Procédures sévères
Création d’un nouveau modèle d’hypertension pulmonaire thromboembolique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Soumises à une ligature de l'artère pulmonaire droite pour provoquer une hypertension pulmonaire, 94 souris adultes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère ou sans réveil, toutes tuées à l'issue pour l'analyse du cœur et des poumons. Pour une partie d'entre elles, la ligature passe par une ouverture du sternum sous anesthésie. Les autres sont opérées par thoracotomie puis réveillées, passent une échocardiographie 28 jours plus tard et subissent enfin une seconde ouverture du thorax, par le sternum, dont elles ne se réveillent pas. Le projet doit transposer à la souris une méthode d'induction mise au point chez le rat, pour disposer des outils transgéniques propres à cette espèce. Le porteur décrit, d'après ses expériences chez le rat, une hypertension "cliniquement asymptomatique" et sans surmortalité, pour un projet dont une partie des procédures est classée en souffrance sévère.
Objectifs
L’hypertension pulmonaire thromboembolique chronique (HTP-TEC) est une maladie cardio-pulmonaire sévère. Elle est caractérisée par une augmentation anormale de la pression artérielle pulmonaire moyenne (PAPm) au-dessus de 25 mmHg au repos. Cette élévation de la PAP aboutie à une hypertrophie cardiaque droite puis à une insuffisance cardiaque. L’HTP-TEC est due à une obstruction des grosses artères pulmonaires suite à la mauvaise résolution d'un caillot de sang (embolie pulmonaire). L’embolie pulmonaire est une maladie fréquente. En France, au moins 35,000 cas sont traités chaque année. Chez 1 à 3% des survivants, la persistance d’une obstruction artérielle pulmonaire cicatricielle associée à des anomalies des petits vaisseaux pulmonaires peut conduire à une HTP-TEC. La plupart du temps, l'HTP-TEC se soigne bien, avec un acte chirurgical qui vise à retirer le matériel qui obstrue les vaisseaux bouchées (thromboendarectomie). Cependant, dans certain cas, l'augmentation du flux sanguin dans les territoires non obstrués conduit à une altération des petits vaisseaux pulmonaires distaux (inférieurs à 500µm de diamètre) non "débouchables" par la chirurgie. Le modèle le plus pertinent d'HTP-TEC actuel est un modèle d'embolisation pulmonaire par de la colle biologique chez le cochon. Ce modèle de gros animal est difficilement reproductible par des équipes non expertes et ne permet pas de tester à grandes échelles les traitements qui sont excessivement onéreux. Un nouveau modèle chez la souris permettra de mieux comprendre comment se mettent en place les lésions distales d'HTP-TEC et comment soigner cette pathologie. En effet, les patients deviennent symptomatiques (essoufflement à l'effort) et ne sont diagnostiqués que dans les stades terminaux de la maladie. ll n'est donc pas possible de disséquer l'histoire naturelle du développement des lésions pulmonaires chez l'homme. C'est pour cette raison que nous travaillerons avec un modèle animal de cette maladie finalement assez fréquente mais mal comprise et mal traitée en dehors du traitement chirurgical. Développer un modèle d'HTP-TEC chez la souris est donc un enjeu majeur pour augmenter la survie des malades.
Bénéfices attendus
L’hypertension pulmonaire thromboembolique chronique (HTP-TEC) représente un défi majeur de santé publique, entraînant un handicap significatif, une insuffisance cardiaque et un risque accru de mortalité en l'absence de traitement. Cette forme grave de maladie vasculaire pulmonaire est souvent méconnue, ce qui entraîne des retards dans le diagnostic et expose les patients à un risque élevé de décès prématuré. À court terme, notre projet vise à établir un modèle expérimental d'HTP-TEC chez une espèce animale pour laquelle une panoplie d'outils génétiques et scientifiques ont déjà été développés et validés. À long terme, l'objectif principal de ce projet est d'améliorer la prise en charge des patients atteints d'HTP-TEC. En développant un modèle animal pertinent de cette maladie, nous espérons mieux comprendre ses mécanismes sous-jacents et identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques. Ce faisant, nous visons à réduire la morbidité et la mortalité associées à l'HTP-TEC et à améliorer la qualité de vie des patients affectés.
Procédures
Pour une partie des animaux, une hypertension pulmonaire sera induite par ligature de l’artère pulmonaire droite (chirurgie thoracique avec sternotomie, durée de l’acte chirurgical : 40 minutes maximum) sous anesthésie et analgésie. Pour une seconde partie des animaux, une ligature de l’artère pulmonaire droite est réalisée via une thoracotomie (20 minutes), puis les animaux sont réveillés. Ils sont soumis à un examen échocardiographique non invasif 28 jours post-ligature (10-20 minutes sous anesthésie gazeuse) puis sont soumis à une chirurgie terminale via sternotomie sous anesthésie et analgésie (20minutes) sans réveil avec mise à mort subséquente.
Impact sur les animaux
Dans les expériences que nous avons réalisées chez le rat, l’hypertension pulmonaire qui se développe chez nos animaux est cliniquement asymptomatique (hypertension pulmonaire modérée au niveau hémodynamique, sans insuffisance cardiaque), n’entraînant pas de surmortalité, ni d’effets indésirables sur les animaux sur la période considérée (aiguë ou 4 semaines). Les souris sont soumises à une chirurgie (sous anesthésie) qui est un acte douloureux et seront prises en charge par ailleurs. Une partie des animaux sera soumise à une échocardiographie sous anesthésie, qui est une procédure non invasive et non douloureuse.
Devenir
Les animaux sont mis à mort en fin d’expérimentation pour permettre l’analyse (moléculaire, cellulaire et histologique) du cœur et des poumons (nécessité de prélever les organes).
Remplacement
L'objectif de recherche est d'étudier et comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans le développement de l’hypertension pulmonaire. Le recours à des animaux est indispensable et se justifie par la nécessité d'étudier la fonction ventriculaire droite, la réactivité vasculaire, l'histologie pulmonaire dans un contexte physiologique et pathologique. Ce projet se justifie également par l'impossibilité de simuler ex vivo la mise en place d'une hypertension pulmonaire puis d'une altération cardiaque droite chez l'humain qui est un processus multifactoriel complexe.
Réduction
En fin d’expérimentation, les tissus prélevés (cœur et poumons) seront stockés pour une utilisation directe mais aussi ultérieure, pour des études mécanistiques plus poussées. Des expériences de biochimie et biologie moléculaire à partir des différents tissus collectés et des études sur cellules isolées seront effectuées. Des calculs de puissance ont permis de déterminer les effectifs minimums nécessaires à l’obtention de résultats statistiquement exploitables. Le nombre total de souris utilisés sera de 94 sur l'ensemble de l'étude en combinant plusieurs approches expérimentales par différents expérimentateurs sur le même animal.
Raffinement
Toutes les procédures seront pratiquées sous anesthésie générale et couverture analgésique adaptées aux actes pratiqués. Des points limites spécifiques ont également été mis en place. De la nourriture et de l’eau sous forme gélifiée seront disposés sur la litière de la cage pour permettre un accès facilité à la nourriture et à la boisson.
Choix des espèces
Nous avons développé chez le rat ce modèle qui mime les conditions hémodynamiques et les lésions vasculaires pulmonaires rencontrées dans la pathologie humaine. Pour aller plus loin dans l’étude de la pathologie (mécanistique), les modèles transgéniques constituent un outil puissant, car ils peuvent être utilisés efficacement pour tester des interventions conçues contre des voies et des processus moléculaires particuliers impliqués dans la maladie. Or la majorité de ces outils ne sont disponibles que chez la souris. C’est pourquoi, nous voulons transposer ce nouveau modèle chez cette espèce. Nous utiliserons des souris adultes (8-20 semaines) pour reproduire les caractéristiques démographiques de la pathologie étudiée et faciliter l’approche chirurgicale (en comparaison aux souris juvéniles).
Evaluation de différentes formes galéniques implantables au niveau la zone portale chez le porc miniature comme thérapeutique du diabète de type 2
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
20 porcs miniatures adultes, âgés de plus de 3 ans et obèses, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue. Ils reçoivent par cœlioscopie un implant posé au niveau de la veine porte, censé libérer pendant des mois une molécule contre le diabète de type 2, puis sont anesthésiés à plusieurs reprises pour des scanners ou des prises de sang, jusqu'à une dernière anesthésie de 2 heures, dont ils ne se réveillent pas, pour une tomographie par émission de positons. L'implant peut provoquer une brèche vasculaire ou une compression de la veine porte, et le porteur signale chez ces porcs obèses des plaies de contact et des fractures possibles lors des pesées hebdomadaires. Il situe le bénéfice à court terme dans la possibilité de "lancer la phase humaine du programme", et l'expérience doit aussi calibrer des tests in vitro de libération de la molécule. Il écrit enfin qu'un calcul de puissance statistique classique "n'est pas pertinent" pour cette expérience et fonde l'effectif sur ses projets antérieurs.
Objectifs
Le diabète de type 2 est une maladie endémique qui touche plus de 25 millions de personnes dans le monde. De nouveaux traitements existent mais leur efficacité est entachée par de nombreux effets indésirables. Une solution vise à rétablir la sensibilité des récepteurs au Glucagon-like-peptide 1 (GLP-1 r) situés dans un très court segment de la veine porte. Cela peut être produit par la libération locale et prolongée d’un composé capable de restaurer la densité des récepteurs GLP-1. Ce dernier est libéré par un implant idéalement biodégradable sur plusieurs mois. Le projet vise à évaluer la conversion d’un dispositif antérieur reposant sur un implant non biodégradable cylindrique en dispositif utilisable chez le patient humain et répondant aux bonnes pratiques de fabrication en accord avec les autorités de régulation des dispositifs biomédicaux implantables (GMP - good manufacturing practices). Le but de l’expérience est d’évaluer plusieurs dispositifs implantables biodégradables susceptibles de libérer in situ, sur plusieurs mois, une dose idoine de la molécule capable de réguler la densité des récepteurs GLP1. Cette évaluation comprend également une mesure directe et indirecte de la libération de la molécule active afin de calibrer différents tests in vitro de validation des implants dans le cadre de l’utilisation clinique chez l’homme de l’implant une fois celui-ci sélectionné.
Bénéfices attendus
Les bénéfices à court terme sont ceux associé à la possibilité de lancer la phase humaine du programme. Les bénéfices à long terme sont directement associés à la mise en place d'une thérapeutique alternative au traitement du diabète de type 2. Dans tous les cas, nous visons la production d’un dispositif médical susceptible d’être produit en condition GMP et dont la mise en place soit faiblement risqué pour le patient tout en allongeant de façon significative la durée de libération de la molécule active. L’idéal étant de disposer d’un dispositif médical qui puisse fonctionner plusieurs années i.e. qui libère la molécule active durant cette période. Cela nécessite de façon connexe de disposer d’un modèle de libération in vitro. L’expérience proposée vise entre autres à caliber in vivo ce modèle in vitro
Procédures
Les animaux seront soumis à une procédure comprenant diverses étapes durant la durée du projet. Au cours de la première expérience, trois types de dispositifs libérant une molécule active seront placés par voie chirurgicale coelioscopique (durée max de la chirurgie proprement dite - 15 minutes)chez trois groupes d’animaux. Chacun de ces groupes sera suivi durant 1 mois avec une anesthésie au cours de la semaine 2 et 4 post implantation. Au cours de cette anesthésie, un scanner et une prise de sang (2,5 mL) seront réalisés (durée max 30 minutes). La dernière anesthésie est terminale et permettra avant l’administration de l’agent déclenchant l’euthanasie une tomographie d’émission positronique destinée à la mesure de la densité des récepteurs GLP-1 (durée anesthésie 2 heures). Au cours de la seconde expérience, un implant choisi à la suite des résultats de la première expérience sera également implanté par voie chirurgicale coelioscopique sur un groupe unique d’animaux. les animaux seront suivi durant 6 mois avec 4 prises de sang sous anesthésie légère toutes les deux semaines puis tous les mois. Come pour les animaux de l’expérience précédente, une dernière anesthésie terminale permettra avant l’administration de l’agent déclenchant l’euthanasie une tomographie d’émission positronique destinée à la mesure de la densité des récepteurs GLP-1.
Impact sur les animaux
Le projet sera réalisé en s’assurant qu’aucune angoisse, douleur ou souffrance inutile ne soit ressentie lors de toute intervention sur les animaux. Les effets liés au risque septique bien que parfaitement maitrisés sont pris en compte dans la surveillance durant semaine post-chirurgicale (recherche d’un arrêt de l’ingestion, prostration, toux, vocalisation au couché, diminution de la diurèse, température rectale accrue). En dehors de ces effets, et dans le cas de la première expérience, les effets indésirables potentiels sont ceux directement liés à la présence physique de l’implant et correspondent soit une brèche vasculaire soit une compression portale. Ils peuvent survenir durant la totalité de la période expérimentale mais ne peuvent être objectivés que par l’imagerie abdominale (US 2D et Doppler respectivement). Ils seront suspectés par les signes cliniques classiques d’une péritonite (arrêt brutal de l’ingestion, prostration, douleur à la palpation abdominale). Outre ces signes, des effets plus complexes à mettre en évidence sont possibles mais ont un tableau clinique protéiforme. Ces effets peuvent également survenir durant la totalité du protocole expérimental. C’est pourquoi, en cas de baisse significative de l’ingestion qui reste le seul élément quantitatif précoce dont nous disposons, nous compléterons l’examen clinique par une mesure de l’ECG et de la pression artérielle. En fonction de l’impact sur le bien être de l’animal, une euthanasie préventive sera réalisée. Dans le cas de la seconde expérience, les effets néfastes directs liés à l’implant sont identifiés et résolus. Les nuisances relèvent de l’élevage en condition expérimentale (plaies de contact, fractures au moment des pesées hebdomadaires en dépit d’une conception idoine des structures d’animalerie) sur des animaux obèses. Celles=ci peuvent survenir tout au long de la durée expérimentale. Aucun autre effet indésirable n'est attendu en consequence de leur obésité.
Devenir
Un réveil à la suite d'une longue anesthésie est potentiellement douloureux et/ou induit un mal-être sans qu'il ne soit réellement possible de contrer ces effets par un susbtitut pharmacologique. Face à ce risque, nous estimons qu'il est préférable de réaliser une euthanasie à l'issu de l'expérimentation
Remplacement
Ce projet réalisera de nouvelles recherches pour lesquelles l'information n'est pas déjà disponible dans la littérature. Bien que le remplacement par des alternatives non animales soit un atout inestimable pour la recherche, celles-ci ne peuvent pas reproduire la physiologie intégrative complexe présente chez un animal modèle, qui s’apparente étroitement à l'homme. En raison du haut niveau de complexité des systèmes étudiés, de leur intégration complexe et des conséquences multiples de leurs dérèglements, il existe trop d'inconnues pour créer des modèles fiables générés par ordinateur. Cette expérience vise d’une part à valider un modèle in vitro de libération de la substance active. Ce modèle n’existe actuellement pas du fait des particularités vasculaires de la zone d’implantation. Les questions suivantes nécessitent encore un modèle animal. Comment se comporte la libération de la molécule candidate au cours du temps et plus particulièrement une fois que l’implant est inséré dans une structure jouxtant une des plus grosses veines de l’organisme ? Encore une fois, nous avons réalisé un modèle pharmacocinétique sur la base de nos expériences antérieures et nos partenaires développent un modèle in vitro de libération à l’horizon d’un an post implantation. Néanmoins, il est impératif d’avoir des données in vivo de façon à calibrer ce modèle in vitro. Par ailleurs, l’utilisation d’un modèle animal pour le volet chirurgical reste indispensable notamment pour répondre aux questions suivantes: Quelle est la meilleure matrice biodégradable et la forme optimale de l’implant pour permettre une implantation aisée en cœlioscopie. La matrice biodégradable de l’implant peut-elle supporter la procédure d’implantation et l’outil d’implantation est-il suffisant pour réduire les contraintes physiques sur l’implant de façon à ce que ce dernier reste intact ? Ces deux questions font l’objet de modélisations physiques à l’aide de l’outil Comsol. Il reste à valider les données de stress mécanique tant sur l’implant que sur les tissus biologiques qui vont accueillir l’implant - une phase qui ne peut être réalisée que sur un modèle chirurgical.
Réduction
Ce projet a été conçu pour utiliser un nombre minimum d'animaux, tout en garantissant l'obtention de résultats scientifiquement pertinents et l'atteinte des objectifs de l'étude. Néanmoins les questions posées, le caractère exploratoire des différents modèles d’implants et le risque de survenue d’événements néfastes sont tous difficilement modélisables et par voie de conséquence un calcul de puissance statistique classique n’est pas pertinent pour le type d’expérience projeté. L'objectif de réduction se basera donc sur l'expérience acquise au cours des projets antérieurs de même nature (implantation coelioscopique d'implants non biodégradable). Par ailleurs, il est tout à fait possible que rapidement les premiers essais conduisent à identifier une incompatibilité immédiate entre la nature de l'implant et la zone à traiter. Dans ce cas, le nombre d'animaux prévu pour ce sous groupe sera immédiatement réduit.
Raffinement
Des points limites sont fixés au préalable, et un suivi des animaux est effectué de facon très régulière. Les procédures chirurgicales et d’imagerie ont été conçues et validées par un vétérinaire en incluant une valence analgésique forte. Les méthodes d’imagerie sont les plus sophistiquées possible à ce jour indépendamment de l’espèce utilisée. La méthode chirurgicale est reconnue comme celle produisant les suites post-opératoires néfastes les plus limités possibles. Les possibilités d'affiner la procédure seront continuellement explorées et mises en oeuvre dans la mesure du possible pendant la durée de vie du projet. Des revues de littérature régulières seront effectuées pendant toute la durée du projet pour s'assurer que les procédures utilisées sont aussi raffinées que possible et restent conformes aux recommandations de bonnes pratiques.
Choix des espèces
Le porc s’impose comme un modèle privilégié pour les études en nutrition et neurosciences. En contexte nutritionnel délétère, le miniporc adulte développe une obésité similaire à la pathologie humaine. De plus, le capteur GLP-1r au niveau portal est altéré par l'obèsité. Le choix du modèle porcin se justifie également par rapport à l’utilisation d’une procédure d’implantation cœlioscopique qui sera celle utilisée chez l’homme et qui ne peut être effectuée techniquement sur un animal de plus petite taille. Pour les mêmes raisons de taille, la résolution spatiale obtenue par l’utilisation du modèle porcin, du fait des limitations techniques fait qu’un modèle de grande taille est recherché. Les animaux seront des adultes bien après que leur croissance ait atteint un plateau i.e. > 3 ans. Ceci se justifie par le fait que la condition visée par notre solution thérapeutique est celle du diabète de type 2 chez l'adulte et que ce dernier se développe préférentiellemetn après 45 ans
Étude de la formation des métastases des cancers du sein triple négatifs chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
866 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour que leurs poumons et leurs organes métastatiques soient prélevés. Chacune reçoit une injection de cellules cancéreuses dans la glande mammaire, puis l'ablation de la tumeur quand celle-ci atteint sept millimètres à un centimètre, certaines recevant ensuite une injection de cellules dans la veine de la queue et une chimiothérapie hebdomadaire pendant trois semaines. Le porteur décrit une tumeur dont le volume peut gêner la mobilité, se nécroser et s'ulcérer, et des métastases pulmonaires pouvant provoquer une difficulté à respirer. Il précise que ce modèle métastase rarement de lui-même, moins de 15 % des animaux, ce qui le conduit à injecter directement les cellules cancéreuses dans le sang pour obtenir les métastases que le modèle ne produit pas.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de d’étudier la colonisation métastatique des cancers du sein en se rapprochant au plus près des conditions cliniques afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques contre les métastases. Le projet global consiste à étudier le phénotype des cellules cancéreuses lors de leur arrivée dans les poumons après le développement d’une tumeur primaire mammaire en présence ou non de chimiothérapie afin de définir : 1 : Les états cellulaires des cellules cancéreuses et du microenvironnement au cours de la colonisation métastatique 2 : L’impact de la tumeur primaire sur la colonisation métastatique des cellules cancéreuses 3 : L’impact de la chimiothérapie sur les cellules cancéreuses et le microenvironnement lors de la colonisation métastatique 4 : l’absence de réponse immunitaire qui a permis l’établissement des métastases 5 : les stratégies thérapeutiques pouvant amplifier les effets de la chimiothérapie
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est de déchiffrer les mécanismes cellulaires et moléculaires de la colonisation métastatique des cancers du sein et plus particulièrement des cancers du sein triple négatifs en se rapprochant au plus près de conditions observées chez les patientes. Ce sous-type de cancer du sein est considéré comme le plus agressif avec un mauvais pronostic due la formation fréquente de métastases chez les patients et l’absence de traitement ciblé. Malheureusement, il n’y a à ce jour aucun traitement curatif pour les patientes présentant des métastases. Une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents à la formation et au développement des métastases des cancers du sein est une première étape cruciale vers le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour cibler la maladie métastatique. Le projet de recherche proposé a un potentiel important pour faire progresser notre compréhension de la formation des métastases de cancer du sein triple négatif et donc de réduire la mortalité des patients. De plus, les résultats obtenus ouvriront de nouvelles voies de recherche pour identifier des thérapies ciblées contre la maladie métastatique.
Procédures
Les animaux recevront deux procédures chirurgicales : l’injection de cellules cancéreuses dans la glande mammaire (durée : 20 min) suivie et l’ablation de la tumeur lorsque celle-ci atteint 0,7 à 1 cm de diamètre (durée 30 min). Par la suite certains animaux recevront une injection dans la veine caudale de cellules cancéreuses (durée 2 min). Ces animaux pourront alors recevoir un traitement chimiothérapeutique 1 fois par semaine pendant 3 semaines (durée inférieure à 2 min).
Impact sur les animaux
Le modèle murin employé ici est un modèle de cancer mammaire montrant une croissance tumorale rapide mais rarement métastatique (moins de 15% des animaux développent des métastases spontanées). La croissance de la tumeur primaire peut provoquer des effets indésirables sur les animaux. Particulièrement, l’animal peut subir une nuisance mécanique de la tumeur par son volume pouvant compliquer sa mobilité et son activité. La tumeur primaire, par sa croissance rapide, peut montrer une nécrose (mort cellulaire) et être associée à la formation d’ulcère entraînant une douleur pour l’animal. L’induction de métastases par injection chez la souris peut entrainer des difficultés fonctionnelles au niveau des poumons. Notamment, elle peut entrainer une difficulté à respirer due à la présence mécanique des métastases. De manière plus générale, l’animal peut être touché par des signes plus généraux de mauvais état général comme la perte de poids et d’appétit. Des observations et examens cliniques seront réalisés tous les deux à trois jours afin de mettre en lumière les animaux montrant des signes cliniques. Si des signes cliniques sont détectés, les animaux seront alors surveillés tous les jours afin de leur administrer un analgésique en cas de signes de douleur (opioïdes) ou procéder à une mise à mort anticipée en cas d’atteinte de points limites majeurs.
Devenir
A la fin de cette procédure ou si un animal atteint un point limite, les animaux seront euthanasiés afin de collecter les poumons et les potentiels organes métastatiques pour étudier la formation des métastases.
Remplacement
Le projet s’intéresse à la caractérisation des mécanismes de colonisation métastatique. Il est très compliqué de mimer in vitro la formation de métastases dans un environnement riche et complexe comme les poumons. Une étape in vivo est donc nécessaire pour se rapprocher au plus près des conditions de clinique humaine, afin d’observer finement les mécanismes d’action des cellules tumorales au niveau de l’organe métastatique. De plus, il est compliqué de maintenir in vitro l’hétérogénéité des cellules cancéreuses observée in vivo. Toutefois, avant implantation in vivo dans la souris, les cellules cancéreuses seront étudiées ex vivo avec des essais se rapprochant le plus des conditions in vivo comme la culture de cellules cancéreuses en 3 dimensions et la culture de tranches de poumons. Notamment, afin d’étudier le rôle de gènes d’intérêt, l’effet de l’amplification ou la délétion de ces gènes sera évalué ex vivo afin d’éliminer les gènes n’ayant pas d’effet sur les cellules cancéreuses.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombres d’animaux utilisés, le personnel est formé aux outils statistiques appliqués à l'expérimentation animale (planification, randomisation et analyse par l’utilisation de traitements statistiques des données). Les protocoles d’injection issus de la bibliographie sont validés et robustes permettant une prise tumorale optimale sur l’ensemble des individus de la cohorte, limitant l’utilisation d’animaux dont les prélèvements se révèlent non analysables. Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé en se basant sur notre expérience du modèle murin employé ici et pourra être réduit en fonction des résultats préliminaires qui seront obtenus ex vivo. L’ensemble du protocole expérimental sera précisément défini en amont afin de limiter les biais de non-homogénéité entre lots de souris.
Raffinement
Le bien-être des animaux de l’étude sera particulièrement porté à l’attention du personnel qui veillera aux meilleures conditions d’élevage possible, notamment via un maintien des groupes sociaux (4- 5 animaux par cage) et l’enrichissement de l'habitat (frisottis de papier ajoutés aux cages). La gestion du stress des animaux sera maximisée, par une contention la plus rapide et la moins fréquente possible. Nous avons une grande expérience des injections intraveineuse caudales qui nous permet de les réaliser rapidement en limitant le stress chez l’animal. La douleur des animaux utilisés sera fréquemment évaluée par un examen clinique des animaux tous les jours afin de déterminer la présence de signes cliniques et de mettre en place un protocole d’analgésie ou la mise à mort en cas d’atteinte de point limite.
Choix des espèces
La souris est l’espèce de choix pour ces essais : - Concordance des lignée murines génétiquement modifiées avec les observations cliniques chez les femmes atteintes de cancer du sein triple négatif - Similitudes de la physiologie et de la taille du génome entre la souris et l'homme - L'organisme évolue rapidement (courte durée de vie) et permet des analyses compatibles avec les impératifs de progrès thérapeutiques à apporter en clinique humaine - Certaines souches sont génétiquement modifiées, permettant la création de modèles tumoraux particuliers (expression de marqueur fluorescent permettant la détection des cellules cancéreuses). Les animaux seront utilisés entre 10 et 18 semaines, âge adulte permettant aux souris de supporter le développement de métastases et la chirurgie
Evaluation de nouveaux traitements dans les modèles de colite induite chimiquement ou par des agents infectieux
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Rats : 2400
Perte de poids d'au moins 20 %, hypothermie, difficulté à respirer, automutilation, absence prolongée de réponse aux stimulus : les points limites retenus disent l'état attendu des animaux. 7 500 souris et 2 400 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 2 000 souris de plus dans des procédures d'un niveau modéré, tous tués ensuite pour prélever leurs organes. Une colite leur est provoquée par une administration orale, intrarectale ou intrapéritonéale, et le porteur indique qu'ils développeront des signes de douleur, perte de poids et prostration. Il s'agit d'évaluer des molécules, des fibres, des vitamines ou des minéraux, tous décrits comme sans danger, à raison de dix animaux par groupe, ce qui suppose plus de mille groupes expérimentaux pour atteindre 11 900 animaux.
Objectifs
Le projet s’inscrit dans une thématique générale d’évaluation de l’effet thérapeutique anti-inflammatoire de certaines molécules chez la souris ou le rat. Ces études permettront d’évaluer l’efficacité de traitements préventifs ou thérapeutiques sur l’inflammation ainsi que la compréhension des mécanismes associés aux modifications de l’immunité et de l'ensemble des bactéries intestinales de l’individu dans les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. En effet, le nombre de ces maladies telles que la maladie de Crohn et la colite ulcéreuse s’accroît depuis ces dernières années, en particulier chez les personnes de 20 à 30 ans et chez les adolescents. En Europe, 2.2 millions de personnes sont affectées par les maladies inflammatoires intestinales. Malgré une évolution clinique et une recherche intensive, les causes sont encore mal connues. Il a été clairement établi que ce sont des maladies multifactorielles impliquant des facteurs génétiques, bactériens et environnementaux. Les patients atteints de ces pathologies sont caractérisés également par un déséquilibre intestinal. L’utilisation des traitements actuels ne permet pas de guérir de ces maladies et certains patients deviennent résistants aux traitements actuellement sur le marché. Les travaux envisagés comprennent; l’évaluation de nouvelles molécules, l’évaluation des conditions nutritionnelles, l'apport de fibres alimentaires, vitamines ou minéraux, seuls ou en combinaison, tous considérés comme sans danger. Ces évaluations pourront être réalisées dans des modèles d'inflammation intestinale qui feront l'objet de procédures et qui seront choisies en fonction de leur pertinence pour le mécanisme d'action ciblé par la molécule à tester.
Bénéfices attendus
Ce projet et les composés identifiés pourraient ouvrir la voie à des traitements encore plus adaptés et plus personnalisés des maladies digestives. A terme, nous souhaitons proposer de nouvelles options thérapeutiques pour les maladies digestives qui sont des maladies de plus en plus présentes.
Procédures
Les inductions des colites se feront par differents modes d'administration en fonction des procédures : soit une seule administration par voie orale, intraréctale ou intra-péritonéale. Aucun prélèvement sur animal vigile ne sera effectué et il n'y aura aucune procédure chirurgicale. Les prélèvements sur les animaux se feront uniquement post mortem.
Impact sur les animaux
Du fait de l'administraion aigüe ou chronique de produits induisant une colite, les animaux vont développer des signes de douleurs (perte de poids, prostration). Ces signes seront surveillés pour chaque expérimentation. Les types d'administration (intraréctale, gavage, injection) sont susceptibles également de créer une douleur légère. Ces paramètres seront surveillés en observant l'animal quotidiennemnt dans sa cage.
Devenir
A l'issue de la procedure tous les animaux seront mis à mort selons les réglementations en vigueur afin de prélever les organes d’intérêt
Remplacement
Les interactions entre le microbiote, la barrière intestinale et le système immunitaire sont indispensables pour l’étude des mécanismes infectieux et inflammatoires. L’étude des interactions de nouveaux médicaments ainsi que leur efficacité et l’absence d’effets secondaires implique de disposer d’un modèle mimant au mieux l’écosystème intestinal humain, tenant compte des différences d’absorption, de biodisponibilité et de composition des microbiotes et de l’état inflammatoire induit par la colite et également de modèles mimant spécifiquement la maladie ciblée ainsi que les lésions ou symptômes associés. Bien que des sélections et modélisations in vitro se réalisent en amont, le modèle rongeur reproduit la physiologie des muqueuses digestives humaines pour analyser la dissémination des produits dans les organes cibles, les processus de biotransformation et de détoxification de l’hôte, avec sa composante métabolique et immunitaire, pertinents pour étendre les conclusions à l’Homme. Nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte necessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres modèles expérimentaux n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'informations.
Réduction
Dans le respect des règles des 3R, le nombre minimum d'animaux sera utilisé pour garantir une analyse statistique correcte prenant également en compte la variabilité de l'expression des gènes. Les paramètres mesurés seront analysés par des tests non-paramétriques pour petits échantillons (tests de Kruskal Wallis, Wilcoxon, Mann-Whitney, et corrélation de Spearman). Le nombre d’animaux par groupe est de n = 10, qui est calculé sur la base de la puissance statistique des tests utilisés (intégrant la dispersion des valeurs individuelles, déterminés auprès de la littérature et suite à des expériences pilotes). Afin de pouvoir conclure à l'efficacité du traitement, ce protocole n'est mis en place qu'avec des molécules qui ont été validées sur des études in vitro précédentes.
Raffinement
Toutes les procédures induisant une douleur seront réalisées sous anesthésie (intraréctales, intraveineuses etc) durant toute la procédure expérimentale afin de maîtriser et limiter la douleur et la souffrance des animaux. Les animaux seront sous surveillance rapprochée pendant toute la durée de l'étude. Les animaux trouvés dans des conditions moribondes ainsi que les animaux montrant une douleur sévère et montrant des signes de détresse seront mis à mort. Les points limites sont définis selon les Directives de l'OCDE (document ENV/JM/MONO(2000)7) et incluent notamment : perte de poids supérieure ou égale à 20% par rapport au poids initial, une hypothermie, une absence prolongée de réponse volontaire à un stimulus externe comme le bruit, des problèmes ambulatoires empêchant l'animal d'accéder à la nourriture ou à l'eau, difficulté à respirer, automutilation, blessure ou plaie de la plaie etc. Un tableau de suivi a été mis en place en adaptant les points limites au seuil le plus bas. Si les signes persistent au bout de 24H, l'animal sera sorti de la procédure et mis à mort. Afin de réduire le stress des animaux, leur milieu sera enrich avec du matériel de nidification afin qu'ils puissent se cacher et ronger. La sociabilisation avec l'expérimentateur sera plus importante pour les animaux isolés dans leur cage. Les procédures seront réalisées dans une zone calme, différente de la pièce d'hébergement. Pour limiter le stress et l'angoisse des animaux, ils seront manipulés avec délicatesse et sociabilisés (habitués à l'expérimentateur) avant le début de l'étude. L'objectif est de préserver le bien-être des animaux; la satisfaction de leurs besoins physiologiques et comportementaux permettra d'éviter tout biais sur les résultats des expérimentations.
Choix des espèces
La souris et le rat représentent les modèles les plus accessibles et les plus pertinents pour modéliser la physiologie digestive des vertébrés supérieurs à sang chaud; en particulier, le système immunitaire complexe et la diversité des microbiotes sont relativement proches. De plus les modèles de colite sont validés dans ces espèces. Le choix de l'espèce rat ou souris dépendra de l'efficacité de la molécule dans une espèce donnée. En effet, si celle-ci s'avère efficace elle pourra être éventuellement testée dans l'autre espèce afin de montrer une efficacité espèce dépendante. Les animaux seront commandés en fonction de leur poids entre 22 - 25g soit environ 10 semaines. Nous avons besoin d'animaux adultes avec un poids assez élevé contenu de la perte de poids qui sera engendrée par l'induction des colites.
Etude multi-échelle à court, moyen et long terme de la maltraitance infantile chez des modèles murins
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Secoués quinze secondes, laissés sept jours dans un environnement appauvri ou séparés de leur mère trois heures par jour pendant deux semaines, des souriceaux sont utilisés pour reproduire trois formes de maltraitance infantile. Ils seront 2 464 en tout, dont 1 989 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 419 d'un niveau léger et 56 d'un niveau modéré. Le porteur annonce chez les nouveau-nés une baisse temporaire de la température corporelle et un retard du développement psychomoteur, chez les adultes un stress social important, puis prélève systématiquement le sang et le cerveau des animaux expérimentaux. 475 souris échappent à la mise à mort, les visiteuses des tests d'interaction sociale ainsi que les mères et les pères, gardées vivantes pour d'autres projets, l'avis du vétérinaire étant sollicité pour celles qui ont subi l'agressivité de congénères.
Objectifs
Les violences faites aux enfants et adolescents sont un fléau sanitaire et sociétal mondial. Un quart des adultes déclarent en avoir été victime mais une minorité d’entre eux est repérée suffisamment précocement pour éviter les conséquences « vie entière » somatiques et neuropsychiatriques de ces violences et leur impact socio-économique majeur. Les violences faites aux enfants et adolescents sont définies par l’OMS comme « toutes les formes de mauvais traitements physiques […] de négligences ou d’exploitation, entraînant un préjudice réel ou potentiel pour la santé de l’enfant, sa survie, son développement […] ». Dans les pays à économie développée, on estime la fréquence des maltraitances physiques de 4 à 16% chez les mineurs et de1 à 15% pour la négligence (et carence de soins). Pour les enfants survivants aux violences physiques du syndrome du bébé secoué, les conséquences à long terme sont majeures sur le plan neurologique et développemental (périmètre crânien diminué, épilepsie, déficiences motrices visuelles intellectuelles, trouble du langage, et anomalies comportementales). Pour les enfants victimes de négligence physique et carence de soins les conséquences sont les plus graves pour leur développement cognitif et l’insertion sociale. Dans ce projet, nous étudierons les effets spécifiques et communs de différents aspects de la maltraitance chez le souriceau par l’utilisation d’un modèle du syndrome du bébé secoué et deux modèles de négligence. Des analyses multi-échelles seront réalisées à différents temps de la maturation du cerveau : enfance, adolescence et adultes. Nous établirons 1) un profil comportemental individuel sur plusieurs composantes émotionnelle, sociale et cognitive ; 2) Les effets au niveau moléculaire de ces maltraitances seront également étudiés afin de permettre un futur transfert chez l’humain. Les analyses seront ciblées sur les marqueurs moléculaires de deux axes identifiés chez l’humain comme perturbés après exposition à des maltraitances dans l’enfance : la neuroinflammation et la production d’hormones. Les études protéiques et génétiques seront réalisées dans le sang périphérique et le cerveau des animaux à trois âges ; 3) Enfin des approches thérapeutiques comportementales (précoces et tardives) permettant de contrecarrer les effets de la maltraitance, seront entreprises.
Bénéfices attendus
Les maltraitances faites aux enfants et aux adolescents impactent un ensemble de comportements essentiels pour la santé mentale et sociale des individus, pour le reste de leur vie. Les maltraitances majorent la propension à développer des pathologies psychiatriques, aux symptômes plus sévères et de façon plus précoce. Le but de ce projet, qui s’intègre dans un projet de recherche plus large avec des volets cliniques, est de produire des connaissances nouvelles pour identifier les moments clés du développement lors desquels la mise en place de thérapies comportementales et/ou biologiques auraient le plus d’impact sur la réduction des conséquences dramatiques des violences faites aux enfants et adolescents. Le but sera aussi d’identifier si les effets sont liés au genre, ce qui semble être le cas chez l’humain sans en connaitre les mécanismes. Les maltraitances affectent le fonctionnement du cerveau, en particulier la détection des menaces, la régulation des émotions et la motivation. Mais on ne sait pas si ces altérations reflètent les effets toxiques des stress au début de la vie, ou des modifications adaptatives. Les facteurs protecteurs du fonctionnement du cerveau, restent à identifier, de même que les types de traitements réduisant, voir annulant les effets de la maltraitance. Il est nécessaire de mieux comprendre les conséquences psycho-biologiques des maltraitances chez les victimes au cours du développement du cerveau, et de préciser les mécanismes avec des modèles animaux. Le but de ce projet est d’étudier les liens entre types de maltraitances et leurs impacts spécifiques sur la maturation du cerveau selon les sexes et au niveau comportemental et biologique. Ce projet permettra d’identifier pour la première fois, pour chaque type de maltraitance modélisée et par comparaison des types de maltraitance, les mécanismes et la cinétique du 1) traumatisme crânien du syndrome du bébé secoué, 2) de la négligence physique et 3) de la négligence par manque de soins à l’échelle génique, moléculaire et comportementale au cours de la vie des individus. Le but de ce projet est de permettre l’identification spécifique à chaque modèle, de la période la plus propice au traitement de ces individus. Il permettra de préparer des interventions de prévention secondaires adaptées et correctrices.
Procédures
Dans le cadre du modèle du syndrome du "bébé secoué". La procédure de secouement dure 15 secondes maximum (1 seule fois). Dans le cadre du modèle de "négligence physique". L’appauvrissement de l’environnement de vie dure 7 jours. Dans le cadre du modèle de "négligence et séparation maternelle". La séparation maternelle quotidienne est de 3h, sur 7 à 14 jours consécutifs. La prise de sang des animaux à l’âge juvénile et adolescent dure 1 minute maximum. L’implantation sous anesthésie d’une puce d’identification RFID dure 20 secondes
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sur les animaux adultes sont : 1) un stress social important bien que temporaire chez les animaux expérimentaux et 2) en fonction des conditions expérimentales, un stress modéré temporaire d’un sous-groupe de mère. Chez les nouveau-nés et juvéniles, toujours en fonction des conditions expérimentales, on peut prévoir une légère baisse temporaire de la température corporelle et un retard dans le développement psychomoteur.
Devenir
A la fin de toutes les procédures, pour tous les animaux expérimentaux le sang et le cerveau des animaux seront systématiquement prélevés pour l’analyse moléculaire et génétique des facteurs biologiques modifiés par les maltraitances infantiles et responsables des altérations comportementales observées. C’est également grâce à l’identification de ces marqueurs biologiques que nous pourrons confirmer le rôle bénéfique de notre procédure de remédiation sur les effets de la maltraitance. L’identification de ces facteurs biologiques permettra d’identifier des cibles thérapeutiques potentielles pour la remédiation des effets dramatiques de ces violences chez l’homme. Toutes les souris visiteuse, ainsi que les mères et pères seront gardés en vie pour une possible utilisation dans d’autres projets. S’il les souris visiteuses ont subi de l’agressivité de la part de congénère, l’avis du vétérinaire référent sera sollicité. Dans le cas des mères de la procédure 2, l'avis du vétérinaire référent sera sollicité pour évaluer si elles peuvent être réutilisées ou non.
Remplacement
Les objectifs de ce projet étant d’étudier le rôle de différents modèles de maltraitance sur les comportements des animaux et l’expression de processus biologiques complexes périphériques et centraux, nous devons pouvoir observer et analyser ces comportements et ces mécanismes systémiques chez des animaux vivants et se comportant. Nos travaux de recherche ne peuvent donc pas se faire à l’aide d’autres types de procédures expérimentales (simulations informatiques ou cultures cellulaires par exemple).
Réduction
La réduction des animaux est faite par le suivi des mêmes animaux de l’âge juvénile à l'adolescence et de l’âge juvénile à l'âge adulte, pour éviter d'avoir trop d'animaux. Le nombre d’animaux est choisi pour tenir compte des difficultés inhérentes des modèles, à la durée totale d’expérimentation pour chaque individu et de prendre en compte la variabilité inter-individuelle. Les différentes procédures expérimentales ont ainsi été pensées et élaborées afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement puissants. Les lots de mise en place (pilote) permettront de sélectionner les meilleures conditions de test et si le premier lot est validé, le second lot ne sera pas utilisé, si aucun des lots n’est concluant la procédure sera stoppée, ce qui contribue à diminuer le nombre d’animaux. Pour réduire le nombre d’animaux visiteurs nécessaires pour nos tests d’interaction sociale, nous passerons plusieurs fois le même animal en tant que visiteur.
Raffinement
L’implantation sous-cutanée de puce RFID (sous anesthésie générale) prend 20 secondes environ. Un suivi post-opératoire sera réalisé. Une analgésie pourra être utilisée en fonction des signes de douleurs. Pendant et après la phase de maltraitance on surveillera l’état général des souriceaux dans et hors du nid à l’aide de documents adaptés au soin des nouveau-nés. Ils permettent d’observer les souriceaux dans la portée avec un minimum de manipulation de la part de l’expérimentateur. Pour limiter le stress des animaux, le(s) même(s) expérimentateur(s) habitueront les animaux à leur présence et à leur manipulation dès la naissance. Chaque animal bénéficie d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions et en dehors pour assurer un bien-être optimal durant toute l’étude. Les animaux isolés socialement bénéficieront des conditions d’enrichissement standard. Les animaux en restriction alimentaire seront suivis attentivement. Dès que l’isolement ou la restriction alimentaire n’est plus nécessaire les animaux sont remis en groupes et l’accès à la nourriture ad libidum. La collecte des fèces des animaux et l’analyse des métabolites présents dans ces fèces sera évaluée comme méthode alternative à la prise de sang à l’âge juvénile et adolescent.
Choix des espèces
Le choix de la souris est dû au fait que la souris est un mammifère social dont les capacités cognitives, affectives et sociales sont adaptées aux questions posées dans le projet. Le choix de la souris est pertinent d’un point de vue scientifique en termes de reproductibilité, des connaissances biologiques de l’espèce et du temps de reproduction. Les modèles de maltraitance utilisés seront implémentés entre 2 et 14j de vie, ce qui correspond à la petite enfance chez l’humain. Nous étudierons les interactions entre le fonctionnement cérébral en développement et trois modèles de maltraitance ainsi que sur le développement de l’axe du stress. Pour cela il est nécessaire d’utiliser une espèce animale qui présente un système nerveux central proche de celui de l’homme. La souris remplit très bien cette condition. Notre projet vise à investiguer les effets comportementaux et biologiques spécifiques de différents modèles murins de maltraitance, à plusieurs périodes sensibles de la maturation du cerveau, chez des animaux juvéniles, adolescents et adultes des deux sexes. Pour chaque modèle la cinétique des effets sera observée à un stade précoce (enfance), puis à moyenne (adolescence) et longue (adulte) distance du traumatisme. Nous utiliserons donc des animaux nouveau-nés (PN inférieur à 15 jours), des adolescents (PN inférieur à 50 J) et des animaux à l’âge adulte (PN supérieur à 70 J) selon les expériences. L’expression adaptée des capacités cognitive, sociales et affectives des individus, dépend largement du fonctionnement de différentes régions cérébrales corticales-sous corticales dont la cinétique de maturation est différente. Nous étudierons les effets de différents types de maltraitance sur la trajectoire de maturation de ces régions cérébrales et la régulation de l’axe HPA et comment ces différences structurelles et moléculaires expliquent les altérations comportementales associées et potentiellement différentes en fonction de l'âge des animaux.
Caractérisation de l’épuisement hématopoîétique dans un modèle de drépanocytose
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Exposées quatre-vingt-dix secondes à des rayons X, greffées avec des cellules sanguines, puis soumises à sept prélèvements de sang sous anesthésie espacés de deux semaines, 26 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur décrit l'irradiation, les transplantations, les prises de sang et l'anesthésie comme des nuisances, et ajoute que les pesées peuvent être source d'angoisse. L'objectif déclaré porte sur les mécanismes des défauts de production des cellules du sang dans la drépanocytose. Les bénéfices annoncés, un "nouvel arsenal thérapeutique" dans un futur proche, relèvent d'un programme plus large, quand la caractérisation du système hématopoïétique de ces 26 souris exige leur mise à mort.
Objectifs
L’objectif de notre étude est l’évaluation des mécanismes cellulaires et moléculaires associés aux défauts d’hématopoïèse et d’érythropoïèse dans le cadre de la drépanocytose.
Bénéfices attendus
Nous espérons que cette étude nous permettra de mieux clarifier les mécanismes physiopathologiques associés à la drépanocytose afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Ce programme s’inscrit dans un projet plus global qui devrait permettre également d’identifier les mécanismes d’action et l’efficacité de candidats médicaments afin d’offrir dans un futur proche un nouvel arsenal thérapeutique dans la prise en charge de la drépanocytose.
Procédures
L’ensemble des animaux subira une exposition à des rayonnement X (90sec), une transplantation de cellules sanguines et une série de 7 prélèvements sanguins sous anesthésie (3min) tous espacés de 2 semaines.
Impact sur les animaux
Les transplantations, l’irradiation, les prélèvements sanguins et l'anesthésie constitueront une nuisance pour les animaux. L'ensemble des manipulations, ainsi que les pesées peuvent être source d'angoisse.
Devenir
Les 26 souris impliquées dans ce projet feront l’objet d’une caractérisation de leur système hématopoïétique qui nécessitera leur mise à mort.
Remplacement
Les nombreux partenaires (cellulaires et moléculaires) des processus dynamiques d’hematopoïèse, et d’éyrthropoïèse nécessitent une approche expérimentale in vivo car il n’existe pas à ce jour de système suffisamment fiable pour mimer cette complexité biologique.
Réduction
En nous appuyant sur un test d'effectif, nous utiliserons le nombre minimum d’animaux requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre l’objectif scientifique du projet, à savoir de déterminer s’il y a ou pas un épuisement des cellules souches hématopoïétiques dans le contexte pathologique d’une drépanocytose. Ce calcul d’effectif sera réalisé sur la base d’une expérience pilote qui implique elle-même un nombre minimum d'individus déterminé sur la base de données de la littérature. La comparaison des différentes conditions expérimentales se fera par des tests statistiques adaptés à ces petits effectifs.
Raffinement
Le suivi du développement hématopoïétique transplanté se fera par des mesures utilisant un procédé peu invasif à partir de prélèvements sanguins réalisés sous anesthésie. Afin d’améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, enrichissement, stabulation en groupe). Les animaux seront hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température : 20-22°C ; renouvèlement d’air : 15 volumes/heure; éclairage artificiel : 12h jour/12h nuit). Afin de respecter leur instinct grégaire, les souris seront stabulées par petits groupes de 3 à 5 dans des cages dont l’environnement est enrichi à l’aide de copeaux de bois compactés, de coton et de dômes en carton. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée (comme par exemple l'apport d'un analgésique) à mener en fonction d’une grille de score du bien-être.
Choix des espèces
Le projet nécessite l’utilisation d’une espèce de la classe des mammifères proches de l’homme pour sa physiologie. Les données bibliographiques démontrent que le modèle murin est le plus adapté pour adresser les questions relatives à l’hématopoïèse, à l’erythropoïèse et à la thrombose. En effet les caractéristiques moléculaires des cellules hématopoïétiques murines sont très semblables aux cellules hématopoïétique humaines. Nous utiliserons des souris de 8-9 semaines qui ont un age compatible avec l’exposition à l’irradiation nécessaire à déplétion hématopoïétique.
Impact de la craniectomie décompressive sur la neuroinflammation après un AVC ischémique malin.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Système nerveux
Une grande partie de la voûte crânienne retirée, la peau seule refermée sur le cerveau : 660 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus. 160 subissent cette craniectomie, 160 un accident vasculaire cérébral provoqué, 180 les deux combinés, 160 constituant le groupe témoin avec des incisions cutanées refermées. Le porteur indique que le déficit neurologique provoqué peut entraîner des difficultés à se mouvoir, à se nourrir et à s'hydrater, ainsi que des troubles de la vigilance pouvant conduire au décès. Il affirme que ces procédures ont un caractère de "stricte nécessité" et ne peuvent être remplacées, tout en écrivant que le bénéfice de la craniectomie décompressive est déjà démontré chez les patients.
Objectifs
L’accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique est une pathologique fréquente et grave dont un des traitements standards est l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA). Le tPA, par son action lytique sur le caillot fibrino plaquettaire, restaure le flux d’une artère occluse et améliore le pronostic neurologique du patient lorsqu’il est mis en place précocement. Un AVC malin est un type particulier d’AVC qui présente un volume important et notamment plus de 50% du territoire de l’artère sylvienne. Il est associé à plus de 80% de mortalité. La craniectomie décompressive (CD), procédure courante en neurochirurgie, permet de limiter à 30% le taux de mortalité de ces AVC. Elle consiste à retirer une grande partie de la voûte crânienne et à ne fermer que la peau sur le cerveau. Cela permet de limiter la compression du cerveau, de diminuer la pression intracrânienne et d'améliorer la perfusion cérébrale. Son bénéfice a été clairement démontré en clinique. Elle limite le risque de lésions cérébrales secondaires et diminue donc le risque de handicap séquellaire lourd. Cependant, même si la craniectomie décompressive présente un bénéfice à court terme en contrôlant l'augmentation de la pression intracranienne, il est probable que le fait de laisser le patient sans voûte crânienne puisse modifier la physiologie cérébrale, ainsi que les phénomènes secondaires à l’œuvre après une lésion cérébrale. Il est décrit dans la littérature que la voute cranienne est composé de niches de leucocytes. Dès lors, enlever la voûte cranienne pourrais influencer la neuroinflammation qui est un phénomène central lors d'un AVC.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales mais aussi translationnelles ou appliquées menées pour différentes pathologies où cette interaction joue un rôle (AVC et processus inflammatoires). Nous souhaitons évaluer l’évolution de la neuro inflammation lors de la réalisation d’une craniectomie et notamment mettre en évidence une modification de l’infiltrat leucocytaire. Cela permettra d’améliorer nos connaissances sur les craniectomies décompressives, et donc potentiellement d’en affiner les indications et les caractéristiques techniques. Ainsi, nous espérons améliorer la prise en charge future des patients.
Procédures
L’ensemble des animaux de la procédure seront soumis à une craniectomie décompressive (n = 160 ; 15 minutes), un modèle d’AVC (n = 160 ; 75 minutes), ou la combinaison des 2 techniques (n = 180 ; 90 minutes). Le groupe « sham » subira des incisions cutanées, ensuite refermées (n = 160 ; 5 minutes). 24 heures et 5 jours après, chaque animal fera l'objet d’un examen par Imagerie par Résonnance Magnétique (IRM) (n = 660 , 45 minutes), ainsi qu’une évaluation comportementale (n = 660, 2 minutes). Un génotypage par biopsie sur la queue sera effectué à 1 semaine de vie pour les souris transgéniques (n=560).
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les rongeurs seraient pour toutes les procédures : une perte de poids, des douleurs post-opératoires, du stress. La procédure d’AVC provoque un déficit neurologique qui peut entrainer une situation anxiogène importante associée à de difficultés pour se mouvoir, se nourrir et s‘hydrater. L’augementation de la pression dans la tête peut être à l’origine de troubles de la vigilance et peut conduire au décès. En plus, on peut noter des dysrégulations thermiques et des troubles hydroélectrolytiques dans le contexte de souffrance cérébrale. La biopsie de la queue lors du génotypage peut entrainer une douleur légère et de courte durée.
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure afin de générer des tissus permettant des observations histologiques ou par quantification du traceurs injectés de l'intégrité anatomique et vasculaire du système nerveux central (SNC).
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. Au vu de l’implication à la fois locale et systémique de l’inflammation, il est nécessaire de réaliser les procédures in vivo. De plus, nous souhaitons évaluer l’inflammation dans la moelle osseuse, les méninges et le parenchyme ce qui implique d’avoir un ensemble de tissus (méninges, parenchymes…) non modélisables actuellement.
Réduction
Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité. Dans chaque phase du projet, le minimum d’animaux a été prévu afin d’arriver à des résultats qui soient en adéquation avec les tests statistiques prévus lors de ce projet et des données de la littérature sur la neuroinflammation. Les procédures décrites ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas d'animaux. De plus, des méthodes d’études non invasives telle que l’imagerie par résonnance magnétique sont utilisées dans ce projet afin de faire un suivi longitudinal des animaux, permettant de recueillir de nombreuses données sans augmenter le nombre d’animaux.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les animaux sont hébergés dans des cages standards aux normes européennes. Le bien-être des animaux est contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne et hebdomadaire permettra de détecter tout signe clinique de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à cette détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire montre que les animaux se déplacent et s’alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l’oreille humaine et ne présentent aucun « sickness behavior syndrom ». Les animaux seront également placés dans un environnement enrichi : 5 souris par cage maximum, coton, paillettes, petite maison. Pendant les 48h critiques au modèle, les animaux seront également évalués et pesés 3 fois par jour pour surveiller les points limites. Une mise à mort sera réalisée si les points limites sont atteints et non reversés. Durant la mise en place des modèles, les souris seront sous anesthésie générale et sous analgésie. Les animaux recevront également une anesthésie locale sur la peau au niveau cervical et/ou crânien. Les yeux des souris seront couverts afin de ne pas les éblouir avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir de la déshydratation. Après chirurgie, les souris disposeront d’une couverture analgésique. Au vu des difficultés d’alimentation attendues, nous leur disposeront des croquettes humides dans une coupelle sur le sol de leur cage et mettrons également du « diet gel ».
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine du neurodéveloppement, les AVC et les techniques employées sont bien connues. L’anatomie du SNC murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Les expériences envisagées nécessitent l’utilisation d’animaux transgéniques. Ces modèles transgéniques ne peuvent être réalisés que chez la souris. Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’Homme. Concernant l’ensemble des procédures, seuls des animaux adultes âgés de 6-12 semaines seront nécessaires. Ceci se justifie par le fait que l’AVC touche principalement les adultes. De plus, les études antérieures concernent également des modèles murins adultes. Dans ce sens, afin de faciliter le comparatif, nos souris le seront également.
Oestradiol et déconditionnement musculaire chez la souris KI-Dnm2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
Porteuses d'une mutation du gène de la dynamine qui reproduit une myopathie humaine, 300 souris vont être utilisées, la moitié dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, l'autre moitié dans des procédures d'un niveau sévère. Les femelles subissent une ovariectomie, l'implantation sous la peau de pastilles d'œstradiol, des prises de sang et une mesure invasive de force musculaire, les mâles recevant deux implantations à quinze jours d'intervalle. Le porteur affirme que cette myopathie n'est associée ni à une souffrance de l'animal ni à une altération de sa mobilité, alors que 150 souris sont déclarées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Toutes sont tuées au terme de chaque procédure pour prélever leurs tissus et leur sang.
Objectifs
La myopathie centronucléaire autosomale dominante (MCN-AD) est principalement due à la mutation du gène dynamine. Le modèle murin de cette pathologie exprime à l’état hétérozygote la mutation la plus fréquemment retrouvée chez l’homme. Elle présente un retard de croissance musculaire et une perte de force musculaire entre 4 et 8 semaines d’âge. De façon intéressante, nos données préliminaires suggèrent l'existence d'une différence d'évolution de la maladie entre les mâles et les femelles. Par ailleurs, des éléments bibliographiques indiquent que les œstrogène, hormones feminines, s exercent un effet bénéfique sur la synthèse de protéines du muscle et procurent une résistance à la fatigue musculaire. Dans ce contexte, notre hypothèse générale est que les œstrogènes confèrent un effet protecteur aux souris femelles face au développement de la myopathie. L'objectif de ce projet consistera donc à vérifier si les œstrogènes procurent un effet protecteur dans l'évolution de la myopathie centronucléaire et comment transposer cet avantage aux souris males.
Bénéfices attendus
En déterminant le rôle protecteur potentiel des oestrogènes lors de la mise en place des symptomes de la myopathie centronucléaire ce projet permettra de développer notre compréhension des mécanismes mis en jeu lors de ce déconditionnement, et de proposer des stratégies d'intervention basées sur l'utilisation de modulateurs de l'activité du récepteur aux oestrogènes.
Procédures
Pour déterminer si l'oestradiol exerce un effet protecteur face au déconditionnement musculaire des souris femelles, les souris femelles seront soumises aux interventions suivantes: ovariectomie (durée totale 15 min), implantation sous-cutanée de pastilles (diamètre 3,5 mm, épaisseur 2 mm) contenant de l'oestradiol (durée totale 3 min), prélèvement sanguin (5 min), mesure de force musculaire (45 min), prélèvements tissulaires (15 min). Pour déterminer si l'oestradiol exerce un effet protecteur face au déconditionnement musculaire des souris mâles, les souris mâles seront soumises aux interventions suivantes: 2 implantations à 15 jours d'intervalle sous-cutanée de pastilles contenant de l'oestradiol (durée totale 3 min x 2 ), prélèvement sanguin (5 min), mesure de force musculaire (45 min), prélèvements tissulaires (15 min).
Impact sur les animaux
La procédure d'ovariectomie et d'implantation sous cutanée de la pastille sont susceptibles d’engendrer des douleurs post-chirurgicales chez les souris. La mesure de force musculaire de part son invasivité peut générer des douleurs imperceptibles chez l'animal du fait de la profondeur de l'anesthésie. Nuissances en lien avec les prélèvement sanguins : les prélèvements au bout de la queue seront réalisée sous anesthésie générale gazeuse. A l'issue de cette prise de sang, les souris seront injectées avec un mélange kétamine et xylazine en vue de la réalisation d'une procédure de prélèvements tissulaires sans réveil Aucune nuisance n'est donc attendue compte tenu de l'état de l'animal au moment du prélèvement et du volume prélevé.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort de façon réglementaire et éthique au terme de chaque procédure afin de réaliser des prélèvements tissulaires et sanguins.
Remplacement
L’atteinte de la masse et de la fonction musculaire associé à la myopathie centronucléaire autosomale dominante est un processus multifactoriel sollicitant de nombreux tissus, le muscle bien évidement, mais aussi le système neuroendocrinien (axe gonadotrope). Un système expérimental in vitro ne permettrait pas de reproduire la complexité de ces régulations. Seul un modèle animal murin permet de reproduire la complexité des mécanismes biologiques mis en jeu.
Réduction
Nous avons calculé l'effectif par groupe sur la base du critère d'évaluation principal, à savoir la force musculaire, à l'aide d'un outil statistique prenant en compte les données de la littérature pour anticiper sur la variabilité des résultats dans notre projet. Pris en semble, ces prévisions indiquent que 14 animaux par groupe seront nécessaires. Afin d'anticiper le cas rare où une interruption précoce de la procédure serait nécessaire pour certains animaux, nous prévoyons des lots de 15 animaux par groupe. Ces animaux supplémentaires ne seront inclus qu’en cas de besoin afin d’obtenir au final les 14 animaux par groupe nécessaires à la significativité des résultats.
Raffinement
L'hébergement des animaux leur permet d'avoir accès à un enrichissement (dômes et coton) suffisant et stimulant pour réaliser leur nid. Les animaux seront hébergés par 2 à 4 individus par cage dans un local à température contrôlée avec un cycle lumière/obscurité de 12H00. Les souris auront libres accès à l'eau et à la nourriture. Afin de réduire le stress des animaux, les souris seront habituées aux expérimentateurs qui les manipuleront de façon bi-hebdomadaire (suivi de poids, apparition de signes évocateurs de souffrance) à partir de l'âge de 3 semaines. Une observation des animaux sera réalisée toutes les 2 heures pendant 6 heures après la réalisation des procédures, puis toutes les 24H00 afin de déceler l'apparition des signes généraux évocateurs de souffrance. Les animaux seront scorés sur 3 critères, le changement de poids corporel, l'apparence physique, et le comportement.
Choix des espèces
La totalité des données dans le domaine du déconditionnement musculaire associé à la MCN-AD et l'ensemble des techniques utilisées ont été développés chez la souris. Nous pourrons donc interpréter nos données à la lumière des déjà publiées ou acquises au laboratoire. La myopathie centronucléaire autosomale dominante (MCN-AD) est une myopathie modérée qui n'est pas associé à une souffrance de l'animal, ni à une altération de leur mobilité ou de leur comportement. Leur durée de vie, leur fertilité et leur vieillissement sont dans la norme des souris sauvages. Le phéntoype de la souris reste modérée tout au long de sa vie etdans les conditions d'hébergement que nous lui proposons. Il n'y a pas de détérioration majeur de son état physiologique au delà de la mise en place du phéntoytpe au cours de la croissance post-natale. Aucune donnée de la littérature ne suggère une agravation de son phénotype quelques soient les conditions d'hébergement ou expérimentales. Les souris seront utilisées à partir de l'âge de 4 semaines. La fin de procédure aura lieu a l'âge de 8 semaines. En effet les symptômes apparaissant entre l'âge de 4 et 8 semaines, un traitement pendant cette période permettra de vérifier l'efficacité de thérapie basée sur l’utilisation de substances hormonales.
Exploration de l’efficacité d’un inhibiteur de nécrose régulée dans un modèle de lésions hépatiques (chirurgie et greffe du foie) chez le modèle porcin
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Une transplantation du foie, ou une interruption puis une reprise de la circulation artérielle hépatique, est pratiquée sur 71 cochons de 30 à 35 kilos. Cinquante d'entre eux relèvent de procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, seize sont opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil, cinq relèvent d'un niveau modéré. Chacun subit des biopsies du foie au poinçon de quatre millimètres avant, pendant et après l'ischémie, puis des prélèvements de sang une heure avant l'opération et à trente minutes, une heure, trois heures et chaque jour après la greffe, en cage individuelle. L'ensemble teste une molécule candidate contre les lésions d'ischémie-reperfusion, les cochons donneurs de foie étant tués immédiatement après la chirurgie et les receveurs sept ou quatorze jours après leur réveil.
Objectifs
L’ischémie correspond à la diminution ou à l’arrêt de la circulation artérielle dans un tissu ou organe, tandis que la reperfusion correspond à la reprise de cette circulation. Les lésions d'ischémie/reperfusion (IRI) hépatiques sont une complication majeure de la chirurgie du foie, notamment la résection (enlèvement) hépatique, la transplantation hépatique et la chirurgie traumatique. Ces événements physiopathologiques influencent considérablement le pronostic de la fonction hépatique et une méthode de prévention ou de traitement efficace fait toujours défaut. La mort cellulaire est un indicateur pathologique constant de l'IRI. Par conséquent, il semble probable que l’inhibition de la cascade de mort cellulaire associée à l'IRI pourrait constituer une nouvelle stratégie thérapeutique actuellement non satisfaite. L’objectif de ce projet est de tester les effets d’une nouvelle molécule (SBL01) appartenant à la famille des inhibiteurs de mort cellulaire. Au cours de ce projet, SBL01 sera évaluée comme candidat médicament pour le traitement des lésions hépatiques d’ischémie-reperfusion, sur des modèles d’ischémie hépatique et transplantation chez le modèle porcin.
Bénéfices attendus
Il n’existe pas actuellement de petites molécules proposées pour la protection du foie ou des greffons contre les lésions d’ischémie-reperfusion. La molécule d’intérêt, candidat médicament que nous souhaitons tester, trouverait de nombreuses applications dans le domaine de la chirurgie hépatique et de la transplantation. La plupart des solutions en développement se focalisent davantage sur les modalités de conservation des greffons dans l’objectif d’améliorer l’oxygénation des organes. La solution proposée dans ce projet, c’est-à-dire l’inhibition de la mort cellulaire par administration (supplémentation des solutions ou par voie systémique) d’une molécule thérapeutique serait pionnière.
Procédures
Des échantillons de sang de 0,5-1 mL seront prélevés 1h avant la chirurgie du foie, puis 30 min, 1h, 3h, et chaque jour après la transplantation. Des biopsies hépatiques seront prélevées à l'aide d'un poinçon stérile de 4 mm avant l'ischémie (arrêt de la circulation artérielle), à la fin de l'ischémie et après la reperfusion (reprise de la circulation artérielle), sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Douleur/lésion physique après intervention chirurgicale. Toxicité éventuelle du produit injecté pouvant induire un stress physique. Stress psychosocial léger du fait de l’hébergement en cages individuelles, même si les animaux ont toujours des contacts visuels et auditifs avec des congénères.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort soit immédiatement après chirurgie sous anesthésie générale (animaux donneurs de foie), soit 7 ou 14 jours maximum après le réveil post-chirurgie (animaux receveurs et selon la phase du protocole) afin de pratiquer des prélèvements post-mortem à des fins d'analyses biologiques.
Remplacement
Les objectifs de ce projet sont d’une part d’évaluer la pharmacocinétique d’une nouvelle molécule pour atteindre une concentration plasmatique efficace qui permettra de réduire les lésions d’ischémie/reperfusion hépatiques (i.e. arrêt et reprise de la circulation artérielle) en inhibant la cascade de mort cellulaire associée, et d’autre part de tester les effets in vivo de cette molécule chez le modèle porcin au travers de deux modèles d’ischémie hépatique et transplantation. Cette nouvelle molécule doit impérativement être testée sur un modèle in vivo pertinent avant de l’appliquer à une étude clinique chez l’humain. Le porc est l’animal de référence pour l’expérimentation médicale sur les greffes d’organes. Son système digestif, son anatomie et sa physiologie générales sont proches de ceux de l’humain.
Réduction
Comme précédemment validé et publié, un effectif de 5 animaux par traitement représente le strict minimum nécessaire pour observer des différences significatives entre groupes expérimentaux dans le domaine des modèles d’ischémie (arrêt de la circulation artérielle) et de transplantation hépatique, mais nous avons décidé d’inclure 8 animaux par groupe/traitement afin de garantir une puissance statistique satisfaisante tout en palliant d’éventuels imprévus.
Raffinement
Les techniques d’anesthésie et de chirurgie employées utilisent des appareillages de pointe et seront réalisées par des chirurgiens spécialistes de la transplantation hépatique chez l’humain, avec l’aide de personnels compétents en anesthésie et analgésie porcine. Le suivi et l’analgésie post-opératoires des animaux seront effectués par des personnels compétents de manière à réduire la douleur et la souffrance des animaux. Toutes les interventions chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale et respecteront la charte nationale d’éthique sur l’expérimentation animale. Une prise en charge de la douleur per- et post-opératoire sera effectuée avec un traitement analgésique adapté à l'espèce et aux procédures. Des points limites précis ont été établis et une grille optimisée pour l'évaluation de la douleur et du bien-être animal sera utilisée.
Choix des espèces
Le porc est l’animal de référence pour l’expérimentation médicale sur les greffes d’organes. Son système digestif, son anatomie et sa physiologie générales sont particulièrement proches de ceux de l’humain. Porcs en croissance (30-35 kg)
Identification de molécules pour traiter un stress chronique imprévisible (CUS) chez la souris et évaluation du comportement 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles nerveux
La finalité annoncée est d'offrir à des entreprises pharmaceutiques ou nutraceutiques, publiques ou privées, la validation in vivo de leur molécule comme antidépresseur. 1 500 souris vont être utilisées, 1 250 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour mesurer la motilité intestinale et des marqueurs cérébraux. Chacune subit un stress différent par jour pendant huit semaines, contention, stress olfactif, stress social, stress environnemental, perturbation du rythme circadien, puis huit jours de tests comportementaux dont un test de préférence au sucrose imposant cinq jours d'isolement et un autre, non nommé, plaçant l'animal dans une position inconfortable. Le porteur qualifie chaque stress de léger pris isolément, et l'accumulation de l'ensemble de classe sévère.
Objectifs
Le projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs -EU 1/2 et EU 2/2/). Aujourd’hui, la recherche sur la dépression est entravée par la complexité des facteurs induisant cette maladie. Par ailleurs, il est connu que le stress chronique imprévisible (CUS), assimilé à la dépression, est un modèle de fragilisation de la barrière intestinale. Ce modèle CUS validé par la communauté scientifique chez la souris, permet la découverte de nouvelles molécules (probiotiques, prébiotiques, molécules pharmacologiques) agissant sur le système digestif afin de diminuer la dépression. Notre objectif est donc d'offrir à des entreprises pharmaceutiques ou nutraceutiques, publiques ou privées, une validation in vivo de leur molécule (probiotiques, prébiotiques, molécules pharmacologiques) et montrer qu'elle peut être un traitement antidépresseur. La dépression affecte 15% de la population. Ces chiffres n’ont cessé d’augmenter depuis les années 70 ce qui en fera la pathologie la plus coûteuse d’ici 2030 selon l’OMS. Les traitements actuels sont insuffisants puisqu’il existe un risque de récidive de l’ordre de 50% au bout de 6 mois d’arrêt de traitement. De plus, jusqu’à 80% des suicides sont le fait d’individus dépressifs. Par ailleurs, la recherche sur la dépression est entravée par les effets indésirables de certains antidépresseurs (troubles du sommeil etc) ainsi que par la complexité des facteurs induisant cette maladie (sociaux, psychologiques et biologiques). Ainsi, la pathologie de la dépression est un problème majeur de santé publique qui nécessite de nouveaux traitements.
Bénéfices attendus
Il est connu que les antidépresseurs ont de nombreux effets indésirables. De plus, de nombreuses études ont démontré, lors d’études précliniques et cliniques, qu'à la dépression sont associés une altération de la fonction de barrière intestinale ainsi qu’un déséquilibre de la flore intestinale. La découverte de nouvelles molécules agissant sur le système digestif est donc considérée comme une avancée thérapeutique majeure pour traiter le syndrome dépressif.
Procédures
Les différents types d'intervention se feront sur animal vigile uniquement. Parmi 60 souris, 10 représentent le groupe contrôle (sans intervention) appelé G1. Pour développer un stress chronique et imprévisible chez la souris (e.g dépression), des stress différents vont être utilisés sur les 8 semaines de protocole de stress (CUS). Un seul stress par jour va être appliqué à l'animal pendant 8 semaines. Les différents types de stress sont des stress de contention, stress olfactifs, stress sociaux, stress environnementaux, et une perturbation du rythme circadien. Le second groupe (G2) subira ces stress pendant 8 semaines. Le troisième groupe (G3) subira le protocole de stress pendant 8 semaines et recevra un traitement antidépresseur connu. Ce groupe permet de comparer les effets des molécules à tester contre la dépression avec l’antidépresseur connu. Enfin, les souris du quatrième groupe (G4) subiront également les protocoles de stress associés à un traitement à tester (probiotique, prébiotiques par exemple). Cette étape d'induction d'un stress chez l'animal s'effectuera dans l'EU ½. Après 8 semaines, une évaluation comportementale des souris sera effectuée dans l’EU 2/2. Le niveau d’anxiété des animaux, leur activité exploratoire, ainsi que leur état “dépressif” sera évalué au moyen de tests de comportement sur une période de 8 jours.
Impact sur les animaux
Les souris des groupes stressés ou CUS seront soumises à un stress, une fois par jours pendant 8 semaines consécutives. Sur la durée, les animaux soumis à différents stress présenteront un pelage moins bien entretenu sans présenter de blessure ni d’anomalies physiques graves. Ces animaux vont subir certaines contraintes d'une courte durée (une fois par jour, le matin). L’intensité de la nuisance de ces stress cumulés est modérée. De plus, le groupe stressé recevant le traitement avec l’antidépresseur de référence recevra une injection quotidienne tout le temps du protocole de stress (8 semaines). L’intensité de la nuisance de ces injections répétées est modérée. Le dernier groupe recevra par voie orale le traitement à tester pendant la durée du protocole. L’intensité de la nuisance de ces gavages sur 8 semaines est faible. Les animaux vont également subir des contraintes de courte durée pendant les tests comportementaux, et notamment lors d’un test de comportement au cours duquel les animaux seront placés dans une position inconfortable pendant quelques minutes. L’intensité de la nuisance de ce test est modérée. Lors du test de préférence au sucrose, les souris vont être placées en cage individuelle pendant 5 jours afin de mesurer leur consommation hydrique. L’intensité de la nuisance due à l’isolation des animaux pendant 5 jours consécutifs est modérée.
Devenir
Les souris seront ensuite mises à mort afin d'étudier la motilité intestinale de ces souris grâce à des capteurs isotoniques. De plus en post mortem, l'analyse de marqueurs spécifiques d'un état dépressif sera effectuée sur différentes parties du cerveau.
Remplacement
Pour identifier des probiotiques ou molécules capables de diminuer la dépression, nous avons besoin d’individus vivants en contact ou non avec des agents stressants détaillés dans les procédures. En effet, l’état dépressif implique un contexte psychosocial, physique et physiologique particulier et leur combinaison est essentielle à son installation. De plus notre projet implique la communication inter-organes (intestin-cerveau), il n'est donc pas possible de se passer d'organismes complets. Malheureusement aucune méthode alternative in vitro ou in silico n’est disponible pour répondre à la problématique posée.
Réduction
Le modèle de stress chronique imprévisible ou CUS est un modèle détaillé et validé dans la littérature. De plus, la souris est un modèle de référence dans l’étude des désordres psychiques comme la dépression. Notre maîtrise de l’utilisation de la souris nous permet de limiter le nombre d’animaux. Par ailleurs, notre protocole de stress a été soumis à une veille bibliographique minutieuse et validé par différents spécialistes du secteur. Les effectifs ont été optimisés afin d’assurer la reproductibilité de nos résultats tout en tenant compte de la variabilité inter-individuelle.
Raffinement
Les stress pris individuellement peuvent être qualifiés de léger, en raison de leur brièveté. Deux des tests comportementaux peuvent être chacun considéré comme modérée, du fait de l’inconfort et de l’isolement nécessaire à leur exécution. Le temps de repos entre chaque test comportemental bien qu'important et suffisant pour permettre un retour à la normale de l’état des animaux, l'accumulation de l'ensemble de ces stress nous semble de classe sévère. C'est pourquoi la surveillance des animaux et surtout leur comportement seront observés avec une grande vigilance. Les conditions d’élevage des animaux non stressés seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement du milieu. Une surveillance quotidienne de chaque souris sera effectuée. La préhension des souris s'effectuera avec une nouvelle technique "main en coupe" permettant de limiter au maximum le stress de l'animal en dehors des procédures expérimentales de stress.
Choix des espèces
La souris est un des modèles utilisés pour mimer parfaitement le syndrome de la dépression chez l’Homme. En effet, de nombreuses publications justifient cet animal comme modèle à l’instar du rat. Nous souhaitons nous affranchir de la période de croissance des animaux. La souris est un des modèles utilisés pour mimer parfaitement le syndrome de la dépression chez l’Homme. Nous souhaitons nous affranchir de la période de croissance des animaux (pas d'induction de la dépression à cet âge), de ce fait les animaux auront à minima 8 semaines (âge adulte).
SEPSISmique : Etude de la réponse immunitaire mise en place sur un modèle murin de sepsis via CLP (Coecal Ligature Ponction)
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
2 776 souris vont être utilisées, 2 492 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour l'analyse du sang, des poumons, de la rate, des reins et de la moelle osseuse. Chacune subit une chirurgie abdominale de ligature et ponction du cæcum qui déclenche un sepsis, avec douleurs abdominales et viscérales et environ 30 % de décès annoncés. Selon le lot, s'y ajoutent jusqu'à quarante injections sous-cutanées d'antibiotique, une injection intra-trachéale de pathogène sous anesthésie, ou la pose d'une chambre d'observation entre les côtes pendant deux heures sans réveil. Le porteur écrit que des progrès considérables ont été accomplis dans la compréhension du sepsis sans qu'aucune nouvelle thérapie spécifique n'ait vu le jour, et annonce un effectif incluant 10 % de mortalité chirurgicale.
Objectifs
Le sepsis est défini comme un état aigu de dysrégulation de la réponse de l'organisme, un dysfonctionnement d’organes, potentiellement mortel, dont la forme la plus grave est le choc septique. La plupart du temps, le sepsis est la conséquence d’un infection bactérienne, virale, fongique ou parasitaire entraînant la perte de fonction des organes et un risque vital pour le patient. La gravité du sepsis n’est pas seulement liée à l’infection en elle-même. Elle est également due à un diagnostic souvent tardif car la cause et la symptomatologie sont variées et une très grande hétérogénéité existe dans la prise en charge des patients. En France, la mortalité des patients hospitalisés pour un sepsis est de 25 pourcent, mais la mortalité du choc septique peut atteindre 50 pourcent ; on estime à plus de 60 000 le nombre de décès annuels consécutifs au sepsis. Un doublement du nombre de cas d’ici cinquante ans est suggéré, s’expliquant notamment par le vieillissement de la population. De plus, une part importante de patients regagnant leur domicile présente un risque accru de décès précoce ou de complication dans les années suivant son sepsis. L’OMS recommande à l’ensemble des états membres de réagir face au sepsis notamment via un meilleur diagnostic, une meilleure compréhension des mécanismes immunitaires mis en jeu et une recherche de traitements efficaces. Ces dernières années, des progrès considérables ont été accomplis dans la compréhension de la physiopathologie associée au sepsis mais aucune nouvelle thérapie spécifique n’a vu le jour. Le corps médical ne dispose que de peu de traitement et aucun traitement ni aucune prise en charge n’est universel ni pleinement efficace pour cette pathologie. En effet, le sepsis présente des causes et symptômes variés ; il est donc difficile de mettre en œuvre une thérapie unique et efficace sur tous les patients. En ce sens, des investigations exhaustives sont nécessaires afin d’avoir une compréhension globale des mécanismes mis en jeu lors du développement du sepsis et une meilleure connaissance des différents acteurs intervenants dans l’inflammation et l’immunité.
Bénéfices attendus
L'ensemble de nos investigations vises à apporter des pistes pour répondre aux questions rencontrées en clinique chez les patients septiques. Nous espérons identifier une signature immunitaire spécifique et précoce de la sévérité de la maladie. Nous souhaitons contribuer à une meilleure compréhension de l'impact de comorbidités sur la réponse immunitaire mise en place lors d'un sepsis. Nous souhaitons également appréhender plus finement l'impact d'un sepsis sur la réponse immunitaire mise en place lors d'une infection secondaire. Et enfin, nous aimerions mieux comprendre l'impact de différents traitements sur la réponse immunitaire mise en place.
Procédures
Selon l'étude menée, les animaux ne recevront pas l'ensemble des actes (traitement antibiotique OU molécule thérapeutique en injection intraveineuse OU injection thérapeutique en injection intrapéritonéale OU injection intra-trachéale comme détaillé par la suite, idem pour les traitements terminaux : injection IV pour suivi des populations immunitaires puis prélèvement de sang OU chirurgie visant à la pose d'une canule puis pose d'une chambre intercostale). Les animaux seront soumis aux actes suivants. - Chirurgie abdominale afin de réaliser un sepsis par ligature et ponction du caecum CLP (la chirurgie devrait durer 10 à 15 minutes) sur animal analgésié et anesthésié pré et post-opératoire. : 1 seule fois. - Injection thérapeutique en sous-cutanée d'antibiotique sur animal vigile toutes les 24h (quelques secondes, 6 à 40 fois au maximum seulement sur les lots concernés) - OU Injection thérapeutique intra-veineuse sur animal vigile (2 à 3 minutes, 3 à 11 fois au maximum.) - OU Injection thérapeutique intra-péritonéale sur animal vigile (quelques secondes, 5 à 20 fois au maximum) - OU Chirurgie visant à l'injection intra-trachéale de pathogène sur animal analgésié et anesthésié pré et post-opératoire. Cette intervention durera 5 à 10 minutes, une seule fois. - Injection intraveineuse d’une solution permettant de réaliser un suivi des cellules immunitaires sur animal anesthésié, quelques secondes, une seule fois. - Prélèvement de sang sur animal anesthésié, 30 secondes, 1 seule fois. - Chirurgie visant à la pose d’une canule dans la trachée permettant de maintenir l’aération des voies respiratoires et l'anesthésie des animaux (durée : environ 10 minutes, une seule fois) sur animal analgésié et anesthésié. - Pose d’une chambre d’observation en intercostal (durée de la procédure 2 heures en moyenne, 1 seule fois) sur animal analgésié et anesthésié pré-opératoire, il n'y aura pas de réveil des animaux en fin de procédure chirurgicale. - Euthanasie par méthode réglementaire, quelques secondes, 1 seule fois.
Impact sur les animaux
Les animaux impliqués dans ces expérimentations seront tous soumis au stress lié à l'expérimentation (pesée, administration de traitement). Les animaux auront tous une chirurgie abdominale, ils sont donc susceptibles de subir les nuisances suivantes : risque de détresse respiratoire lors de l’anesthésie, rougeurs et inflammation au niveau de la plaie, arrachages de points, croûte… Les animaux recevant une CLP (Coecal Ligature Ponction) développeront un sepsis et donc les symptômes suivants : douleurs abdominales et viscérales, développement d'une infection et d'une inflammation pouvant évoluer vers un abcès, et dans environ 30 pourcent des cas, conduire au décès de l'animal. Nous souhaitons tester plusieurs approches thérapeutiques susceptibles de réduire les symptômes de la CLP (administration de différents traitements).
Devenir
Le sepsis induit une réponse de l'hôte qui évolue au cours du temps et touche plusieurs organes et fonctions physiologiques. Chacune de nos procédures vise à étudier la réponse immunitaire mise en place dans différents organes. Afin de mieux comprendre ces mécanismes immunitaires et inflammatoires induites par l'hôte dans cette maladie, nous analyserons le sang, les poumons, la rate, les reins et la moelle osseuse des animaux par différentes techniques : imagerie cytométrie, histologie, transcriptomique et en microscopie in vivo. L'étude de l'ensemble de ces paramètres implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux à la fin de chacune des procédures.
Remplacement
Le développement d’un sepsis fait intervenir une réponse immunitaire de l’hôte qui est évolutive au cours du temps et qui touche plusieurs organes et grandes fonctions physiologiques. L’étude des mécanismes impliqués dans la mise en place de la réponse immunitaire dans ce contexte pathologique rend l’étude in vivo indispensable. Toutefois, nous développons en parallèle, un maximum d’approches in vitro (sang total humain, cellules mononucléaires périphériques...) dans le but de répondre à l’ensemble des questions posées dans notre projet de recherche.
Réduction
Nous utiliserons au total 2776 animaux (en incluant les 10 pourcent de mortalité dus à la chirurgie réalisée sur chacun de nos animaux). Nous avons limité au maximum nos groupes d’animaux. Pour exemple : un seul groupe contrôle pour plusieurs groupes tests. Nos études portent sur l’analyses de différents paramètres de la réponse immune dans différents organes. Ainsi pour chaque animal euthanasié, nous prélèverons un maximum d’organes afin de collecter les données pour l’ensemble des tissus. Nous nous organiserons afin d’appliquer une multi-approche expérimentale en utilisant un même organe pour différentes techniques d'évaluations cellulaires. Nous utilisons maintenant des approches d'analyse à haute dimension permettant d'obtenir un très grand nombre d'informations sur un seul animal. L'utilisation de ces technologies innovantes nous a permis de réduire considérablement le nombre d'animaux utilisés. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Nos animaux seront placés en acclimatation pendant un minimum de 7 jours avant d'entrer en procédure expérimentale. Les souris seront stabulées en portoirs avec accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. La température et l'hygrométrie seront contrôlées. Afin de stimuler les activités cognitives et exploratrices des animaux tout en satisfaisant leurs instincts naturels, le milieu des cages sera enrichi avec des nidifications biodégradables en papier kraft. Un suivi journalier de l’état de santé des animaux sera réalisé par du personnel compétent. Une pesée des animaux sera réalisée 3 fois par semaine dès la procédure chirurgicale engagée. Nous réduirons la douleur induite par nos procédures envers nos animaux en les réalisant sous anesthésie générale et en administrant un analgésique en pré- et post-opératoire. Une grille de scoring et des points limites adaptés à l’étude ont été définis
Choix des espèces
Le sepsis murin est un modèle d’étude largement utilisé et décrit présentant une physiopathologie proche de celle observée en clinique chez le patient. De plus, la souris représente le modèle animal le plus riche en outils pour l’étude du système immunitaire : nombreux anticorps de cytométrie, modèles murins porteurs de fluorescences endogènes. Cela permet d’étudier la réponse immune induite après sepsis par cytométrie en flux et par video-microscopie in vivo. Pour pouvoir tester plusieurs approches thérapeutiques, certaines souches murines seront génétiquement modifiées présentant des protéines fluorescentes, avec des gènes déficients ou remplacés. Pour étudier l’impact de facteurs de comorbidités tels que l’âge ou la surcharge pondérale, des souris âgées ou génétiquement modifiées seront utilisées. Les animaux utilisés seront des animaux adultes uniquement. Ils seront âgés de 8 à 20 semaines pour les adultes "classiques" et de 18 à 30 mois pour les adultes "âgés". En effet, le sepsis touche toutes les tranches d'âge de la population, mais le projet porte sur l'étude du sepsis de l'adulte présentant plus ou moins des comorbidités.
Maintien de lignées transgéniques modèles d’une neurocristopathie (Renouvellement)
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Les souris porteuses de l'allèle p53 muté sont tuées d'office à huit mois, pour devancer l'apparition de tumeurs spontanées. 200 souris vont être utilisées dans cet élevage, 150 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 50 un niveau sévère, avec une mortalité périnatale annoncée pour les porteuses d'une certaine combinaison génétique. Les actes déclarés se limitent à une biopsie de l'oreille de un millimètre et un tatouage d'identification. Le projet ne produit pas de résultats en propre, il entretient une lignée modèle d'une neurocristopathie, les animaux jugés intéressants partant vers un autre établissement pour d'autres projets et le reste étant tué si l'élevage s'arrête.
Objectifs
Nous avons montré que notre protéine d'intérêt est essentielle au developpement des cellules souches. Ces cellules souches donnent les os et le cartilage de la face ainsi que les neurones sensoriels et les cellules de Schwann des nerfs périphériques. L'ensemble de nos travaux montre que les modèles murins que nous avons générés développent des caractéristiques très similaires aux neurocristopathies humaines, pathologies d'origine génétique hétérogène induisant des défauts de développement des crêtes neurales. Ces maladies font partie des maladies rares. En outre, il a été montré qu'une inactivation d'un gène suppresseur de tumeur fait disparaitre totalement ou partiellement les signes cliniques de diverses neurocristopathies. C'est pourquoi nous souhaitons étudier si l'inactivation de ce gène dans nos souris, permet d'éviter ou de limiter le phénotype dommageable, renforçant l'intérêt de notre modèle comme modèle de neurocristopathie et soulignant aussi le rôle de notre protéine intérêt dans ces pathologies. Pour cela, et c'est l'objet de la présente demande, il nous faut maintenir notre élevage de souris. Les animaux aux caractéristiques interessantes pour l'étude seront transférés dans une autre EU pour intégrer différents projets.
Bénéfices attendus
Cet élevage à pour objectif de fournir des reproducteurs pour nos expérimentations dans une autre EU. Nos études apportent une meilleure connaissance du rôle du métabolisme de certaines cellules souches au cours du developpement embryonnaire et dans leurs dérivés.
Procédures
Les animaux subiront une biopsie à l'oreille de 1 mm et un tatouage d'identification. Les douleurs produites à cette occasion seront légères et de courtes durées. La biopsie et le tatouage sont sans conséquences sur le bien être des animaux.
Impact sur les animaux
Tumeurs spontanées à partir de l'âge de 8 mois pour les animaux porteurs de l'allèle muté du gène suppresseur de tumeur. Mort périnatale pour les animaux porteurs de la combinaison génétique neutralisant notre gène d'intérêt.
Devenir
Les animaux produits ont pour vocation de maintenir notre modèle et de fournir des animaux pour les projets de recherche que nous menons dans un autre EU. A la fin de la procédure d'élevage, si nos projets de recherche sont prolongés ou bien si d'autres projets font l'objet d'un financement au delà de la période de cette DAP, nous ferons une nouvelle demande d'autorisation de projet pour maintenir notre lignée. Dans le cas contraire notre lignée étant cryopréservée, nous stopperons l'élevage en procédant à la planification de l'arrêt des reproductions et l'euthanasie des animaux.
Remplacement
Nous travaillons sur des syndromes liés à des défauts de développement embryonnaire. Ces pathologies génétiques rares au tableau clinique complexe n'ont pas de modèle in vitro. En parallèle d'études des mécanismes moléculaires in vitro sur une lignée de cellule de crêtes neurales, il est nécessaire d'étudier le devenir de ces cellules in vivo, dans leur microenvironnement. Pour étudier l'impact réel des modifications génétiques sur l'évolution de ces pathologies, nous devons faire naitre des animaux.
Réduction
Nous ne faisons pas de croisement produisant les phénotypes sévères et létaux à la naissance, ce qui réduit fortement le nombre d'animaux à phénotype dommageable.
Raffinement
Pour les animaux porteurs de l'allèle muté p53, nous pratiquons l'euthanasie systématique à l'age de 8 mois afin d'éviter l'apparition de tumeurs spontanées. Cette méthode a montré son efficacité sur la dernière période de 5 ans au cours de laquelle l'apparition d'une tumeur a concerné moins de 2% des souris porteuses de cet allèle. Pour les 2% se souris qui peuvent présenter des tumeurs avant cette date, elles seront euthanasiées dès qu'une grosseur ou un signe de mal-être sera détecté au cours des observations quotidienne et du change des litières. Les points limites ainsi définis permettent de mettre en place des critères d'arrêt prédictifs et précis pour limiter la souffrance de nos animaux. Les conditions d'hébergement sont respectées pour nos animaux selon les recommandations gouvernementales avec, notamment, la mise en place d'enrichissement. Enfin, le personnel travaillant sur nos animaux est compétent et formé
Choix des espèces
La souris est un vertébré au developpement embryonnaire comparable au developpement embryonnaire humain avec un cyle de gestation court et des portées nombreuses. Cela permet de générer rapidement des embryons et des souriceaux. En outre la souris est un modèle courant pour l'étude des neurocristopathies. C'est notre modèle depuis une dizaine d'année et un grand nombre de nos données antérieures portent sur ce modèle. Tous les animaux ont pour fonction de maintenir la lignée. Nous les utiliserons donc à l'âge adulte.