les défauts de développement thymique liés à l’âge et pourrait permettre d’améliorer la prise en charge des patients atteints de leucémies.
Procédures
Pour l’étude du rôle du ligand-X dans les cellules des parois des vaisseaux sanguins thymiques, des souris âgées de 8 semaines, 12 mois (involution thymique avancée) ou 18 mois (involution thymique très avancée) vigiles recevront 2 séries d’injections (1 injection quotidienne par série de 4 jours, espacée de 3 jours de la suivante) permettant d’éliminer le récepteur Y dans les cellules des parois des vaisseaux sanguins. Trois jours après la dernière injection, les souris âgées de 12 et 18 mois seront traitées avec le ligand-X ou un contrôle par injection sous anesthésie gazeuse légère, 3 injections par animal sur 3 jours consécutifs. Une partie des animaux recevront des progéniteurs de lymphocytes T par injection sous anesthésie gazeuse légère. La fonctionnalité des cellules sera ensuite analysée. Pour le modèle de leucémie, les souris âgées de 8 semaines recevront 2 séries d’injections (1 injection quotidienne par série de 4 jours, espacée de 3 jours de la suivante) permettant d’éliminer le récepteur Y dans les cellules des parois des vaisseaux sanguins. Trois jours après la dernière injection, les animaux recevront une injection de cellules leucémiques sous anesthésie gazeuse légère durant 2 minutes par animal. Aux jours 3 et 6 après l’injection des cellules leucémiques, les animaux seront soumis à un prélèvement de sang sur animaux vigiles. Finalement, pour les tests de réponse vaccinale, des souris de 12 mois seront traitées avec le ligand-X ou un contrôle sous anesthésie gazeuse légère, 3 injections par animal sur 3 jours consécutifs. 28 jours après la première injection, les animaux recevront par voie sous-cutanée une protéine A en tant que modèle de vaccination sous anesthésie gazeuse légère.
Impact sur les animaux
Les injections intraveineuses (sous anesthésie gazeuse légère) et intrapéritonéales peuvent générer un stress, un inconfort et une douleur légère de courte durée. Concernant le modèle de leucémies, la maladie peut générer des nuisances caractérisées par un inconfort et une douleur prolongée. Bien que ce modèle puisse être léthal au-delà de 21 jours, les souris seront mises à mort et analysées à un temps court (maximum 10 jours) dans le cadre de ce projet. Les nuisances possibles sont : un stress, une perte de poids et une potentielle douleur prolongée. Concernant le modèle de réponse vaccinale, les injections sous-cutanées (sous anesthésie gazeuse légère) peuvent générer un stress et une douleur légère de courte durée et peuvent éventuellement générer une inflammation locale, qui sera surveillée quotidiennement attentivement. Les nuisances possibles sont : un stress, une perte de poids et une potentielle douleur modérée et prolongée.
Devenir
Les animaux utilisés seront mis à mort pour l'analyse à la fin des procédures.
Remplacement
A ce jour, aucune alternative non animale permet d’étudier l’effet de la régénération de la production du thymus par le traitement ligand-X. De plus, l’étude de la dissémination leucémique au sein des tissus nécessite l’utilisation du modèle in vivo. Notre projet nécessite donc une approche in vivo afin de mettre en relation les différentes composantes tissulaires et cellulaires impliquées dans la réponse étudiée.
Réduction
Le choix du nombre d’animaux est réalisé afin de réduire le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la reproductibilité et la fiabilité des résultats. Il prend en considération la variabilité inter-individuelle, la variabilité de réponse au traitement et la variabilité de charge leucémique. Après la première expérience, le nombre d'animaux à utiliser sera ajusté après estimation du nombre d'animaux nécessaires pour garantir un résultat fiable. D’après nos analyses de la littérature et notre expérience passée, un nombre de 9 à 15 animaux par groupe devraient fournir des résultats suffisamment robustes et interprétables. Afin d’éviter les biais expérimentaux, les animaux seront répartis en aveugle dans les différents groupes de traitement par un expérimentateur tiers. Afin de réduire le nombre de souris contrôles utilisées, un maximum de groupes différents seront constitués lors d’une même expérience, e.g. l'étude de la dissémination leucémique chez les animaux et l’étude de l’effet d’une neutralisation du ligand-X chez ces animaux.
Raffinement
Afin de réduire les nuisances, plusieurs mesures seront prises. Concernant le stress de manipulation, les animaux seront manipulés par un seul expérimentateur sauf pour l’étape de répartition dans les groupes. Les animaux seront soumis à une anesthésiés gazeuse légère par inhalation gazeuse avant chaque injection intraveineuse. Les animaux bénéficieront par ailleurs d’une surveillance quotidienne ou tous les deux jours selon la procédure, afin d’identifier tout signe de gêne ou de douleur, à l’aide d’une grille d’évaluation dans le cas de la leucémie. Entre autres, les animaux seront pesés tous les jours avec une balance de précision, et seront soumis à une surveillance accrue dès l’identification d’une perte de poids. En cas de faiblesse pouvant générer un défaut d’alimentation ou de perte de poids importante, une alimentation hydratée spécifique sera déposée dans le fond de la cage. Les signes de douleurs seront monitorés avec précision selon la grille d’évaluation, et des analgésiques seront administrés à l’apparition de signes de douleurs.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix des divers projets de l’équipe, adapté à l’analyse du système immunitaire, et en particulier du thymus, ainsi qu’à l’oncologie. Les souris génétiquement modifiées que nous utiliserons ont un fond génétique stable et après traitement, le récepteur Y sera spécifiquement mutée dans les cellules des parois des vaisseaux sanguins thymiques . Trois âges sont prévus : -stade jeune : souris de 8 semaines. -stade avancé d’involution thymique : souris âgées de 12 mois. -stade très avancé d’involution thymique : souris âgées de 18 mois.
Investigation du rôle des systèmes neuromodulateurs dans l’alignement de l’axe vertébral du poisson zèbre
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
2 012 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, 1 824 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 188 un niveau sévère. Une partie est exposée vingt heures par jour pendant quatre jours à un composé pharmacologique qui déforme la colonne vertébrale, avec une mortalité attendue jusqu'à 40 % chez les larves traitées. D'autres subissent une biopsie de la nageoire caudale, une immobilisation en gel d'agarose, une injection intramusculaire paralysante, puis jusqu'à quarante-cinq minutes d'illumination laser des tissus. Le porteur écrit que cette étude "ne peut donc être soumise au principe de remplacement", au motif que seules des espèces pourvues d'une colonne vertébrale permettraient d'étudier la scoliose.
Objectifs
Les déformations de la colonne vertébrale regroupent des pathologies de l’alignement du rachis qui surviennent autour de la période de forte croissance chez l’adolescent. Parmi elles, la scoliose idiopathique de l’adolescent (SIA) est la plus fréquente : elle consiste en des désalignements des vertèbres qui touchent 1 à 4% de la population. La correction de ces déformations spontanées, détectées principalement chez les filles, se base sur le port prolongé de corsets et sur des chirurgies invasives de fusions vertébrales dont le but est de recouvrer une posture correcte et d’atténuer les douleurs thoraciques associées. A ce jour, aucun traitement non invasif n’existe pour traiter la SIA, faisant de la compréhension de ses causes un enjeu majeur pour son traitement mais aussi pour sa détection précoce. L’étiologie de la SIA est restée longtemps peu comprise, principalement à cause de l’absence de modèles intégrant la complexité spatiale, temporelle et moléculaire, impliquée dans le développement et la consolidation du squelette vertébral. Récemment, le poisson zèbre a émergé comme un modèle puissant pour cette pathologie. Des travaux récents ont montré que le système nerveux est à l’origine de voies importantes, mais encore mal comprises, dans l’établissement de l’alignement de la colonne vertébrale au cours du développement post-embryonnaire. La finalité de ce projet est donc de comprendre, en utilisant le poisson zèbre comme modèle animal, par quels mécanismes le système nerveux influence l’alignement de la colonne vertébrale au cours du développement post-embryonnaire.
Bénéfices attendus
Ce projet offre deux bénéfices principaux. Du point de vue scientifique, il permettra à court terme (pendant la durée du projet) de faire progresser les connaissances liées à l’influence du système nerveux sur l’alignement de la colonne vertébrale ainsi que sur les mécanismes sous-jacents qui se mettent en place au cours du développement post-embryonnaire et de la croissance de l’organisme. Du point de vue sociétal, il permettra à plus long terme d’identifier de nouveaux marqueurs de progression ou de nouvelles cibles pharmacologiques potentielles permettant d’infléchir l’évolution de la scoliose idiopathique de l’adolescent.
Procédures
Les signes cliniques attendus dans nos modèles de scoliose consistent en des déformations de la colonne vertébrale, sans troubles visibles attendus en termes de douleur, de nage, de comportement, ou d’alimentation (durée attendue des signes cliniques allant de 2 à 32 semaines en fonction des lots). Des animaux seront exposés à des traitements pharmacologiques délivrés directement dans l’eau permettant de mettre en place un de nos modèles de scoliose (un traitement par animal 20h par jour avec 4h de récupération, pendant 4 jours ; durée attendue des signes cliniques de 8 jours). Les animaux, sous anesthésie profonde, seront soumis soit à une biopsie de la nageoire caudale (biopsie de 1-2 mm, une fois par animal, 30 secondes), soit à des immobilisations en gel d’agarose (indolore, 1 fois par animal, durée : 10 à 15 minutes) suivies d’injections intramusculaires (une fois par animal, 2 secondes) suivies de d’enregistrements non invasifs d’images en fluorescence à des stades du développement où ils sont transparents et optiquement accessibles (une fois par animal, 30 à 45 minutes). Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode règlementaire en fin de procédure.
Impact sur les animaux
La première catégorie d’effets indésirables attendus est liée à l’apparition de déformations de l’axe du corps chez des animaux mutants et chez des animaux exposés à des traitements pharmacologiques permettant établir notre modèle. Ce signe clinique apparait spontanément chez les mutants étudiés (à environ 2 semaines d’âge) et sera effectif jusqu’à la fin des procédures expérimentales associées. Il sera induit pharmacologiquement chez les animaux traités pendant une durée de 7 jours. Les observations reportées dans la littérature et nos observations préliminaires n’indiquent aucun impact détectable de ce signe clinique sur l’alimentation des animaux, leur comportement de nage en milieu aquatique, et leurs interactions en groupe social, suggérant des conséquences modérées en termes de stress, de douleur ou de mobilité. La deuxième catégorie d’effets indésirables attendus est liée aux actes expérimentaux nécessaires pour effectuer des expériences d’imagerie. Elle comprend le prélèvement des animaux de leur aquarium avec une épuisette, l’anesthésie, l’immobilisation d’animaux profondément sédatés, la paralysie par injection intramusculaire, et l’illumination des tissus avec un laser. Les effets indésirables prévus pour ces animaux couvrent donc le stress induit par la manipulation jusqu’à la sédation, leur immobilisation après une sédation profonde, la douleur causée par une aiguille permettant de procéder à une injection intramusculaire et l’illumination des tissus sous un microscope à fluorescence, couvrant une durée ne dépassant pas 60 minutes par animal. La troisième catégorie d’effets indésirables concerne la toxicité du composé pharmacologique délivré dans l’eau permettant de mettre en place un de nos modèles de scoliose, auquel les animaux seront exposés et qui nécessitera une modification des conditions d’hébergement (modification du cycle jour-nuit), pouvant générer un stress, et diminuera leur taux de survie pendant la période d’exposition. Enfin l’acte de biopsie consistant à prélever un échantillon de nageoire caudale chez des adultes sous anesthésie générale afin d’identifier leur statut génétique constitue la dernière catégorie de nuisance pour les animaux étudiés.
Devenir
Pour toutes les procédures de ce projet, les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de nous permettre de réaliser les analyses prévues post-mortem. Elles comprennent des analyses de l’alignement vertébral, d’histologie, d’anatomie, et de prélèvement de tissus post-mortem qui seront utilisés pour des analyses de biologie moléculaire nous permettant de caractériser génétiquement chaque animal.
Remplacement
La scoliose idiopathique est une déformation de la colonne vertébrale qui apparaît spontanément chez l’adolescent au cours de la puberté. L’étude des origines génétiques ainsi que des mécanismes biologiques qui la sous-tendent ne peut donc être réalisée que chez espèces pourvues de colonnes vertébrales. Aucune alternative non animale n’existe à ce jour permettant d’étudier ces questions, notamment le rôle du système nerveux dans l’alignement vertébral, ni de sonder les conséquences induites par la manipulation de ce système sur leurs cibles en aval. Cette étude ne peut donc être soumise au principe de remplacement.
Réduction
2012 animaux seront utilisés dans ce projet. Afin de limiter le plus possible le nombre d’animaux prévus dans notre étude, nous avons évalué le nombre d’individus nécessaires pour chaque procédure en se basant sur : (i) l’identification de lots déterminés par les stades développementaux clés pour mener nos investigations et tester nos hypothèses de travail, (ii) une estimation de l’échantillonnage nécessaire pour détecter les effets biologiques testés, basée sur une comparaison statistique, (iii) la prise en compte d’une comparaison de groupes expérimentaux liée à l’identité génétique de frères et sœurs dont la distribution est connue, (iv) un taux de survie estimé à 80 pour cent pour les alevins mis élevage, (v) une mortalité maximale estimée à 40 pour cent pour les larves exposées au traitement pharmacologique permettant de mettre en place notre modèle, (vi) la prise en compte d’un échantillonnage équivalent de mâles et de femelles. Pour chaque quantification effectuée, les tests statistiques appropriés seront utilisés pour évaluer la significativité des effets observés dans nos procédures. Certains animaux seront utilisés pour mener des investigations post-mortem et répondre à plusieurs questions scientifiques. Pour chacune des procédures conçues, un nombre d’animaux inférieur à celui prévu sera utilisé si nos résultats sont statistiquement fiables avant l’utilisation de l’ensemble des animaux envisagés. En particulier, nous tenterons de développer une technique de biologie moléculaire nous permettant de caractériser génétiquement chaque animal de façon précoce avant leur mise en élevage. Si cette implémentation s’avère fructueuse, un nombre moins important d’animaux sera effectivement utilisé, notamment pour les groupes témoins, pour atteindre des résultats statistiquement fiables.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans une animalerie agréée, où les paramètres environnementaux sont vérifiés, contrôlés et adaptés si nécessaire (qualité et température de l’eau, cycle lumineux, etc.). Les animaux seront nourris 1 à 2 fois par jour avec une alimentation adaptée à leur stade physiologique. Les mesures spécifiques de raffinement qui seront prises incluent : (i) une surveillance accrue des mutants étudiés et des animaux soumis aux traitements pharmacologiques permettant d’induire des scolioses, afin de détecter et limiter les signes de mal-être liés à leur désalignement axial ou à l’exposition au composé pharmacologique utilisé à cet effet, (ii) l’hébergement des animaux par groupes de phénotypes semblables dès que possible au cours du développement post-embryonnaire afin de limiter un accès compétitif à la nourriture si cela est pertinent, (iii) l’utilisation d’une grille de score standardisée au sein de la structure d’hébergement, permettant d’évaluer les signes de mal-être, de douleur ou de souffrance et permettant une prise en charge rapide et optimale par l’utilisateur en coordination avec la structure chargée du bien-être animal et l’équipe vétérinaire, (iv) l’identification de points limites pour chacune des procédures permettant une prise en charge rapide et optimisée en fonction des procédures expérimentales, (v) l’utilisation d’un composé non aversif et à induction rapide pour l’anesthésie et l’euthanasie, (vi) le choix de manipulations douces des animaux avec des instruments atraumatiques (épuisette, cuillère), (vii) la mise en place d’une habituation des animaux à un changement environnemental lorsque cela est pertinent, (viii) l’optimisation d’une technique de biologie moléculaire permettant de caractériser génétiquement chaque animal de façon précoce avant sa mise en élevage afin de permettre l’hébergement d’animaux qui auront des signes cliniques comparables, avant que ces derniers ne se déclarent ; (ix) une technique de biopsie sur animaux adultes sous anesthésie générale à induction rapide incluant des manipulations atraumatiques et un prélèvement limité avec des outils désinfectés.
Choix des espèces
Le poisson-zèbre constitue un modèle de choix pour l’étude de la scoliose idiopathique de l’adolescent. En effet, sa colonne vertébrale partage les mêmes caractéristiques morphoanatomiques que celles de l’homme. Elle est soumise, du fait qu’il évolue en milieu dense, à des forces biomécaniques similaires à celles des espèces bipèdes, contrairement aux quadrupèdes dont le rachis subit des sollicitations influencées par une perception différente de la gravité. Le poisson zèbre possède un génome conservé à 70 pour cent avec celui de l’homme, permettant des analyses étiologiques poussées. Il présente enfin l’avantage de se reproduire en milieu externe et de rester optiquement transparent pendant une large partie de son développement post-embryonnaire, permettant d’implémenter des méthodes non invasives basées sur la microscopie in vivo afin de mener les investigations appropriées sans induire de dommages durables. Chez le poisson zèbre, des animaux âgés de 4 à 29 jours post fertilisation sont considérés comme des larves, des animaux âgés entre 30 et 89 jours post fertilisation sont considérés comme des juvéniles, et au-delà de 90 jours post fertilisation comme des adultes. Dans ce projet, 1556 animaux seront utilisés au stade larvaire (7 jours à 4 semaines post fertilisation), 52 animaux au stade juvénile (6 semaines post fertilisation) et 404 animaux au stade adulte (12 et 32 semaines post fertilisation) afin de répondre aux questions scientifiques testées.
Etude de la variabilité de l’effet thérapeutique de cellules issues de cordons ombilicaux humains dans la maladie du greffon contre l’hôte.
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Dépourvues de système immunitaire par construction génétique, les souris de ce projet reçoivent des cellules sanguines humaines qui vont attaquer leurs propres tissus. 375 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Après une irradiation de cinq minutes, elles reçoivent l'injection dans la veine de la queue, développent la maladie du greffon contre l'hôte, perdent du poids puis leurs poils, et subissent une prise de sang à la joue chaque semaine pendant quarante-cinq jours. Le porteur prévoit de les tuer avant terme si leur état se dégrade brutalement ou si une grille de signes cliniques l'indique, l'enjeu déclaré étant de comparer l'efficacité de cellules de cordon ombilical selon les donneurs.
Objectifs
Les cellules stromales mésenchymateuses (CSM) sont des cellules de soutien particulières, présentes dans le cordon ombilical. Elles ont des fonctions biologiques intéressantes pour la régulation et la modulation du système immunitaire : on parle de propriétés immunomodulatrices. Les CSM de cordon ombilical (CSM-CO) humain émergent depuis plusieurs années comme une perspective pour le développement de médicaments de thérapie cellulaire (médicaments composés de cellules, qui portent l’activité thérapeutique), en particulier dans les maladies immunitaires et inflammatoires (maladies associées à une réaction excessive du système immunitaire) très sévères et ne répondant pas aux traitements classiques (maladies infectieuses, maladies auto-immunes…etc.). Cependant l’hétérogénéité de leurs propriétés en fonction des donneurs soulève un réel défi qui limite aujourd’hui leur utilisation en clinique. En effet, l’utilisation de CSM-CO isolées de donneurs dont les cellules présentent de moins bonnes propriétés immunomodulatrices, peut-être à l’origine d’un échec thérapeutique chez les malades, sans aucune autre alternative. Dans ce projet, l’objectif est d’étudier cette hétérogénéité des CSM-CO sur un modèle de maladie inflammatoire bien connu chez la souris : la maladie du greffon contre l’hôte (GVH). Nous étudierons les différences de propriétés qui existent entre les CSM issues de plusieurs donneurs, entre des sous populations de CSM issues d’un même donneur, ainsi que l’intérêt d’un mélange de ces cellules (= pool) pour lisser la variabilité observée entre les dons individuels et obtenir une efficacité thérapeutique reproductible entre les malades.
Bénéfices attendus
La détermination et la caractérisation de « bons » donneurs de CSM et/ou d’une stratégie de construction d’un pool de CSM présentant des propriétés modulatrices du système immunitaire fortes permettrait de valider notre stratégie de développement pour un médicament de thérapie cellulaire. Ce projet contribuera à la progression des connaissances sur les CSM dans le traitement de l’ensemble des maladies immunitaires et/ou inflammatoires.
Procédures
Afin d’étudier les différences de propriétés immunomodulatrices de CSM issues de sources différentes, nous utiliserons un modèle de souris parfaitement décrit dans la littérature scientifique. Des souris immunodéficientes (dépourvues de système immunitaire) seront soumises à une irradiation, étape d'une durée de 5 minutes non douloureuse permettant de "faire de la place" avant l'injection des cellules sanguines humaines qui seront à l'origine du développement d’une maladie du greffon contre l’hôte (GVH). C’est cette maladie, due à la réaction des cellules du donneur contre les cellules du receveur qui constituera notre modèle de maladie inflammatoire. Un jour après l'irradiation, les souris recevront par voie intra-veineuse (injection dans la veine de la queue réalisée sur souris éveillées, durant moins d'une minute par souris) les cellules sanguines humaines. Pour étudier l’effet de nos CSM sur le contrôle de l’évolution de la GVH, les souris recevront 18, 21 et 24 jours après l’administration de cellules sanguines humaines et par voie intra-veineuse des CSM. Nous suivrons le développement de la GVH par l'apparition des signes cliniques mais également grâce à des prélèvements sanguins hebdomadaires. Ces prélèvements sanguins (au niveau de la joue, geste réalisé sur souris éveillées durant une minute par souris) seront effectués chaque semaine sur toute la durée (45 jours) de la procédure expérimentale. Le volume sanguin prélevé est faible et compatible avec une répétition hebdomadaire..
Impact sur les animaux
Les souris développant une GVH vont présenter une perte de poids dans les 30 jours après le début de la procédure. Une atteinte cutanée sera également observable (poils hérissé puis perte de poils). La mise en place du modèle implique une étape d'irradiation à une dose qui ne devrait pas avoir d’effet néfaste sur le bien-être de l’animal. Les administrations répétées par voie intra-veineuse pourront également avoir un impact sur le bien-être de l’animal (saignement, stress, perte de mobilité...).
Devenir
L’euthanasie de tous les animaux à l’issue de chaque procédure est rendue nécessaire pour l’évaluation de la réponse immunologique des CSM sur la GVH. Les différents organes liés au système immunitaire ou connus pour être des organes cibles de la GVH seront prélevés pour analyse.
Remplacement
L’objectif à long terme de ce projet est le développement d’un médicament de thérapie cellulaire, or les nouvelles stratégies pour le développement de ce type de traitements sont très difficiles chez l’homme et requiert au préalable une preuve de concept réalisée sur un modèle animal pertinent. Il n’existe pas d’alternatives non animales dans ce domaine. En effet, le processus de développement d’une maladie inflammatoire concerne l’ensemble des organes d’un organisme vivant. L’étude de l’efficacité d’une thérapie cellulaire sur la modulation de la réaction inflammatoire ne peut donc se faire que chez un organisme vivant entier. Le maximum d’études n’utilisant pas d’animaux ont été réalisées en amont de ce projet, pour démontrer les propriétés de régulation des CSM sur le système immunitaire, mais des expériences chez l’animal sont nécessaires avant de valider nos hypothèses avant leur application chez les malades.
Réduction
Grâce à une analyse statistique, nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum tout en s’assurant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. De plus nous optimisons au maximum nos expériences pour réaliser le plus d’analyse possibles sur les cellules obtenues à partir d’un même animal (récupération dans une seule expérience d’un grand nombre d’organes du système immunitaire afin de réaliser le maximum d’analyse, optimisation des prélèvements sanguins réalisés …).
Raffinement
Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Tout d'abord, les souris seront hébergées dans un environnement enrichi (présence de papier kraft pour la création de nid et de buchette en bois à ronger). Une surveillance quotidienne obligatoire des animaux sera réalisée par le personnel technique et/ou les expérimentateurs. Les animaux seront euthanasiés si leur état se dégrade soudainement ou si le score déterminé à partir d'une fiche d'évaluation des signes cliniques indique des signes de souffrance. Les souris dépourvues de système immunitaire utilisées pour la mise en place du modèle expérimentale, seront manipulées dans des conditions particulières (environnement propre, sous hotte) afin d'éviter leur contamination par des organismes pathogènes.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme espèce animale pour réaliser les expériences de ce projet est pertinent, car un modèle reproduisant de nombreux signes de la GVH humaine est parfaitement décrit dans la littérature. C’est un modèle de maladie inflammatoire idéal pour répondre à notre question scientifique. De plus nous avons une bonne connaissance des signes de souffrance chez la souris et la possibilité de les prendre en charge facilement et rapidement. Les souris utilisées dans le cadre de ce projet seront des souris immunodéficientes (dépourvues de système immunitaires murin) adultes, car nous nous intéressons à traiter la GVH de l’adulte humain.
Effet d’un régime hyperénergétique sur la dysfonction mitochondriale des cellules épithéliales intestinales chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Quatre-vingt-quatre gavages, un par jour pendant douze semaines, pour 96 des souris de ce projet. 432 souris vont être utilisées au total, toutes tuées à l'issue, 96 d'entre elles dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 336 un niveau modéré. 264 subissent un test de tolérance au glucose, gavage d'une solution sucrée puis sept piqûres de la veine de la queue étalées sur deux heures, répété jusqu'à trois fois, pour mesurer l'effet d'un régime riche en gras sur les défenses de l'intestin grêle. Le porteur fixe le seuil de mise à mort à une perte de poids supérieure à 20 % en une semaine.
Objectifs
Le surpoids et l’obésité sont des conditions de santé induisant une inflammation faible mais chronique à l’origine de maladies comme le diabète de type 2 ou certains types de cancer. Ces maladies auraient comme origine des modifications des capacités de défense de l’intestin liées à une alimentation trop riche en gras ou en sucre. Dans une étude précédente, il a été démontré chez la souris qu’une alimentation riche en gras induisait un certain nombre d’altérations au niveau de l’intestin grêle. Le présent projet se situe dans la continuité de cette étude, en cherchant à mieux caractériser l’origine de ces altérations d’une part et les moyens de les réduire d’autre part. Le microbiote intestinal est central dans le maintien des fonctions de défense de l’intestin. Il a récemment été montré qu’un microbiote altéré était retrouvé dans l’intestin grêle d’individus en situation de surpoids ou d’obésité. Cependant, aucun lien entre cette modification du microbiote de l’intestin grêle et les altérations des défenses intestinales que nous avons observées n’a été encore établi. De plus, l’étude précédente n’a pas caractérisé l’effet à long-terme de ces altérations des défenses intestinales, même après retour à un régime normal. En effet, les recommandations de santé suggèrent une perte de poids via des mesures hygiéno-diététiques afin d’améliorer l’état de santé. Cependant, il n’a pas encore été démontré à ce jour l’impact fonctionnel d’une perte de poids liée à un changement de régime alimentaire sur les fonctions de défense de l’intestin. Enfin, nos données in vitro ont montré des effets prometteurs d’une molécule extraite d’algues sur certains aspects des altérations des défenses intestinales liées à un excès de graisse. Cette molécule pourrait donc être un moyen simple de prévenir les altérations de l’intestin. Cependant une validation in vivo reste à montrer. Les objectifs de ce projet sont donc triples : une première partie du projet concernera l’étude du rôle du microbiote de l’intestin grêle dans les altérations de l’intestin induites par un régime riche en lipides, une deuxième partie s’attachera à caractériser l’effet à long-terme des modifications des défenses intestinales induites par un régime riche en gras lors d’une perte de poids et la troisième partie visera à évaluer les effets de la molécule extraite des algues sur l’apparition des altérations intestinales et les maladies associées à l’obésité.
Bénéfices attendus
Ce projet s’inscrit dans le cadre du développement des connaissances sur la physiopathalogie des maladies associées à l’obésité et au surpoids, problèmes de santé publique majeurs puisque près de 50% de la population française est maintenant en surpoids ou obèse. Notamment, une connaissance accrue sur le microbiote de l’intestin grêle permettrait de cibler des probiotiques ou prébiotiques à proposer à des personnes souffrant de surpoids ou d’obésité afin de restaurer la fonction intestinale. De même, connaître l’effet à long-terme de l’obésité sur l’intestin et les conséquences métaboliques qui en découlent contribuera à évaluer la capacité de l’intestin à revenir à un état fonctionnel optimal après arrêt du régime riche en gras. Enfin, les connaissances sur les effets de l’extrait d’algue sur l’intestin pourront contribuer au développement de composés nutraceutiques permettant de prévenir l’apparition des troubles métaboliques associés à l’obésité et au surpoids.
Procédures
Le test de tolérance au glucose sera mené sur des animaux vigiles, une seule fois ou 3 fois par animal. Un gavage intra-gastrique avec une solution de glucose sera réalisé. Cette intervention prendra de 10 à 15 secondes par animal. Sept prélèvements de sang au niveau de la queue seront réalisés par ponction de la veine caudale afin de recueillir une goutte de sang par prélèvement. La durée de l’intervention (contention, ponction, prélèvement) sera de 30 secondes par animal. Les prélèvements s’étaleront sur deux heures. 264 souris seront concernées par cette intervention. Un gavage (solution de fucoxanthine ou de PBS) quotidien pendant 12 semaines sera mené sur des animaux vigiles, ce qui représente 84 interventions par souris. Le gavage prendra de 10 à 15 secondes par animal. 96 souris sont concernées.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables qui pourraient survenir durant cette étude sont : 1) Du stress et de la douleur lors des tests de tolérance au glucose nécessitant une étape de gavage et une ponction de la veine caudale à l’aide d’une aiguille pour prélever du sang. 2) La perte de poids prévue durant l’une des procédures du projet est inévitable car elle fait partie des objectifs de la procédure, mais cela ne devrait pas entrainer d’effet indésirables chez les animaux. 3) Du stress lors des gavages quotidiens des souris avec la molécule extraite d’algue ou une solution saline. Les autres procédures ne devraient pas entrainer d’autres souffrances ni d’angoisse.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour récupérer les tissus biologiques, indispensables pour mener les expérimentations en lien avec les questions de recherche du projet.
Remplacement
Dans ce projet, nous cherchons à évaluer les interations entre l’alimentation, le microbiote et l’intestin, ainsi que les impacts sur le métabolisme de l’individu. Ces interactions sont, à l’heure actuelle, impossibles à modéliser in vitro ou in silico. Le recours à des animaux nous parait donc nécessaire pour intégrer l'ensemble des données sur la composition du microbiote intestinal et/ou l’ensemble des données biologiques obtenues in vivo (poids corporel, test de tolerance au glucose) ou à partir des tissus prélevés chez l'animal.
Réduction
Le nombre de souris par groupe (n=24, 12 femelles et 12 mâles) a été déterminé afin de pouvoir comparer les paramètres étudiés soit à l’aide de tests paramétriques si la distribution des données le permet, soit de tests non paramétriques le cas échéant. Ce nombre a été calculé à partir de la variabilité des paramètres étudiés, notamment de la fonction mitochondriale (données issues d’une étude précédente au laboratoire) ainsi que la variabilité éventuelle entre les sexes.
Raffinement
Les souris seront logées en groupe de 4 par sexe, dans des cages enrichies offrant des zones où elles pourront se dissimuler. De même, les souris seront habituées au gavage et à la contention avant le test de tolérance au glucose ou d’administration de la molécule extraite d’algue ou de solution saline. Les souris seront pesées régulièrement, et elles seront toutes observées chaque jour afin de prévenir la survenue d’un potentiel problème. Des analgésiques seront utilisés pour prévenir la douleur (crème anesthésiante avant ponction de la veine caudale, analgésique avant le prélèvement intra-cardiaque). De même, une anesthésie à l’isoflurane et une analgésie seront pratiquées avant le prélèvement sanguin intracardiaque suivi de l’euthanasie des souris. Des points limites stricts et spécifiques au projet seront appliqués, comme la perte de poids >20% du poids sur une semaine.
Choix des espèces
Le modèle souris est largement utilisé pour les recherches sur l'obésité en raison de ses réponses reproductibles permettant une reproductibilité des résultats. L'abondance des données dans la littérature sur ce modèle permet le raffinement des méthodes (outils analytiques disponibles, évitant la mise au point de certaines méthodes sur des animaux supplémentaires). De même, les précédentes études menées au laboratoire sur ce modèle souris nous permettent de disposer de nombreuses données et méthodes (notamment en ce qui concerne les méthodes d’analyse à partir des tissus prélevés) qui serviront dans ce projet. Nous avons choisi de travailler sur des animaux en croissance de 6 semaines d'âge afin de travailler sur des animaux adultes ayant un microbiote stabilisé.
Caracterisation fonctionnelle d’une sous-population astrocytaire dans le cerveau de souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
528 souris vont être utilisées, toutes tuées pour analyse histologique, dont 360 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. 120 femelles gestantes subissent une électroporation in utero, une chirurgie d'environ une heure que le porteur reconnaît pouvoir provoquer douleurs, infections et stress, tandis que 120 autres animaux reçoivent des injections quotidiennes de tamoxifène pendant deux jours. Un glioblastome est induit chez une partie des souris, pour observer le comportement d'une sous-population d'astrocytes dans l'environnement tumoral, embryons, souriceaux et adultes étant prélevés à six stades du développement. Sur le remplacement, le porteur affirme que l'étude de la diversité des astrocytes repose "entièrement" sur les lignées de souris transgéniques et qu'aucun substitut n'existe aujourd'hui.
Objectifs
Dans le système nerveux, les cellules gliales, oligodendrocytes et astrocytes sont les cellules qui forment l'environnement des neurones. Leur fonction dans le traitement de l'information nerveuse est aujourd'hui reconnue comme essentielle au fonctionnement du cerveau. Cependant, des études récentes de la biologie des cellules gliales mettent en avant les aspects simplificateurs de cette classification ne reflétant pas leur diversité fonctionnelle, surtout pour les astrocytes. La même problématique s‘applique aux gliomes, tumeurs primaires du cerveau qui se caractérisent par leur hétérogénéité. Les astrocytes sont aussi présents dans le microenvironnement tumoral, caractériser leurs fonctions et interactions dans ce contexte est une priorité de la recherche fondamentale en neuro-oncologie. Nos travaux récents nous ont permis de mettre en évidence dans le cerveau de souris une sous-population non identifiée d'astrocytes (Olig2-AS) qui peut être distinguée des autres populations d'astrocytes par l'expression d'Olig2, une protéine actuellement reconnu comme une caractéristique des gliomes. Nos objectifs sont les suivants : -Etablir la distribution des astrocytes-Olig2 dans le cerveau de souris au cours du développement et chez l’adulte. -Déterminer le rôle de ces astrocytes-Olig2 au sein de l’environnement tumoral dans un modèle de souris ou un glioblastome sera induit. -Etablir le rôle de la protéine Olig2 dans les astrocytes-Olig2 au cours du développement cortex cérébral.
Bénéfices attendus
Il n’existe aucune donnée sur la caractérisation des astrocytes-Olig2 dans le cortex cérébral de souris. Ce projet aura pour but de caractériser ces cellules ce qui aura pour conséquence une meilleure connaissance du développement des astrocytes dans le cerveau. D’autre part, le projet permettra d’étudier le rôle de ces cellules dans un contexte tumoral ainsi que le rôle de la protéine Olig2 dans ces cellules. En conclusion, ce projet pourrait conduire à la caractérisation d'un nouveau sous-type d'astrocytes associés à la tumeur dans le microenvironnement du glioblastome. Ce microenvironnement est de plus en plus reconnu comme un élément pivot de la tumorigénicité et pourrait participer à la résistance du glioblastome aux thérapies actuelles observée chez les patients. Ainsi, ce projet aura des retombées à la fois en termes d'innovation et de thérapie qui sont des aspects clés pour recherche sur le cancer.
Procédures
Dans le cadre du projet des électroporations seront réalisées, c’est une procédure chirurgicale sur femelles gestantes. 120 femelles dans le cadre du projet seront concernées par cette opération qui dure environ une heure. Des injections de tamoxifène seront aussi réalisées, l’opération dure en moyenne moins d’une minute et concernera 120 animaux. Elles seront quotidiennes sur une durée de deux jours. En termes de prélèvements terminaux sur animaux anesthésiés, le cerveau sera prélevé pour les futures analyses.
Impact sur les animaux
L'électroporation in utéro est une procédure chirurgicale qui peut entrainer des douleurs, des infections et du stress. En ce qui concerne les injections, les souris recevront des injections qui provoqueront un stress léger lié à la contention et l’introduction de l’aiguille pendant moins de 30 secondes. Ces injections peuvent induire une certaine sensibilité locale. Ce désagrément ne dure que quelques minutes au maximum.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour des analyses histologiques
Remplacement
Les observations réalisées sur les tissus embryonnaires et adultes dans lesquels les cellules d’intérêt restent localisées dans leur contexte endogène et, en particulier, restent soumises à l’influence des signaux de communication émis par les autre types cellulaires (neurones, cellules endothéliales etc..) sont absolument requises pour comprendre le développement des cellules gliales et leur diversité. Ce contexte complexe, mal connu, ne peut être recréé in vitro et il n’est pas possible de travailler sur des modèles de cellules en culture. Nous utiliserons des lignées de souris déjà établies dans lesquelles des mutations génétiques ont été ciblées sur les gènes d’intérêt. L’étude de la diversité astrocytaire repose à ce jour entièrement sur l’utilisation de lignées de souris transgéniques, il n’est pas possible à l’heure actuelle de remplacer ce modèle animal.
Réduction
-Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, nous concentrerons nos analyses pour la distribution des Olig2-AS sur 4 stades clés du développement embryonnaire du cerveau et un stade perinatal. Pour les électroporation durant la période embryonnaire, les analyses seront réalisées en périnatal (analyse morphologique), et chez l’adulte (analyse glioblastome) -Les analyses seront réalisées sur 6 individus pour chaque génotype à chaque stade et pour chaque type d'analyse ce qui est le minimum nécessaire pour obtenir des données statistiquement fiables, c’est ainsi que nous avons pu déterminer le nombre d’animaux à utiliser pour chaque procédure. Pour les analyses immunohistochimiques nous réaliserons des coupes fines (paraffine ou coupes à congélation) ce qui nous permet de collecter un grand nombre de coupes pour chaque échantillon et ainsi réaliser toute la série de marquages immunohistochimiques nécessaires à la caractérisation des phénotypes.
Raffinement
La surveillance renforcée permettra une vigilance accrue en cours d'expérimentation et la détection de l'atteinte des points limites. Les souris seront quotidiennement observées et pesées par du personnel compétent. Des grilles de scoring seront utilisées pour suivre les animaux en expérimentation afin de mettre en place, lorsque nécessaire, des mesures pour atténuer la douleur, l'angoisse ou le stress. Les critères d’observations seront : le poids, la quantité d’aliment ingérée quotidiennement, l’apparence du pelage, l'activité et comportement. Pour l'électroporation in utero, les souris reçoivent une injection d’analgésique 30 min avant d’être anesthésié via un gaz. Seuls les embryons facilement accessibles sont injectés afin de diminuer le temps d'anesthésie.
Choix des espèces
L’espèce utilisée est la souris, modèle mammifère dans lequel il est possible d’introduire des mutations génétiques ciblées ou des transgènes rapporteurs de l’expression d’un gène d’intérêt. C’est aussi le modèle génétique le plus proche de l’Homme. Dans ce contexte, les résultats obtenus à la suite des expériences proposées pourront potentiellement trouver une application dans des études d’intérêt thérapeutique chez l’Homme. Afin d’étudier le développement et la maturation des astrocytes en condition physiologique et pathologique, les embryons, souriceaux et souris seront collectés à 6 stades différents du développement qui couvrent tout le début de la vie de l’animal.
Etude de la modulation du métabolisme du tryptophane sur la polyarthrite expérimentale
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
La douleur de l'arthrite induite au collagène, qualifiée de sévère dans le résumé lui-même, ne recevra aucun antalgique, aucune molécule contre la douleur n'étant selon le porteur dépourvue d'un effet anti-inflammatoire qui fausserait le résultat. 104 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour l'analyse histologique de leurs articulations, dont 24 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection intradermique sous anesthésie, puis des injections intrapéritonéales quotidiennes, avec une pesée quotidienne et une mesure du volume de leurs pattes arrière gonflées trois fois par semaine. Le projet, financé par des agences de recherche, vise à accélérer le développement clinique d'une molécule contre la polyarthrite rhumatoïde et à en établir la dose minimale efficace.
Objectifs
La polyarthrite rhumatoïde est le plus fréquent des rhumatismes inflammatoires. Cette pathologie touche les articulations mobiles telles que les articulations des mains, des pieds, les poignets et les genoux. Elle est caractérisée par une inflammation articulaire et une destruction progressive des structures cartilagineuses et osseuses. C’est une maladie douloureuse qui affecte la qualité de vie des patients et qui peut provoquer un isolement social. Plusieurs traitements contre la polyarthrite rhumatoïde, notamment les biothérapies, sont actuellement utilisés. Mais des résistances et des échappements thérapeutiques sont fréquents. Ainsi, il a y une nécessité de trouver de nouveaux traitements et de comprendre les mécanismes d’action, et notamment les mécanismes cellulaires, de ces traitements. L'objectif de ce projet financé par des agences de recherche est d'accélérer le developpement clinique d'un médicament contre la polyarthrite rhumatoïde. Les objectifs spécifiques sont de comprendre le mode d'action de cette nouvelle approche thérapeutique ainsi que de déterminer la dose minimale efficace.
Bénéfices attendus
Comme l'enzyme AADAT (notre piste thérapeutique) s'est déjà avéré efficace dans le modèle de polyarthrite par injection d'anticorps anti-collagène, la présente étude permettra d'explorer les potentialités anti-inflammatoires de la molécule dans le but d'avancer cette molécule candidat médicament plus avant vers la clinique, les études prévues dans ce projet permettront entre autres d'aider à résoudre le mécanisme d'action de la molécule et donc d'envisager la mise sur le marché d'un nouveau médicament à terme.
Procédures
Certains animaux recevront des injections intradermiques (une injection unique d'une durée d'1 min environ) sous anesthésie générale. Les autres injections intrapéritonéales (d'une durée de 15 secondes et avec une fréquence maximale d'une injection par jour pendant la durée du traitement comme indiqué en 4.3.1 et 4.3.2) sont réalisées sur animaux vigiles . Les injections sont réalisées par du personnel expérimenté. Au cours de la procédure les animaux seront pesés (15 secondes maxi par animal avec une fréquence maxi quotidienne) et l'oedème des pattes arrieres mesurès par mesure du volume (1 min maximum par animal à une fréquence maxi de 3 fois par semaine).
Impact sur les animaux
Nuisance n°1 Induction de l'arthrite sous anesthésie générale, d'une durée de 3 min environ, temps d'induction compris, cette anesthésie est réalisée sous isoflurane. Nuisance n°2 Développement de l'arthrite Perte de poids et douleurs pour les animaux induits par l'arthrite. La douleur considérée comme sévère pour le modèle d'arthrite au collagène et modérée pour le modèle d'arthrite aux anticorps anti-collagène, ne peut être prise en charge pharamacologiquement car à ce jour aucune molécule antalgique n'a été identifiée comme dépourvue d'effet anti-inflammatoire. Nuisance n°3 Administration des composés pharmacologiques par injection intrapéritonéale quotidienne .
Devenir
Des analyses histologiques sur les articulations (arthrite) seront réalisées à l'issue des procédures expérimentales nécessitant la mise à mort des animaux.
Remplacement
La présente étude a été planifiée après une recherche documentaire approfondie et de nombreuses études in vitro. Après avoir soigneusement analysé les études thérapeutiques cruciales in-vivo, il a été observé que les modèles de souris utilisés ici sont les modèles de référence pour la polyarthrite rhumatoide. De plus, compte tenu des développements déjà réalisés sur cette molécule, cette étude in-vivo est cruciale et constituera un jalon pour progresser sur l'avenir de notre molécule médicament. Cette étude est une partie impérative du développement préclinique de la molécule. Après avoir consulté la littérature et considéré l'importance de cette étude pilote, le présent projet ne peut être remplacé par aucune autre étude alternative.
Réduction
Ce projet est planifié en gardant à l'esprit le nombre minimum d'animaux nécessaires (8 animaux par groupe) pour atteindre le niveau de signification pour chaque modèle. Le projet est divisé en trois groupes : le groupe témoin inflammatoire, le groupe traité avec AADAT, le groupe contrôle avec le médicament déja approuvé. Pour une étude comparative, il est important d'inclure ce groupe témoin qui servira de norme pour les comparaisons nécessaires pour comprendre l'impact du médicament sur la gravité et la progression de la maladie. Compte tenu de l'importance de chaque groupe dans l'étude, il n'est pas possible de réduire le nombre de groupes et d'animaux. Une analyse statistique sera réalisée pour les comparaisons entre les trois groupes.
Raffinement
Les souris seront hébergées par 4 dans des cages conventionnelles conformes pour cette espèce (directive 2010/63/EU) au sein de notre animalerie conventionnelle. L'enrichissement est apporté par des objets (tunnel, maison) dédiés à cet usage. Les injections intra-dermiques sont réalisées sous anesthésie gazeuse générale. Les deux modèles sont bien connus et maîtrisés au laboratoire en termes de douleurs. Nous surveillerons quotidiennement les animaux. Les animaux seront pesés deux fois par semaine. Un changement de litière bi- hebdomadaire puis quotidien lorsque les animaux seront en phase d’arthrite sévère, l'utilisation de tunnel permettra de diminuer le stress occasionné par le changement de litière. Des points limites (liés à la perte de poids et/ou des anomalies du comportement) sont mis en place.
Choix des espèces
Les souris mâles avec un fond génétique de suceptibilité à l'auto-immunité, ont été largement étudiées dans la littérature comme modèle expérimental de la polyarthrite rhumatoïde. L'immunisation avec le collagène de type II provoque une réponse auto-immune similaire à celle observée chez les patients atteints de polyarthrite Des souris adultes mâles seront utilisées pour cette étude afin de diminuer l'influence hormonale des oestrogènes.
Etude de l’efficacité de traitements innovants pour traiter le syndrome hématologique radio-induit chez le primate non humain (PNH)
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Des macaques à longue queue subissent une irradiation du corps entier sous anesthésie générale, puis un traitement quotidien pendant 30 jours, jusqu'à 16 ponctions de sang et 6 ponctions de moelle osseuse sous anesthésie en trois mois, et parfois l'implantation chirurgicale d'une chambre d'injection. 73 macaques vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger ou sévère, pour tester une molécule contre les lésions de la moelle osseuse dues aux radiations, dans la perspective d'une guerre ou d'un accident nucléaire, et les résultats rejoindront le dossier d'enregistrement de cette molécule. Les macaques irradiés peuvent présenter des saignements sous la peau, une anémie, des difficultés respiratoires, des vomissements, des diarrhées et des saignements digestifs, et le porteur attend une atteinte des points limites chez environ la moitié des témoins. Les irradiés sont tués pour une analyse anatomopathologique et une banque de tissus, ceux qui n'ont reçu que le traitement pourront être réutilisés après avis vétérinaire, et 8 macaques sont déclarés réutilisés. Au score limite, un vétérinaire et le directeur d'étude prennent "une décision rapide quant au devenir de l'animal", sans que sa nature soit précisée.
Objectifs
Dans un contexte de guerre nucléaire ou d’accident nucléaire majeur, l’exposition à une forte dose de rayonnement ionisant conduit notamment à des dommages de la moelle osseuse, qui produit les cellules sanguines. Ces atteintes sont parmi les premières causes de mortalité des victimes civiles comme militaires. En dépit des avancées des dernières décennies, le besoin d’une molécule capable de réduire ces effets et de mise en œuvre facilitée dans le contexte d’un afflux de nombreuses victimes demeure. Le but du présent projet est d’évaluer l’efficacité d’une nouvelle molécule pour 1) réduire la gravité des dommages de la moëlle osseuse et 2) accroitre le taux de survie des victimes. Cette évaluation sera réalisée chez le primate non humain (PNH). En effet, le présent projet est mené en parallèle du développement clinique de cette molécule et il apportera les données d’efficacité qu’il n’est pas possible d’obtenir chez l’humain. Les résultats obtenus seront inclus dans le dossier d’enregistrement. Une étude de pharmacologique préliminaire a déjà été réalisée chez le PNH et ses résultats seront utilisés dans raffiner notre étude. Conformément aux recommandations européennes, l’évaluation de l’efficacité thérapeutique sera réalisée chez des modèles animaux mâles et femelles. Des molécules dérivées de la nouvelle molécule pourront éventuellement être testées en complément, dans le cadre d’études pilotes. Cette étude comportera 2 phases : • une phase d’efficacité pilote, réalisée étape par étape, sur de petits nombres d’animaux, • si la la phase pilote est concluante, une étude d’efficacité incluant suffisamment d’animaux pour permettre une analyse statistique robuste.
Bénéfices attendus
Valider un nouveau traitement des lésions de la moelle osseuse après une exposition à des radiations, en particulier dans les situations d'urgence où il y a un grand nombre de victimes. L'objectif est de trouver une méthode efficace pour traiter ces lésions le plus rapidement possible et améliorer les chances de guérison des personnes touchées.
Procédures
Irradiation corporelle totale unique sous anesthésie générale Administration quotidienne pendant 30 jours de traitements médicamenteux (médicamenteux (voie orale, sous-cutanée ou intraveineuse ; durée de chaque traitement : 10 minutes maximum). Une éventuelle implantation d’une chambre d’administration du traitement sous anesthésie générale. Durée de l’intervention 30 minutes. Suites possibles : réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie rare, durée de 1 à 5 joursPonctions de sang veineux (16 ponctions maximum sur une durée de 3 mois) et de moelle osseuse (6 maximum sur une durée de 3 mois) sous anesthésie générale durant 30 à 45 minutes chacune.
Impact sur les animaux
Après l’irradiation, les animaux qui ne peuvent reconstituer leur hématopoïèse sont victimes de petits saignements visibles sur la peau sous la forme de pétéchies, conséquence du manque de plaquettes. La perte de sang correspondante provoque une anémie et une fatigue jusqu’à des difficultés de respiration, entre 10 et 20 jours après irradiation. Des troubles gastro-intestinaux tels que nausées, vomissements, diarrhées et saignements digestifs peuvent se produire. Une anorexie résultant en une perte de poids de 5-10% est possible, entre 10 et 40 jours après irradiation. Une atteinte des points limite est attendue chez environ la moitié des animaux témoins. L’administration des molécules peut causer un stress.. L’éventuelle chirurgie pour implanter une chambre d’administration du traitement peut induire une réaction locale au site d’incision -gonflement, suintement de la plaie), rarement : une hémorragie et/ou une infection. Les anesthésies peuvent induire une légère perte d’appétit dans les premières heures qui suivent, pouvant causer une déshydratation chez les animaux qui sera surveillée et compensée au besoin.
Devenir
Animaux irradiés : mise à mort pour analyse anatomopathogique et constitution d’une tissuthèque Animaux non irradiés : les animaux ayant reçu uniquement le traitement pourront être réutilisés dans d’autres protocoles après un avis vétérinaire favorable.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative à l’utilisation de modèles animaux pour réaliser ce projet. L’évaluation de l’efficacité d’une molécule pharmacologique capable de réduire la durée et la profondeur l’atteinte de la moelle osseuse radio-induite sévère chez l’humain nécessite une étude de la réponse intégrée à l’échelle de l’organisme entier. D’autant plus qu’en cas d’irradiation corporelle totale où d’autres tissus que le tissu hématopoïétique, notamment le système digestif, sont impliqués. Il est donc nécessaire d’utiliser un organisme entier présentant les caractéristiques physiologiques et immunologiques les plus proches de l’humain que possible. Le modèle expérimental primate non humain (macaque) répond à ces requis entrant pleinement dans le cadre de l’évaluation d’un traitement d’une « maladie » létale . Il reproduit de plus le caractère intrinsèquement hétérogène des dommages radio-induits observés après irradiations accidentelles, lié notamment à l’atténuation du rayonnement par l’épaisseur corporelle. Ce paramètre est fondamental pour tester la capacité d’une molécule à stimuler l’hématopoïèse résiduelle issue des zones relativement sous exposées.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au minimum nécessaire. L’étude préliminaire inclura les animaux de façon échelonnée, pour tirer parti des résultats des cohortes précédentes afin de minimiser le nombre d’animaux inclus. Dans la même optique de réduction, nous réaliserons une phase de preuve de concept avec un nombre réduit d’animaux par groupe (n=4 ou 5), avec des cohortes échelonnées. Cette phase sera considérée un jalon décisif pour la poursuite de l'étude. L’étude permettant une analyse statistique robuste, qui inclut un nombre plus important d’animaux par groupe (n=8), nécessaire pour démontrer l’efficacité de la molécule candidate, utilisée seule ou en combinaison, selon les recommandations des agences réglementaires, ne sera réalisée que si la preuve de concept est concluante. Le nombre d’animaux par groupe a été calculé pour permettre de mettre en évidence l’efficacité du traitement selon les méthodes statistiques en vigueur.
Raffinement
Les interventions et l’irradiation seront effectuées sur des animaux anesthésiés. Les animaux seront suivis quotidiennement par du personnel formé et des mesures seront réalisées à chaque anesthésie. Une grille de suivi clinique et biologique, basé sur notre expérience et sur la bibliographie, a été établi. Ce score pourra être adapté si besoin afin de suivre de plus près l’évolution clinique des animaux pour limiter au mieux la souffrance. Les traitements seront réalisés en première intention sur les animaux vigiles après un entrainement comportemental par conditionnement opérant de type click-training, faisant appel à la collaboration des animaux. Après l’éventuelle chirurgie pour implanter une chambre d’administration des traitements,une surveillance accrue sera réalisée pendant 15 jours avec une échographie de contrôle à J15 post implantation. En cas de douleurs, une analgésie sera mise en place. Suivi quotidien : • Suivi de l’état général des animaux vigiles (1x/j minimum, week-end compris). En cas de modification de comportement de l’animal ou de signe de souffrance, un signalement vétérinaire sera effectué. • Les animaux seront scorés chaque jour avec la grille précédemment établie avec les vétérinaires de l’installation. Cette grille a une valeur prédictive quant à la possible dégradation de l’animal. Si un PNH venait à atteindre un score limite, un vétérinaire et le directeur d’étude seront consultés immédiatement pour prendre une décision rapide quant au devenir de l’animal. • Si des atteintes inattendues surviennent ou si l’animal démontre une souffrance non anticipée, une analgésie sera mise en place si pertinente et un vétérinaire et le directeur d’étude seront également consultés immédiatement pour prendre une décision rapide quant au devenir de l’animal. Suivi lors des prélèvements : En plus du suivi clinique (poids, température), un suivi biologique complémentaire sera réalisé. Ce suivi sera réalisé à une fréquence plus rapprochée au début de l’étude puis progressivement espacée lorsque la période critique sera passée. Transport : les animaux seront transportés vigiles, par paire au minimum. Des jouets, de l’eau et de la nourriture seront à leur disposition. Hébergement : les animaux seront hébergés en accord avec la réglementation et bénéficieront d’un l’enrichissement multimodal : sensoriel, alimentaire, social et ludique (jouets fixes et mobiles).
Choix des espèces
Le macaque cynomolgus jeune adulte (2 à 8 ans), qui est notre modèle animal historique, a été retenu pour ce projet car : - Il présente des caractéristiques physiologiques, hématologiques et immunologiques proches de l’humain adulte. - Il permet de plus de par sa taille, son âge (hématopoïese mature non sénescente) et son épaisseur corporelle de reproduire le caractère hétérogène des irradiations accidentelles (gradient de dose et donc de dommage antéro-postérieur significatif) fondamental pour tester la capacité d’une molécule à stimuler l’hématopoïèse résiduelle post accidentelle.
Evaluation de l’effet de souches probiotiques sur les altérations de fonction barrière de l’intestin et l’hypersensibilité viscérale induites par un stress chronique chez le rat.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Soumis une heure chaque matin pendant quatre jours à un stress d'évitement de l'eau, puis gavés quotidiennement pendant quinze jours, 200 rats Wistar vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, la moitié d'entre eux en souffrance sévère. Vient ensuite une chirurgie de trente minutes sous anesthésie pour implanter un dispositif d'enregistrement, dix jours de récupération, puis une distension colorectale en trois paliers de cinq minutes, animal vigile maintenu dans un tunnel de contention. Le porteur, qui travaille avec un partenaire industriel, cherche à savoir si huit souches probiotiques corrigent la perméabilité intestinale et l'hypersensibilité viscérale du syndrome de l'intestin irritable. Tous les rats sont tués en fin de procédure, ceux qui ont reçu un radioélément ne pouvant plus, selon lui, être prélevés ensuite pour des raisons de sécurité.
Objectifs
Le Syndrome de l’intestin irritable (SII) est défini comme une maladie chronique définie par ses symptômes à savoir des troubles du transit intestinal (diarrhée ou constipation, voire une alternance des 2) et des douleurs abdominales (fortes douleurs au ventre, spasmes, ballonnements). Il a un retentissement très important sur la qualité de vie des personnes qui en sont atteintes, jugé équivalent ou supérieur à d’autres pathologies chroniques digestives. Cette maladie est très répandue à travers le monde et en France elle affecte 5% de la population soit plus de 3 millions de personnes. Les causes du SII ainsi que les dysfonctionnements et anomalies qui génèrent les symptômes sont multifactoriels et restent mal connues. Parmi les facteurs qui peuvent générer et/ou exacerber les symptômes du SII le stress occupe une place importante. Concernant les dysfonctionnements impliqués dans cette maladie, une mauvaise communication intestin-cerveau, un intestin poreux ou encore des modifications du microbiote intestinal ont été incriminés. Face à cette diversité de causes et dysfonctionnements, les traitements médicamenteux restent peu efficaces. Parmi les pistes thérapeutiques en développement figure l'utilisation de micro-organismes (bactéries et levures) qui ont des effets bénéfiques sur la santé quand ils sont consommés en quantité suffisante (ces micro-organismes sont appelés probiotiques). Dans ce projet nous évaluerons les effets des traitements par différentes souches probiotiques (8) sur l’augmentation de la perméabilité intestinale et de la sensibilité viscérale (dysfonctionnements observés dans le SII) induites par un stress (facteur impliqué dans le SII) à l’aide d’un modèle de stress chronique chez le rat (stress d’évitement passif de l’eau WAS)
Bénéfices attendus
Ce projet doit permettre d’identifier des souches probiotiques intéressantes dans la restauration de la fonction barrière de l’intestin et de la sensibilité viscérale altérées par le stress et les mécanismes impliqués dans ces effets. Outre l’apport de connaissances sur le rôle des probiotiques dans la santé digestive, ce projet vise à apporter du rationnel pour le développement de traitements préventifs et thérapeutiques pour le SII, sur la base des propriétés des souches testées
Procédures
Tous les animaux seront soumis au stress d’évitement passif de l’eau d’une durée de 1h, à heure fixe le matin pendant 4 jours consécutifs. Tous ces animaux recevront par voie orale des souches probiotiques ou du sérum physiologique d’un volume de 1ml à une fréquence de 1 fois par jour pendant 15 jours consécutifs. La durée d’ administration orale est de courte durée de 30 secondes par animal. Pour la mesure de la perméabilité intestinale, les animaux recevront une dose unique d’un volume de 500 µl molécule marquée. Ce geste d’ administration orale est aussi de courte durée, d’environ 30 secondes. Pour la mesure de la sensibilité viscérale, les animaux seront équipés d’un dispositif d’enregistrement, nécessitant une chirurgie. Les chirurgies étant réalisées et maitrisées par des agents expérimentés sont de courte durée maximum de 30 minutes, ce qui facilitent au mieux la récupération des animaux. Après 10 jours de récupération de l’acte chirurgical , les animaux seront soumis à une distension colorectale de 3 paliers successifs d’une durée chacun de 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les souches probiotiques seront administrées par voie orale et des nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux peuvent être : Une mobilité réduite liée à la préhension pour le gavage, geste d’une durée de 1 minute ainsi qu’une douleur ou irritation du tube digestif lors des premiers jours d’administration des souches probiotiques -Le stress d’évitement passif de l’eau d’une durée d’1 heure pendant 4 jours successifs pourrait engendrer une perte de poids. Des signes d’anxiété pourraient être observés. -Pour la mesure de la perméabilité intestinale. les animaux seront placés en cages métaboliques, ce qui pourrait engendrer un stress à ce nouvel environnement, -Pour la mesure de la sensibilité viscérale, tous les rats seront soumis à une chirurgie sous anesthésie générale à raison d’un temps maximum de 30 minutes par intervention et pourrait engendrer un inconfort au réveil. - La distension colorectale nécessite de placer l’animal vigile en tunnel de contention, les effets indésirables pourront être une mobilité réduite et un inconfort pour l’introduction du ballonnet et la mesure de contractions.
Devenir
Tous Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure. Les animaux seront euthanasiés afin d’effectuer des prélèvements de tissus post-mortem pour différentes analyses, et dosages. Les animaux qui ont reçu un radioélément empêche leur utilisation et prélèvements ultérieurs pour des raisons de sécurité et seront euthanasiés à la fin de la procédure conformément à la réglementation.
Remplacement
Le SII est une maladie dont les causes sont méconnues et les mécanismes complexes (ex. altération de l’axe intestin-cerveau incluant la douleur viscérale, augmentation de la perméabilité intestinale, altération de la flore intestinale etc..).L’utilisation du modèle in vivo se révèle indispensable pour mimer le SII qui implique la communication inter-organes (intestin-cerveau), et des conséquences à l’échelle de l’organe (intestin poreux). Cette approche à l’échelle de l’organisme est pertinente pour l’évaluation pré-clinique des traitements probiotiques en vue d’un futur développement chez l’Homme dans la thérapie du SII. Ainsi dans l’objectif de tester des traitements en l’occurrence des probiotiques sur les paramètres le plus caractéristiques pour cette pathologie comme la sensibilité viscérale et la perméabilité intestinale totale du tractus digestif, le modèle animal semble l’approche pré-clinique la plus appropriée.
Réduction
L’amélioration du bien-être animal acquise par les études précédentes a abouti à une réduction du nombre d’animaux utilisés. Ainsi, l’amélioration de la prise en charge post-opératoire par l’acquisition d’armoires ventilées a permis d’augmenter la survie des animaux et d’éviter des études en répétition et donc de réduire le nombre d’animaux nécessaires. Le nombre calculé (basé sur des études antérieures) au plus juste d’animaux nécessaire est de 10 rats par groupe, étant donné la variabilité inter-individuelle liée à la sensibilité viscérale (mesure de la variable « contraction musculaire abdominale) et à la mesure de perméabilité intestinale totale (mesure de la variable « volume totale d’urines »).
Raffinement
Pour assurer une fiabilité des résultats et limiter le nombre d’animaux utilisés, une attention particulière sera accordée au bien-être de l’animal (contrôle de l’environnement, respect du cycle jour nuit). A leur arrivée les animaux seront hébergés collectivement (n=5/cage) au calme et surveillés pendant une période d’acclimatation (7 jours). L’acclimatation permet de récupérer du stress lié au transport et de s’adapter aux nouvelles conditions de vie. Ce n’est qu’à l’issue de cette période que les animaux seront inclus dans l’étude. Dans le but d’améliorer le bien-être de ces animaux, des bûchettes en peuplier et maisonnette en inox seront disposées dans chaque cage. Une surveillance quotidienne des animaux sera effectuée pour détecter à temps toute anomalie et minimiser la durée de toute souffrance constatée. Un procédé de notation (grille de scoring) fondé sur la mise en place de points limites permettant de déterminer la capacité de l’animal à rester en procédure et adapté à chaque procédure est établi afin d'effectuer une surveillance de l'état général des animaux. Toutes les mesures seront prises pour réduire le stress et la douleur (habituation à des nouveaux environnements, prise en charge de la douleur pré-post opératoire, réhydratation, tapis chauffant, armoires ventilées, mesures des poids, état général des animaux).
Choix des espèces
Le modèle animal rat souche Wistar est un modèle largement utilisé dans la littérature pour comprendre les effets et mécanismes impliqués dans le SII. Nous utiliserons donc cette espèce qui a fait aussi l’objet de nos précédents travaux académiques et de collaboration avec ce partenaire industriel sur les effets du SII permettant de respecter l’utilisation d’un nombre d’animaux réduits plutôt que d’ajouter un paramètre de variabilité par l’utilisation d’une autre espèce et souche nécessitant de mises au point et des répétitions. Les animaux seront commandés à l’âge adulte (100-125g correspondant à 28-30 jours) et n'entreront en procédure qu'après une semaine d'acclimatation. Les animaux utilisés sont adultes car il est indispensable d’avoir un tractus digestif à pleine maturité physiologique.