Procédures sévères

Soumis à une ligature d'artère coronaire pour provoquer un infarctus, puis rouverts une semaine plus tard pour qu'un patch soit collé sur leur cœur, 320 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacun subit deux chirurgies thoraciques de trente à quarante minutes sous ventilation mécanique, cinq prises de sang et quatre échographies cardiaques sous anesthésie, réparties sur quatre-vingt-dix jours. Tous sont tués au terme du suivi, pour analyser la cicatrice, les vaisseaux formés et l'intégration du patch. Le porteur annonce une mortalité postopératoire de 30 % après induction de l'infarctus et pose du patch, soit près d'une centaine de rats morts des suites des opérations.

Objectifs

L'ischémie cardiaque, un problème où le cœur manque d'oxygène, est la principale cause de décès dans le monde depuis deux décennies. Ce manque d'oxygène entraîne des dommages au cœur, conduisant à une maladie chronique appelée insuffisance cardiaque. Récemment, des scientifiques et des médecins se sont intéressés à des thérapies alternatives basées sur l'ingénierie tissulaire pour réparer le cœur. Une méthode récente qui a attiré l'attention des chercheurs et des médecins est l'utilisation d'une structure appelée matrice extracellulaire native, obtenue à partir de tissus dépourvus de cellules. Cependant, cela présente des défis tels que le manque de donneurs, le risque d'infection, et des déséquilibres chimiques et physiques qui peuvent affecter les tissus et les cellules. Dans ce contexte, notre équipe de recherche vise à développer un biomatériau imitant les caractéristiques de la matrice extracellulaire cardiaque pour être utilisé comme une sorte de "squelette" actif dans le traitement de l'insuffisance cardiaque. Notre idée est de combiner différents matériaux dans un patch cardiaque unique, avec des propriétés physiques et chimiques contrôlées, ainsi que la matrice extracellulaire naturellement sécrétée contenant les éléments nécessaires à la réparation des tissus. Nous pensons que cette approche fournira un environnement optimal aux cellules cardiaques, favorisant ainsi la réparation du cœur après une ischémie cardiaque. Nous prévoyons de démontrer l'efficacité de ce patch en évaluant la réparation cardiaque chez le rat, en analysant les tissus grâce à des techniques d'imagerie médicale et de mesure morphologique après l'implantation du patch dans un modèle chirurgical simulant l'ischémie cardiaque.

Bénéfices attendus

Aujourd'hui, il n'existe malheureusement aucun traitement curatif pour l'insuffisance cardiaque causée par des lésions chroniques du cœur. Les solutions actuelles se concentrent principalement sur le soulagement des symptômes pour améliorer la qualité de vie des patients. De plus, ces traitements sont souvent associés à des effets indésirables. La transplantation cardiaque reste une option thérapeutique, mais elle est souvent réservée en dernier recours en raison de ses contraintes importantes. Heureusement, des avancées récentes ouvrent la voie à des thérapies alternatives pour traiter la perte de tissu cardiaque, en évitant la formation de cicatrices et le remodelage du cœur. Une approche prometteuse utilise ce qu'on appelle la matrice extracellulaire (MEC) native, obtenue par un processus de décellularisation des tissus. Cette MEC agit comme un matériau biologique pour réparer le cœur, et certains produits basés sur cette technologie sont déjà disponibles sur le marché. Les avantages de la MEC sont nombreux, car elle présente des propriétés physiques favorables et des composés qui régulent le comportement des cellules cardiaques et leur communication. Cependant, l'utilisation de MEC d'origine animale a ses limites, notamment en raison du nombre restreint de donneurs, des risques d'infection et des différences physiques et chimiques qui peuvent affecter la physiologie des tissus et des cellules. Notre projet innovant vise à créer un patch cardiaque qui offre un environnement propice aux cellules cardiaques, permettant ainsi une amélioration de la fonction cardiaque après un épisode d'ischémie. Cette avancée pourrait représenter une percée majeure dans le traitement de l'ischémie cardiaque, offrant de nouvelles perspectives d'amélioration de la santé cardiaque.

Procédures

Des animaux participeront à une étude simulant une crise cardiaque. Tout d'abord, ils seront traités avec des anti-douleurs et placés sous anesthésie et seront ventilés mécaniquement, puis une incision sera pratiquée sur le côté de leur poitrine. En utilisant un fil spécial, une ligature sera placée autour d'une artère importante du cœur pour provoquer une crise cardiaque simulée. Cette procédure durera entre 30 et 40 minutes et sera réalisée sous anesthésie pour le confort des animaux. Une semaine plus tard, ces mêmes animaux recevront un traitement sous forme d'un patch cardiaque. Encore une fois, ils seront ils seront traités avec des anti-douleurs et placés sous anesthésie et respiration assistée, puis une petite incision sera faite au niveau de la poitrine (sternum) pour exposer la zone du cœur touchée. Le patch sera fixé à cette zone à l'aide d'une colle médicale. Cette intervention durera également entre 30 et 40 minutes et sera réalisée sous anesthésie. Pour évaluer l'efficacité des traitements, des prises de sang seront effectuées aux jours 1, 7, 30, 60 et 90 pour examiner les changements dans leur santé (durée de l'intervention: 5 minutes). Des images du cœur seront également prises aux jours 5, 30, 60 et 90 à l'aide d'une échographie cardiaque, le tout sous anesthésie (durée de l'intervention: 10 minutes). À la fin de l’étude, une perfusion sera réalisée sous anesthésie, sans que les animaux se réveillent, pour évaluer le fonctionnement du cœur. Ces évaluations permettront de suivre la récupération du cœur après les différentes interventions.

Impact sur les animaux

Induction de l'ischémie cardiaque, une procédure simulant une crise cardiaque, sera réalisée en pratiquant une incision sur le côté gauche de la poitrine et en ligaturant une artère importante du cœur. Les animaux ressentiront une douleur post-opératoire modérée. Des prélèvements sanguins seront effectués aux jours 1, 7, 30, 60 et 90, avec une douleur modérée. L'implantation du patch cardiaque, réalisée par une incision sur le thorax, peut entraîner une douleur post-opératoire. La mortalité post-opératoire après induction de l'ischémie cardiaque et implantation du patch cardiaque est de 30 %. Les animaux peuvent ressentir du stress en raison des anesthésies répétées. Il y a également un risque d'infection au niveau des sutures et un risque de cicatrisation déficiente.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés après 7, 30, 60 ou 90 jours suivant l'implantation du patch. Cette mesure sera prise dans le but d'analyser les tissus du cœur, en évaluant des aspects tels que la présence de cicatrices, le nombre de cellules, leur multiplication, l'intégration du patch, la formation de nouveaux vaisseaux sanguins et les changements dans la matrice extracellulaire. Ces informations nous aideront à mieux comprendre l'efficacité du traitement et son impact sur la récupération du cœur.

Remplacement

Actuellement, il n'est pas possible de reproduire avec précision l'action des patchs cardiaques dans un tissu cardiaque en laboratoire ou par simulation informatique. Il n'existe pas de modèle fiable, que ce soit in vitro (dans une boîte de culture) ou in silico (simulation numérique), pour imiter une crise cardiaque. De nombreuses études scientifiques se basent sur des modèles expérimentaux d'ischémie cardiaque chez le rat, ce qui permet de mieux comprendre les mécanismes de la maladie chez l'homme. Pour étudier les changements au niveau cellulaire, des analyses des tissus sont nécessaires, impliquant malheureusement l'euthanasie des animaux. Cependant, au cours des deux dernières années, des expériences ont été menées in silico (modélisation 3D) et in vitro (culture de cellules cardiaques) au sein de notre unité. Ces travaux ont permis de réduire le nombre de biomatériaux à tester in vivo (dans des organismes vivants) et d'établir un processus de fabrication robuste des patchs cardiaques. Ces avancées sont essentielles pour mieux comprendre et traiter les problèmes cardiaques dans le futur.

Réduction

Nous utilisons des méthodes d'imagerie non invasives, comme l'échocardiographie, qui nous permettent de suivre les changements chez les mêmes animaux au fil du temps. De plus, nous avons effectué des calculs statistiques pour déterminer le nombre optimal d'animaux nécessaires à nos études, visant à obtenir des résultats significatifs sans avoir à utiliser un grand nombre d'animaux. Ces calculs ont été réalisés à l'aide d'un test spécifique, et pour détecter une différence significative entre les groupes d'étude et les groupes témoins. Les résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques appropriés pour garantir la fiabilité de nos conclusions.

Raffinement

Nous nous assurons que les conditions de vie des animaux sont optimales. Ils sont placés en petits groupes de trois dans des cages et nous enrichissons leur environnement. Nous respectons également leur rythme jour-nuit et leur accordons le temps nécessaire pour s'acclimater avant toute procédure. Nous avons mis en place des normes strictes pour garantir le bien-être des animaux. Nous utilisons des techniques d'imagerie non invasives, comme l'échocardiographie, et nous recourons à l'anesthésie et à des analgésiques pour toutes les procédures afin de minimiser tout inconfort. Les animaux seront surveillés quotidiennement, avec un suivi clinique réalisé chaque jour pendant la première semaine, puis deux fois par semaine par la suite. Cette surveillance sera effectuée en se basant sur une grille spécifique permettant d'identifier précocement les signes de douleur. En fonction de l'état des animaux, des mesures seront prises pour minimiser la douleur au maximum. Cela peut inclure l'application de soins locaux au site opératoire, l'administration d'analgésiques, et dans les cas de souffrance sévère, l'euthanasie sera envisagée pour mettre fin à la douleur.

Choix des espèces

Nous avons choisi avec soin le modèle animal pour nos recherches, en optant pour des rats, une sélection basée sur les publications scientifiques les plus pertinentes dans le domaine. L’implantation de patchs cardiaques et le modèle d’ischémie cardiaque chez le rat ont été décrites dans de nombreuses publications internationales de prestige. Les dimensions du cœur du rat permettent l’induction de l’ischémie, l'implantation du patch et l'analyse en imagerie. Les rats seront utilisés à un stade adulte car la population humaine présentant des ischémies cardiaques est relativement âgée. Les animaux seront utilisés à 9 semaines de vie ce qui correspond à un stade adulte.

Une administration unique de bléomycine dans les poumons déclenche une fibrose pulmonaire, puis les candidats médicaments sont administrés aux animaux ainsi rendus malades. 600 souris et 600 rats vont être utilisés de cette façon, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils passent jusqu'à quatre heures d'affilée dans un caisson de mesure respiratoire sans accès à l'eau ni à la nourriture, jusqu'à trois fois par semaine pendant trois semaines, et peuvent être saignés une fois par jour sur la même période. Le porteur ramène les effets attendus à un "mal-être" lié à l'insuffisance respiratoire et à un "stress mineur de courte durée", pour des procédures qu'il classe lui-même en sévère.

Objectifs

La fibrose pulmonaire est une maladie chronique qui affecte les poumons. Elle se caractérise par une inflammation et une transformation du tissu pulmonaire sain et distensible, en tissu fibreux et cicatriciel. Cette rigidification du tissu pulmonaire provoque une diminution de la capacité des poumons à fonctionner correctement, qui se manifeste chez les patients par un essoufflement, une toux sèche, une fatigue importante et une perte de poids. Il n'existe actuellement pas de traitement pour soigner cette maladie. Après avoir constaté chez l'homme l'apparition d'une fibrose pulmonaire suite à l'administration de bléomycine (agent anti-cancéreux), un modèle animal a été développé pour étudier le processus de développement d'une fibrose pulmonaire et tester l'efficacité de nouveaux médicaments. Ce projet consiste donc à évaluer l'efficacité de nouveaux candidats médicaments sur l'établissement d'une inflammation et/ou d'une fibrose pulmonaire suite à l'administration de bléomycine chez le rat ou la souris. Pour cela, au cours de chaque étude, les animaux seront exposés une fois à de la bléomycine au niveau de leurs poumons. Ces mêmes animaux seront traités par un placebo ou par le candidat médicament. Une observation très régulière des animaux sera réalisée pendant toute la durée de l'étude. Les paramètres respiratoires pourront être mesurés à plusieurs reprise grâce à la technique appelée "pléthysmographie". Une à 3 semaines après l'administration de bléomycine, les animaux seront euthanasiés et des prélèvements seront effectués (poumons ...).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont le développement de nouveaux médicaments pour traiter la fibrose pulmonaire et la découverte des mécanismes d'action impliqués dans le développement de cette maladie encore mal connue.

Procédures

Une administration unique de bléomycine sera effectuée par voie intranasale (animaux conscients ou anesthésiés pendant 15-30min) ou par voie intratrachéale (5-10min d'anesthésie). L'administration intratrachéale sera faite par les voies naturelles (= pas de trachéotomie). Les candidats médicaments seront administrés aux animaux vigiles par différentes voies, avec 1 à 3 minutes par administration. Dans certains cas, les animaux seront placés quelques heures (maximum 4h car non accès à l'eau et la nourriture) dans des enceintes spécifiques permettant de mesurer leurs paramètres respiratoires (="pléthysmographe") à raison de maximum 3 fois par semaine pendant la durée de l'étude (maximum 3 semaines). Si des prélèvements de sang doivent être réalisés en cours d'étude, ils seront effectués sur animal vigile ou sous anesthésie gazeuse (environ 2min par prélèvement, maximum une fois par jour pendant 3 semaines) et en respectant un volume maximale de prélèvement dans la limite des volumes autorisés. En cas de prélèvement sanguin terminal, il se déroulera sous anesthésie (durée entre 4 et 6 minutes).

Impact sur les animaux

L'effet indésirable principal attendu est un mal-être provoqué par l'inflammation pulmonaire et l'insuffisance respiratoire entrainant une perte de poids et un comportement apathique. Lors de certaines administrations nécessitant une aiguille, les animaux pourront aussi subir une douleur équivalente à la piqûre d'une aiguille. De plus, la manipulation des animaux vigiles pour induire l'anesthésie et administrer les composés à tester peuvent engendrer un stress mineur de courte durée.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure suite aux prélèvements d'organes terminaux et à cause des effets indésirables induits par la bléomycine chez les animaux.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rat ou la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur la fibrose pulmonaire. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Avant toutes administrations à l'Homme, l'étude sur corps entier constitue un passage obligatoire pour l'évaluation de l'efficacité d'un candidat médicament.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Compte tenu de la variabilité du modèle, le nombre d’animaux minimal et suffisant pour réaliser une analyse statistique est estimé à 10 par groupe (6 groupes par étude, et 2 études par an et par espèce).

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un hébergement en groupe, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux et des signes cliniques (avec une grille de scoring). Egalement, les animaux auront accès à un complément alimentaire par un gel nutritif et hydratant, une semaine après induction de la fibrose.

Choix des espèces

Le rat et la souris font parties des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour les modèles animaux de la recherche biomédicale. En effet, les rongeurs et l'Homme partagent de nombreuses similarités anatomiques, physiologiques et génétiques (environ 90% de gènes en communs). De plus, les rats et les souris sont des animaux de petite taille, facile d'entretien, avec des cycles réproductif et de vie courts. Par conséquent, ces deux espèces sont les plus couramment utilisées dans la recherche médicale et notamment, dans les modèles de fibrose pulmonaire. Ce projet sera réalisé sur des animaux mâles adultes. En effet, la fibrose pulmonaire touche principalement les adultes chez l'Homme. Ce projet n'a donc pas pour objectif d'étudier les effets du produit sur l'animal à d'autres stades de développement.

2 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont sensibilisées à un allergène une fois par semaine, parfois sous anesthésie, puis soumises à un test de provocation destiné à déclencher la réaction allergique, avant le prélèvement terminal du cerveau et des reins. L'objet du travail est double : mesurer l'allergénicité d'aliments et de formulations, et tester des molécules censées atténuer la réponse allergique. Le porteur écrit qu'un effectif minimum de dix souris par expérience est requis et conclut qu'il est "difficile de diminuer l'effectif en fonction de la sévérité de la procédure".

Objectifs

L’allergie alimentaire constitue une préoccupation importante en allergologie du fait de l’augmentation de son incidence au cours des dernières décennies. Les manifestations provoquées par une allergie alimentaire sont nombreuses et surviennent en général quelques secondes à quelques heures après avoir ingéré l'aliment responsable. Elles peuvent provoquer des manifestations modérées et exceptionnellement provoquer des manifestations sévères telles que l’œdème de Quincke ou le choc anaphylactique. La meilleure des solutions pour éviter une allergie alimentaire consiste à supprimer tout contact avec l’allergène. Cette éviction est relativement facile à mettre en œuvre lorsque le produit est peu utilisé dans l'alimentation quotidienne, mais plus difficile quand l'aliment est présent dans de nombreuses préparations, notamment industrielles. A ce jour, aucune thérapie n’a réellement montré son efficacité dans le domaine de l’allergie à l’arachide, contrairement à d’autres types d’allergie, excepté l’administration immédiate d’épinéphrine ou la totale éviction de l’aliment allergisant. Le développement de modèles murins précliniques à des allergènes cliniquement pertinents est donc prometteur pour évaluer non seulement de potentiels traitements pharmacologiques mais également pour tester de nouvelles préparations alimentaires.

Bénéfices attendus

Une allergie alimentaire est une réaction d'hypersensibilité immédiate qui se déroule en deux étapes : une phase de sensibilisation (premier contact de l'organisme avec l'allergène) et une phase de déclenchement (deuxième contact avec le même allergène). L'objectif est double: - mimer l'allergie et rechercher à diminuer la réponse allergique à l'aide d'agents pharmacologiques - évaluer l’allergénicité de certains aliments/formulations Après sensibilisation pendant plusieurs semaines, les souris subissent un test de provocation avec l’allergène sensibilisant. Les médiateurs de la réaction allergique précoce et tardive sont alors quantifiés. La majorité des signes cliniques observés chez l’homme sont mis en évidence chez la souris : bronchoconstriction, production locale de cytokines impliquées dans la réaction allergique,…

Procédures

Lors de la première phase, les animaux seront sensibilisés (généralement une administration par semaine, sous anesthésie si la voie d'administration le nécessite, durée de l'ordre de 30 secondes à 1 minute sans anesthésie, et de 20 minutes avec anesthésie) puis seront challengés avec l'allergène. Au cours de l'étude, les animaux resteront hébergés en groupe. A différents temps définis par le protocole d'étude, des prélèvements de sang seront réalisés chez l'animal vigile. Pour les besoins des études, les animaux sont euthanasiés pour le prélèvement des organes cibles d'intérêt (cerveau, rein, …).

Impact sur les animaux

Lors de l'évaluation de l’allergénicité de certains aliments, il est attendu de voir la potentielle apparition de signes cliniques plus ou moins marqués. L’anticipation de ces effets sert à écarter des aliments pouvant provoquer de sévères réactions. Quand on cherche à moduler la réponse allergique à l'aide d'agents pharmacologiques, il est possible d'établir la balance « bénéfice/risque » pour permettre un bon emploi des médicaments de demain. Les expérimentations animales occupent aujourd’hui une place centrale dans les démonstrations. Ces études ont pour objectif de renseigner les effets secondaires ou l’efficacité des substances testées, les doses ayant induit ces effets et la vraisemblance biologique d’un effet suspecté chez l’homme. Selon la durée et la fréquence de ces événements, ces procédures engendrent une souffrance plus ou moins intense et sont donc classées de légère à sévère. Un effectif minimum de 10 souris est inclus dans les expériences pour mettre en évidence un effet suffisamment robuste. Il est donc difficile de diminuer l'effectif en fonction de la sévérité de la procédure.

Devenir

Pour les 2 procédures décrites dans ce projet, tous les animaux sont soumis à un prélèvement terminal et sont donc euthanasiés.

Remplacement

Les tests/modèles que nous souhaitons développer et valider dans ce projet ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car ils impliquent l’observation des effets de substances pharmacologiques sur la réaction allergique.

Réduction

Dans le contexte de l'évaluation de composés potentiellement allergisants, la stratégie expérimentale consiste à comparer, les groupes recevant l'allergène à un groupe contrôle non-sensibilisé, l'objectif étant de réduire la réaction allergique induite par l'allergisant. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet ou plusieurs agents en comparaison par rapport à un groupe contrôle non sensibilisé. Cherchant à réverser/diminuer la réaction allergique, nous pouvons observer une variabilité inter-individuelle de réponse pouvant être liée à l’agent allergisant utilisé et à la substance d’essai évaluée. Compte-tenu de la variabilité de réponse connue d'un individu à une autre, 10 souris minimum sont nécessaires pour disposer de la puissance statistique suffisante et nécessaire pour comparer les différents groupes expérimentaux.

Raffinement

Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs vont consister en un suivi des points limites permettant d'euthanasier précocement tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objet de nidification, objet à ronger ou à mastiquer, présence de congénères. Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données. De plus, les animaux sont manipulés fréquemment par des techniciens formés et attentifs et suivis par le vétérinaire.

Choix des espèces

L’impact de substances pharmacologiques sur la réponse allergique des rongeurs est prédictif de leur efficacité en clinique. Principalement rongeurs sevrés, âge variant entre 3 semaines et 2 ans, conformément aux données historiques, à la bibliographie scientifique. L'efficacité de nouvelle immunothérapie peut également être évaluée chez des souris transgéniques HLA-A2/DR1 qui récapitulent les réponses immunitaires humaines.

Jusqu'à 576 heures d'enregistrement cérébral par animal, par tranches de quatre-vingt-seize heures consécutives chaque semaine : 132 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Celles opérées à l'âge adulte vivent seules pendant six semaines, de la chirurgie jusqu'à leurs trois mois, les électrodes implantées dans le cerveau interdisant de les garder en groupe. Le porteur indique que la moitié des souriceaux mutés meurent trois semaines après la naissance et que les autres font des crises d'épilepsie entre une et trois semaines de vie, l'objet du projet étant de caractériser ces crises. Il décrit la connexion hebdomadaire au système d'enregistrement comme "simple à réaliser et indolore", et prévoit la mise à mort des animaux surnuméraires au sevrage pour ne pas stresser leurs parents.

Objectifs

La protéine d’intérêt (PI) étudiée dans ce projet est impliquée dans la sclérose latérale amyotrophique (SLA) et la démence frontotemporale (DFT). Ces maladies sont dites neurodégénératives, c’est à dire qu’elles sont caractérisées par une perte progressive des neurones. Ce projet a pour but de mieux comprendre l'implication de cette protéine PI dans la régulation de l’activité des neurones. En condition normale, elle se situe majoritairement dans le noyau, où elle a plusieurs fonctions. Le noyau est la structure qui contient l’essentiel de l’information génétique de la cellule. Il est entouré du cytoplasme, qui est une structure cellulaire dans laquelle les protéines sont produites. Ainsi, PI doit être transportée du cytoplasme (où elle est produite) jusqu’au noyau (où elle doit se trouver pour remplir ses fonctions). Ce transport est permis car PI contient un "domaine de localisation nucléaire”. Ce domaine est une région spécifique qui indique qu’une protéine doit être transportée jusqu’au noyau. En condition pathologique, PI n‘est plus transportée jusqu‘au noyau, la protéine s‘accumule donc dans le cytoplasme. Chez les souris, il est possible d’induire la SLA et la DFT en supprimant le domaine de localisation nucléaire de PI afin qu’elle ne soit plus transportée jusqu’au noyau et s’accumule dans le cytoplasme. Chez les souris et les humains, cela s’accompagne, entre autres, de défauts des neurones inhibiteurs. Ces neurones sont importants pour réguler l‘activité électrique du cerveau en l‘empêchant d‘être trop élevée. Pour comprendre le rôle des neurones inhibiteurs dans les pathologies liées à PI, il existe une lignée de souris dans laquelle PI est mutée spécifiquement dans les neurones inhibiteurs. Les premières caractérisations de cette lignée montrent que cette mutation pourrait être pertinente en dehors de l'étude de la SLA-DFT. Lorsqu’une seule copie du gène PI est mutée (l’autre restant à l’état sauvage), les souris présentent une activité électrique anormale dans le cerveau à l’âge adulte. Lorsque les deux copies du gène PI sont mutées, les souriceaux développent des symptômes qui pourraient être liés à une activité électrique anormale dans le cerveau, voire à des crises d'épilepsie. Ce projet a alors pour but d’évaluer l’activité électrique dans le cerveau de souris juvéniles et jeunes adultes, et de caractériser les possibles crises d'épilepsie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra à court terme de mieux comprendre les mécanismes pathologiques présents chez des souris qui ont une protéine d’intérêt (PI) mutée spécifiquement dans certains types de neurones. Les neurones sont les cellules électriques du cerveau. Leur fonctionnement, et donc le fonctionnement du cerveau, peuvent être modifiés par des mutations. Ainsi, le projet permettra de savoir si l’activité électrique dans le cerveau des souris mutées est anormale avant même qu’elles ne deviennent adultes. Ces souris modélisent des maladies neurodégénératives. Or, les maladies neurodégénératives, telles que la sclérose latérale amyotrophique et la démence frontotemporale, apparaissent majoritairement à l’âge adulte mais il est possible que des altérations soient présentes dès l’enfance, voire avant. En observant des altérations chez des souriceaux et jeunes souris, ce projet soulèverait la question de possibles altérations précoces dans des maladies diagnostiquées bien plus tardivement. Ce projet permettra également d’étudier les mécanismes à l’origine des potentielles crises d’épilepsie. Ainsi, à long terme, ce projet permettra de mieux comprendre l‘implication de PI dans la régulation du fonctionnement des neurones chez l’humain. Un rapprochement pourrait alors être fait entre les pathologies connues pour être liées à PI et l’épilepsie.

Procédures

Les souris étudiées pour ce projet pourraient présenter une activité électrique anormale dans le cerveau, voire des crises d'épilepsie. Afin de vérifier cela, les souris seront étudiées et recevront les gestes techniques mentionnés ci-après. Pour savoir si les animaux sont mutants ou non, un prélèvement d’un bout d’oreille et/ou de l’extrémité distale de la queue devra être réalisé. Ce geste sera réalisé par des personnes expérimentées, sur animal vigile, une seule fois dans la vie de l’animal et durant très peu de temps (cela ne prend que quelques secondes par animal). Une chirurgie d'une heure maximum sera réalisée sous anesthésie générale et analgésie. Une seule procédure chirurgicale par animal sera réalisée. Chez les souris adultes la chirurgie sera réalisée à partir de 6 semaines (1,5 mois). A partir de ce moment, ces souris devront être isolées jusqu’à leur 12 semaines (3 mois). Elles seront donc isolées durant 6 semaines (1,5 mois) maximum. La chirurgie sera également réalisée sur des souriceaux de moins d’un mois (avant sevrage). Les souriceaux non-sevrés rejoindront le reste de la portée et leurs parents, qui auront été préparés pour éviter de les rejeter. Ils ne seront donc pas isolés. Après une période de convalescence, l’activité électrique du cerveau des animaux sera mesurée. Pour cela les souris devront être connectées à un système d’enregistrement. Cette connexion hebdomadaire est simple à réaliser et indolore pour les souris. Ces dernières seront vigiles, et pourront se déplacer librement durant le test. Pour les souriceaux, ces tests auront lieu sur 5 jours consécutifs, d’abord durant 1h par jour puis en augmentant progressivement cette durée jusqu’à 3h par jour. Au maximum, les souriceaux réaliseront 5 enregistrements par semaine, soit (5 enregistrements x 3h)15h d’enregistrement par semaine . Pour les souris adultes les tests auront lieu (4 enregistrements *24h) sur 96 heures consécutives par semaine jusqu’à leur 3 mois. Au maximum, les souris adultes réaliseront (6x96h) 576 heures enregistrements. A la fin du projet, les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

une partie des souriceaux mutés sont systématiquement plus petits et plus légers que leurs congénères appartenant aux mêmes portées. Par ailleurs, ces souriceaux développeront potentiellement des crises d’épilepsie lorsqu’ils auront entre une et trois semaines. Les premières caractérisations de la lignée montrent que ces souris ont parfois des phases d'absence ou de baisse d’activité. Ces phases sont courtes, le plus souvent suivies par une période où le souriceau redevient actif, et les mères continuent de s’occuper des souriceaux même quand ils sont peu actifs. La moitié de ces souriceaux mutés décèderont trois semaines après la naissance. En revanche, les souris mutées adultes ne présentent pas de symptômes indésirables visibles. Lors du prélèvement (du bout d’oreille ou de l’extrémité de la queue) pour déterminer si l’animal est muté ou non, il pourra ressentir une légère et brève douleur. La chirurgie pourrait créer de l’inconfort et des douleurs, qui seront suivies de près par les expérimentateurs et personnels de soin animalier. Pour mesurer l‘activité électrique du cerveau, les animaux devront être isolés. Pour les souriceaux, il pourrait y avoir un stress et un inconfort lié à l’absence de leur mère. En dehors des phases de test, le protocole mis en place permettra aux souriceaux et à leurs parents d’être hébergés ensemble, ce qui aura un effet bénéfique sur l’ensemble des animaux. A l’inverse les souris opérées à l’âge adulte devront être isolées dès la chirurgie et le resteront pendant la durée de l’étude jusqu’à l’âge de trois mois.

Devenir

Les animaux nécessaires à l’étude seront produits grâce à des accouplements contrôlés, les animaux surnuméraires seront euthanasiés au moment du sevrage (c’est-à-dire lorsqu’ils auront 3 à 4 semaines) pour ne pas stresser leurs parents. Les animaux inclus dans les procédures de chirurgie et enregistrements seront euthanasiés à la suite de la détection de crises épileptiques, ou à l’âge de trois mois maximum si aucune crise ne survient. Ils ne peuvent pas être gardés en vie et réutilisés après ce projet car ils auront des électrodes implantées dans le cerveau. Les parents seront euthanasiés à la fin de l’étude car ils n’auront plus l’âge de se reproduire.

Remplacement

Avec ce projet nous souhaitons étudier l'implication d’une protéine dans la régulation de l’activité électrique du cerveau. Plus précisément, il s’agira de définir si une mutation, lorsqu’elle a lieu dans un type cellulaire spécifique, entraine la survenue de crises d’épilepsie. Nous ne pouvons pas étudier cela avec des cultures cellulaires car elles ne reproduisent pas toutes les propriétés des crises d'épilepsie observées dans un cerveau entier. La modélisation informatique nécessite des données expérimentales encore manquantes et ne nous permet donc pas, pour le moment, de répondre à notre question scientifique. Sachant cela, l’utilisation d’un organisme entier est nécessaire. Cependant, nous ne pouvons pas étudier la mutation d’intérêt chez l’humain car il faudrait s’assurer que la mutation soit présente uniquement dans les cellules qui nous intéressent (ce qui n’est possible qu’avec une étude post-mortem), tout en mesurant l’activité électrique du cerveau des sujets vivants. Finalement, l’utilisation d’animaux est nécessaire afin de reproduire à la fois la complexité du système nerveux et la complexité comportementale.

Réduction

Nous veillerons à générer le minimum d'animaux nécessaires à la constitution des groupes expérimentaux en vue de produire des conclusions scientifiques statistiquement fiables. Au total nous aurons 132 animaux inclus dans le projet, dont 12 reproducteurs et 35 souris opérées. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul statistique. Ce dernier pourra être ajusté selon les premiers résultats, selon les différences observées entre chaque groupe et la possible variabilité au sein d’un même groupe. Une fois les données récoltées, des tests statistiques seront utilisés pour assurer une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les animaux sont hébergés selon les normes en vigueur concernant la taille des cages, le nombre d‘animaux par cage, la température ambiante, le taux d‘humidité, les cycles de lumière, et l’accès à l’eau et à la nourriture. Les cages seront enrichies d’un nid de coton et, si besoin d’une maison en carton. Le prélèvement du bout d’oreille ou de l’extrémité de la queue (pour savoir si les animaux sont mutants ou non) est rapide, parfaitement maitrisé et pratiqué au calme. Il a lieu au même moment que l’identification pour limiter la manipulation de la portée. Le matériel est propre et désinfecté entre chaque animal pour limiter le risque d’infection et de contamination. Le transport des animaux sera réalisé selon les normes en vigueur et avec un transporteur agréé. Les symptômes que pourraient développer les souris ne sont pas encore complètement caractérisés, c’est pourquoi les animaux seront étroitement surveillé par le personnel de soin animalier et les expérimentateurs. Des points limites ont été définis et seront respectés pour éviter toute souffrance des animaux. Avant la chirurgie, des phases d’habituation permettront aux souriceaux et à leurs parents de découvrir les gestes et matériaux nécessaires pour l’opération. Lors de la chirurgie et après, une prise en charge anesthésique et analgésique adaptée sera assurée. Une fois anesthésié, les animaux seront maintenus à bonne température et leurs yeux seront protégés pour qu’ils ne se dessèchent pas. Suite à la chirurgie, les animaux feront l’objet d’un suivi postopératoire avec une surveillance rapprochée jusqu’à leur réveil complet. L’expérimentateur et le personnel de soin animalier réaliseront ensuite une surveillance quotidienne étroite pendant une semaine. Un médicament antidouleur sera administré toutes les 12h. Si nécessaire, ce traitement pourra être prolongé jusqu’au rétablissement de l’animal. Après la chirurgie, les animaux seront pesés chaque jour pendant une semaine, puis une fois par semaine pour s‘assurer qu‘ils ne perdent pas de poids.

Choix des espèces

Ce projet sera mené avec des souris, qui sont encore aujourd’hui l’un des modèles animaux les plus pertinents dans le domaine de la recherche sur les maladies neurodégénératives et l’épilepsie. Ce choix a été motivé par des raisons scientifiques : 1) Cette étude nécessite des modifications génétiques très précises (mutation d’une protéine d’intérêt dans un seul type de cellules du cerveau). 2) Avoir une lignée pure, dont certaines caractéristiques génétiques sont stables, homogènes et utilisées dans les laboratoires du monde entier, permet de pouvoir comparer et reproduire des résultats. De cette façon, le nombre d’animaux nécessaires est réduit. 3) Cette espèce est largement utilisée pour étudier les crises d’épilepsie. Elle a été explorée de manière exhaustive, du niveau moléculaire jusqu‘à l‘échelle du comportement animal. Cela permet d‘avoir une solide base scientifique sur laquelle le projet se repose. 4) Les rongeurs ont un cerveau qui génère des activités électriques et des crises d’épilepsie dont les mécanismes pathologiques, au niveau moléculaire et cellulaire, sont similaires à l'humain. Les procédures seront réalisées sur des animaux de 7 jours (prélèvement pour savoir si les animaux sont mutés ou non) à 3 mois (euthanasie). Pour une partie des animaux, la chirurgie aura lieu quand ils auront 12 à 14 jours. Pour l’autre partie, la chirurgie sera réalisée quand les animaux auront 6 semaines (1,5 mois).

Rendues insuffisantes cardiaques par une chirurgie de cent dix minutes dans un premier établissement, puis transportées vers un second, 92 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles y reçoivent un traitement ou un placebo par voie orale, puis une suspension de SARS-CoV-2 dans le nez, avant d'être tuées pour prélever leurs organes. Ce qui est fait pendant l'opération de cent dix minutes n'est jamais précisé, alors que le RNT annonce un infarctus du myocarde et une insuffisance cardiaque installée, et qu'il affirme qu'aucun effet indésirable n'est attendu des échographies des huit semaines suivantes. Sur le remplacement, le porteur conclut à la "nécessité" de réaliser l'étude in vivo, aucune approche in vitro ne reproduisant selon lui l'ensemble d'un processus d'infection.

Objectifs

Les coronavirus sont une grande famille de virus qui provoquent des maladies allant du simple rhume à des maladies respiratoires très graves. Au 2 février 2022, sur un total de plus de 376 millions d'infections liées au coronavirus (COVID-19) dans le monde, 5,6 millions sont décédées à ce jour, dont plus de 128 000 en France. 73% des victimes du coronavirus en France avaient 75 ans ou plus. Le type le plus courant de maladie associée entraînant la mort après une infection par le coronavirus SRAS-Cov-2 est la maladie cardiaque. En effet, près d’un tiers des personnes décédées du Covid-19 souffraient de maladies cardiovasculaires, dont l'insuffisance cardiaque était majoritaire. Les maladies cardiovasculaires préexistantes ont été proposées pour identifier les patients à risque plus élevé de résultats indésirables de la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19), mais les preuves existantes sont contradictoires. Ainsi, il n'est pas clair si les maladies cardiovasculaires préexistantes sont indépendamment des facteurs prédictifs importants de COVID-19 sévère et encore plus importants pour le succès du traitement. Il a été montré que les maladies cardiovasculaires préexistantes entraînent une inflammation accrue et un risque de lésion myocardique lors de l'infection chez la souris, ce qui est cohérent avec les observations chez l'Homme. Une autre stratégie est l'induction de maladies cardiovasculaires, comme proposé dans ce projet. Dans ce contexte, l'objectif du projet est de tirer parti de la complémentarité des centres de recherche nationaux pour évaluer les effets des maladies cardiaques sur la sévérité de l'infection par le Covid19 et l'efficacité des thérapeutiques antivirales dans les conditions cardiovasculaires à l'aide d'un outil préclinique murin. Chronologiquement, un premier établissement de recherche va générer des animaux insuffisants cardiaques (avec les mêmes atteintes que celles développées chez les patients), puis dans un deuxième temps, un autre établissement de recherche va étudier les effets des traitements et de l’infection par le COVID-19 chez cette population de souris.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet se situent à différents niveaux : 1) Répondre au besoin de recherche sur la compréhension des mécanismes de la maladie grave dans la population touchée par le COVID-19, 2) Élaborer la preuve de concept pour offrir de nouveaux modèles expérimentaux plus proche de la clinique, 3) Délivrer un service basé sur des expertises complémentaires, en évitant de dupliquer investissements et expérimentations, 4) Évaluer l'impact de l'infection du covid-19 chez les patients souffrants de maladies cardiovasculaires. Il reste encore beaucoup à apprendre sur le rôle des maladies cardiovasculaires dans le COVID-19 humain, et les modèles animaux atteints de maladies cardiovasculaires sont fondamentaux pour déterminer le rôle de l'infection par rapport aux maladies cardiovasculaires dans la gravité de la maladie. Ces efforts peuvent également conduire à la conception et évaluation de thérapies antivirales, anti-inflammatoires et vaccinales spécifiques contre le COVID-19 sévère qui fonctionnent le mieux dans le contexte de conditions médicales particulières.

Procédures

Au sein de l’établissement EU1, chaque animal sera soumis sous anesthésie à : 1) une échographie cardiaque préopératoire (20 min), 2) une procédure chirurgicale (110 minutes), 3) une échographie cardiaque à 8 semaines (20 min). 4) envoi des animaux à l’établissement partenaire. Au sein de l’établissement EU 2 , chaque animal sera soumis sous anesthésie à : 1) une administration du traitement ou du placebo par voie orale (20 min), 2) une administration intranasale d’une suspension virale (20 min), 3) des prélèvements d’organes pour des études d’infection virale (30 min).

Impact sur les animaux

Les souris subiront un infarctus du myocarde et des symptômes d’insuffisance cardiaque conséquente à la maladie. Nous nous attendons à un cœur plus gros et un remplissage du cœur diminué, raison de l’étude. Aucun effet indésirable n’est attendu en réponse aux examens échographiques (non invasifs) sur la période considérées (8 semaines). Les animaux insuffisants cardiaques seront ensuite envoyés vers l’EU 2 par un transporteur agréé. Aucune perte n’a été notée jusqu’à ce jour, et une procédure est en place pour limiter le stress des animaux. Les souris subiront aussi une infection avec le virus SarsCov2 et des symptômes de la maladie. Sous anesthésie, les souris subiront des injections intranasales pour tester l’efficacité des traitements contre les effets du covid-19, finalité de l’étude.

Devenir

A la fin des procédures expérimentales décrites ci-dessus, les animaux seront mis à mort pour les prélèvements des organes.

Remplacement

Notre étude ayant pour but d'établir une nouvelle stratégie d’étude du Covid-19 en association à différentes maladies cardiovasculaires et d'évaluer son impact à long terme sur l’efficacité de traitement contre la maladie virale, il apparait ainsi pertinent d'effectuer ces analyses sur l'animal entier et non sur des modèles in vitro. Il n’y a pas de méthode sans l’utilisation de modèle animal permettant d’atteindre l’objectif visé de cette étude. À l’heure actuelle, aucune approche in vitro ne permet de reproduire de façon satisfaisante l’ensemble des phénomènes impliqués dans un processus d’infection de l’initiation au développement de la pathologie et au suivi de la réponse immune.

Réduction

Les groupes d’animaux ont été réduits au minimum de telle manière que les échantillons récupérés (n=5) soient suffisamment nombreux et donc représentatifs du groupe, afin que les données récoltées soient robustes statistiquement. En effet, si les groupes sont constitués de trop peu d’individus, la puissance statistique des données sera trop faible pour en tirer une conclusion fiable, ce qui impliquerait de répéter l’expérience et donc d’impliquer de nouveaux animaux. Il en va de même pour les animaux utilisés pour le suivi et la survie (n=13). De plus, dans cette étude, un groupe « témoin » (groupe 2, voir Annexe 1) ne portant pas de maladie cardiovasculaire est impliqué (constitué du même nombre d’animaux que le groupe 1 « test » soit n=36), et pourra être utilisé comme contrôle pour plusieurs prestations. Cela permettra de réduire grandement le nombre d’animaux utilisés sur le long terme dans les recherches. Le nombre utilisé pour ces expériences est de 6 animaux par génotype et par lot expérimental afin d’avoir des données statistiques robustes et de limiter le nombre d’expérience.

Raffinement

Les souris seront hébergées par groupe de 5 pour éviter le stress de l’isolement et les cages seront systématiquement enrichies par l’ajout de plusieurs éléments, notamment de la nourriture hydratée dès que nécessaire pour pallier toute perte de poids et/ou déshydratation durant leur hébergement. Les souris en expérimentations seront observées quotidiennement par le personnel formé et qualifié en charge de l’expérimentation. L’utilisation de grille de score journalier permettra de définir les soins à mettre en œuvre aux premiers signes de souffrance chez les souris sur la base de points limite définis. Selon le cas, le vétérinaire référent et le chef de projet sont prévenus pour décider, soit de soins/analgésie adaptés et compatibles avec le projet, soit de la mise à mort précoce de l'animal. L’expérimentation est optimisée en amont par le choix de modèle utilisé, la planification de protocole pour éviter le stress et mise en place des points limites (ou critère d’arrêt anticipé) de la procédure comme décrits ci-dessus. Le raffinement est également mis en place pendant l’expérimentation et il concerne les méthodes et les procédures des soins adéquats pendant et après l’infection ; l’anesthésie/analgésie et les procédures d’euthanasie appropriées.

Choix des espèces

La physiologie et la génétique de la souris étant « proches » de celles de l’Homme, nous avons choisi de réaliser l’ensemble de nos expériences chez cette espèce animale. Notre objectif principal est de comprendre l’effet des comorbidités à la susceptibilité à l’infection avec Sars Cov 2. Un modèle murin donnera non seulement des informations clés sur la physiopathologie du Covid19, mais servira également de plateforme d'évaluation préclinique à haut débit pour identifier des antiviraux et des vaccins performants, essentiels pour les essais humains en aval. Les nombreux travaux et les publications ont validé l’utilisation de modèle de la souris étant adapté pour comprendre et avancer la pathologie de COVID19. À l’heure actuelle, aucune approche in vitro ne permet de reproduire de façon satisfaisante l’ensemble des phénomènes impliqués dans un procès d’infection de l’initiation au développement de la pathologie et au suivie de la réponse immune. Ces différents arguments soulignent la nécessité de réaliser notre étude in vivo avec des modèles de souris. Il n’y pas de méthode sans l’utilisation de modèle animal permettant d’atteindre l’objectif visé de cette étude. Nous prévoyons d’utiliser des animaux âgés de 8 à 12 semaines. Il s'agit ici d'un âge moyen le plus souvent utilisé pour les études dans le domaine dans la littérature.

Après une injection de cellules tumorales dans la veine de la queue, des souris développent des nodules pulmonaires qui peuvent causer des douleurs, des difficultés respiratoires, une prostration et l'arrêt du toilettage. 1 794 souris de 6 à 10 semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère : selon les groupes, une injection sous anesthésie ou sous simple analgésie locale, puis trois ou quatre injections éveillées, et pour 54 d'entre elles une chirurgie suivie de 1 à 3 heures de microscopie intravitale. Le porteur affirme que le point final de chaque expérience "se situe bien avant d'atteindre les points limites", pour des procédures qu'il déclare pourtant en souffrance sévère. Toutes sont tuées pour des prélèvements de tumeurs ou d'organes, ou à l'issue d'une chirurgie prolongée, et 810 d'entre elles reçoivent encore une injection éveillées une heure avant leur mise à mort.

Objectifs

Les traitements par l’immunothérapie anti-cancéreuse ont révolutionné le traitement de nombreux cancers. Cependant, ces traitements ne sont pas efficaces chez tous les patients. Les vaisseaux à endothélium épais associés aux tumeurs (TA-HEV) sont des vaisseaux sanguins particuliers présents dans les tumeurs murines et humaines. Ils sont les portes d’entrées majeures des lymphocytes dans les tumeurs aux cours de l’immunité antitumorale et lors de traitements combinés d’immunothérapie (anti-CTLA-4 et anti PD-1). De plus, un traitement augmentant la fréquence et la maturité de ces vaisseaux induit une meilleure réponse à l‘immunothérapie dans des modèles précliniques murins. Enfin, dans les tumeurs fortement infiltrées par les cellules immunitaires ou tumeurs « chaudes », la présence de lymphocytes B et de structures lymphoïdes tertiaires (TLS) riches en lymphocytes B dans les tumeurs est souvent associée à une bonne réponse à l’immunothérapie. Cependant, les mécanismes qui régulent l’entrée des lymphocytes B dans ces tumeurs restent inconnus. L’objectif de ce projet est donc d’étudier le rôle de ces vaisseaux dans l’infiltration des lymphocytes B et la formation des TLS dans les tumeurs « chaudes » traitées par immunothérapie.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de mieux caractériser le rôle des vaisseaux à endothélium épais associés aux tumeurs dans l'établissement de structures lymphoïde tertiaires (TLS). Ces TLS sont des structures qui ressemblent en partie à nos ganglions lymphatiques et leur induction et leur développement pourrait favoriser la réponse immunitaire anti-cancéreuse.

Procédures

540 souris subiront une injection en vigile sous analgésie locale (1-2 minutes), ces 540 animaux subiront aussi quatre injections en vigile (environ 10 secondes par injection). 1200 souris subiront une injection sous anesthésie (2-3 minutes) ainsi que trois injections en vigile (environ 10 secondes par injection). 810 souris parmi ces 1200 inclus subiront en plus, 1h avant leur mise à mort, une injection en vigile sous analgésie locale (1-2 minutes). 54 souris subiront une injection sous anesthésie (2-3 minutes), ces 54 animaux subiront trois injections en vigile (environ 10 secondes par injection). Ces 54 animaux seront anesthésiés avant la pose d’un cathéter, puis subiront une chirurgie nécessaire à la microscopie intra vitale, cette procédure dure moins d’1h, l’imagerie quant à elle dure en moyenne une heure pour la microscopie intravitale à champ large et de 2 à 3h pour la microscopie intravitale multiphoton.

Impact sur les animaux

Pour les modèles de développement de tumeurs au niveau des poumons, l’injection des cellules tumorales dans la veine de la queue peut induire une douleur modérée et la contention de l'animal pour cette injection peut entrainer du stress. L’évolution du cancer se manifeste par une apparition de nodules au niveau des poumons ce qui peut causer des douleurs, des difficultés respiratoires et une dégradation de l’état des animaux (absence de toilettage, prostration, lenteur dans les mouvements…). Pour les modèles de tumeurs développées, l’injection des cellules tumorales peut provoquer du stress chez l'animal. Le développement tumoral peut aussi causer des douleurs et une dégradation visible de l’état des animaux (absence de toilettage, prostration, lenteur dans les mouvements…). Les traitements d'immunothérapie peuvent avoir des effets indésirables identiques à ceux observés chez l'homme avec une inflammation et une auto-immunité.

Devenir

L’ensemble des animaux est mis à mort pour des prélèvements de tumeurs ou d’organes ou bien à l’issue d’une chirurgie prolongée ne permettant pas de réutilisation des animaux

Remplacement

Les procédures réalisées sur l’animal dans le contexte de ce projet ne peuvent pas être remplacées par des méthodes expérimentales alternatives. En effet, il n’est pas possible à l’heure actuelle de disposer de modèles in vitro permettant d'intégrer à la fois le système immunitaire, le développement d'une tumeur et le système vasculaire sanguin. De plus les vaisseaux auxquels nous nous intéressons dans ce projet ne conservent pas leur caractéristiques en dehors d'un organisme vivant.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé pour chaque expérience a été déterminé à partir de nos études antérieures et de la littérature scientifique. Il est de 15 animaux maximum pour chaque groupe afin d’avoir un nombre suffisant d’animaux pour mettre en évidence des différences significatives statistiquement, en utilisant des tests de comparaison de moyennes multiples appropriés. Le projet est conçu avec une hiérarchie des procédures où la réalisation d’une procédure ultérieure n’est possible que si les résultats des procédures précédentes le justifient.

Raffinement

La stratégie de raffinement se base premièrement sur une connaissance approfondie du développement tumoral des modèles : les résultats d’expériences précédemment établies et publiés nous permettent de connaître précisément le moment où la réponse immunitaire anti tumorale est maximale et nous ont permis d'établir le point final de chaque expérience qui se situe bien avant d'atteindre les points limites. Le suivi des animaux sera réalisé quotidiennement par les expérimentateurs et des soigneurs en suivant une grille des scoring conçue spécifiquement pour ce projet. Les méthodes d’expérimentation et d’hébergement sont optimisées pour réduire au maximum le stress et la douleur causée par les procédures. Les injections intraveineuses sont réalisées sous anesthésie locale et avec un matériel de contention dédié et optimisé pour ces injections.

Choix des espèces

La souris est un organisme modèle génétiquement proche de l’être humain, ce qui en fait un modèle préclinique de choix très utilisé dans les domaines de la cancérologie et de l’immunologie. L'étude présentée ici nécessite aussi l'utilisation d'un modèle mammifère car les ganglions lymphatiques sont apparus tardivement au cours de l'évolution. Pour toutes les procédures, des souris âgées de 6 à 10 semaines seront utilisées car à ce stade, ces animaux ont un système immunitaire mature.

Les souris mâles utilisées ici sont privées du gène Mecp2 et développent dès l'âge de trente jours des apnées, une hyperventilation, une perte de mobilité et une perte de poids. 1 695 souris entrent dans le projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, pour tester un virus modifié censé délivrer une copie saine du gène au système nerveux central. Chaque animal subit une biopsie d'identification, une injection sous anesthésie gazeuse, un gavage, des tests comportementaux dont l'un dure jusqu'à quarante-huit heures, puis une ponction et une perfusion intracardiaques. Une partie des souris est gardée en vie comme reproductrices, les autres sont tuées à la fin des procédures pour prélever leurs organes, et le porteur présente l'étude sur les femelles comme une étape "indispensable" avant l'essai clinique.

Objectifs

Le syndrome de Rett (RTT) est une maladie rare neurodéveloppementale d’origine génétique liée au chromosome X. Elle conduit à une déficience intellectuelle progressive et sévère majoritairement chez les filles. Dans 95% des cas le RTT est dû à une mutation du gène MECP2. Le RTT ne connait à ce jour aucun traitement curatif. Les traitements administrés ciblent les symptômes et complications liées à la maladie afin de les alléger et ainsi améliorer la vie des patientes. Parmi les symptômes on retrouve notamment une perte des fonctions motrices volontaires, des troubles de la respiration et des troubles divers affectant le sommeil et l’alimentation. En 2007, la preuve de concept selon laquelle il est possible de restaurer un phénotype sain (c’est-à-dire que la souris malade est guérie) chez la souris mâle déficiente pour Mecp2 même à un stade avancé de la pathologie est publiée. Cette avancée est porteuse d’espoir et laisse place à de nombreuses études notamment en thérapie génique de remplacement visant à intégrer dans les cellules une copie saine du gène via un virus modifié. La cible étant le système nerveux central, les études se heurtent à un obstacle majeur : le passage de la barrière hémato-encéphalique présente autour du système nerveux central pour le protéger contre les substances étrangères. Jusqu’ici le virus le plus adapté pour infecter mène à un taux d’infection des cellules assez faible et plusieurs études utilisant ce virus rapportent également une forte expression du gène apporté dans le foie causant une toxicité. Récemment, une publication a montré le potentiel d’un nouveau virus conçu de manière à avoir une forte infection dans le système nerveux central mais pas ailleurs. Ces caractéristiques pourraient résoudre les effets secondaires observé avec le précédent virus. L’objectif de l’étude est de caractériser ce virus appelé AAV.Cap-B10 dans le cadre d’un traitement par thérapie génique sur des souris mâles Mecp2 et femelles déficientes et d’évaluer l’efficacité et la toxicité du traitement.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but d’évaluer l’efficacité d’un nouveau virus capable de cibler spécifiquement le système nerveux central sans infecter les autres organes dans le cadre d’une thérapie génique d’une pathologie neuronale. Si l’infection s’avère spécifique et homogène les résultats pourront servir à d’autres équipes cherchant à infecter le système nerveux central dans d’autres pathologies du cerveau. De plus, si le traitement est efficace les résultats serviront de bases pour une étude sur le modèle femelle Rett, étape indispensable avant le passage en essai clinique chez les patientes.

Procédures

Les animaux seront soumis à: - une biopsie pour identification et classement des animaux (une dizaine de secondes – 1 fois) – déclaration de la maladie (troubles respiratoires, moteurs; stress et perte de poids) - une anesthésie générale gazeuse au cours de laquelle sera réalisée l'injection pour la thérapie génique (durée environ 10min - 1 fois) - des tests comportementaux non invasifs (durée variable selon les tests de 5minutes à 48h – 1 à 3 fois par tests selon les groupes) - une administration par voie orale par gavage (30s à 1 minute) - une anesthésie générale profonde pour la mise à mort (durée 30min – 1 fois) – ponction cardiaque (1 fois 1min au décès) – perfusion intracardiaque (1 fois 1min au décès)

Impact sur les animaux

Dans ce modèle de souris, les mâles et les femelles déclarent plusieurs symptômes mimant ceux présents dans le syndrome de Rett. Les mâles montrent une apparition sévère des symptômes de manière précoce (environ 30 jours après la naissance). Chez les femelles les symptômes apparaissent plus tardivement (vers 5mois) et sont moins sévères, la souris est progressivement atteinte. Les effets cliniques attendus chez ces souris sont sévères et comprennent : - une altération des fonctions respiratoires conduisant à des apnées ou de l’hyperventilation - une altération des fonctions motrices conduisant à une réduction de la mobilité - une sensibilité accrue au stress et une perte de poids seulement chez les mâles (les femelles présentent à l’inverse une prise de poids). Les nuisances générées par les procédures comprennent : - le stress léger lié à la réalisation d'une anesthésie générale gazeuse - le stress léger lié aux tests comportementaux non invasifs - la douleur modérée, de courte durée, modulée par une anesthésie et analgésie adaptée) liée au prélèvement intracardiaque et à la perfusion intracardiaque terminale.

Devenir

Certains animaux seront gardés en vie comme reproducteurs. Les autres animaux seront mis à mort à l'issue des procédures expérimentales pour prélèvements d'organes.

Remplacement

La pathologie nécessite l’étude du cerveau et se caractérise par un polyhandicap. Pour l’étudier sous toutes ses dimensions un modèle de culture cellulaire n’est pas envisageable. Il est donc nécessaire d'avoir recours à un modèle animal de la pathologie pour espérer produire des résultats qui seront transférables chez l’homme. L'expérimentation sur l'animal permettra d'acquérir le recul et les compétences requises à une recherche translationnelle.

Réduction

La variabilité interindividuelle est réduite par l’utilisation de souches murines fixées génétiquement. Le nombre d’animaux a été déterminé en se basant sur nos études précédentes et sur le calcul statistique de puissance avec GPower pour répondre à la question expérimentale de façon que les effets attendus puissent être détectés avec un niveau de significativité suffisant tout en garantissant la sécurité des résultats. Cependant, nous utilisons un nouveau vecteur et une nouvelle construction. De ce fait, les effets attendus pourraient ne pas correspondre à ceux émis pour effectuer le calcul de puissance. C’est pourquoi, les expérimentations seront initialement réalisées sur la moitié du n prévu. Les données obtenues feront l’objet d’une analyse statistique préliminaire (étude pilote) en fonction du résultat : - les expérimentations seront arrêtées si aucune différence ne ressort entre les groupes - le nombre d’animaux par groupe sera augmenté si une différence entre les groupes semble exister mais ne ressort pas suffisamment pour atteindre la significativité. Enfin, les expérimentations post-mortem seront réalisées sur un demi- cerveau au lieu d’un cerveau entier (certaines expériences nécessitant des tranches et d’autres le broyage), permettant de réduire de moitié le nombre d’animaux nécessaires pour ces expérimentations.

Raffinement

L’hébergement est adapté aux besoins physiques et physiologiques des animaux et permet l’expression de leur gamme normale de comportements. Les souris sont hébergées en groupe, dans des cages enrichies (litière, dôme et bandelettes en carton) avec nourriture et eau ad libitum, dans des conditions environnementales maitrisées et conformes à la réglementation. Les souris étant particulièrement sujettes au stress, la manipulation des animaux et le change des cages seront faits par des personnes compétentes et sensibilisées à la contention low stress (cupping et tunnels) et à la fragilité de la lignée. Une période d’habituation à l’expérimentateur et aux tests de comportements est prévue le cas échéant. Les animaux seront anesthésiés pour toutes les procédures expérimentales induisant de la douleur, ici les injections des vecteurs viraux et des microbulles de gaz inerte via la voie rétro-orbitale le cas échéant. Cette anesthésie, sous forme gazeuse (isoflurane), suit les protocoles standards et sera accompagnée d’une analgésie et d’un suivi post-opératoire approprié. Des points limites clairs sont définis et évalués via une grille de suivi du phénotype des animaux afin de mettre en place les soins adaptés le plus précocement possible (antiseptiques, antalgique, anti inflammatoire). En parallèle, l'état général de nos animaux ainsi que l'état de la cage, de la nourriture et de l'eau seront surveillés quotidiennement. Des périodes d’habituation avec les expérimentateurs et pour les tests comportementaux le cas échéants sont prévues afin de diminuer le stress de nos animaux.

Choix des espèces

La souris permet actuellement de disposer facilement et rapidement d’un modèle mammifère de maladie génétique par manipulation du génome. L'intérêt général du modèle souris, utilisé comme modèle pré-clinique, repose essentiellement sur la proximité physiopathologique avec l'espèce humaine (transférabilité des résultats), un élément nécessaire à une recherche translationnelle valide. Le modèle Mecp2-deficient est le modèle le plus largement utilisé par les laboratoires de recherche dans les études sur le Syndrome de Rett. Il est largement caractérisé dans la littérature ce qui permet une bonne compréhension des animaux. Les souris seront incluses dans les procédures 2 et 3 à 30 jours post-natal (P30). Période à laquelle apparaissent les premiers symptômes chez les mâles et donc est plus proche de ce qui se passerait chez l’homme. L’apparition des premiers symptômes étant nécessaire au diagnostic de la pathologie. Les femelles et mâles utilisés pour la reproduction seront mis en procédure 1 durant la période de fertilité optimale respectivement de 2 à 8 mois et de 2 mois à 1 an post-natal afin d’obtenir des mâles et des femelles malades nécessaires à l’étude. Les deux premiers mois correspondent au temps d’acquisition de la maturité sexuelle.