Procédures sévères
Création et caractérisation des lignées SynCre*P2X4KO*SOD1, CD11bCre*P2X4KO*SOD1, SynCre*P2X4mCherry*SOD1 et CD11bCre*P2X4mCherry*SOD1
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Les souris portent une mutation SOD1 semblable à celle qui provoque la sclérose latérale amyotrophique chez l'être humain, et développent une dégénérescence progressive de leurs neurones moteurs. 6 330 souris vont être utilisées pour créer et caractériser quatre lignées croisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, dont 1 267 en gravité sévère. Chacune est génotypée par biopsie de la queue, puis les animaux d'intérêt passent le rotarod deux jours par semaine à partir du 75e jour de vie, placés sur un cylindre tournant jusqu'à ce qu'ils tombent, l'épreuve étant répétée trois fois, et un test de nage dont le porteur ne précise ni la durée ni les conditions. Le porteur qualifie ce stress de "mineur" et fixe la mise à mort à l'atteinte des points limites, que les animaliers sont formés à repérer dès les premiers signes.
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique (SLA) ou maladie de Charcot est une maladie caractérisée par une dégénérescence des neurones moteurs qui survient pendant la vie adulte et qui conduit à la mort 3 à 5 ans après le diagnostic chez l'homme. Malgré le développement de différents modèles animaux tels que les souris transgéniques SOD1 qui miment une forme génétique de SLA humaine, aucun mécanisme clé conduisant à la perte de certains neurones et aucun traitement efficace contre la SLA n’a encore été identifié. Pour lutter contre cette maladie progressive multifactorielle, il est donc crucial d’identifier de nouvelles cibles spécifiques afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. L’adénosine triphosphate extracellulaire (ATP) est une molécule de signalisation abondamment présente dans système nerveux central (SNC). Elle a été identifiée comme impliquée dans la communication entre certaines cellules du SNC via des récepteurs-canaux présents sur ces cellules et directement impliquée dans la SLA. Ce projet a pour but d’identifier l’implication respectives des récepteurs à l’ATP présents sur les différents types des cellules du SNC.
Bénéfices attendus
Ces travaux permettront de comprendre la fonction de la signalisation médiée par l’ATP dans le cerveau et la moelle épinière ainsi que l’implication des récepteurs de l’ATP dans le développement de la SLA. Ce projet pourrait déboucher sur l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques afin d'améliorer la vie des patients atteints de SLA.
Procédures
Les animaux seront tous genotypés par une biopsie de la queue réalisée en quelques secondes. La mutation portée par les animaux est similaire à celle de l'homme. Ces animaux vont présenter des altérations motrices qui seront surveillées de très près par une équipe compétente (50% des animaux de l'étude). De même, les animaux seront soumis à un certain stress lié aux tests de comportement. Enfin, ils seront systématiquement anesthésiés avant euthanasie. Les animaux d’intérêt passeront sur le test de la nage et du rotarod. Rotarod: A partir de P75 après une semaine d'habituation, le test du rotarod sera fait 2 jours par semaine, les mardis et jeudis, les animaux seront placés sur le rotarod à 10 rpm jusqu’à ce que l’animal tombe. Le test sera répété 3 fois. On gardera le score plus élevé. La vitesse sera augmentée progressivement jusqu’à la chute de l’animal avec un maximum de 3’30 min.
Impact sur les animaux
La mutation portée par les animaux SOD1 est similaire à celle de l'homme. Ces animaux vont présenter des altérations motrices qui seront surveillées de très près par une équipe compétente. Les animaux seront soumis à un stress mineur lié aux tests de comportements. En effet, le rotarod et le test de nage sont des protocoles comportementaux utilisés en routine en neuroscience et déjà publiés et validés sur le modèle murin SOD1 qui n’engendrent pas de stress à long terme. Enfin, ils seront systématiquement anesthésiés avant euthanasie.
Devenir
La SLA est une maladie mortelle dans 100% des cas. Il est important d'euthanasier les animaux avant toute souffrance
Remplacement
Il n’existe actuellement pas de méthode alternative permettant de remplacer l’utilisation de souris car ce projet repose sur l’évolution de la sclérose latérale amyotrophique dans un modèle animal suite à la modification d’un gène dans une population cellulaire donnée.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’animaux, chaque animal sera utilisé pour les études comportementales mais aussi pour de nombreuses approches in vitro à partir de nombreux prélèvements effectués post-mortem. Cela nous permettra de réduire au maximum le nombre de souris utilisées tout en conservant une significativité scientifique statistique (hétérogénéité interindividuelle). Ainsi, le nombre de souris utilisées dans chacun des groupes expérimentaux ne dépassera pas 12 animaux. De nombreux tests ex-vivo seront réalisés en post-mortem pour optimiser au maximum l'utilisation de chaque animal
Raffinement
Les animaux seront hébergés au sein d'un établissement utilisateur agréé dans des conditions d’hébergement favorisant leur bien-être (enrichissement, suivi quotidien par du personnel qualifié). Les animaux d'intérêt seront maintenus en groupe dans l'animalerie (cages enrichies avec sizzlenest, tube en carton, bâton de bois à ronger) et testés comportementalement à partir de 75 jours après la naissance jusqu'à l'atteinte des points limites et/ou l'atteinte des differents temps de prélèvement. Les animaliers sont formés à la détection des points limites liés au transgène SOD1-G93A et préviennent les chercheurs dès les premiers signes. Les personnes de l'équipe travaillant sur ces animaux passent aussi tous les jours voir les cages
Choix des espèces
La souris est un modèle dont le génome est parfaitement connu. De plus, un modèle murin de la sclérose latérale amyotrophique existe et des modèles permettant la délétion ou la sur-expression de P2X4 spécifiquement dans certains types cellulaires n’existent que chez la souris. Le système de reproduction des souris permet d'avoir régulièrement des animaux dans un espace relativement réduit. Pour tous les groupes expérimentaux (animaux issus des accouplements 4), les tests comportementaux commenceront 75 jours après la naissance (P75) avant l’apparition des premiers symptômes moteurs afin d’avoir une période contrôle avant la dégradation progressive des différents paramètres moteurs analysés qui débutent chez les souris SOD1 autour de P90-P100.
Etude du rôle des Lymphocytes T CD8 régulateurs dans l’homéostasie du système immunitaire dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Colite déclenchée par l'eau de boisson, encéphalomyélite induite par deux injections sous la peau, psoriasis provoqué par une pommade appliquée six jours sur le dos : 1 508 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, dont 720 en gravité sévère. Une partie est rendue immunodéficiente, donc plus vulnérable aux infections, avant d'être reconstituée par injection intraveineuse de cellules. Le porteur décrit pour le modèle d'encéphalomyélite une paralysie des membres postérieurs puis antérieurs accompagnée d'une perte de poids, pour la colite du sang dans les selles et des diarrhées avec déshydratation, et pour le psoriasis un érythème cutané plus ou moins étendu. Les 1 508 souris sont tuées à la fin de chaque procédure parce que les cellules régulatrices étudiées doivent être analysées dans les organes atteints.
Objectifs
Le système immunitaire est le fruit d’un équilibre complexe entre des cellules effectrices qui combattent les pathogènes et des cellules régulatrices qui refreinent ces dernières. En effet, les cellules effectrices du système immunitaire peuvent parfois s’attaquer aux propres cellules de l’organisme et conduire à ce que l’on nomme une maladie auto-immune. Certaines catégories des cellules régulatrices appelés lymphocytes T régulateurs (Tregs), sont très bien connues et décrites depuis une trentaine d’années. D’autres ont été mises en évidence plus récemment mais sont beaucoup moins bien décrites et connues. Ce projet a pour but de mieux comprendre le rôle des Tregs récemment mis en évidence dans différentes maladies auto-immunes grâce à des modèles murins uniques.
Bénéfices attendus
Notre étude est originale car c'est la première fois, grâce à l'établissement d'une nouvelle lignée murine transgénique, que les cellules régulatrices (Tregs) seront étudiées indépendamment selon leur sous-type. En effet, plusieurs modèles existent dans lesquels toutes les cellules régulatrices peuvent être supprimées, sans distinction des sous-types cellulaires. Avec cette étude nous allons supprimer spécifiquement des Tregs dans des contextes de maladies auto-immunes, et nous verrons directement leur rôle dans la régulation du système immunitaire. Cette étude va permettre de mieux comprendre le rôle des Tregs qui semble d’après plusieurs études avoir un rôle important dans l’équilibre du système immunitaire. Si ce rôle est bien confirmé, nous pourrons alors proposer des thérapies chez l’homme dans les maladies auto-immunes.
Procédures
La colite sera induite via eau de boisson pendant 5-6 jours (abreuvement spontanée, animaux vigiles). L’EAE sera induit par injection sous-cutané (SC) d’un peptide avec de l’adjuvant à J0 ainsi que par l’injection d’un traitement en intra-péritonéale (IP) à J0 et J2. Le psoriasis est induit par application d’une pommade pendant 6 jours sur le dos des animaux. La suppression du système immunitaire sera obtenue par injections chroniques d'un traitement par voie IP. L’injection de cellules est effectuée par voie intra-veineuse (IV). Les injections, qu’elles soient par voies IV ou SC sont effectuées sous anesthésie gazeuse, tout comme le rasage du pelage et l’application de crème sur la peau. Les injections durent 5 minutes et sont réalisées 1 seule fois par animal pour les IV, et 2 fois par animal pour les SC. Les injections par voie intra péritonéales (IP) ainsi que les prélèvements sanguins sont quant à eux réalisés sur animaux vigiles. Ces actes ne durent que quelques minutes et sont réalisés 6 fois maximum pour les injections IP et 3 fois maximum pour les prélèvements sanguins. Certains animaux présenteront un phénotype dommageable d'immunodéficience, les rendant plus sensibles aux infections. Les animaux sont euthanasiés par une méthode réglementaire en fin de projet.
Impact sur les animaux
Une partie des animaux présente une immunodéficience acquise ou induite ce qui implique un risque accru aux infections, à des atteintes cutanées avec l’apparition de lésions de l’épiderme, ou encore à des atteintes digestives conduisant à une perte de poids. Les 6 injections de traitement nécessaires pour la suppression du système immunitaire pourront conduire à un stress limité et à une douleur de courte durée. La reconstitution des souris immunodéficiences avec un système immunitaire spécifique selon les conditions sera réalisée par une injection de cellules en suspension par voie intraveineuse. L’injection pourra conduire à une gêne très courte suite à un écoulement sanguin. L’immuno-monitoring sera réalisé sur un prélèvement sanguin. Ces prélèvements (3 au maximum), peuvent conduire à un hématome ou une hémorragie. La douleur mandibulaire peut aussi avoir pour conséquence des difficultés pour se nourrir. De manière générale toutes les injections par voie intraveineuse et sous-cutanée ainsi que les prélèvements sanguins sont réalisés sous anesthésie gazeuse ce qui pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse respiratoire. L’induction d’encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE) est réalisée par 2 injections sous cutanées pouvant conduire à une inflammation et donc à une douleur locale. Ce modèle a pour conséquences à une paralysie des membres postérieurs puis antérieurs associée à une perte de poids. Cette perte de mobilité peut conduire à un stress des animaux. Le modèle de colite peut conduire à une forte perte de poids, du sang dans les selles et des diarrhées plus ou moins fortes ayant pour conséquence une déshydratation. Le modèle de psoriasis quant à lui conduit à l’apparition d’érythème cutané plus ou moins étendu. Tous ces modèles de maladies auto-immunes peuvent avoir pour conséquence des symptômes une douleur qui sera évaluée tout au long des protocoles.
Devenir
Il est nécessaire à la fin de chaque procédure mettant en jeu un modèle de pathologie auto-immune d'analyser les cellules d'intérêt dans les organes atteints par la maladie. Ainsi, les prélèvements ou les analyses dans les organes internes impliquent l’euthanasie des 1508 animaux par une méthode réglementaire.
Remplacement
Le modèle animal est indispensable pour étudier le rôle d’une population cellulaire, ici une sous population régulatrice du système immunitaire, qui sont encore peu décrits et étudiés, dans différentes pathologies auto-immunes. Ici nous avons choisi d’étudier ce rôle dans 3 pathologies distinctes faisant intervenir des acteurs immunologiques de nature différente au sein de 3 organes cibles distincts : le système nerveux central, la peau et le système digestif. Les organes et les réponses immunitaires étudiés sont complexes et il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires entrant en jeu.
Réduction
Le projet impliquera un total de 1508 animaux. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu de nos résultats préliminaires, nous avons pris l’hypothèse que la différence de score entre les souris dans nos 3 modèles pathologiques serait d’environ 10 pourcents. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les animaux sont hébergés dans les conditions standard exempt d'organisme pathogène spécifique (EOPS). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de papier Kraft, maison en carton, tunnel en carton ou carré de coton de nidification compacté. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés. Lors des gestes invasifs tels que injections, rasage et application de crème cutanée les animaux subissent une courte anesthésie gazeuse. Si après ces courtes anesthésies les animaux ont du mal à retrouver un état vigil, ils seront gardés dans la cage d’induction posée sur plateau chauffant à 37 degrés dans laquelle seule l’oxygène sera maintenu. Les animaux seront surveillés jusqu’à récupération complète. Si les animaux montrent des signes de douleur un traitement antalgique par voie orale sera mélangée à un aliment appétant. De même, 30 minutes avant les euthanasies, les animaux seront sous analgésie.
Choix des espèces
La souris est un modèle validé pour les études immunologiques. Les 3 modèles de maladies auto-immunes utilisées dans ce projet sont également très bien caractérisés et favorisés par le fond génétique choisi. Les modèles de souris transgéniques utilisées dans ce projet permettent d’étudier spécifiquement nos cellules régulatrices d’intérêt ce qui a pour conséquence que le projet tel qu’il est ne pourrait pas être réalisé dans une autre espèce animale. Les animaux inclus dans les protocoles seront des animaux adultes de 6 semaines minimum, condition favorable permettant d’obtenir un stade de maturité immunitaire suffisant tout en limitant le temps d’hébergement total. L’âge maximum d’inclusion dans une procédure sera quant à lui de 24 semaines. Au-delà on estime que le système immunitaire sera vieillissant vis-à-vis des animaux les plus jeunes.
Caractérisation tissulaire des zones impliquées dans la survenue de troubles du rythme cardiaque
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
Un tiers des porcs devrait mourir subitement au moment où on leur provoque un infarctus : c'est le calcul qui porte l'effectif de 8 à 12. 12 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils subissent d'abord une heure et demie de chirurgie sous anesthésie générale pour l'infarctus, puis deux mois plus tard trois heures de cartographie du ventricule gauche destinée à déclencher une tachycardie ventriculaire, avant la mise à mort et le prélèvement du tissu cardiaque. Le porteur retient le porc juvénile de 30 à 35 kg au motif que son cœur est le plus proche de celui de l'être humain, les animaux devant peser 70 à 80 kg à la fin du protocole.
Objectifs
La mort subite touche environ 50 000 patients en France tous les ans. Sa cause principale est l’infarctus du myocarde. Les mécanismes de la mort subite sont mal connus. Cependant des troubles du rythme cardiaque, faisant suite à la survenue de l'infarctus, sont suspectés. Ainsi le mécanisme rythmique à l’origine de la mort subite est le plus souvent la survenue d’une tachycardie ventriculaire (rythme cardiaque trop élevé) qui se transforme en fibrillation (contractions érratiques) ventriculaire, responsable de l’arrêt cardio-circulatoire. Pour mieux comprendre les mécanismes tissulaires qui expliquent la survenue de ces troubles du rythme, nous proposons de réaliser une analyse histologique des zones responsables de ces arythmies. Ceci n’est pas réalisable chez l’homme et nous proposons de réaliser cette étude sur le porc, gros animal, dont l’anatomie cardiaque est très proche de celle de l’homme. Pour cela en pratique, nous proposons d’induire une tachycardie ventriculaire, qui est le trouble du rythme à l’origine de la mort subite, à distance (a posteriori) de l'induction d’un infarctus du myocarde. Nous souhaitons étudier les anomalies histologiques et moléculaires présentes dans les zones anatomiques impliquées dans la survenue d’une tachycardie ventriculaire. Ainsi la première phase de l’étude consistera en la réalisation d’un infarctus du myocarde et la deuxième phase consistera à induire une tachycardie ventriculaire et à repérer les zones anatomiques responsables de cette tachycardie ventriculaire. Cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes de survenue de ces tachycardies qui sont responsables de mort subite chez l’homme.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes de remodelage tissulaire responsable du développement des arythmies ventricuaires. Cela pourrait aboutir à l’identification de biomarqueurs cellulaires spécifiques et à des applications thérapeutiques.
Procédures
Réalisation d’un infarctus du myocarde sous anesthésie générale. La durée de cette procédure est d’environ 1h30. Deuxmois après cartographie ventriculaire gauche sous anesthésie générale. La durée totale de cette intervention est d’environ 3 heures.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus incluent : - le stress induit par la contention avant induction de l'anesthésie générale, - les risques liés à l’anesthésie générale elle-même : hypoxie, hypothermie, arrêt cardio-respiratoire, - l'induction d’un infarctus du myocarde avec risque d'insuffisance cardiaque ou de mort subite.
Devenir
Des prélèvements du tissu cardiaque doivent être effectués pour analyses histologiques, nécessitant la mise à mort de l’animal.
Remplacement
Aucun modèle in vitro ou mathématique ne permet de reproduire et de modéliser les dommages tissulaires provoqués par un infarcus du myocarde. Un étude animale est obligatoire pour caractériser ces lésions tissulaires, car il n’est pas possible de faire ce type de prélèvements chez l’homme. Il n’est pas non plus possible d’effectuer cette étude sur un cadavre humain car il n’y a plus d’activité électrique dans le cœur.
Réduction
Il s’agit d’une étude pilote. Nous comparerons les tissus chez les porcs chez qui il sera possible d’induire un trouble du rythme cardiaque après l’infarctus versus ceux chez qui il ne sera pas possible d’induire ce troube du rythme. Nous estimons qu’il sera possible d’induire une tachycardie ventriculaire dans la moitié des cas. L’autre moitié servira de groupe contrôle. Nous attendons une différence de 40% dans la répartition tissulaire entre ces 2 types groupes (groupe tachycardie et groupe contrôle), ce qui correspond à 8 porcs dont les résultats pourront être analysés. Nous estimons que 1/3 des porcs feront une mort subite à l’induction de l’infarctus, raison pour laquelle nous prévoyons d’inclure 12 porcs dans l’étude.
Raffinement
Les porcs sont hébergés dans une animalerie où les paramètres d’ambiance sont contrôlés, avec un cycle alternance jour/nuit de 12h/12h. Ils sont hébergés en groupes sociaux sur litière de copeaux de bois afin de leur permettre d’exprimer leur comportement de fouissage. Des enrichissements sont mis à disposition tels que chaine à mâcher, ballons en platique et boules dans lesquels des granulés ou de la compote de pomme peuvent être cachés. Ces enrichissements sont mis à disposition de façon alternative toutes les semaines environ. Des morceaux de fruits sont également distribués. Les porcs bénéficient d’une période d’acclimatation de minimum 7 jours au cours desquels ils sont habitués à la présence de l’homme et à leur manipulation lors des périodes de change et la distribution de nourriture/eau notamment, moments propices à la distribution de caresses (avec des gants de massage) et de friandises. Les interventions pouvant occasionner de la gêne ou de la douleur sont réalisées sous anesthésie générale et une analgésie multimodale incluant des opioïdes est administrée. Des points-limites adaptés ont été définis afin de limiter toute forme de stress ou de souffrance. Les animaux sont a minima contrôlés une fois par jour pendant la période d’acclimatation puis 3 fois par jour après l'induction de l’infarctus et ce jusqu’à la fin de la période de suivi de 2 mois au terme de laquelle une cartographie tisuslaire est réalisée.
Choix des espèces
Il s’agit de l’espèce la plus proche de l’homme au niveau cardiaque, permettant de réaliser un infarctus du myocarde et une cartographie électrique de la tachycardie ventriculaire. Nous souhaitons travailler sur des porcs juvéniles d’environ 30-35 kg au moment de la première phase (induction de l'infarctus) car la deuxième phase (induction de la tachycardie ventriculaire et réalisation de la cartographie) sera espacée de 2 mois et les porcs pèseront environ 70-80 kg en fin de protocole.
Etude du rôle du système à peptide RFamide PrRP/GPR10 dans la modulation de la nociception et de la douleur à l’aide de souris génétiquement modifiées. (2/2)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une biopsie de la queue entre 5 et 7 jours de vie, puis pour 1 248 d'entre elles une injection de tamoxifène et un phénotypage comportemental : 1 754 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère. Selon le lot, elles subissent ensuite jusqu'à 84 tests de douleur répartis sur 42 jours, ou une chirurgie de la patte droite suivie de tests répétés pendant sept semaines. Le porteur indique que ces procédures peuvent abaisser le seuil douloureux et provoquer inflammation, œdème, infection des sutures et troubles de la locomotion, l'objectif étant de caractériser un récepteur impliqué dans l'hyperalgésie induite par les opiacés. Les souriceaux au mauvais génotype sont tués au sortir de l'élevage, les autres à l'issue de leur procédure, aucune réutilisation n'étant possible parce que la douleur infligée fausserait tout protocole ultérieur.
Objectifs
La douleur chronique est un problème de santé publique majeur. Elle diminue la qualité de vie des patients et son traitement a un impact économique considérable. Bien que des progrès importants aient été réalisés dans la compréhension des mécanismes de la douleur, peu de progrès ont été faits dans le développement de nouveaux analgésiques. Dans le cadre d’une douleur modérée à sévère, les opiacés restent à ce jour le moyen le plus efficace de traiter ces douleurs. Par contre, leurs effets indésirables sont nombreux, dont notamment la tolérance analgésique caractérisée par une diminution au cours du temps de l’effet du traitement nécessitant une augmentation des doses pour soulager le patient. La prise chronique d’opiacés entraîne également le développement d’une hypersensibilité à la douleur, ce qui sous-entend des points communs entre l’hyperalgésie induite par les opiacés et le développement de l’hyperalgésie induite par les douleurs chroniques. Les données de la littérature ainsi que nos premiers résultats indiquent qu’un récepteur spécifique serait impliqué dans ces phénomènes. Ce projet est un projet de recherche préclinique qui vise à développer de nouvelles voies thérapeutiques analgésiques peu ou pas caractérisées jusqu'à présent. Pour ce faire, nous avons récemment généré une lignée de souris chez qui nous pouvons désactiver ce récepteur. L’étude de cette lignée nous permettra notamment de mieux comprendre l’implication de ce récepteur dans la modulation de la douleur et le développement de l’hyperalgésie, mais aussi d’envisager le développement de nouveaux traitements de la douleur plus sûrs et présentant moins d’effets secondaires que les traitements existants. Ce projet est un projet multi-site se déroulerant dans 2 Etablissements Utilisateurs.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet, combinés aux résultats précédemment obtenus par une approche pharmacologique avec un ligand exogène (molécule synthétique pouvant se fixer au récepteur), permettront d’affiner le rôle de ce récepteur ainsi que de son ligand endogène (molécule naturellement synthétisée par les neurones et pouvant s’y fixer) dans la modulation de la nociception et le développement de l’hyperalgésie induite par les opiacés et les douleurs persistantes. Ce projet pourrait permettre à terme d’établir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de la douleur.
Procédures
Tous les animaux subiront une biopsie unique sur animal vigil à l'âge de 5 à 7 jours afin de réaliser leur génotypage (réalisée dans l'EU1). 1248 animaux du projet subiront une injection de tamoxifène et un phénotypage comportemental (réalisée dans l'EU1). Un 1er lot d’animaux subira 1 à 2 tests nociceptifs d’une durée de 15 min environ par jour pendant 12 jours ; puis 2 tests de confort nociceptif d’une durée d’1h (1 test par jour dans ce cas)(EU2). Un 2nd lot d’animaux subira 4 injections à raison d’une injection toutes les 15 min. Ces animaux subiront au total 36 tests nociceptifs d’une durée de 3 min environ espacés sur une période de 22 jours (EU2). Un 3ème lot d’animaux subira des injections pendant 11 jours. Ces animaux subiront au total 66 tests nociceptifs d’une durée de 3 min environ espacés sur une période de 4 semaines (EU2). Un 4ème lot d’animaux subira une injection dans la queue. Ces animaux subiront également au total 48 tests nociceptifs d’une durée de 3 min environ espacés sur une période de 25 jours (EU2). Un 5ème lot d’animaux subira une injection dans la queue. Ces animaux subiront également au total 84 tests nociceptifs d’une durée de 3 min environ espacés sur une période de 42 jours. Un 6ème lot d’animaux subira deux tests nociceptifs d’une durée de 10 min environ par jour pendant 7 jours puis les animaux subiront une chirurgie de la patte droite avant de réaliser les mêmes tests nociceptifs, à raison de 4 tests maximum (espacés de 4h minium) par semaine, pendant 7 semaines (EU2). Un 7ème lot d’animaux subira 2 tests nociceptifs d’une durée de 10 min environ par jour pendant 7 jours puis les animaux subiront une chirurgie de la patte droite avant de réaliser les mêmes tests nociceptifs, à raison de 2 tests par jour (espacés de 4h minium) pendant 3 semaines. Un dernier lot d’animaux subira un test nociceptif d’une durée de 3 min environ par jour pendant 7 jours puis les animaux subiront une injection avant de réaliser le même test nociceptif, tous les 15 min pendant 90 min (EU2).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables pouvant apparaitre après application de nos procédures, sont une douleur modérée après la biopsie, l’abaissement du seuil douloureux, l’apparition d’inflammation / œdème / infection au niveau des points d’injection ou des sutures chirurgicales, comportements anormaux, problème de locomotion, inconfort transitoire au point d’injection.
Devenir
Les animaux issus de l'élevage ayant le génotype d'intérêt continue vers les procédures de phénotypage comportemental et ceux n'ayant pas le génotype d'intérêt sont mis à mort. Les animaux avec le génotype d'intérêt inclus dans les procédures sont mis à mort à l'issue de chacune d'elles. Aucune réutilisation d'animaux n'est possible du fait des modèles de douleur subit par les animaux qui mettraient en cause les résultats d'une nouvelle procédure si elle était réalisée.
Remplacement
Au vu de notre objectif d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, la caractérisation de la modulation de la nociception et de la douleur nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile.
Réduction
Au regard des données de la littérature, de notre expérience et de la variabilité phénotypique individuelle, nous avons pu estimer par une analyse statistique que 12 animaux de chaque sexe/groupe sont requis pour obtenir des résultats exploitables. Ainsi chaque étude de base comportera un groupe transgénique témoin et un groupe transgénique invalidé pour la protéine d'intérêt sans avoir été soumis au traitement cet un groupe de souris transgéniques obtenues par traitement. Les animaux utilisés dans des études similaires n’étant pas disponibles, en cas de réussite avec ce nouveau modèle, les animaux prévus pour les deux autres études ne seront pas utilisés. De par notre expérience du maintien des lignée de souris transgéniques incluses dans le projet, nous connaissons aussi le nombre optimal de couples reproducteurs qu'il nous faut, pour pouvoir à la fois maintenir les lignées et fournir les animaux nécessaires au bon déroulé des expériences.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en cohorte, dans un milieu enrichi, et observés quotidiennement par l’expérimentateur, ou une personne compétente dans un établissement agréé de façon à maximiser leur confort et limiter une quelconque souffrance. Pour le transport des animaux, vu la courte distance entre les 2 EU (5 km), celui-ci sera effectué par véhicule personnel. Les cages seront positionnées de manière à ce qu'elles ne puissent bouger ni se renverser pendant le transport. Les conditions environnementales seront maintenues pendant le transport (on vérifiera la température du véhicule avant le transport). Les cages de transport contiendront de l'eau et la nourriture gélifiés ainsi que des enrchissements (frissure et morceaux de bois à ronger). Les souris sont habituées à l’expérimentateur et à l’expérimentation afin de limiter leur angoisse et le stress. Pour chacune des procédures, des points limites adaptés ont été définis. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et les injections d'agent inflammatoire sous anesthésie gazeuse. Pour les tests comportementaux mesurant les seuils de douleur, les animaux gardent le contrôle sur le test: le retrait de la patte de l'animal ou de la queue met fin au test, ou l’animal change de compartiment. Le test est de toute façon toujours arrêté au seuil nociceptif de l’animal et des points limites spécifiques ont été défini pour éviter toute lésion des tissus. En cas de nécessité des décisions seront prises en accord avec le vétérinaire, la Structure chargée du Bien-Etre des Animaux et/ou le personnel zootechnique de l’institut pour stopper tout signe de mal-être de l’animal.
Choix des espèces
Les objectifs du projet consistent à étudier le rôle du récepteur GPR10 dans la modulation de la nociception et de la douleur. Pour ce faire, il nous est indispensable de travailler sur un modèle entier et complexe prenant en compte les cascades de réactions, les voies de signalisation, la communication entre les organes afin d’être dans des conditions au plus proche de la complexité humaine. Le modèle murin présente une forte homologie structurale du cerveau avec l’Homme le rendant incontournable dans la recherche en neurosciences et notamment dans la compréhension des mécanismes de la douleur. En plus de sa proximité physiologique avec l’Homme, la souris possède également une forte homologie génétique faisant d’elle un bon modèle d’étude de la douleur. Par ailleurs, la souris permet des délétions conditionnelles qui est la base d’étude de ce projet. Des animaux adultes seront utilisés (début des procédures à 8 semaines, poids supérieur à 20g) car l’étude des comportements dans nos différents modèles nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures. Pour le génotypage, les souriceaux seront utilisés entre 5 et 7 jours car la minéralisation des os de la queue ainsi que le développement de la vascularisation ne sont pas encore complets, ce qui minimise la souffrance des petits.
Effet de l’inhibition d’un transporteur du tubule proximal sur la fonction rénale des souris atteintes par la maladie Dent
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
176 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, chacune passant cinq jours en cage à métabolisme sur une grille métallique de surface réduite. Les souris génétiquement modifiées pour reproduire la maladie de Dent perdent protéines et calcium dans leurs urines et développent une fibrose rénale. À 4 mois, puis pour une partie d'entre elles à 7 et 10 mois, elles subissent une mesure de composition corporelle en tube clos, une anesthésie pour mesurer la filtration rénale avec risque d'hypothermie et de détresse respiratoire, puis un prélèvement sanguin sous-mandibulaire qui peut provoquer une hémorragie. Toutes sont tuées à 4 ou 10 mois pour prélever les reins.
Objectifs
La maladie de Dent de type 1 est une maladie rénale rare caractérisée par une perte urinaire de protéines et de calcium, la présence de calculs rénaux, et une insuffisance rénale progressive. La maladie est causée par des mutations d’une protéine appelée ClC-5. Jusqu'à présent, il n'existe pas de traitement spécifique pour cette maladie. Une souris modifiée génétiquement présentant les mêmes traits cliniques observés chez les patients a été générée. L’objectif de ce projet est d'identifier des pistes thérapeutiques pertinentes pour ralentir la progression de la maladie et freiner l’apparition de l'insuffisance rénale. Certains inhibiteurs de transporteurs du tubule proximal montrent des effets néphroprotecteurs prometteurs dans de nombreuses maladies rénales chroniques. Aucun effet délétère majeur n’a été recensé suite à l’utilisation de ces traitements dors et déjà administrés à de nombreux patients souffrant de problèmes néphrologiques. Notre objectif est d'étudier les effets d’un traitement inhibiteur ciblant un transporteur du tubule proximal sur l’évolution de la maladie de Dent de type 1.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer l’effet d’un inhibiteur ciblant un transporteur du tubule proximal afin de ralentir l’évolution de la maladie de Dent 1, une pathologie conduisant à l’insuffisance rénale. Il n’existe pour le moment que des traitements symptomatiques de la maladie., en vue d’améliorer la fonction rénale des patients atteints par cette pathologie. En faisant appel à l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés, celui-ci aura un impact significatif sur la santé humaine car il permettra d’apporter une preuve de concept sur la capacité de ce médicament, déjà disponible sur le marché et donc prescriptible, à ralentir l’apparition de l'insuffisance rénale dans le cadre de la maladie de Dent.
Procédures
Un premier lot de souris recevra ou non un traitement dans leur nourriture en croquette. Ces souris ne changeront plus de régime alimentaire jusqu'à la fin de leur vie. A 4 mois, une mesure non invasive de composition de la masse corporelle sera effectuée en plaçant les souris dans un tube clos pour la mesure (environ 2 minutes). Ensuite, une mesure de la filtration rénale sera effectuée impliquant une anesthésie, la pose d’un capteur de fluorescence maintenu par un adhésif adapté, une injection intra-veineuse du traceur fluorescent (environ 10 minutes) puis un suivi sur animal vigile d’environ 2 heures. Après, ces souris seront placées en hébergement dans une enceinte spécifique permettant de prélever l’urine durant 5 jours (3 jours d’habituation et 2 jours de d'expérience). A l’issue de cet hébergement, un prélèvement sanguin de faible volume sera réalisé sur souris vigiles (environ 1 minute). Ensuite, les animaux seront soit euthanasiés (groupe 4 mois) ou retourneront en stabulation en attendant la prochaine phase d’analyse (groupe 10 mois). En effet, le groupe 10 mois, repassera par la même série d’analyses précédemment décrites à 7 mois et à 10 mois avant euthanasie et prélèvements. Un second lot de souris recevra ou non un traitement dans leur nourriture en croquette. Ces souris ne changeront plus de régime alimentaire jusqu'à la fin de leur vie. A 4 ou 10 mois, les organes seront récupérés après l’euthanasie effectué sous anesthésie et analgésie.
Impact sur les animaux
Les souris présentent un phénotype dommageable avec une diminution de la filtration rénale, une augmentation de l’excrétion de solutés tels que les protéines et le calcium, augmentation de la fibrose rénale. Toutefois, nous anticipons une amélioration progressive avec l’âge de la fonction rénale des animaux génétiquement modifiés et traités. Cependant, l’addition dans la nourriture de l’inhibiteur de transporteur du tubule proximal pourrait engendrer un léger stress des souris. Les souris seront hébergées en cage à métabolisme. Ce type d’hébergement peut générer des nuisances sur les animaux car ceux-ci sont hébergés, et ils se déplacent sur une grille métallique de surface réduite. A l’issue de leur hébergement en cage à métabolisme, les souris auront un prélèvement de sang sous-mandibulaire. Celui-ci est susceptible de causer une douleur de courte durée associée à la piqûre de l’aiguille, mais également une hémorragie. Par ailleurs, les souris seront anesthésiées pour la mesure de leur débit de filtration glomérulaire. Cette intervention est susceptible de générer une hypothermie et une détresse respiratoire. Enfin les souris seront placées dans un tube clos pour la mesure de la composition corporelle pouvant entraîner un léger stress le temps de la mesure de résonance nucléaire magnétique.
Devenir
L’ensemble des animaux devront être euthanasiés à 4 ou 10 mois pour permettre de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses.
Remplacement
Dans la mesure du possible, le remplacement des animaux pour des méthodes alternatives (par exemple des cellules en culture) est préférable. Toutefois, seules des études sur des animaux nous permettront de déterminer l’effet des traitements sur leur phénotype rénal (notamment les modifications des contenus urinaires et plasmatiques, les altérations histologiques et moléculaires des cellules rénales) en comparaison avec celui des animaux non traités.
Réduction
Ce projet a une durée de 5 ans, et nécessitera l’utilisation de 176 souris. La taille des effectifs est déterminée par notre expérience concernant ce type d’expérimentation que nous avons mené dans d’autres projets au laboratoire. Il sera par ailleurs nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats (ANOVA un ou 2 facteurs et test de student). Nous limiterons le nombre d’animaux en réalisant des expériences sur les mêmes animaux.
Raffinement
Durant leur hébergement en stabulation, les animaux auront un accès libre à la nourriture et à de l’eau filtrée, et seront placés dans des cages ventilées. L’environnement des animaux sera enrichi avec du nid végétal, des cylindres en carton, des bouts de bois et/ou des maisons. L'hébergement en cages à métabolisme sera lui aussi réalisé dans l'établissement utilisateur. Par ailleurs, la détermination quotidienne du poids, de l’apparence physique et du comportement des animaux durant leur hébergement en cages à métabolisme nous permettra de définir les points limites nécessitant une euthanasie de l’animal. De plus, la mesure de la filtration rénale sera effectuée sous anesthésie. Pour le prélèvement de leurs reins, les animaux recevront au préalable une anesthésie suivie d’une euthanasie. L’ensemble des expériences sera mené en présence de personnels hautement qualifiés dans des locaux d’hébergement respectant les standards en vigueur.
Choix des espèces
Nous avons choisi de mener nos expériences chez la souris, car seuls des modèles animaux nous permettront d’évaluer l’effet de cet inhibiteur de transporteur du tubule proximal visant à ralentir l’évolution de la maladie de Dent 1. Nous utilisons des souris mâles contrôles et transgéniques âgées de 4,7 et 10 mois afin d’évaluer l’effet du traitement sur l’évolution de la maladie.
Évaluation de l’efficacité d’un traitement contre les infections de prothèse aortique d’origine bactérienne par administration de virus ayant une activité antibactérienne
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Une première chirurgie de quatre-vingt-dix minutes pose une prothèse aortique et un cathéter central, l'infection à staphylocoque doré résistant s'installe, deux prises de sang par semaine suivent, puis viennent au quinzième jour une injection de virus antibactériens sous scanner et quinze jours d'injections quotidiennes. 24 porcs de dix semaines, pesant trente à trente-cinq kilos, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. La fièvre est attendue pendant toute la durée du protocole, avec perte d'appétit, fatigue et isolement, et le porteur mentionne des risques rares d'hémorragie ou d'obstruction artérielle. Tous sont tués au trentième jour lors d'une seconde chirurgie, le porteur jugeant "déraisonnable" de rétablir la continuité vasculaire pour les réveiller.
Objectifs
L’aorte, plus gros vaisseaux du corps humain, est sujette à de nombreuses pathologies, notamment les anévrismes, une dilation du vaisseau pouvant conduire à sa rupture, à l’origine de 15000 décès/an aux USA. Pour les traiter, le segment dilaté peut être remplacé par une prothèse en tissu. L’une des complications opératoires les plus fréquentes est une infection de cette prothèse vasculaire aortique (IPA). C’est une complication grave, qui peut être traitée en remplaçant la prothèse infectée et en associant une antibiothérapie. Cependant, 20% des patients sont non opérables et sont traités par une antibiothérapie au long cours seule. Ces patients présentent un risque élevé de mortalité. L’utilisation de virus capables de détruire une bactérie (phagothérapie) a montré son efficacité sur les infections bactériennes dans plusieurs études. Devant l’échec de l’antibiothérapie, il est apparu logique d’étudier l’efficacité de la phagothérapie dans les IPA. La sévérité des IPA est une problématique majeure en chirurgie vasculaire. La phagothérapie pourrait présenter un bénéfice majeur en élargissant les possibilités de traitements, et en représentant une alternative/un complément à l’antibiothérapie. Il s’agit du premier projet de recherche sur modèle porcin, évaluant la phagothérapie dans les IPA, et cherchant à proposer une nouvelle thérapie. Les résultats favorables de la phagothérapie dans d’autres infections et l’absence d’étude sur leur efficacité sur les IPA, ont conduit à mettre en place ce projet. Le modèle porcin se rapproche biologiquement le plus du modèle humain pour cette étude. Les objectifs de cette étude sont de valider les aspects techniques de l’administration de la phagothérapie dans notre modèle et d’évaluer l’efficacité de la phagothérapie seule ou associée aux antibiotiques. L'hypothèse principale est que la phagothérapie, dans les infections de prothèses aortiques, exerce une activité anti- infectieuse supérieure à l’antibiothérapie seule. L'objectif ultime est d'évaluer la phagothérapie seule ou associée aux antibiotiques dans les IPA chez des patients non opérables. Le transfert clinique en cas de résultats favorables paraît rapidement envisageable au vu de l’absence de traitement pour les patients.
Bénéfices attendus
Il s'agit de la première étude s'adressant à la phagothérapie dans les infections de prothèse aortique sur un modèle préclinique. L'objectif ultime est d'évaluer la phagothérapie seule ou associée aux antibiotiques en tant que traitement conservateur dans les IPA chez des patients inopérables, voire en tant que traitement adjuvant d’une chirurgie conservatrice. De plus, une application locale de phages est également envisageable chez l'homme, pour traiter les infections de prothèses aortiques par voie mini-invasive, c’est-à-dire libérées à l’intérieur d’un anévrysme pour l’exclure du flux sanguin. Le transfert clinique en cas de résultats favorables paraît rapidement envisageable vu le contexte pathologique de départ. Il s'agit de la combinaison d'un sujet extrêmement actuel, la phagothérapie à l’ère l'antibiorésistance, avec une pathologie sévère résistante aux traitements antibiotiques classiques. Le transfert clinique est aisément envisageable, vu le contexte pathologique.
Procédures
Tout d’abord, les animaux sont soumis à la chirurgie initiale de mise en place d’une prothèse aortique sous anesthésie générale. Celle-ci sera réalisée sur les 24 animaux avec une durée d’intervention de 90 minutes. La pose d’une voie veineuse centrale tunnelisee, sera effectuée sur tous les animaux au cours de cette chirurgie, permettant les prélèvements et l’administration de médicament. Des prélèvements sanguins seront réalisés chez les 24 animaux, sans anesthésie par le cathéter mis en place au cours de la chirurgie initiale. Ils seront effectués 2 fois par semaine, soit 8 fois au cours de la procédure. Un prélèvement sanguin dure en moyenne 15 minutes. Les animaux des groupes traités par phagothérapie, seule ou en association aux antibiotiques, soit 12 animaux, recevront une injection locale de virus à activité antibactérienne par ponction guidée par scanner. Cette injection aura lieu une seule fois au cours de la procédure (à J15), elle sera réalisée sous anesthésie générale et durera environ 45 minutes. Ils receveront également une injection intraveineuse de virus à activité antibactérienne. Cette injection se fera sans anesthésie à l’aide des cathéters, une fois par jour pendant 15 jours dès J15. Une injection dure en moyenne 5 minutes. Les animaux des groupes traités par antibiotiques, seules ou en association à la phagothérapie (12 animaux), recevront un traitement antibiotique par daptomycine. Cette injection se fera sans anesthésie à l’aide des cathéters, une fois par jour pendant 15 jours dès J15. Une injection dure en moyenne 5 minutes. La chirurgie finale sous anesthésie générale permettra le prélèvement de la prothèse et des tissus biologiques. Elle sera réalisée à J30 sur les 24 animaux, avec une durée attendue de 90 minutes.
Impact sur les animaux
Il existe des complications pendant la chirurgie : risque de saignement par lésion d’un vaisseau, risque de lésion des intestins et risque d'embolisation d'un caillot sanguin. Ces complications sont rares. La cicatrice abdominale est à l’origine de douleurs abdominales qui sont courantes, avec une durée attendue de 7 jours. Elle entraine également le risque d’une perte d’appétit avec retard à la reprise du transit, normalement de courte durée (24-48h). Suite à la chirurgie, il existe un risque de saignement post-opératoire, pouvant être lié à une lésion d’un vaisseau, un risque d'obstruction de vaisseaux des membres postérieurs par un caillot sanguin qui s'embolise. Ces deux évènements sont rares mais peuvent survenir pendant toute la durée de l’étude. Il existe un risque rare d’obstruction (embolisation) d'une des artères destinées aux intestins. Cet effet indésirable survient principalement en post- opératoire immédiat (24-48h). L’étude a pour but de créer une infection de prothèse aortique, ainsi une fièvre est attendue, effet qui peut être ressenti pendant toute la durée du protocole. La fièvre se traduit par une perte d’appétit, un ralentissement dans le comportement du porc à type de fatigue associée à un isolement. Pour chaque étape (chirurgie, prélèvements etc), il existe un stress lié à l’isolement de l'animal de ses congénères pour les manipulations. En post-opératoire immédiat, l’isolement se fait pour une durée de 24 heures, pour permettre le repos/la surveillance rapprochée de l’animal et éviter l'arrachage de points de suture.
Devenir
Il est prévu de mettre à mort les animaux à la fin du projet. Le but de cette mise à mort est de prélever la prothèse vasculaire posée initialement ainsi que les tissus biologiques entourant cette prothèse afin d’effectuer l’analyse bactériologique de la prothèse et des tissus biologiques (prélèvements aortiques au contact de la prothèse). Cela permettra également l’analyse histologique de tissus biologiques afin de comparer les degrés d’infection dans les groupes. Par ailleurs, en accord avec les recommandations des vétérinaires, la mise à mort est nécessaire afin d’éviter des nuisances et souffrances inévitables induites par l’ensemble de la procédure. Le rétablissement de continuité vasculaire par une autre prothèse dans ce contexte sceptique est jugé déraisonnable, étant donné les douleurs post- opératoires attendus et le risque attendu infectieux si l’animal était destiné à être réveillé.
Remplacement
Il n’existe aucune méthode de substitution permettant l’étude d’un traitement infectieux sur une infection bactérienne développé sur une prothèse vasculaire. En effet la prothèse vasculaire doit être dans des conditions d’analyses proches de l’humain, c’est à dire greffé à un tissu organique natif, soumis aux régimes hémodynamiques et sur un terrain susceptible de permettre le développement d’une infection bactérienne in vivo. Une prothèse aortique seule infectée par une culture de Staphylococcus aureus résistant à la méticilline, ex vivo ne reproduirait pas l’effet sur : les tissus périphériques, l’hémodynamique, l’impact sur l’organisme avec les aspects cliniques, et les modifications histologiques artériels. De plus l’objectif est d’évaluer l’efficacité de la phagothérapie au sein d’un organisme vivant et dont la physiologie est proche de l’homme. De nombreuses études ont été faite pour évaluer l’efficacité de la phagothérapie sur des souches bactériennes en cultures in vitro. De nombreuses études d’efficacité in vivo sur des modèles animaux ont permis de montrer l’efficacité de la phagothérapie sur des pathologies spécifiques. Notamment dans le traitement des infections pulmonaire à Pseudonomas aeruginosa chez des souris atteintes de mucoviscidose par phagothérapie, ainsi que dans le traitement d’infection de matériel orthopédique à Staphylocoque doré résistant à la méticilline. Il s'agit de la première étude visant à évaluer l’efficacité de la phagothérapie sur modèle vivant d'infection de prothèse aortique.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de résultats obtenus dans le cadre d'études antérieures. Le nombre de 24 animaux a été défini comme le nombre minimum d’animaux à utiliser pour mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Le nombre d’animaux « n » nécessaires à l’obtention d’une valeur statistique permettant de conclure à une supériorité de la phagothérapie, a été calculé à l’aide d’un test statistique. Il a été décidé lors de diminuer la sensibilité de notre test, c’est-à-dire la puissance statistique, afin de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Le test statique sera utilisé pour comparer les différences des charges bactériennes entre les groupes de traitement et de contrôle. Toutes les analyses statistiques seront effectuées à l'aide du programme statistique. Les choix des groupes expérimentaux et témoins, se sont fait en fonction de modèles expérimentaux préalablement étudiés. Dans les groupes témoins (sans traitement) nécessaires à la réalisation de l’étude, l’effectif a été réduit au strict minimum. Le travail en aveugle pour les injections (le manipulateur ne connait pas le produit qu’il administre, phagothérapie ou antibiothérapie) n’est pas possible, les voies d’administration étant différentes en fonction du traitement. Afin de diminuer le nombre de geste invasif sur l’animal, il ne semblait pas convenable de réaliser des injections placebo. Les analyses des critères infectiologiques, cliniques et biologiques seront effectuées en aveugles.
Raffinement
Une période d’acclimatation de 7 jours minimum est respectée, permettant l’habituation des animaux au contact et à la manipulation par du personnel expérimenté. L’hébergement des animaux est réalisé en groupes sociaux (contact visuel, olfactif, physique) sur litière de copaux. Les porcs sont hébergés globalement 1 par box mais les boxes communiquent entre eux. Les animaux seront 3 par groupes, pour éviter l’isolement. La nourriture est distribuée au sol afin de favoriser le comportement de fouissage ; Le contact est réalisé à minima 3 fois par jour, pour le change de la litière, la distribution de nourriture et d’eau. Les porcs sont ainsi habitués à la présence de l’Homme dans le box/l’environnement et à son contact (tête, dos...). Des morceaux de pommes et des caresses sont distribués comme récompenses. Quotidiennement sont observés la prise alimentaire et de boisson, le comportement de fouissage, l’absence de bagarre, le temps passé couché pendant la phase d’habituation. Ensuite, tout au long du protocole, la présence/absence de ces mêmes comportements sont observés. Sont contrôlés également l’abattement, la position voussée du dos, la réticence au déplacement pouvant indiquer par exemple une douleur abdominale, de la fièvre... Les animaux sont gardés dans une animalerie avec un cycle d’alternance jour/nuit de 12h/12h. Des jouets en plastique fixés au mur ou ballon en plastique au sol sont mis à disposition. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale gazeuse avec prémédication incluant anti-inflammatoire et opioïde pour la prise en charge de la douleur. Les animaux sont placés sur tapis chauffant tout au long de la chirurgie. En période post-opératoire, la douleur est prise en charge par des anti-inflammatoires, éventuellement associés à des opioïdes si besoin. Lors de la première chirurgie, un cathéter central sera mis en place pour limiter le nombre de piqûres et de gestes invasifs pour prélèvements sanguins. Les porcs sont surveillés de façon quotidienne au niveau du comportement et de la prise de la température. La surveillance hebdomadaire du poids sera également réalisée. Enfin des points-limites spécifiques et stricts à la fois pendant la procédure chirurgicale et pendant toute la durée du suivi ont été définis et seront appliqués.
Choix des espèces
Le modèle de l’infection de prothèse aortique chez le porc est utilisé dans cette étude. Sur le plan scientifique, c’est l’animal le plus utilisé dans les domaines de la recherche en chirurgie aortique, la majorité des techniques chirurgicales sont expérimentées sur le porc. Les mécanismes d’action, au sein de l’organisme, des produits de cette étude, l’antibiothérapie et la phagothérapie, sont proches de celles de l’homme. Le modèle d’infection de prothèse aortique à Staphylocoque (bactérie étudiée dans cette étude) chez le porc est un modèle qui a été standardisé et utilisé dans de nombreuses études expérimentales. Sur le plan technique, le porc se rapproche le plus de l’homme. En termes d’anatomie vasculaire et d’hémodynamique. La technique chirurgicale, le risque de traumatisme chirurgical et infectieux, sont strictement comparables. Sur le plan éthique, cette espèce est la plus susceptible de survivre à une infection sévère comme les infections de prothèses aortiques. Elle présente une résistance étudiée et connue à la chirurgie aortique, et à ses complications. Nous utiliserons le modèle de l’infection de prothèse aortique chez le porc (30- 35 kg). Ils sont âgés de 10 semaines au début du protocole. Le choix s’est orienté vers des porcs de poids peu élevés, et s’explique de plusieurs manières. En effet cela permet de faciliter la manipulation des animaux, et de diminuer ainsi le stress ressenti. Cela permet également de faciliter la chirurgie, avec des conditions anatomiques plus favorables, et donc un meilleur taux de succès chirurgical. L’injection du traitement sous-scanner est également facilité par le choix de porc de petite taille, afin d’être adapté à la taille de la machine.
Identification des mécanismes impliqués dans exacerbation de l’artériopathie oblitérante des membres inférieurs
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Neuf souris diabétiques sur dix auront un à cinq ongles nécrosés après la chirurgie qui leur coupe la circulation dans la patte arrière gauche. 2 240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour prélèvement d'organes, une partie recevant en plus quatre à cinq injections dans le ventre sur cinq jours consécutifs. L'objectif déclaré est de comprendre pourquoi l'artériopathie des membres inférieurs s'aggrave chez des patients souvent diabétiques, les nouvelles thérapies annoncées restant au stade de la perspective. Le porteur prévoit de prélever un maximum d'organes pour que ces souris servent aussi à des projets sur la démence, la néphropathie ou la rétinopathie.
Objectifs
L’ischémie critique des membres inférieurs est un problème de santé publique majeur dans les pays industrialisés ; son risque est accru par la proportion croissante de patients diabétiques ou obèses. Cette pathologie a un pronostic très sombre puisque, à un an, seule la moitié des patients survivent sans amputation majeure. Plusieurs essais thérapeutiques visant à favoriser le développement de nouveaux vaisseaux pour revasculariser le membre malade ont été réalisés mais sans succès. L’objectif de notre projet est de mieux comprendre les processus pathologiques conduisant au développement de cette maladie dans le but de proposer de nouvelles thérapies.
Bénéfices attendus
Mieux comprendre les mécanismes responsables de l'aggravation de l'artériopathie oblitérante vers le stade le plus grave de la maladie c'est à dire l'ischémie chronique menaçant le membre dans le but de proposer de thérapies pour les patients atteints de cette pathologie qui sont souvent diabétiques et qui sont aujourd’hui sans options thérapeutiques.
Procédures
Une partie des souris subiront une série de 4 ou 5 injections intrapéritonéales. Toutes les souris subiront une chirurgie de 10 minutes visant à induire une ischémie du membre inférieur gauche. Toutes les souris seront anesthésiées pour être soumises à des protocoles sans réveil.
Impact sur les animaux
Administration intrapéritonéales répétées (pendant 5 jours consécutifs) pour les souris trangéniques. Surpoids, polyurie, polydipsie pour les souris diabétiques Douleur post-chirurgicale, Nécrose des ongles des orteils (1 souris C57BL/6J sauvage/10 va avoir un ongle nécrosé suite à la chirurgie d'ischémie du membre inferieur. 9 souris diabétiques sur 10 vont avoir 1 à 5 ongles nécrosés suite à la chirurgie d'ischémie du membre inferieur).
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures dans le but de prélever des organes sur lesquels nous réaliserons des analyses post mortem.
Remplacement
L‘artériopathie oblitérante des membres inférieur est une pathologie complexe mettant en jeu des interactions diverses entre de nombreux types cellulaires locaux (fibres musculaire, cellules endothéliales, péricytes, fibroblastes) et circulants (cellules sanguines diverses). Etudier l’ensemble de ces acteurs et plus encore leurs interactions ne peut pas à l'heure actuelle être réalisé uniquement par des tests in vitro. Le recours à un organisme vivant proche de l’homme est donc nécessaire.
Réduction
Le nombre d'animaux a été calculé à l'aide d'un logiciel informatique: Pour avoir 90% de chance de mettre en évidence des différences significatives entre 2 groupes, le nombre de souris par groupe doit être 10. Ce chiffre est conforté par notre propre expérience et à celle de la communauté scientifique s'intéressant aux pathologies cardiovasculaires, 10 animaux par lot et par analyse sont nécessaires pour obtenir des résultats exploitables statistiquement aussi bien pour les mesures de l'irrigation sanguine et les analyses histologiques. Pour réduire le nombre d'animaux, aucune expérience déjà publiée ne sera reproduite. Les manipulations seront réalisées par du personnel technique entrainé de façon à réduire la variabilité des résultats donc le nombre d'animaux nécessaires. Les animaux des groupes "contrôles", traités de façon identiques, mais inclus dans différentes procédures seront dès que possible utilisé dans plusieurs "expériences ou procédure". Le nombre de souris nécessaires à la réalisation de ce projet sera ainsi réduit. Le premier objectif de ce projet est de mieux caractériser la physiopathologie de l'ischémie chronique des membres inférieurs, cependant nous prévoyons de prélever un maximum d'organes pour réutiliser ces souris dans des projets s'intéressant notamment à la physiopathologie d'autres pathologies micro vasculaires comme la démence, la néphropathie, la rétinopathie.....
Raffinement
L’hébergement des animaux sera réalisé dans des conditions qui limiteront le stress et l’inconfort (animalerie agrée, personnels formés, cage de 3 à 6 animaux maximum en portoir ventilé avec libre accès à l’eau et à la nourriture ainsi qu’un environnement enrichi avec igloo cartonné et serpentins de papier à dérouler). La souffrance des animaux sera réduite par l'usage d'anesthésiques et d'antalgiques adaptés pour la réalisation des gestes douloureux et la mise en place de points limites. D'autre part, les animaux seront surveillés quotidiennement par le zootechnicien, le responsable du bien-être animal ou l'expérimentateur. Dès le début des expérimentations, une fiche de suivi « bien-être » sera créée. Le bien-être des animaux sera alors gradé ce qui permettra d'apporter dans les plus brefs délais la mesure adaptée à l'animal.
Choix des espèces
La souris est un modèle de mammifère à sang chaud dont l'organisation structurale du réseau vasculaire a de forte ressemblance avec celui de l'homme. Par ailleurs, il existe dans cette espèce des individus présentant des mutations spontanées prédisposant au diabète de type 2 (facteur de risque cardiovasculaire). Aussi, il existe des souris transgéniques permettant d'invalider certains gènes d’intérêt. Des souris adultes âgées de 8 semaines (début du protocole) à 6 mois (fin du protocole) seront utilisées. Notre objectif n'est pas d'étudier des processus développementaux mais des processus physiopathologiques. Pour être sûr de ne pas induire de phénotype lié à une anomalie du développement. L'invalidation de nos gènes d'intérêt sera induit chez des animaux âgés d'au moins 8 semaines.
Modulation des niveaux de BIN1 et DNM2 dans le traitement de la maladie de Charcot-Marie-Tooth
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
La queue plongée dans un bain-marie jusqu'à vingt secondes, les pattes posées sur une plaque chauffée jusqu'à trente secondes, la queue tirée par l'expérimentateur pour mesurer la force d'agrippement, la course sur tapis roulant puis sur cylindre rotatif : 720 souris passeront cette série de tests à six mois puis à un an. 1 246 souris modèles de la maladie de Charcot-Marie-Tooth vont être utilisées au total, 1 104 d'entre elles dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour analyse histologique. 584 reçoivent une injection de virus adéno-associés entre le premier et le vingt et unième jour après la naissance, et des femelles sont isolées une semaine pour que leurs ultrasons soient enregistrés. Le porteur écrit que ces lignées ne présentent aucun signe de douleur ni incapacité locomotrice, alors qu'il déclare lui-même 1 104 souris en gravité sévère.
Objectifs
Le but de ce projet est de développer une stratégie thérapeutique pour la maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) en utilisant des modèles souris. La maladie se manifeste au début de l’enfance par une faiblesse musculaire distale, une perte sensorielle et un déficit de coordination évoluant vers une incapacité motrice chez les patients adultes. La CMT est caractérisée par des repliements complexes des gaines de myéline qui entourent et isolent les fibres nerveuses et une vitesse de conduction nerveuse réduite. Ces caractéristiques sont retrouvées chez les modèles souris de la CMT. Le but de notre étude est d'utiliser ces souris et de moduler l'expression de deux gènes impliqués dans une voie de signalisation associée à la CMT pour tenter d'atténuer les symptômes associés aux anomalies de la myéline. Nous réaliserons cette modulation par des techniques de croisement génétique ainsi que par l'injection de virus adéno-associés couramment utilisés dans la recherche médicale.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de mieux comprendre quelle(s) voie(s) de signalisation sont impliquée(s) dans le dévelopement de la CMT. Une meilleure connaissance des processus moléculaires permettra de mieux comprendre la maladie et potentiellement de proposer de nouvelles thérapies plus ciblées.
Procédures
Pour réguler l'expression des gènes impliqués dans la voie de signalisation étudiée dans notre équipe, une partie de nos animaux (584 sur 1246) sera injectée (durée d'injection de quelques secondes) avec des virus adéno-associés entre le 1er et le 21ème jour après la naissance A soix mois et à un an, 720 souris (dont 360 injectés avec des virus adéno-associés) seront soumises à une série de tests comportementaux pour évaluer la force musculaire, la coordination motrice, la sensibilité, ainsi que la conduction nerveuse. Pour évaluer la force musculaire, les souris sont placées sur la grille d'un dynamomètre et la force d'agripement sera mesurée. Pour évaluer la coordination motrice, les animaux se déplaceront sur un tapis roulant et sur un cylindre rotatif. Pour évaluer la sensibilité, les queues des souris seront mises dans un bain-marie et la latence d'enlèvement de la queue sera mesurée avec une durée limite du test de 20 secondes. Les animaux seront également placés sur une plaque chauffée et la latence de réaction sera notée avant de sortir l'animal avec un temps limite de 30 secondes.Pour évaluer la conduction nerveuse, la mesure de l'activité électrique musculaire des animaux se fera sous anesthésie générale. Amendement. Nous isolerons les femelles pendant 1 semaine puis nous les mettrons en contact avec des femelles wt plus jeunes pendant 10 minutes durant laquelles nous mesurerons les ultra-sons émis par les animaux isolés.
Impact sur les animaux
Dans cette étude, nous utiliserons trois lignées de souris modèles de la maladie de Charcot-Marie-Tooth dont les caractérisations ont déjà été effectuées et les animaux ne présentent aucun signe de douleur et aucune incapacité locomotrice. Au vu des phénotypes observés chez les animaux modèles âgés (et donc montrant un pourcentage plus important des repliements de la myéline), nous n’anticipons pas que nos modulations d'expression des gènes de la voie de signalisation étudiée n'engendre de phénotypes plus grave qu’une diminution de la coordination motrice. Nous effectuerons néanmoins une étude des phénotypes dommageable sur ces animaux. Les nuisances ou effets indésirables causés par les différents tests phénotypiques sont les suivants : pour la mesure de force musculaire, l’expérimentateur tire progressivement la queue de l’animal agrippé sur la grille du dynamomètre afin d’obtenir la force développée par la souris. Pour la coordination motrice, le fait de se déplacer sur un cylindre rotatif surelevé engenre du stress physique chez l'animal. Pour les tests de sensibilité, la chaleur ressentie par l'animal engendre un stress physique. L’électromyographie sera réalisée sous une anesthésie générale. La chirurgie pour l’injection de virus adéno-associés au niveau du nerf sciatique sera réalisée sous une anesthésie générale, une antalgie en sous-cutané et en local sera réalisée avant et après la procédure. Amendement. Pour les tests de vocalisation, l'isolement des animaux pendant 1 semaine provoquera un stress de classe modérée mais l'isolement est le seul moyen de stimuler la vocalisation des femelles avant de faire le test.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin des procédures pour prélèvements d'organes pour des études histologique.
Remplacement
Le modèle souris étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, il nous permettra d’étudier d’une part la physiopathologie de la maladie de Charcot-Marie-Tooth et d’autre part de mieux comprendre les voies de signalisation impliquée dans le développement de cette myopathie. De plus, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation de la force musculaire, de la coordination motrice et de la conduction nerveuse seraient impossibles à évaluer. Une étude sur culture de cellules mutantes ne peut être envisagée car les symptomes décrits ne se développeraient pas et la caractérisation du modèle serait alors impossible.
Réduction
Les études histologiques et procédures expérimentales seront réalisées avec un nombre d’animaux qui sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante. Nos connaissances sur les modèles murins et les études réalisées sur d’autres thérapies montrent que 8 souris par groupe pour l'étude de phénotypes dommageables et 15 souris par groupe pour l'étude comportementale seront nécessaires pour obtenir une étude concluante avec des tests statistiques adéquats. Une première étude pilote sera réalisée à 6 mois avec un nombre réduit d'animaux. Nous effectuerons ensuite une étude de phénotypes dommageables et une étude histologique (8 animaux par groupe) à six mois. Nous réaliserons finalement une étude comportementale à 6 mois et 1 an tout en effectuant une étude histologique à 1 an (15 animaux par groupe).
Raffinement
Si des difficultés de locomotion apparaissent, de la nourriture sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupe de 2 à 5 par cage et la qualité de l’air sera assurée par une ventilation. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration, l’abaissement des paupières et l’apparition d’une cyphose. Pour le nouveau-né, la souffrance sera évaluée visuellement : capacité à se retourner, couleur de la peau, capacité à se mouvoir. À partir du sevrage, une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole. La pesée des animaux sera réalisée 3 fois par semaine (lundi, mercredi et vendredi). En cas de douleur, et particulièrement après les injections intrathécales et intracérébroventriculaires, un analgésique pourra être administré et l’étude pourra être prématurément stoppée. La douleur sera évaluée à l'aide d'un score. L'étude sera stopée prématurément si nécessaire pour éviter des douleurs aiguës pendant de longues périodes.
Choix des espèces
Afin d’évaluer et de comprendre les mécanismes moléculaires aboutissant à la maladie de Charcot-Marie-Tooth, nous avons besoin d'effectuer des expériences physiologiques in vivo. Ces mesures ne peuvent pas être réalisées sur d'autres espèces évolutivement plus éloignées de l’homme car la structure des nerfs est trop différente. D'une part, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l'ensemble de l'organisme et l'évaluation sur le bénéfice de la structure des fibres nerveuses, de la coordination motrice, de la sensibilité et de la vitesse de conduction nerveuse seraient impossibles à évaluer. D'autre part, une étude sur culture de cellules ne peut être envisagée car le phénotype pathologique ne se développe pas et le bénéfice sur les paramètres décrits ci-dessus ne peut être mesuré. Pour moduler l'expression des gènes de la voie de signalisation étudiée dans notre équipe, nous injecterons des virus adéno-associés chez des animaux âgés entre 1 et 21 jours selon la voie d'administration choisie pour cibler les cellules de Schwann avant l'apparition des symptomes. Les défauts de myélinisation s'aggravent avec l'âge des animaux modèles de la maladie de Charcot-Marie-Tooth. Nous voulons donc réaliser une première étude histologique à 6 mois, âge auquel 10% des fibres présentent des défauts de myéline chez les animaux modèles de la CMT. Nous réaliserons ensuite une étude comportementale suivie d'une étude histologique à 12 mois, âge auquel les animaux modèles de la CMT présentent des déficits de coordination motrice et de vitesse de conduction nerveuse.
Etude de la cardioprotection au cours de l’infarctus en ciblant la voie extrinsèque de l’apoptose. Influence du sexe et des hormones femelles
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Commandées chez un fournisseur à 7 ou 11 semaines pour subir un infarctus entre 12 et 14 semaines, 2 595 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 1 611 d'entre elles et sévère pour 984, toutes tuées pour prélèvement du cœur. Une ligature d'artère coronaire suivie de reperfusion leur provoque l'infarctus, certaines femelles subissant en plus une ovariectomie, la pose d'un implant hormonal et deux frottis vaginaux, dont l'un sur animal vigile. Les protocoles longs ajoutent cinq prélèvements sanguins sur animal vigile et quatre échocardiographies d'une demi-heure sous anesthésie. Sur la réduction, le porteur indique que l'analyse statistique se fera au fil des expériences afin d'arrêter d'inclure des animaux dès que la différence devient significative.
Objectifs
Le seul traitement pour sauver un patient lors de l’infarctus du myocarde est de réouvrir l’artère occluse le plus rapidement possible. Cependant, malgré des effets bénéfiques immédiats associés à l’arrêt des lésions d’ischémie, la reperfusion induit des effets indésirables, appelés lésions de reperfusion, du fait du retour brutal du sang oxygéné dans le muscle cardiaque ischémique. Il est admis que le taux de mortalité précoce (30 jours post-infarctus) est plus élevé chez les femmes que les hommes. Bien que le rôle des hormones sexuelles au cours de l’infarctus soit loin d'être univoque, de nombreuses données suggèrent que les hormones sont impliqués dans les différences liées au sexe au sein des maladies cardiovasculaires et ont été montrées cardioprotectrices. Il est essentiel de mener des recherches expérimentales pour mettre au point des stratégies thérapeutiques spécifiques aux femmes. Nous avons montré que la voie des récepteurs de mort joue un rôle crucial dans les lésions de reperfusion. Des travaux de la littérature montrent chez des femelles ovariectomisées des lésions d’infarctus plus sévères et suggèrent un lien entre hormones et mort cellulaire. Nous avons développé des stratégies thérapeutiques permettant de bloquer cette cascade de mort cellulaire au cours de l’infarctus et de la reperfusion. L’objectif de notre projet sera donc d’évaluer l’efficacité de ces stratégies thérapeutiques dans le cœur de souris femelles au cours de l’IR myocardique et d’étudier l’influence des hormones sur la mort cellulaire à court et long termes.
Bénéfices attendus
A ce jour, il n’existe aucun traitement pharmacologique disponible pour traiter les lésions de reperfusion au cours de l’infarctus. Les études jusqu’à présent n’ont considéré que de jeunes animaux de laboratoire (jeunes adultes de 8 à 12 semaines) et en majorité des mâles afin de s’affranchir de l’influence des hormones femelles qui sont décrites comme cardioprotectrices. Ce projet permettra une meilleure connaissance de la physiopathologie de l’infarctus dans le cœur de femelles, afin de pouvoir développer et de tester des stratégies thérapeutiques pour le sexe féminin, répondant à un besoin sociétal actuel compte tenu de la recrudescence des cas observés les 15 dernières années. De plus, ce projet sera le premier à étudier l’implication de la mort cellulaire dans les cœurs de souris femelles au cours de l’infarctus et sa dépendance au statut hormonal ainsi que dans l’insuffisance cardiaque post-infarctus. Puis, ce sera également la première évaluation de l’effet cardioprotecteur des nos molécules thérapeutiques dans le cœur féminin . Ce projet devrait permettre de réussir la translation vers la clinique en permettant notamment de développer un traitement de l'infarctus, destinés aux patients (2ème cause de mortalité masculine) et à des patientes (1ère cause de mortalité féminine devant le cancer du sein) à risque d’infarctus.
Procédures
In vivo court terme : 3 injections de produits anesthésiants + 1 chirurgie sous anesthésie ; 1 injection létale et 1 prélèvement sang total et cœur (10 min) In vivo court terme avec réveil : 3 injections de produits anesthésiants; 1 chirurgie sous anesthésie (selon procédure de 1h10 à 1h30) + 1 injection létale et 1 prélèvement sang total et cœur (10 min). 3 prélèvements sanguins sur animal vigile In vivo long-terme avec réveil: 5 injections de produits; 1 chirurgie sous anesthésie + 5 prélèvements sanguins sur animal vigile + 4 échocardiographies sous anesthésie gazeuse (30 min chacune) + 1 injection létale + 1 prélèvement sang total et cœur (10 min). * en plus pour les femelles: 1 frottis vaginal sur animal vigile et 1 frottis vaginal sous anesthésie . Quand ovariectomie : chirurgie sous anesthésie gazeuse (30 min); 5 injections de produits, 1 Pose d’implant (10 min);
Impact sur les animaux
- Pour le frottis vaginal, les souris subiront l'inconfort de la contention et du geste gynécologique. - Pour le protocole in vivo d’échographie, les animaux subiront le stress de la préhension par l’expérimentateur puis ils auront une anesthésie gazeuse avec une première phase d’induction le stress sera de courte durée à l’endormissement et au réveil. - Pour l’ovariectomie et la mise en place d’implants, outre le stress de préhension qui sera de courte durée avant l’anesthésie gazeuse, les animaux subiront des douleurs post-chirurgicales qui seront gérées par des antalgiques lors des phases de réveil. - Pour le protocole de chirurgie d’ischémie-reperfusion myocardique, les animaux subiront un stress lié à la contention et une douleur légère de courte durée à l’injection intramusculaire d’anesthésiques ainsi qu’un inconfort lié aux sutures. Les douleurs post- chirurgicales seront gérées avec des analgésiques. - Prélèvements sanguins : procédure réalisée sur animal vigile non anesthésié, ce qui peut constituer un stress et une douleur légère.
Devenir
L'analyse de la cardioprotection nécessite de prélever le coeur en fin de protocole expérimental et donc de mettre à mort chaque souris incluse dans ce projet.
Remplacement
Il n’y a pas d’alternatives non-animales disponibles pour ce projet. Dans le cadre du développement d’un médicament, la cardioprotection par les peptides thérapeutiques doit se mesurer à la fois en terme d’effets vasculaires et musculaires et par conséquent sur cœur entier. Les expériences in vivo à court terme permettent d’évaluer s’il y a bien un ciblage des outils pharmacologiques développés dans le tissu cardiaque après une injection intraveineuse en aigu. Les expériences in vivo avec suivi à long terme, permettent de mimer ce qui se passe dans la condition clinique chez les patients et donc d’évaluer l’effet de la molécule à long terme sur le tissu cardiaque tout en considérant la métabolisation et l’élimination des molécules mimant la situation clinique.
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux, et dans la mesure du possible, plusieurs mesures seront faites sur chaque individu : échographie, dosage marqueurs sériques, analyse de la cicatrice d’infarctus par histologie. Ensuite concernant les tests statistiques : prévision à priori du nombre de souris afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Les nombres de souris à inclure dans les groupes de traitement ont été définis à priori afin de garantir des résultats statistiquement significatifs avec un nombre minimal d’animaux. Pour les expériences comprenant une ligature de coronaire, un groupe Sham d'animaux (protocole complet sauf ligature) sera inclus en réduisant à n=6 souris pour chaque contingent. Ensuite, l’analyse statistique permettra de faire les comparaisons statistiques. Elle se fera au fur et à mesure des expériences afin d’arrêter d’inclure des animaux dès que la différence est significative.
Raffinement
- Conditions d’hébergement : les cages de stabulation sont enrichies (maisons en cartons) pour limiter le stress. - Chirurgie cardiaque : les protocoles ont été optimisés de manière à ce qu’ils soient le moins invasifs possible. Il est important de noter que l'utilisation de substances anesthésiques permet de limiter la souffrance des animaux pendant les procédures. - La phase de réveil permettra une récupération optimale de l’animal : réchauffement, oxygénothérapie et hydratation (poche sous-cutanée de sérum physiologique injectée dès la dernière phase de la chirurgie) et hygrométrie contrôlée. Une feuille de suivi avec grille de scores et points limites sera mise en place. - L’échographie transthoracique et l’injection d’implants sous- cutanés sont réalisées sous anesthésie gazeuse. - Pour l’ovariectomie, l’anesthésie gazeuse est complétée par l’injection d’analgésique.
Choix des espèces
L’espèce Mus musculus a été choisie pour développer les modèles d’étude de l’équipe. Les raisons sont : - Les résultats obtenus par l’équipe montrent que ce modèle est proche de l’Homme : par exemple, le Post- conditionnement ischémique est une technique cardioprotectrice qui fonctionne aussi bien chez la souris que chez l’Homme (ce n’est pas le cas pour le rat). - De plus, l’Homme et la souris possèdent 99% de gènes homologues donc le choix de la souris est très avantageux pour une étude qui permet d’étudier les effets d’une molécule qui sera développée en thérapeutique ; - Petite taille et faible prix des animaux ; - Les conditions d’hébergement compatibles avec celles proposées par l’Institut où seront réalisées les expériences. Les animaux femelles : les femelles jeunes qui seront ovariectomisées seront commandées à 7 semaines et subiront un infarctus entre 12 et 14 semaines. Pour les femelles jeunes non ovariectomisées : elles seront commandées à 11 semaines et subiront un infarctus entre 12 et 14 semaines. Les animaux mâles : seront commandés chez le fournisseur à 11 semaines pour être utilisés entre 12 et 14 semaines pour les animaux mâles jeunes.
Traitement du syndrome gastro-intestinal radio-induit par thérapie cellulaire chez le porc miniature (EU 2/2)
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Tous mis à mort trente jours après l'irradiation, pour prélever leur intestin et en examiner la réparation, 22 porcs miniatures vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Sevrés depuis peu et pesant cinq à sept kilos, ils subissent une irradiation abdominale sous anesthésie, un prélèvement chirurgical de graisse, huit prises de sang et un transport entre deux établissements. Les symptômes attendus vont des crampes abdominales et des vomissements aux diarrhées hémorragiques et à la fièvre, le porteur indiquant que l'apparition des diarrhées signale des dommages sévères. Il situe le projet dans un contexte d'accident nucléaire ou d'"acte de malveillance" et invoque un "besoin crucial" de traitement d'urgence.
Objectifs
Ce projet se déroule sur 2 établissements. Il a pour objectif de proposer un nouveau traitement par thérapie cellulaire utilisant un produit issu de la graisse en cas de syndrome gastrointestinal (consécutif à une rupture de la barrière intestinale) induit par l’irradiation à la fois pour le militaire ou la population victime lors d’une urgence radiologique, d’un accident nucléaire ou d’un acte de malveillance. Ce traitement est basé sur l’injection d’un produit de thérapie cellulaire la «fraction vasculaire stromale (SVF)» obtenue par digestion de la graisse issue de lipoaspiration. Ce produit est une source riche en cellules de renouvellement, et facile et très rapide d’accès. Actuellement la prise en charge du syndrome gastrointestinal (SGI) ne reste que symptomatique. La rapidité d’apparition des premiers symptômes dépend de la vitesse de renouvellement des cellules constituant les tissus lésés mais aussi de la radiosensibilité des cellules souches. Chez l’homme, les doses supérieures à 6 Gy (Gray, unité de la dose délivrée) sur un large volume d'organes touchés induisent principalement une destruction de la moelle osseuse et des lésions gastro-intestinales, entraînant diarrhée, déshydratation, septicémie, hémorragie intestinale engageant le pronostic vital dans les 10 à 15 jours après l'exposition. Il existe un besoin crucial de mesures thérapeutiques efficaces et rapides pour la gestion du SGI. Il a été démontré que l’injection de la SVF avait un bénéfice thérapeutique objectivé sur plusieurs paramètres (reprise de poids, restauration de la barrière intestinale) et amélioration de la survie chez Ia souris. Ce projet est en synergie avec les nouvelles stratégies en termes de santé, à savoir l’utilisation de produit de thérapie cellulaire à des fins de régénération tissulaire. La SVF d’obtention rapide et ne nécessitant pas de temps de culture cellulaire préalable à son injection est actuellement en essai clinique et est compatible pour le traitement d’urgence dans les 24 heures après l’irradiation. L’objectif de ce projet est de valider l’efficacité thérapeutique de la SVF sur le cochon pour un passage en clinique.
Bénéfices attendus
La preuve de concept a été établie que l’injection de cette thérapie cellulaire chez la souris atteinte de syndrome gastrointestinal améliorait la survie des souris de 80%. Actuellement de nombreux essais cliniques utilisant la SVF sont en cours (osteoartrite, diabète de type 2, maladie de Crohn...). Face à l’enjeu géopolitique (contexte d’accident nucléaire ou acte de malveillance) l’objectif de ce projet est de progresser vers la clinique pour le traitement en urgence du SGI.
Procédures
Sous anesthésie générale, seront réalisés : ->dans l'établissement utilisateur EU 1 : - une prise de sang à J-4 avant irradiation puis à J1, 3, 7, 10, 15, 21, et 30 soit 8 prélèvements (temps de prélèvement entre 5 et 10 min). - une chirurgie de prélèvement de graisse (temps de procédure 20min) suivi de l'injection de SVF (cellules issues de la graisse, 10 min. - des injections d'antibiotiques sont réalisées tous les 3 à 5 jours, au besoin, de préférence lors d'une intervention sous anesthésie générale, ou sur animal vigile. -> dans l'établissement utilisateur EU 2 : - une irradiation, une seule fois pour une durée de 10 min sous anesthésie générale. - un unique examen endoscopique de 30 min, au cours de cette même anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Les cellules de la moelle osseuse sont détruites chez l'Homme pour des doses d'irradiation comprises entre 2 et 6 Gy et conduisant à un défaut d'immunité, défaut de production de plaquettes et de globules rouges. Le syndrome gastro-intestinal survient pour des doses supérieures à 6 Gy (corps entier). Les symptômes majoritaires sont des crampes abdominales et des diarrhées ainsi que des nausées et des vomissements. Des céphalées peuvent également apparaître. L’apparition des nausées, de la fatigue, des crampes abdominales, des vomissements est attendue entre 1 et 3 jours après l'irradiation. L’apparition des diarrhées indique des dommages sévères et peuvent engager le pronostic vital. De 1 à 6 semaines après l’exposition, peuvent survenir d’abondantes diarrhées hémorragiques, de la fièvre, des infections ou septicémies.
Devenir
Tous les porcs sont mis à mort à la fin du protocole à J30 post-irradiation pour des prélèvements tissulaires post-mortem d’intestin pour un examen de la réparation intestinale.
Remplacement
Le passage à la clinique nécessite des animaux autres que le modèle rongeur. Il a été montré que la physiopathologie du syndrome gastro-intestinal sur le porc est similaire à celle observée chez l’homme. La production de cellules issues des tissus graisseux (pour la production du traitement cellulaire) en quantité suffisante est un paramètre limitant, le choix s’est porté sur le miniporc qui est un porc de taille réduite permettant l’injection de cellules en concentration compatible avec leur préparation au sein d’un laboratoire de recherche. Le passage de cette étude en clinique nécessite d’utiliser des modèles in vivo. Le remplacement par des modèles in vitro n’est donc pas possible.
Réduction
Pour atteindre la pertinence statistique, les groupes des miniporcs irradiés et traités par la thérapie cellulaire sont classiquement constitués de 6 à 7 individus pour pallier les variabilités inter-individus des animaux et également de la thérapie cellulaire injectée et pour éviter ainsi d’avoir à renouveler plusieurs fois l’expérimentation. Le nombre d’animaux choisi pour ce protocole est nécessaire et suffisant pour exploiter d’un point de vue statistique les résultats obtenus. Les cochons seront leur propre donneur de graisse, étant donné que les injections de SVF ne peuvent se faire qu’en autologue dû à la présence de cellules immunitaires, ce qui limite le nombre de cochon. Des mesures de la numération formule sanguine seront effectuées à J-4 avant l’irradiation afin d’avoir des valeurs sanguines des cochons avant tout traitement.
Raffinement
Les cages d’hébergement seront enrichies en objets (balles en plastique au sol et au mur). Les paramètres d'ambiance dnas les hébergements sont contrôlés. Les animaux seront anesthésiés pour les interventions (irradiation, prélèvements sanguins) et mis à mort selon la réglementation en vigueur. Des points limites sont définis et seront appliqués pour mettre fin dans les délais les plus brefs à toute anomalie, toute douleur, toute souffrance, toute angoisse ou tout dommage durable qui pourraient être évités tout au long des procédures expérimentales. Les animaux seront acclimatés pendant 2 semaines (habituation à la présence et au contact de l’Homme lors du change des boxes, distribution de caresses et de morceaux de pomme), puis transférés dans des cages de transport avec tapis mou, par un transporteur autorisé sous anesthésie générale en voiture climatisée pour la procédure d’irradiation. Les porcs sont surveillés pendant toute la durée du transport (maximum 45 min). Puis ils retournent dans leur hébergement dans les mêmes conditions de transport (temps transport/irradiation estimé à 3 heures). Une surveillance quotidienne pendant toute la durée de l’expérimentation sera effectuée par les techniciens animaliers et basée sur la prise alimentaire, la présence des troubles digestifs (diarrhée), de la posture et du comportement (animal prostré) : - Pesée des animaux toutes les semaines pendant la durée de l’expérimentation - Les signes de douleur/stress sont définis comme une réduction de la consommation alimentaire et/ou la présence de troubles digestifs et déshydratation, modification des signes locomoteurs (prostration, ne pas remuer la queue, manque de curiosité, changement dans le schéma de vocalisation normal au toucher). Si au cours de l’expérience un animal montre des signes caractéristiques de souffrance, il sera retiré de l’expérimentation et mis à mort. Lors des procédures sous anesthésies, les animaux sont suivis par monitoring cardiaque et respiratoire. Afin de palier à tout risque d’infection lié aux prises de sang et moelle osseuse les cochons reçoivent un antibiotique par voie intramusculaire à chaque intervention sur l'animal. De plus afin de palier au risque de vomissements lié à l’irradiation abdominale un médicament anti-vomissement sera donné avant l’irradiation.
Choix des espèces
Le passage à l’étape clinique nécessite des animaux de grande taille. Les signes cliniques du syndrome gastrointestinale sur le porc de taille réduite (de type miniporc) seront ceux observés chez l’homme. De plus le choix s’est porté sur le miniporc qui est un porc de taille réduite permettant l’administration de cellules en concentration compatible avec la capacité de leur production. Les animaux seront pris après sevrage (soit 2 mois post naissance). Etant donné que le nombre de cellules à greffer est fonction du poids de l’animal, il faut donc des animaux le plus jeune possible avec un poids proche de 5-7 kg environ pour pouvoir greffer environ 10 millions de cellules (quantité compatible avec la production à partir du prélèvement de graisse).
Evaluation de l’effet de différents traitements contre l’état de mal épileptique chez le jeune rat
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
1 100 rats juvéniles, âgés de 21 à 45 jours, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à la fin pour prélèvement d'organes. Des convulsivants leur provoquent un état de mal épileptique pouvant durer jusqu'à quatre heures, 360 d'entre eux subissant en plus une chirurgie d'implantation d'électrodes crâniennes d'une heure, et jusqu'à vingt-deux gavages ou injections quotidiennes selon les groupes. L'isolement de deux à vingt-quatre heures pendant l'enregistrement des crises figure lui aussi parmi les nuisances déclarées, et les rats dont l'état de mal dépasse deux heures après administration des produits sont tués par surdose d'anesthésique. Sur le remplacement, le porteur affirme que les méthodes in vitro ne reproduisent pas les propriétés des crises dans un "cerveau entier" et que la modélisation informatique manque encore de données.
Objectifs
Ce projet va permettre d’évaluer l’efficacité de traitements (pharmacologiques et probiotiques) sur 1) la terminaison de l’état de mal épileptique (status epilepticus) dans un premier modèle, et 2) la prévention de ce status epilepticus dans un deuxième modèle, chez des rats jeunes. Le status epilepticus est défini par une crise prolongée (plus de 5 min). Bien que la plupart des patients répondent bien aux benzodiazépines (médicament donné en première intention), certains patients sont réfractaires (35%) et nécessitent d’autres traitements. Nous proposons ici d’étudier les effets de différents traitements et différentes voies d’administration (orale, intrapéritonéale et intraveineuse) dans 2 modèles de status epilepticus, en commençant par une analyse comportementale, puis, après confirmation des doses effectives, par analyse électroencéphalographique (EEG).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’identifier de nouveaux traitements anti-épileptiques pharmacologiques et/ou probiotiques efficaces dans la terminaison et/ou la prévention de l’état de mal épileptique. Le but est de proposer ces traitements chez l’enfant, soit pour prévenir de l’état de mal épileptique, présent dans de nombreux syndromes épileptiques, dont le syndrome de Dravet ; soit pour terminer un état de mal épileptique afin d’éviter la survenue d’altérations neurologiques. L’état de mal épileptique prolongé (réfractaire aux traitements actuels) touche 1 tiers de patients épileptiques et peut avoir des conséquences délétères pour le cerveau, voire entrainer la mort des patients.
Procédures
- Injection sous-cutanée : animal vigile, 1 fois pour tous les 1100 animaux, et au moins 2 fois pour les 360 animaux qui subiront une chirurgie. - Injection intrapéritonéale : animal vigile, 1 fois ou 2 fois pour 378 animaux respectifs ; et 6 fois (1 fois/jour) ou 22 fois (1 fois/jour) pour 86 animaux respectifs. - Injection intraveineuse : animal vigile, 1 fois pour 378 animaux. - Gavage oral : animaux vigiles, 6 fois (1 fois/jour) ou 22 fois (1 fois/jour) pour 86 animaux respectifs. - Chirurgie d’implantation d’électrodes EEG : anesthésie générale (une fois par animal) et analgésie (en tout 3 ou 4 injections sous-cutanée), 360 animaux, durée de la chirurgie maximum 1h. Ces procédures seront effectuées par du personnel expérimenté pour limiter le stress de l’animal.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont : 1) Une survenue d’un état de mal épileptique (d’une durée maximale de 4h) 2) un stress et une douleur dus à l’administration des convulsivants (PTZ et pilocarpine) 3) un stress et une douleur dus à l’administration aigue ou chronique des traitements proposés 4) un stress du à la chirurgie pour l’implantation d’électrodes (procédures 2 et 4) 5) un stress dû à l’isolement (de 2h à 24h) pendant les périodes d’enregistrement des crises Les traitements seront effectués par une personne expérimentée pour limiter le stress des animaux.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin d’effectuer des prélèvements d’organes, pour compléter cette étude.
Remplacement
L’utilisation d’animaux est justifiée car: (1) Les modifications cérébrales induites par les crises ne peuvent être étudiées expérimentalement chez l’humain. (2) Les méthodes expérimentales in vitro ne reproduisent pas l’ensemble des propriétés des crises d'épilepsie survenant dans un cerveau entier (et ceux malgré le développement de méthodes alternatives). (3) La modélisation in silico nécessite des données expérimentales encore insuffisantes pour produire des données applicables chez l’humain.
Réduction
Nous ferons une planification rigoureuse des expériences, en testant d’abord les traitements par analyse comportementale avant d’effectuer des analyses EEG. De plus, les groupes contrôles et traités seront regroupés afin de minimiser l’utilisation des animaux. Enfin, pour les traitements préventifs : le traitement court de 5 jours sera réalisé en premier avant d’envisager un traitement plus long (21 jours) si nécessaire. Le calcul du nombre des animaux est fait selon une approche statistique, il nous faut au minimum 10 animaux par groupe. Pour les animaux qui seront implantés par des électrodes, un maximum de 12 animaux/groupe sera envisagé afin d’atteindre un minimum de 10 en cas de perte d’animaux.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des cages ventilées enrichies avec des tunnels en plastiques (ou des huttes en carton après implantation d’électrodes, afin d’éviter que les animaux se soient coincés au niveau de leur connecteur). La température est controlée. Le cycle jour/nuit est de 12h, changeant à 7h/19h. Une surveillance attentive et quotidienne des animaux est réalisée. Avant chirurgie, une dose d’analgésique est administrée (environ 45 min avant). Pendant la chirurgie, un gel est instillé au niveau de chaque oeil pour éviter le dessèchement de la cornée. Un spray d’anesthésique local est appliqué au niveau de la peau incisée pour limiter la douleur. De plus, l’animal est maintenu à une température de 37°C à l’aide d’un tapis chauffant avec rétrocontrôle. Puis, à la fin de la chirurgie, une deuxième dose d’analgésique est administrée dans les 4h (soit 6h après la première) pour réduire la douleur postopératoire, puis un antalgique dans l’eau de boisson est donné pendant 48h. Une distribution d'aliment hydraté pourra être effectuée pour faciliter l'alimentation. Lors de l’induction de l’état de mal épileptique, les animaux sont suivis par vidéo ou vidéo-EEG. Si cet état de mal dure plus de 2h après administration des produits, les animaux seront mis à mort par surdose d’anesthésique. Les administrations (intrapéritonéale, sous-cutanée, intraveineuse ou par gavage oral) seront effectuées sur des animaux vigiles par du personnel expérimenté.
Choix des espèces
L’espèce que nous avons choisi (rat Sprague Dawley) est le modèle le plus décrit dans la littérature comme reproduisant au mieux l'épilepsie induit par les proconvulsivants utilisés dans cette étude. Les rongeurs ont un cerveau suffisamment élaboré pour générer des activités épileptiques dont les mécanismes pathologiques aux niveaux cellulaire et moléculaire sont similaires à l'humain. De plus, la lignée Sprague Dawley choisie montre un taux de survie élevé suite à l’induction des crises proposées. Pour toutes les procédures, nous testerons des animaux juvéniles (entre P21 et P45) afin d’évaluer des traitements compatibles chez l’enfant.
Développement d’un modèle murin de la forme infantile sévère de la maladie de Pompe par backcross répétés
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
Les souris de ce projet sont croisées à répétition pour rendre plus sévère la maladie qu'elles portent, jusqu'à obtenir une atteinte musculaire massive, des troubles cardiaques et respiratoires et une mort précoce. 504 souris vont être utilisées, 468 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 36 un niveau modéré, toutes tuées à l'issue. Elles subissent une biopsie de la queue pour génotypage, puis six tests fonctionnels de force et d'endurance dès l'âge de 20 jours. Le porteur ne décrit comme effets attendus qu'une légère cambrure de la colonne, un léger écartement des membres postérieurs et un dandinement, alors que l'objet déclaré du projet est d'obtenir un modèle plus grave que ceux qui existent. Toutes seront tuées pour doser le sucre accumulé dans leurs muscles et leur cerveau.
Objectifs
Le but de ce projet est de développer un nouveau modèle animal plus représentatif de la forme infantile de la maladie de Pompe. La maladie de Pompe est causée par une défaillance du métabolisme du sucre, qui va s’accumuler dans les muscles et induire une faiblesse musculaire importante, des problèmes cardiaquse et respiratoires. Cette maladie est causée par une mutation dans l'ADN qui va entrainer une absence de l'alpha-glucosidase acide (GAA). Cette enzyme permet, chez une personne saine, d'utiliser le sucre, stocké dans les muscles, lors d'un effort musculaire. Le déficit en GAA va induire une augmentation du sucre dans les muscles et ainsi les détériorer. La forme infantile, est la forme la plus sévère de la maladie. S'ils ne sont pas traités, les nouveau-nés, atteint d’une forte faiblesse musculaire, dès la naissance, meurent généralement avant la deuxième année de vie. Un traitement est actuellement disponible : ce traitement ne soigne pas la maladie mais ralenti son développement, son efficacité est réduite au cours du temps et il reste très contraignant (injection toutes les deux semaines). Avec ce traitement, l’espérance de vie de ces enfants varie entre 3 et 7 ans. Pour étudier correctement cette maladie et développer un médicament efficace, nous avons besoin d’un modèle animal ayant, comme les bébés, une atteinte musculaire très importante ainsi que des problème cardiaque et respiratoire et une mortalité précoce.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de développer un modèle murin très sévère de la maladie de Pompe infantile. En effet, la forme infantile est la forme plus sévère, avec un décès du nouveau-né dès la deuxième année s’il n’est pas traité. Un traitement est actuellement disponible mais il reste très contraignant (injection toutes les deux semaines), couteux et perd en efficacité avec le temps (mortalité entre 3 et 7 ans). Le développement d’un modèle plus représentatif de la forme infantile de la maladie de Pompe nous permettra dans un second temps de valider le médicament que nous sommes en train de développer afin d’obtenir des data plus robuste en traitant des symptômes que nous n’avons pas dans les souris classiques de la maladie de Pompe.
Procédures
Les souriceaux seront génotypés grâce au prélèvement d'un petit bout de queue, cet acte durera moins de 15 secondes. Les souris réaliseront 6 différents tests d’évaluation fonctionnels afin de mesurer leur force, leur endurance, etc. Chaque test dure entre 30 secondes et 3 minutes.
Impact sur les animaux
Du stress lié à la manipulation est attendu sur les souris. Le génotypage des souris induira une légère douleur lors de la récupération d'un petit bout de queue. Chez les souris malades, des effets indésirables liés à la progression de la maladie de Pompe seront attendus (légère cambrure de la colonne vertébrale, léger écartement des membres postérieurs, dandinement lors de la marche, dos arqué, écartement des membres). Si l'atteinte musculaire des souris est trop importante, nous modifions l'agencement de la cage (boisson + nourriture au sol) pour faciliter le déplacement des souris et l'accès à la nourriture.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés, par une méthode réglementaire, à la fin de l’étude. Des prélèvements de différents tissus seront réalisés afin de mesurer la quantité de sucre dans les tissus (muscles, cerveau, etc.) signe de l'évolution de la maladie.
Remplacement
Les travaux réalisés précédemment sont encourageants pour développer un modèle plus sévère pour la maladie de Pompe infantile. Basé sur les résultats obtenus (accentuation du phénotype dès la première génération de souris), nous voulons poursuivre dans ce sens pour développer un modèle animal plus sévère. Nous ne pouvons donc pas remplacer le modèle murin dans ce contexte.
Réduction
Des tests statistiques ont été utilisé afin de calculer au plus juste le nombre d'animaux nécessaire pour conduire à des résultats suffisent fiable.
Raffinement
Une nourriture adaptée pourrait être mise en place si les souris sont trop faibles. Les souris ne réaliseront pas plus de deux tests d'évaluations fonctionnels par jour afin de ne pas les stresser et fatiguer. Comme nous mettons en place une nouvelle colonie avec une maladie potentiellement plus sévère, les souris seront observées régulièrement et les points limites pourront être adaptés en fonction de nos observations.
Choix des espèces
Le modèle murin est un bon modèle pour étudier la maladie de Pompe puisque, comme chez l’homme, l’absence de GAA entraine une augmentation de sucre dans les muscles, ainsi qu’il perte de la force musculaire. De plus, le changement de fond génétique que nous voulons apporter ici à déjà montrer une augmentation de sévérité dans d’autres modèle murin. Nous réaliserons des tests d'évaluations fonctionnels précoce (20 jours, 1.5 et 3 mois) car si la maladie est suffisamment sévère, la faiblesse musculaire devrait se voir dans les premières semaines.