Procédures sévères

À J0, un filament est poussé dans l'artère carotide de chaque rat pour boucher une artère du cerveau, l'animal reste éveillé environ quarante-cinq minutes avec l'artère obstruée, puis il est rendormi pour retirer le filament. Suivent des prélèvements de 500 µL de sang à J-7, J0, J1 et J7, cinq séances d'IRM sous anesthésie jusqu'à J14 et onze journées de tests comportementaux étalées jusqu'à J30. 3 120 rats vont être utilisés ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, avec des pertes d'équilibre, une faiblesse musculaire d'un côté du corps et des difficultés à manger et à boire dans les premiers jours. Le projet teste pour des partenaires industriels des molécules contre l'accident vasculaire cérébral, et se termine par l'ouverture du thorax et de l'abdomen des rats pour ponctionner le cœur et prélever le cerveau.

Objectifs

L'accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique est pathologie cérébrale causée par un caillot sanguin qui bloque une artère dans le cerveau. Actuellement, le traitement principal consiste à administrer un médicament appelé activateur tissulaire du plasminogène (tPA) pour dissoudre le caillot, parfois associé à une intervention chirurgicale appelée thrombectomie. Cependant, ces traitements ne sont pas toujours efficaces et peuvent avoir des effets secondaires graves, limitant leur utilisation à moins de 10% des patients. De plus, l'efficacité du tPA peut varier en fonction de la nature du caillot et de l’origine de la maladie. Pour améliorer la prise en charge des patients à long terme, il est crucial de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Notre projet vise à étudier chez le rongeur différentes façons d'administrer des médicaments pour voir comment ils affectent les dommages cérébraux, les saignements, la circulation sanguine dans le cerveau et la récupération après un AVC. Nous utiliserons un modèle d'AVC sévère chez le rat, largement utilisé en recherche. Cela nous permettra d'étudier comment différents traitements pourraient aider les rats à se remettre après un AVC, ce qui pourrait avoir des implications importantes pour le traitement des patients victimes d'AVC.

Bénéfices attendus

Actuellement, la prise en charge des patients en phase aigüe de la pathologie repose sur l’administration de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA), capable de dissoudre les thrombi, associée ou non à la thrombectomie chirurgicale. Cependant, en raison des effets secondaires du tPA et de la difficulté relative de la procédure de thrombectomie, seule une faible proportion des patients (

Procédures

Tous les animaux de cette DAP seront soumis à une chirurgie au niveau de la bifurcation carotidienne dans le cou afin d’induire mécaniquement un AVC ischémique via l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne par un filament inséré dans l’artère carotide externe. Cet acte chirurgical, se déroulant à J0, durera entre 20 et 30 minutes puis l’animal sera maintenu éveillé environ 45 minutes avant d’être soumis à la deuxième chirurgie permettant le retrait du filament. La pose d’un cathéter dans la veine caudale sera nécessaire pour tous les animaux afin d’administrer un ou plusieurs traitements en intraveineux ainsi que les agents de contraste nécessaires à la réalisation de séquences IRM s’intéressant à la neuroinflammation. La pose de cathéter prendra environ 3 minutes. Se dérouleront à J-7, J0, J1 et J7 des prélèvements sanguins sur les animaux vigiles au niveau de la veine caudale à l’aide d’un cathéter 24G inséré à travers la peau. Un volume de 500 µL sera prélevé à chaque temps. Les animaux seront randomisés dans des sous-groupes expérimentaux de manière à ce que chaque animal ne soit pas soumis à l'ensemble de ces prélèvements. À J0, J1, J5, J7 et J14, les animaux seront soumis à l'IRM-7T sous anesthésie générale, pour une durée variant de 15 à 45 minutes en fonction des séquences réalisées. Une randomisation sera effectuée pour répartir les animaux en plusieurs sous-groupes expérimentaux, de manière que chaque animal ne participe pas à l'ensemble des jours d'acquisition. Les animaux passeront également une batterie de test comportementaux, jusque 7 jours avant l’induction de l’AVC pour déterminer l’activité basale, puis à J2, J3, J5, J7, J14, J21, J24, J25, J28, J29 et J30. Chaque animal passera moins de 15 minutes pour chacun des tests. Une randomisation sera effectuée pour répartir les animaux en plusieurs sous-groupes expérimentaux, de manière que chaque animal ne participe pas à l'ensemble des jours d'acquisition. Enfin, à la fin du projet, les animaux seront soumis à une laparo-thoracotomie pour accéder au cœur et faciliter le prélèvement sanguin par ponction cardiaque. Viendra ensuite soit une perfusion transcardiaque permettant la fixation du cerveau avant son prélèvement soit un prélèvement du cerveau frais. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes pour la perfusion puis 10 minutes pour les différents prélèvements.

Impact sur les animaux

Le modèle reproduit les effets d'un AVC ischémique sévère, entraînant des déficits sensorimoteurs dus aux lésions cérébrales de certaines parties du cerveau. Ces déficits sont visibles chez l’animal à court, moyen et long terme, ce qui nous permet d'effectuer des tests comportementaux et de tirer des conclusions pertinentes. Après un AVC sévère, les animaux peuvent présenter des pertes d'équilibre et une faiblesse musculaire des membres du côté opposé à la lésion cérébrale. Dans les premiers jours suivant l'AVC, ils peuvent également rencontrer des difficultés à manger, à boire et à interagir avec leur environnement, nécessitant une surveillance particulière. Les études de tolérance réalisées avant les études d'efficacités visent à identifier tout effet secondaire potentiel de la molécule thérapeutique.

Devenir

A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement du cerveau post fixation pour analyse.

Remplacement

Ce projet correspond aux étapes des tests d’innocuité et d’efficacité de thérapeutiques in vivo faisant suite aux nombreuses expérimentations et validations réalisées in vitro par les industriels financeurs. Actuellement il n’existe aucune méthode alternative à l’expérimentation animale nous permettant d’obtenir le même niveau d’information obtenue avec l’expérimentation animale. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature et au sein de notre laboratoire font des rats le modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, rattus norvegicus est l’une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC ischémique, permettant une analyse comparative et critique des résultats obtenus.

Réduction

Les données extraites de la littérature scientifique préclinique, combinées surtout à une étude de détermination de la puissance statistique régulièrement mise à jour avec nos données (α=0.05 ; β=0.8) permettent de définir un nombre minimal d’animaux de 20 par groupe dans nos conditions protocolaires. Cette approche nous offre la capacité de visualiser des différences réelles de manière statistiquement significative entre les groupes étudiés. Afin d’anticiper les exclusions d’animaux dues à des erreurs techniques ou à de la mortalité, l’augmentation de l’effectif de 26 par groupe expérimentaux est obligatoire pour atteindre un effectif final satisfaisant de 20 animaux par groupe. Maintenir cette marge de sécurité contribue à assurer la validité scientifique de notre projet tout en respectant les normes éthiques et les principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche. Ainsi, en optimisant le nombre d'animaux utilisés, nous parvenons à concilier l'efficacité de notre projet avec sa valeur scientifique, conformément aux principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche.

Raffinement

Les rats seront placés à deux ou trois par cage tout au long de l'expérience. Pour faciliter leur récupération après la chirurgie, ils pourront être isolés pendant quelques jours avant de retrouver leurs congénères. Leur bien-être sera surveillé deux fois par jour par du personnel qualifié en semaine, et tous les jours le week-end et les jours fériés. Les rats seront pesés régulièrement, au moins deux fois par semaine. Pendant la chirurgie, les rats seront anesthésiés et recevront un analgésique pour soulager la douleur. L'anesthésie sera maintenue jusqu'à ce qu'ils se réveillent. Chaque incision sera précédée d'une tonte et d’une désinfection. La température corporelle des rats sera maintenue stable pendant la chirurgie. Les sutures seront faites individuellement pour minimiser les risques de complications. Après la chirurgie, les rats seront placés dans une cage chauffante pendant environ une heure avant de retourner dans leur cage habituelle, où ils auront de la nourriture et un gel nutritif pour les aider à récupérer. Leur état sera surveillé de près, et en cas de problème dépassant les limites fixées, ils seront euthanasiés. Les rats seront également surveillés attentivement pendant les jours suivant la chirurgie, et recevront une autre dose d’antidouleur le lendemain de l'opération.

Choix des espèces

Le rat (Rattus norvegicus) est l’espèce animal la plus étudiée dans la recherche sur les maladies neurodégénératives, particulièrement dans le développement de stratégies thérapeutiques. Cette prééminence découle de divers facteurs, notamment les homologies vasculaires et génétiques entre l’Homme et le rat, le coût relativement bas, et la logistique aisée associée à l'élevage et la stabulation de ces rongeurs. Ces caractéristiques (entre autres) font des rats un modèle animal privilégié pour la recherche préclinique. Dans le contexte spécifique de l'AVC ischémique, l'utilisation des rats devient incontournable. En effet, elle offre la possibilité d'une analyse comparative et critique des résultats obtenus avec ceux de la littérature, renforçant ainsi la fiabilité des conclusions et leur applicabilité potentielle chez l'Homme. Les animaux utilisés seront âgés de 6 à 10 semaines le jour de l’induction de l’AVC pour un poids allant de 250 à 350g. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec celles déjà disponible dans notre laboratoire et dans la littérature scientifique du domaine.

Les points limites fixés pour ces infections "surviennent souvent trop tard", et aucun marqueur ne permet de prédire si une souris infectée mourra ou survivra. 12 670 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Elles sont infectées par la peste ou par des Yersinia intestinales, par voie sous-cutanée, intradermique, orale, par ingestion de pain contaminé ou par instillation nasale, puis passent jusqu'à dix séances d'imagerie sous anesthésie. Le porteur écrit que l'infection sera fatale au groupe témoin comme à la moitié des cas testés, et conclut que le modèle animal reste "irremplaçable" pour évaluer la virulence de façon réaliste.

Objectifs

Alors que la peste, causée par la bactérie Yersinia pestis, est une des maladies infectieuses les plus sévères pour l’homme, d’autres Yersinia pathogènes causent seulement une infection intestinale (entéropathogènes : Y. pseudotuberculosis et Y. enterocolitica). L’origine de cette différence de virulence n’est pas encore complètement élucidée. Afin de pouvoir lutter le plus efficacement contre ces infections, il est capital de mieux comprendre pourquoi et comment ces bactéries inhibent les processus de contrôle de l’une ou l’autre espèce au sein du genre Yersinia et induisent des dommages systémiques et ou locaux. Il est aussi nécessaire de comprendre l’évolution des espèces au sein des Yersinia ainsi que des lignées au sein des espèces. La virulence est multifactorielle chez les Yersinia. Certains facteurs de virulence ont déjà été identifiés, mais beaucoup restent encore mal connus, voire inconnus. L'objectif principal de ce projet est d'utiliser différentes approches in vitro et in vivo pour identifier ces facteurs, étudier leur mode d'action et mieux comprendre la réponse de l’hôte lors de l’infection. L’étude de l’infection permettra également d’identifier de nouveaux biomarqueurs d’infection à visée diagnostique. Pour cela, des souches mutantes de bactéries générées au laboratoire seront étudiées in vivo. Nous analyserons les effets que ces bactéries exercent chez des rongeurs modèles, les souris de laboratoire, et identifierons et caractériserons les processus précoces (efficaces ou non), mis en place par l'hôte lors de l'infection. Le projet a donc pour objectifs : - Identifier les facteurs de la bactérie impliqués dans les processus pathologiques dans le cas d'une infection causée par une des espèces pathogènes de Yersinia. - Analyser les interactions entre bactéries invasives et souris de laboratoire. - Caractériser les processus et les routes de progression des bactéries post inoculation /délivrance. - Caractériser les lésions tissulaires et cellulaires induites par l’une ou l’autre espèce et de comparer ces lésions en fonction du niveau de leur pathogénicité. - Mettre en évidence les mécanismes de la réponse immunitaire de l'hôte induits ou inhibés. - Identifier les cellules de l’hôte expérimental avec lesquelles l’une ou l’autre espèce bactérienne interagit à différentes périodes post inoculation / délivrance et dans différents tissus. - Identifier des biomarqueurs précoces d’infection à visée diagnostic.

Bénéfices attendus

Les résultats de cette étude nous aideront à acquérir une meilleure connaissance des mécanismes physiopathologiques induits par les espèces invasives au sein du genre Yersinia chez leur hôte, ainsi que de l’évolution entre les différentes espèces et au sein des lignées d’une même espèce. En effet ils devraient permettre de mieux comprendre pourquoi et comment l’hôte peut (ou non) contrôler l’infection, notamment en inhibant les processus de virulence des Yersinia, ainsi que d’identifier de nouveaux biomarqueurs d’infection. A terme, les résultats obtenus permettront de lutter le plus efficacement contre la peste et les autres Yersinioses.

Procédures

Gestes techniques communs à toutes les procédures: Infection par voie sc : une injection unique, durant 1 minute, sans anesthésie Infection par voie id : une injection unique, durant 4 minutes ; sous anesthésie gazeuse Infection par voie orale : une inoculation unique, durant 1 minute, sans anesthésie Infection par ingestion de pain : une fois, durant environ 10 minutes (selon leur appétit), sans anesthésie Infection par instillation intranasale : une séance d’instillation unique, durant 5 minutes ; avec anesthésie par injection intrapéritonéale Geste technique spécifique à la procédure n°3 : Prélèvements de sang dans la semaine de l’infection : prélèvement unique, durant 3 minutes, sans anesthésie. Geste technique spécifique à la procédure n°4 : Imagerie in vivo de Yersinia bioluminescentes : anesthésie gazeuse quotidienne (sauf peste : injection sc), un maximum de 10 fois. Imagerie in vivo de Yersinia fluorescentes : anesthésie gazeuse, unique, sans réveil.

Impact sur les animaux

Toutes nos expériences incluent des infections de souris par des bactéries. Les nuisances sont donc presque toujours les mêmes, dans l’ordre chronologique : - Infection / inoculation de bactéries : pour toutes les voies d’infection l’animal recevra une injection unique, que ce soit pour de l’anesthésique (intranasale, intradermique) ou directement de la préparation infectieuse (voies sous cutanée ou intraveineuse). L’infection par la méthode de nourissage au pain infecté ou par canulage intragastrique (infection orale) ne nécessite pas d’injection ni d’anesthésie. - - L’infection bactérienne sera fatale pour le groupe témoin recevant la souche sauvage virulente, et aussi quand les mutations testées ne modifient pas la virulence (nous espérons au maximum 50% des cas). Les procédures sont donc classées « sévères ». Les signes cliniques sont ceux des infections bactériennes : fièvre, poil hérissé, prostration, perte de poids. Des points limites sont définis et seront appliqués. Toutefois, ces point limites surviennent souvent trop tard. De notre expérience, même si certains animaux présentent des signes cliniques, il n'est pas rare qu’ils se rétablissent. Nous avons déjà recherché des marqueurs pronostics de l’infection dans les souris infectées par les Yersinia pathogènes, comme la bactériémie, l’hyperthermie, la perte de poids… sans succès (trop de variations inter-individuelles). Nous ne sommes donc actuellement pas en mesure de prédire la mort ou survie d’un animal infecté par l’observation de tels marqueurs. - Prélèvements : en procédure 3 un prélèvement sanguin unique est effectué avant infection (voir procédures).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. En effet les animaux ayant été infectés développent une immunité anti-bactérienne qui interviendra dans le déroulement d’une autre infection et en altèrera les résultats de manière incontrôlée. Les animaux ne peuvent donc être pas être réutilisés.

Remplacement

Une mise au point in vitro ou ex vivo sera réalisée pour les techniques avancées de criblage. Les résultats de criblage dans des conditions ex vivo (sangs de donneurs, cellules, organes sur puce) permettront également d’identifier des facteurs importants pour l’infection. Une étude approfondie de la littérature sera réalisée afin d’identifier les facteurs déjà décrits, les expériences déjà réalisées ainsi que les résultats négatifs ne montrant pas d’effet lors de la mutation d’un facteur particulier. Les données à grande échelle produites par d’autres laboratoire et rassemblées sur des bases de données spécialisées tels que Yersiniomics seront utilisés afin d’évaluer la pertinence des facteurs choisies. Des tests préliminaires in vitro permettront de réduire le nombre de mutants étudiés in vivo : par exemple ceux qui seraient sévèrement affectés dans leur croissance seraient exclus de ce projet. Aussi, l’absence accidentelle de facteurs de virulence (plasmides, éléments chromosomiques mobiles…) peut être évaluée en amont du présent projet et permettra d’écarter les mutants peu intéressants de l’étude. La possibilité de séquencer les génomes des bactéries à moindre coût est un pas important dans ce sens. Toutefois, les infections bactériennes induisent des processus pathologiques complexes impliquant de multiples organes et le système immunitaire dans son ensemble (organes divers, relations entre organes, circulation sanguine et lymphatique, multiples populations cellulaires et mécanismes effecteurs), ce qui fait que le modèle animal est irremplaçable pour une évaluation réaliste de la virulence.

Réduction

Des expériences pilotes seront réalisées sur un petit nombre d’animaux afin d’évaluer la robustesse des techniques utilisées et des résultats obtenues. Les effets confondants tels que les effets cage, date ou expérimentateur seront pris en compte pour les études avancées et sensibles à l’échelle du génome. Les procédures seront optimisées en étudiant simultanément le plus grand nombre possible de paramètres sur chaque animal, et en regroupant les expérimentations de façon à limiter les groupes d'animaux témoins nécessaires. Les groupes (sauvage vs mutant) seront comparés par des tests statistiques adaptés. Un test sera utilisé pour comparer la survie des groupes (sauvage vs mutant) exposés à la peste. Des modèles linéaires à effets mixtes pourront être utilisés afin de prendre en compte d'éventuels effets techniques liés à la cage et aux répétitions. Le détail des statistiques est décrit dans les procédures. Le nombre d’animaux indiqué a été obtenu par un calcul de puissance statistique en collaboration avec un biostatisticien, et est basée sur le nombre minimum d'animaux permettant d’obtenir des résultats statistiquement robustes et reproductibles.

Raffinement

Durant les infections, un suivi quotidien des animaux sera opéré tout au long de l’expérience pour détecter tout changement physique ou comportemental qui précèdent généralement les signes cliniques, tels que : poil ébouriffé, yeux sales, comportement prostré. Les animaux présentant un état pathologique (score de 2 sur la “grille évaluation douleur stress inconfort utilisée) ou stress ou perte de poids supérieure à 20% du poids initial) seront mis à mort. Dès l’apparition des signes cliniques des actions seront mises en place pour limiter la souffrance et la déshydratation : mise à disposition de gel hydrique, réhydratation sous-cutanée. Si des animaux atteignent les points limites définis, ils seront mis à mort.

Choix des espèces

Les rongeurs (rats, souris, gerbilles etc.) sont des hôtes idéaux pour l'étude de la peste puisqu'ils y sont très sensibles, et sont les principales cibles et réservoirs de la peste dans la nature. La peste se développe chez la souris sous les formes bubonique et pulmonaire avec des cinétiques, signes cliniques et léthalités comparables à celles de la peste humaine. La souris est le modèle le plus utilisé par les laboratoires étudiant la pathogénèse des Yersinia. De même, les souris sont sensibles aux infections par les Yersinia entériques (Y. pseudotuberculosis et Y. enterocolitica) et sont des modèles usuels de ces infections. La disponibilité d'un grand panel de souris génétiquement modifiées (principalement des fonds génétiques classiques : BALB/c et C57BL/6) permet de tester un certain nombre de voies ou de mécanismes potentiellement impliqués soit dans la résistance de l'hôte à l'infection, soit au contraire servant de cible au pathogène pour induire des lésions et inhiber les défenses immunitaires de l'hôte. Le système immunitaire murin étant extrêmement proche de celui des humains, il permet des analyses immunologiques et cliniques adéquates. Les souris auront au moins 7 - 14 semaines (âge adulte) afin d’être représentatifs de l’espèce à l’âge adulte, et par souci d’utiliser des animaux comparables tout au long du projet. À l’âge adulte leur système immunitaire est complètement fonctionnel. Cela assure l’homogénéité des sujets, nécessaire à la reproductibilité intra- et inter-expérimentale des résultats. Les infections par Yersinia pathogènes ne sont pas sensibles à l’âge. Ces indications d'âge sont ± 1 semaine selon les disponibilités du fournisseur.

1 560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un filament inséré dans l'artère carotide bouche l'artère cérébrale moyenne pendant environ une heure, l'animal restant éveillé entre la pose et le retrait, avant des séances d'IRM sous anesthésie à J0, J1, J3, J5 et J14 et une thoracotomie terminale pour ponction cardiaque. Le porteur indique que l'accident vasculaire peut provoquer des pertes d'équilibre, une faiblesse musculaire et des difficultés à s'alimenter, et annonce une batterie de tests comportementaux répétée sept fois sans préciser lesquels. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne donne le même niveau d'information et qualifie le recours à la souris d'"incontournable".

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique est une pathologie neurologique causée par la formation d’un caillot (thrombus) entraînant l’occlusion partielle ou totale d’une artère cérébrale. Actuellement, la prise en charge des patients en phase aigüe de la pathologie repose sur l’administration de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA), capable de dissoudre les thrombi, associée ou non à la thrombectomie chirurgicale. Cependant, en raison des effets secondaires du tPA, comme la survenue de complications hémorragiques lors d’une thrombolyse trop précoce ou trop tardive, ainsi que de la difficulté relative de la procédure de thrombectomie, seule une faible proportion des patients (

Bénéfices attendus

Actuellement, la prise en charge des patients en phase aigüe de la pathologie repose sur l’administration de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA), capable de dissoudre les thrombi, associée ou non à la thrombectomie chirurgicale. Cependant, en raison des effets secondaires du tPA et de la difficulté relative de la procédure de thrombectomie, seule une faible proportion des patients (

Procédures

Tous les animaux de cette DAP seront soumis à une chirurgie au niveau de la bifurcation carotidienne dans le cou afin d’induire mécaniquement un AVC ischémique via l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne par un filament inséré dans l’artère carotide externe. Cet acte chirurgical, se déroulant à J0, durera entre 20 et 30 minutes puis l’animal sera maintenu éveillé environ une heure avant d’être soumis à la deuxième chirurgie permettant le retrait du filament. La pose d’un cathéter dans la veine caudale sera nécessaire pour tous les animaux afin d’administrer un ou plusieurs traitements en intraveineux ainsi que les agents de contraste nécessaires à la réalisation de séquences IRM s’intéressant à la neuroinflammation et l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique. La pose de cathéter prendra environ 5 minutes. À J0, J1, J3, J5 et J14, les animaux seront soumis à l'IRM-7T sous anesthésie générale, pour une durée variant de 15 à 45 minutes en fonction des séquences réalisées. Une randomisation sera effectuée pour répartir les animaux en plusieurs sous-groupes expérimentaux, de manière que chaque animal ne participe pas à l'ensemble des jours d'acquisition. Les animaux passeront également une batterie de test comportementaux, jusque 7 jours avant l’induction de l’AVC pour déterminer l’activité basale, puis à J2, J3, J5, J7, J14 et J21. Chaque animal passera moins de 15 minutes pour chacun des tests. Une randomisation sera effectuée pour répartir les animaux en plusieurs sous-groupes expérimentaux, de manière que chaque animal ne participe pas à l'ensemble des jours d'acquisition. Enfin, à la fin du projet, les animaux seront soumis à une laparo-thoracotomie pour accéder au cœur et faciliter le prélèvement sanguin par ponction cardiaque. Viendra ensuite soit une perfusion transcardiaque permettant la fixation du cerveau avant son prélèvement soit un prélèvement du cerveau frais. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes pour la perfusion puis 10 minutes pour les différents prélèvements.

Impact sur les animaux

Le modèle, par définition, reproduit les effets d’un AVC ischémique sévère, à savoir des déficits sensorimoteurs induits par les lésions cérébrales latéralisées au niveau du cortex somatosensoriel, prémoteur et striatal. Les déficits fonctionnels sont suffisamment importants à court, moyen terme et long-terme dans ce modèle d’AVC pour permettre de faire des conclusions sur les tests comportementaux. L’AVC sévère peut occasionnellement entraîner des pertes d’équilibres et une faiblesse musculaire des membres opposés à la lésion chez l’animal. Dans les premiers jours après l’AVC, l’animal peut rencontrer des difficultés à s’alimenter normalement, s’abreuver et à se fabriquer un nid avec les enrichissements, c’est pourquoi une attention toute particulière sera mise en œuvre dans la surveillance de ces animaux.

Devenir

A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement du cerveau post fixation pour analyse.

Remplacement

Ce projet correspond aux étapes des tests d’innocuité et d’efficacité de thérapeutiques in vivo faisant suite aux nombreuses expérimentations et validations réalisées in vitro par les industriels financeurs. Actuellement il n’existe aucune méthode alternative à l’expérimentation animale nous permettant d’obtenir le même niveau d’information obtenue avec l’expérimentation animale. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature et au sein de notre laboratoire font de la souris le modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, mus musculus est l’une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC hémorragique, permettant une analyse comparative et critique des résultats obtenus.

Réduction

Les données extraites de la littérature scientifique préclinique, combinées surtout à une étude de détermination de la puissance statistique régulièrement mise à jour avec nos données permettent de définir un nombre minimal d’animaux de 20 par groupes dans nos conditions protocolaires. Cette approche nous offre la capacité de visualiser des différences réelles de manière statistiquement significative entre les groupes étudiés. Afin d’anticiper les exclusions d’animaux dues à des erreurs techniques ou à de la mortalité, l’augmentation de l’effectif de 26 par groupes expérimentaux est obligatoire pour atteindre un effectif final satisfaisant de 20 animaux par groupe. Maintenir cette marge de sécurité contribue à assurer la validité scientifique de notre projet tout en respectant les normes éthiques et les principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche. Ainsi, en optimisant le nombre d'animaux utilisés, nous parvenons à concilier l'efficacité de notre projet avec sa valeur scientifique, conformément aux principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE) et isolés de tous les bruits extérieurs. Les souris arriveront au laboratoire en groupes sociaux puis seront stabulés individuellement pendant l’expérimentation pour éviter les conflits entre les souris et ainsi faciliter la phase de récupération post-opératoire. Les animaux auront toujours accès à divers types d’enrichissements : sizzle-dri kraft, coton et demi-sphère de cellulose ainsi qu’accès ad libidum à la nourriture et à l’eau pendant toute la durée de stabulation. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Les animaux seront régulièrement pesés (2 fois par semaine au minimum). Pendant l’opération chirurgicale, l’animal sera anesthésié et aura une couverture analgésique à base de buprénorphine administrée en sous-cutanée 15 minutes avant la première incision. L’anesthésie générale sera maintenue jusqu’au réveil. Chaque site d’incision de peau sera précédé d’une tonte préalable du pelage et d’une désinfection à la chlorhexidine suivie de l’application locale de lidocaïne en spray. La température corporelle de l’animal sera maintenue à 37.5 ± 0.5°C grâce à un système de couverture chauffante rétrocontrôlée et à une couverture isothermique placée sur le dos de la souris qui limite les pertes de chaleur. Le choix de la technique de sutures se portera sur la méthode des points séparés, offrant une plus grande résistance que le surjet par exemple, et limitant le risque pour l’animal de rompre ses points et donc de déhiscence de la plaie. Lors de la phase de réveil, l’animal sera placé dans une cage chauffante pendant une heure avant de retrouver sa cage d’hébergement comportant de la nourriture facilement accessible. La surveillance des animaux sera accrue pendant les premières heures de réveil. En cas de constatation post-opératoire de dépassement des points limites précédemment fixés et détaillés plus bas dans cette DAP, l’animal sera mis à mort par dislocation cervicale. Enfin, une surveillance stricte des souris sera réalisée pendant les jours suivants l’opération. Le lendemain de l’opération chirurgicale, les animaux recevront une nouvelle injection en sous-cutanée de Buprénorphine.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) occupe une place prépondérante dans la recherche sur les maladies neurodégénératives, particulièrement dans le développement de stratégies thérapeutiques. Cette prééminence découle de divers facteurs, notamment les homologies vasculaires et génétiques entre l’Homme et la souris, ainsi que la facilité de manipulation génétique, le coût relativement bas, et la logistique aisée associée à l'élevage et la stabulation de ces rongeurs. Ces caractéristiques (entre autres) font de la souris un modèle animal privilégié pour la recherche préclinique. Dans le contexte spécifique de l'AVC ischémique, l'utilisation de la souris devient incontournable. En effet, elle offre la possibilité d'une analyse comparative et critique des résultats obtenus avec ceux de la littérature, renforçant ainsi la fiabilité des conclusions et leur applicabilité potentielle chez l'Homme. Les animaux utilisés seront âgés d’environ 10 semaines le jour de l’induction de l’AVC pour un poids allant de 25 à 30g pour les C57BL6N. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec celles déjà disponible dans notre laboratoire et dans la littérature scientifique du domaine.

4 640 xénopes tropicaux vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. 1 500 têtards sont exposés dix mois durant, du stade têtard à l'âge adulte, à un mélange de six polluants dont le tributylétain et le benzo[a]pyrène, 1 500 autres servant de témoins, et leurs descendants sur deux générations subissent les mêmes mesures. Les tests imposent des injections dans le ventre ou dans les sacs lymphatiques, des prélèvements de sang au doigt toutes les heures pendant six heures, et une injection de phytohémagglutinine dans une patte pour mesurer le gonflement à douze heures puis sept jours plus tard. Le porteur écrit que ces concentrations ne sont pas censées faire souffrir tout en reconnaissant qu'il ne peut pas évaluer la souffrance liée à l'exposition, et présente le recours au xénope plutôt qu'au rongeur comme un "Remplacement".

Objectifs

Des études récentes suggèrent que les effets métaboliques transgénérationnels induits par les perturbateurs endocriniens (PE) sont des facteurs impliqués dans le déclin des populations d’amphibiens en altérant leur capacité à se reproduire. Cependant, plusieurs questions se posent : Comment les PE agissent chez les amphibiens ? Quelles sont leurs effets sur les autres axes endocriniens ? Quel parent transmet l’effet à la descendance ? Quels sont les mécanismes responsables de la transmission des effets sur plusieurs générations ? Ce projet répondra à ces questions en étudiant les effets d’une mixture de 6 PE à concentrations environnementales sur 3 générations de X. tropicalis (F0 directement exposée, F1/F2 non exposées). Les effets seront évalués à chaque génération par l’étude du développement, des effets reproducteurs, thyroïdiens et neuro-développementaux, des perturbations métaboliques et de la transmission des effets entre générations.

Bénéfices attendus

D'un point de vue scientifique, la recherche générera de nouvelles connaissances et technologies dans les domaines de la physiologie animale, de la perturbation endocrinienne, de la transmission des effets au cours des générations et de l'écotoxicologie. Les informations sur l'impact transgénérationnel des PE chez les vertébrés font défaut et les méthodologies d'exposition des animaux à de faibles concentrations de polluants tout au long de leur vie doivent être testées. Ce projet permettra de comprendre quel sexe transmet les effets des PE à la descendance. D'un point global, la protection de la biodiversité et de la santé humaine est essentielle. Les amphibiens représentent une proportion élevée de la diversité des espèces mondiales et sont largement répandus. Plusieurs études ont démontré que plus la biodiversité des amphibiens est grande dans les zones humides, plus l'écosystème est protégé contre les maladies, y compris celles qui touchent les humains. En fournissant des résultats sur les effets transgénérationnels métaboliques des PE, les données obtenues peuvent être appliquées non seulement aux amphibiens mais aussi aux vertébrés supérieurs, y compris les humains. Comme le modèle xénope partage de nombreuses voies métaboliques avec l'homme, il est de fait un bon prédicteur des effets des PE chez l'homme. Toutes les données générées par ce projet multidisciplinaire seront disponibles pour les organisations qui gèrent la biodiversité ou sont impliquées dans l'évaluation des risques chimiques (OFB, ANSES) et aideront les décideurs à protéger la qualité de l'environnement naturel et à améliorer la santé des écosystèmes. Un objectif important est d'identifier des biomarqueurs précoces potentiels de perturbations métaboliques qui seront applicables à différentes espèces d'amphibiens vivant dans des écosystèmes pollués. La recherche proposée soutiendra l'élaboration de politiques et de lignes directrices qui guideront la conservation des populations d'amphibiens et la gestion des PE.

Procédures

Les xénopes de la génération F0 seront exposés à un mélange de perturbateurs endocriniens (tributylétain, di-2-éthylhexyl phthalate, polybromodiphényle éther 47, triclosan, benzo[a]pyrene, et 4,4’-dichlorodiphényldichloroéthylène) du stade têtard (stade 10 de Nieuwkoop et Faber) au stade adulte pendant une génération (F0) (~10 mois). Au total 1500 têtards seront exposés aux PE et 1500 serviront de contrôles. Pour les tests de tolérance au glucose et de résistance à l’insuline, des injections sont effectuées sur animaux vigiles dans le ventre (intrapéritonéale) ou dans les sacs lymphatiques dorsaux. A la suite de ces injections des dosages de glycémie sont effectués par prélèvements digitaux toutes les heures pendant 6 heures (2 lots d’animaux, exposés et témoins, pour la génération F0 et 4 lots pour les générations F1 et F2 soit un total de 400 animaux (80 F0, 160 F1 et 160 F2). Pour les tests de sécrétion d’insuline, les xénopes subissent une injection intrapéritonéale de glucose à T0 et sont euthanasiés 30 minutes après. 10 mâles et 10 femelles par condition seront utilisés pour les tests de de sécrétion d’insuline après injection de glucose à chaque génération soit un total de 200 animaux (40 F0, 80 F1 et 80 F2). Pour les tests immunitaires, les animaux reçoivent une injection de phytohémagglutine A dans la jambe droite (50 µl à 2 mg/ml) et de solution saline (50 µl de PBS dans la jambe gauche). A T0 et T12heures, le diamètre de chaque jambe est mesuré et un prélèvement digital est réalisé pour faire un frottis sanguin. Cette opération est répétée 7 jours après pour évaluer la mémoire immunitaire. 10 mâles et 10 femelles par condition seront utilisés pour les tests. Pour la fécondation in vitro, les animaux reçoivent deux injections dans les sacs lymphatiques dorsaux d’hCG à 20 heures d’intervalle. A la suite de la seconde injection, les femelles sont laissées tranquilles dans des aquariums pour attendre la ponte qui se fait de manière naturelle environ deux heures après. Les mâles sont euthanasiés deux heures après la deuxième stimulation. Les femelles sont euthanasiées à la fin de la période de ponte. 15 mâles et 15 femelles par condition (traités et non traités pour F0 et les 4 conditions issues des 4 modalités d’accouplement pour F1 et F2) seront utilisés à chaque génération pour les accouplements en vue d’obtenir la génération suivante. Le nombre total d’animaux sera de 300 (60 pour F0, 120 pour F1 et 120 pour F2).

Impact sur les animaux

Les concentrations utilisées sont celles des normes de qualité environnementales. Elles ne sont pas senser induire de souffrance chez les animaux. Il se peut cependant que les effets des PE puissent entrainer une surmortalité ou des malformations mais il n’est pas possible d’évaluer le degré de souffrance engendré par l’exposition. Les prises de sang digitales pour les tests de tolérances au glucose ou de résistance à l’insuline et les injections intrapéritonéales de glucose ou d’insuline dans les sacs lymphatiques sont susceptibles d’entrainer des douleurs légères. Au stade têtard des déformations de la colonne vertébrale sont décrite comme pouvant survenir lors d’un stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour des prélèvements d’organes ou des tests métaboliques.

Remplacement

Les manipulations réalisées sur ces animaux ne peuvent pas être substituées par des manipulations sur cultures cellulaires car les effets observés sont le jeu d’actions et d’interactions entre différents organes et systèmes. Le modèle xénope pour évaluer l’effet des PE en milieu aquatique permet le « Remplacement » du modèle rongeur classiquement utilisé en toxicologie.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est le nombre minimal pour ne pas mettre en péril les manipulations et avoir des résultats significatifs statistiquement (plan d’expérience élaboré avec des statisticiens). Chaque animal est utilisé pour plusieurs types de manipulation et l’utilisation des différents lots n’est justifié que par la petite taille des organes et des volumes possibles de prélèvements sanguins qui limitent le nombre de manipulations possible sur un même échantillon.

Raffinement

Les protocoles d’exposition mis en œuvre permettent de mimer les conditions du milieu (exposition par l’eau) pour confirmer et transposer les résultats obtenus à court terme sur le terrain. Ce genre d’exposition n’entraine pas de souffrance chez l’animal contrairement à l’injection de polluant par voie intrapéritonéale classiquement utilisée en toxicologie. Des points limites ont été définis et adaptés au modèle xénope

Choix des espèces

Le choix de l’espèce xénope tropicalis est justifiée par deux raisons majeures : 1) son temps de génération court pour un amphibien (~10 mois du stade œuf à adulte mature) permet l’étude de l’effet des polluants sur plusieurs générations et 2) c’est une espèce dont le génome est entièrement séquencé et diploïde permettant ainsi des études transcriptomiques ou épigénétiques. C’est un modèle dont nous maitrisons l’élevage au laboratoire (certificat de capacité obtenu) et pour lequel nous avons déjà réalisé des études multigénérationnelles. Les animaux seront utilisés du stade gastrula au stade adulte mature sexuellement. Les PE agissent sur de nombreuses cibles au stade larvaire et durant tout le cycle de développement jusqu'au stade adulte mature sexuellement. Il est donc important de regarder les impacts de ces polluants à différents stades du développement des animaux.

90 poissons zèbres mâles adultes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacun est anesthésié, placé sous binoculaire, son télencéphale droit est lésé, puis on lui injecte aussitôt des globules rouges normaux ou glyqués pour reproduire une hémorragie cérébrale. Quarante-huit heures plus tard ils sont tués par surdosage d'anesthésique et leur cerveau est prélevé, l'enjeu étant de savoir si les globules rouges d'une personne diabétique aggravent les suites d'un AVC. Le porteur classe la procédure en souffrance sévère et cite la mort de l'animal parmi les nuisances possibles, tout en affirmant que la littérature et son expérience "ne rapportent pas de comportements de souffrance anormale" après une lésion.

Objectifs

Les accidents vasculaires cérébraux (AVC) de type hémorragique représentent environ 20 % des AVC (Inserm). Bien que minoritaires, les conséquences de ces AVC sont plus graves (séquelles neurologiques, donc handicaps, et mortalité plus sévères. A l’origine de cette gravité, le déversement des globules rouges dans le parenchyme cérébral entraine la formation d’un hématome puis d'un œdème cérébral comprimant le tissu nerveux et favorisant le développement d’un stress oxydant et inflammatoire. Ces processus entrainent l’activation des cellules immunitaires du cerveau (les microglies) qui migrent et phagocytent les globules rouges pour limiter la perte d’homéostasie du tissu nerveux. Cependant, la clairance des globules rouges reste limitée, ce qui aggrave les séquelles neurologiques de l’AVC hémorragique. Un certain nombre de données de la littérature semble indiquer que le diabète pourrait avoir un impact négatif sur le pronostic des AVC hémorragiques. En situation diabétique, les globules rouges sont glyqués (groupements sucrés présents), pro-oxydant, et plus fragiles. Nous émettons donc l’hypothèse que lors d’un AVC hémorragique, la présence de globules rouges glyqués (« diabétiques ») dans le parenchyme cérébral pourrait aggraver la lésion cérébrale et impacter le processus de clairance des globules rouges par les microglies. Afin de tester cette hypothèse, nous souhaitons injecter des globules rouges (dits GR) et des globules rouges glyqués (GR « diabétiques ») dans le parenchyme cérébral du poisson zèbre, un animal modèle de plasticité cérébrale qui supporte très bien les chocs hémorragiques. En effet, ce dernier peut subir des lésions cérébrales entrainant des hémorragies cérébrales importantes avec un excellent taux de survie (supérieure à 90%) et sans séquelles neurologiques visibles. Ainsi, nous souhaitons étudier les processus de réactivité microgliale et de phagocytose permettant la clairance des globules rouges à un temps de cinétique clé : 2 jours post lésion/injection. Effectivement, après un traumatisme hémorragique chez le poisson zèbre, les microglies sont très largement activées à 2 jours et commencent à revenir à un état initial vers 5 jours.

Bénéfices attendus

Ce projet cherche à déterminer si la glycation des globules rouges entraine une modification de la réactivité des microglies plus importantes et des processus de phagocytose associés. Aussi, ce projet pourra apporter des éléments de compréhension quant à la sévérité des AVC hémorragiques en situation diabétique (globule rouge glyqué) qui semble plus importante. A très long terme, ce projet pourrait permettre de moduler l'activité des microglies afin de favoriser la clairance des globules rouges dans le parenchyme cérébral à la suite d'un AVC hémorragique chez le patient diabétique et non diabétique afin d'améliorer la récupération du patient et de limiter la mortalité.

Procédures

L'ensemble des animaux sera anesthésié et placé sous une binoculaire pour réaliser une lésion de l'hémisphère droit du télencéphale (partie du cerveau). Les animaux seront ensuite immédiatement microinjectés avec la solution contrôle, des globules rouges, des globules rouges glyqués. L'ensemble de cette procédure (aneshtésie + microinjection) dure moins de 5 minutes. Les animaux seront analysés 48h après injection (après mise à mort).

Impact sur les animaux

Les nuisances subies par l'animal sont l'anesthésie, la microlésion/microinjection du télencéphale, la microhémorragie mimée par l'injection des globules rouges sous anesthésie. La procédure (lésion + injection) dure moins d'une minute. Le temps total d'anesthésie total avant la phase de réveil est de moins de 5 minutes. Les nuisances possibles sont un stress, une locomotion altérée, une difficulté d'alimentation et éventuellement la mort de l'animal.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort 48 heures après la microinjection par anesthésie suivie de surdosage anesthésique (Tricaïne). Le cerveau sera récupéré ensuite pour analyse.

Remplacement

La complexité des processus physiologiques se déroulant lors d’une hémorragie cérébrale ne sont pas modélisables par des techniques in vitro. Ils impliquent un œdème, la migration et la prolifération des microglies, ainsi que leur activité de phagocytose. De plus, plusieurs processus physiologiques se mettent en place lors d’un dommage cérébral comme un AVC hémorragique (hypoxie, inflammation, stress oxydatif, sécrétion de facteurs trophiques et neurotrophiques ainsi qu'endothéliaux). A l'heure actuelle, nous ne pouvons réaliser des procédures in vitro permettant d'intégrer l'ensemble de ces acteurs cellulaires et de signalisation. C'est pourquoi le modèle in vivo est pertinent.

Réduction

Chaque expérimentation sera scindée en 3 expériences indépendantes (3 x 10 animaux par groupe). Cela permettra de ne pas utiliser l'ensemble des animaux si nous observons que les résultats obtenus sont suffisamment étayés. De plus, si jamais une souffrance ou une mortalité inattendue venait à apparaitre, cela éviterait de relancer une expérimentation. D'après notre expérience et connaissance du modèle via des expérimentations similaires, le nombre de 3 X 10 animaux par groupe permet de pallier à l'hétérogénéité de réponses des animaux, et des tests statistiques seront réalisés.

Raffinement

Les animaux seront observés plusieurs fois par jour dans leur aquarium. Après lésion, ils seront observés de façon intensive dans les premières 30 minutes suivant la lésion/injection, puis une fois toutes les heures. Tout signe de souffrance ou de comportement anormal sera rapporté au vétérinaire référent afin de prendre les mesures adéquates. Un espace suffisant limitant au maximum les contraintes subies et permettant un comportement normal sera assuré. Les procédures invasives seront réalisées sous anesthésie générale par une personne qualifiée. Différents points limites spécifiques tels qu'un comportement anormal (mouvements circulaires), nutrition anormale (voire incapacité à se nourrir), flottabilité anormale, couleur anormale seront analysés (Les animaux seront observés plusieurs fois par jour dans leur aquarium. Si un de ces paramètres ou points limites est atteint, nous en ferons part au vétérinaire pour arrêt de l’expérimentation et par conséquent euthanasie pour limiter les souffrances de l’animal (sédation profonde puis mise à mort). A noter, que les données bibliographiques et notre expérience du modèle ne rapporte pas de comportements de souffrance anormale, de modification de la prise alimentaire, du comportement locomoteur notable à la suite d'une lésion

Choix des espèces

Le poisson zèbre partage de 70 à 85 % de gènes en commun avec l’espèce humaine, impliqués dans les processus physiologiques et pathophysiologiques, respectivement. De plus, c’est également un modèle reconnu de réparation cérébrale avec des processus de réparation similaires à ceux des mammifères. Animaux mâles pour éviter l'effet hormonal du cycle ovarien chez la femelle. Animaux adultes agés entre 3 mois et 18 mois. A ces stades, les processus régénératifs sont globalement similaires.

Deux injections de cellules tumorales et de cellules CAR-T sous anesthésie ouvrent le protocole, suivies chaque semaine d'une injection dans l'abdomen et de huit minutes d'anesthésie gazeuse pour photographier la tumeur, pendant quatre à six semaines. 5 600 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, avec un prélèvement sanguin trois semaines après l'injection des cellules CAR-T et des pesées hebdomadaires. La tumeur peut provoquer douleur, mobilité réduite, perte de poids et prostration. Les souris jugées inaptes lors de la constitution des groupes sont tuées aussitôt, les autres au gaz carbonique avant tout point limite, à la fin de la période ou dès que l'objectif scientifique est atteint.

Objectifs

L’immunothérapie, une avancée majeure en médecine, exploite les mécanismes naturels du système immunitaire pour combattre diverses maladies, notamment le cancer. Une approche importante de cette thérapie consiste à isoler des cellules du système immunitaire du patient (les lymphocytes T) et à les modifier génétiquement pour les rendre capables de reconnaitre et cibler des protéines présentes à la surface des cellules cancéreuses. Après culture et expansion en laboratoire, ces cellules modifiées connues sur le nom de CAR-T, sont réintroduites dans le patient, où elles traquent et détruisent sélectivement les cellules cancéreuses, constituant ainsi une approche innovante et un espoir dans le traitement du cancer. En effet, les cellules CAR-T sont désormais un élément essentiel de la prise en charge des patients atteints de cancers, tout comme la chirurgie, la chimiothérapie, la radiothérapie et autres thérapies ciblées. Et pour cause, elles ont démontré des résultats cliniques remarquables dans le traitement des cancers du sang en rechute ou résistants aux traitements classiques, et sont en cours de développement pour les tumeurs solides. Malgré leurs succès, les cellules CAR-T présentent des défis et des limites. Des recherches actuelles visent à améliorer ces cellules en utilisant des manipulations génétiques pour réduire leur toxicité, les rendre plus durables dans le corps et prévenir leur perte d’efficacité anti-tumorale au fil de temps. De nombreux partenaires, faisant appel à notre expertise, s'efforcent à comprendre et à évaluer les conséquences des modifications génétiques spécifiques introduites dans les cellules CAR-T sur leur efficacité dans la lutte contre les tumeurs. Ils cherchent également à étudier comment les cellules CAR-T interagissent avec d'autres traitements potentiels tels que des médicaments ou des anticorps pour contrôler la progression des tumeurs. Pour ce faire, après la conception et la modification génétique de variants spécifiques de cellules CAR-T, nous évaluerons leur réponse anticancéreuse en les caractérisant d'abord dans le laboratoire (in vitro), puis en suivant leur évolution et en étudiant leur fonctionnement dans un modèle ronger (in vivo) greffé avec des lignées cancéreuses d’origine humaine. L’évaluation fonctionnelle in vivo est cruciale pour valider l'efficacité thérapeutique préclinique des différents variants de cellules CAR-T dans le traitement de différents types de cancers chez l'homme.

Bénéfices attendus

Bien que les cellules CAR-T, approche thérapeutique en plein essor, offrent des avantages significatifs dans le traitement de certains types de cancer, elles font face à plusieurs défis et limitations. Pour mieux comprendre le fonctionnement de ces cellules, des études expérimentales approfondies et des essais précliniques sont nécessaires Les traitements ciblant spécifiquement les tumeurs avec des cellules CAR-T peuvent parfois entraîner des effets secondaires sérieux, comme une réponse inflammatoire sévère et des problèmes neurologiques. De plus, ces thérapies peuvent être limitées par la durée pendant laquelle les cellules CAR-T restent actives dans le corps, la complexité de l'environnement autour de la tumeur et le manque d'antigènes spécifiques aux tissus cancéreux et n’étant pas exprimés sur les tissus sains du patient. Malgré les avancées dans le développement de différentes générations de cellules CAR-T, les progrès technologiques offrent de nouvelles possibilités pour améliorer encore leur efficacité et leur tolérance chez les patients. Dans le domaine de la recherche sur les cellules CAR-T, les modèles murins de greffes de cellules tumorales humaines sont extrêmement importants. Ils fournissent une plateforme pour étudier différents aspects, tels que la façon dont les cellules CAR-T reconnaissent les cibles tumorales, comment elles s'activent, leurs mécanismes d'action, leur durée d'activité, et comment elles sont tolérées. En recréant des conditions similaires à celles des patients atteints de cancer, ces modèles offrent un environnement expérimental précieux. En outre, ils reproduisent la diffusion et la migration des cellules CAR-T dans tout le corps, contribuant ainsi à une meilleure compréhension des réponses thérapeutiques et des interactions complexes entre cellules dans le contexte du traitement du cancer.

Procédures

Les souris seront soumises à divers actes de manipulation tout au long de ce projet, à savoir : 2 injections uniques de cellules par voie intraveineuse sur animal anesthésié au début de projet (

Impact sur les animaux

La durée de chaque étude inscrite dans ce projet est de 4-6 semaines, en fonction du type de tumeur ciblée et du temps nécessaire à sa croissance. Au cours de cette période, les animaux seront soumis à plusieurs procédures techniques nécessitant une contention pouvant engendrer du stress, tels que : injections de cellules tumorales, injection de cellules CAR-T, suivi tumorale par imagerie ou par pied au coulisses, prélèvement sanguin (1 seul prélèvement de sang 3 semaines après l’injection de cellules CAR-T) et des pesées hebdomadaires. Des effets indésirables liés à la croissance tumorale pourraient apparaître : douleur, mobilité réduite, perte de poids, prostration. Cependant, nous avons mis en place des points limites pour minimiser la gêne et l'inconfort des animaux causéx par la présence de la tumeur. En cas de persistance de ces signes l’animal sera mis à mort. Tous les actes techniques sur les souris seront réalisés par du personnel expérimenté et spécialisé dans ces techniques afin de limiter les contraintes subies par l’animal, ce qui garantit leur bien-être tout au long des étapes expérimentales

Devenir

Au début de notre étude, lors de la constitution des différents groupes d’animaux en expérimentation (randomisation), ceux qui ne remplissent pas les conditions requises pour que la tumeur se développe correctement seront euthanasiés immédiatement. L'euthanasie par inhalation de CO2 sera appliquée à tous les animaux de l'étude avant d'atteindre tout point limite éthique, à la fin de la période expérimentale, ou dès que l'objectif scientifique est accompli.

Remplacement

Nous étudions attentivement comment différents modèles de cellules CAR-T, qui sont des cellules immunitaires modifiées pour combattre les cellules cancéreuses, fonctionnent. Pour ce faire, nous effectuons plusieurs tests pour comprendre à quoi elles ressemblent (leur phénotype) et comment elles agissent (leur fonction). Cependant, ces tests ont leurs limites car ils sont réalisés dans des conditions de laboratoire, en utilisant des plaques de culture où les cellules CAR-T sont mises en contact avec des cellules tumorales. Malgré toute l’information qu’il nous apporte, ce système en laboratoire est très simplifié et ne prend pas en compte de nombreux éléments importants qui existent dans le corps humain, notamment l'environnement complexe autour des tumeurs. Pour vraiment comprendre comment ces cellules CAR-T pourraient fonctionner chez les personnes, en l’occurrence chez les patients atteins de cancers, il est nécessaire de les étudier dans un organisme vivant, tel quel un modèle murin, qui reproduit de manière plus réaliste les conditions que l'on trouve chez les humains. En utilisant des souris, nous pouvons confirmer comment les cellules CAR-T agissent et si elles peuvent surmonter les défis rencontrés dans l'environnement autour des tumeurs. Ces défis incluent un réseau complexe de différentes cellules, de signaux moléculaires, de vaisseaux sanguins, et d'autres éléments qui interagissent de manière dynamique et qui peuvent limiter l'efficacité des cellules CAR-T. Ces interactions sont difficiles à reproduire de manière réaliste en laboratoire. En résumé, étudier ces cellules dans des organismes vivants nous aide à choisir les cellules CAR-T qui sont les plus prometteuses pour le traitement du cancer, en éliminant celles qui ne montrent pas d'activité anticancéreuse. Cela nous donne une base solide pour continuer notre recherche et pouvoir apporter ainsi du rationnel scientifique pour le développement des traitements plus efficaces contre le cancer.

Réduction

Dans la première étape de ce projet, nous étudions et vérifions l’activité anti-tumorale des diverses versions de cellules CAR-T face à un ou plusieurs modèles de tumeur, augmentant ainsi la probabilité d’obtention de réponses favorables dès les premières séries d’expérimentations sur des souris. Cela signifie que nous essayons de faire le moins d'essais possible et d'utiliser le moins d'animaux nécessaires, tout en faisant en sorte de garantir la fiabilité de nos résultats. Nous considérons également d’autres éléments nous permettant de réduire le nombre de souris en expérimentation, notamment : a) l’analyse de plusieurs groupes d’étude en même temps avec un seul groupe témoin ; b) le suivi de la croissance de tumeurs chez les souris par imagerie spécial (bioluminescence), ce qui permet de réduire le nombre d'animaux étudiés, car les images peuvent être extraites des mêmes sujets au fil du temps sans avoir à sacrifier l’animal pour mesurer la croissance des tumeurs ; c) les types de lignées de cellules cancéreuses que nous utilisons ont été étudiés en détail, ce qui nous permet de déterminer la quantité optimale de cellules à injecter pour que la tumeur se développe, réduisant ainsi le nombre de groupes d’animaux nécessaires pour tester différentes quantités de cellules tumorales.

Raffinement

Les animaux utilisés dans les expériences seront hébergés dans un environnement dédié, appelé zone EOPS, dans des cages par groupes de 5 au maximum, du même sexe, avec suffisamment d'espace pour se déplacer librement et un accès libre à la nourriture et à l'eau. Pour rendre leur habitat plus agréable, nous enrichirons leurs cages en ajoutant de la litière en copeaux de bois stérilisée, une maisonnette en carton pour qu'ils aient un endroit où se cacher, ainsi que des morceaux de papier Kraft ou "Sizzle Pad" qu'ils pourront grignoter pour construire un nid. Un temps d’adaptation d’une semaine minimum sera également respecté entre la réception des animaux et le début du protocole expérimental. Pour limiter les effets de stress et de douleur des animaux, les interventions telle que les injections de cellules tumorales et de cellules CAR-T seront réalisées sous anesthésie. Une surveillance quotidienne sera effectuée pour repérer tout signe de détresse ou de souffrance chez les souris, et des mesures appropriées seront immédiatement prises Pour évaluer leur bien-être, nous utiliserons une grille de notation qui prend en compte leur comportement naturel, leur comportement en réponse à certaines situations, les changements de poids, ainsi que les caractéristiques expérimentales, comme l'apparence et la taille des tumeurs. Si les scores atteignent des seuils critiques préétablis, cela pourrait entraîner l'euthanasie de l'animal. Toutes les personnes impliquées dans ce projet ont les qualifications nécessaires et ont démontré les compétences requises pour manipuler les animaux de manière éthique. Pour suivre la croissance des tumeurs, nous utiliserons principalement une méthode non invasive appelée bioluminescence in vivo sous anesthésie gazeuse. Si nécessaire, nous effectuerons des mesures régulières à l'aide d'un pied à coulisse.

Choix des espèces

Le projet nécessite l'utilisation d'une espèce animale dont le fonctionnement interne (physiologie) se rapproche le plus de celui de l'Homme ce qui justifie notre choix d'utiliser des souris comme modèle. Les souris présentent une similitude génétique élevée avec les humains, avec 99% de leurs gènes correspondants à ceux de l'homme. Cela signifie que les résultats obtenus lors des études sur les souris sont plus susceptibles de refléter les réponses biologiques humaines. Actuellement, l'utilisation de souris immunodéficientes (agées de 8 semaines), répresent un avantage majeur pour notre approche, en raison de leur déficit immunitaire profond, facilitant ainsi la prise de greffe de cellules immunitaire et de cellules tumorales, toutes les deux d’origine humaine. Ceci offre la possibilité d'évaluer les immunothérapies avec des cellules CAR-T humaines dans un modèle de souris. En outre, les souris sont des animaux de petite taille, qui se reproduisent rapidement et sont faciles à élever en laboratoire.

Pour reproduire une malformation du cortex responsable d'épilepsies résistantes aux médicaments, des femelles gestantes sont opérées trente à quarante-cinq minutes afin de traiter leurs embryons in utero. 1 332 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Les souris nées avec la malformation font une à cinq crises d'épilepsie par jour et reçoivent, selon les groupes, une injection cérébrale à la naissance, un dispositif d'imagerie ou des électrodes d'électroencéphalogramme posés sous anesthésie, avec des enregistrements étalés sur sept à quinze jours. Le porteur décrit une grille de score au-delà de laquelle l'animal est tué, sans préciser combien de souris atteignent ce seuil.

Objectifs

La Dysplasie Focale Corticale (FCD) est une malformation du développement cortical, à l'origine d'épilepsies résistantes aux médicaments chez l'enfant et l'adulte. Ce projet vise à élucider les mécanismes et les effets pathologiques de la FCD sur l'apparition des crises épileptiques, de même que ses répercussions sur le fonctionnement cérébral ainsi que sur les altérations cognitives et comportementales. Pour atteindre cet objectif, des enregistrements cérébraux seront effectués par imagerie, et électroencéphalographie (EEG) accompagnés d'analyses du comportement (mesures des performances cognitives, de l'humeur et sensorimotrices) à partir d'un modèle murin de FCD (souris).

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche est essentiel, car il vise à élucider les mécanismes développementaux menant à la formation d'une région cérébrale pathologique dans le contexte de la Dysplasie Focale Corticale (FCD), et leurs conséquences sur le fonctionnement cérébral, les crises d'épilepsie, ainsi que sur les altérations cognitives et comportementales (mesures des performances cognitives, de l'humeur et sensorimotrices) à partir d'un modèle murin de FCD (souris). Il est important de noter que cette malformation développementale est souvent associée à des formes d'épilepsie résistantes aux traitements pharmacologiques classiques, ce qui souligne l'urgence de découvrir des alternatives thérapeutiques innovantes. En décryptant les processus sous-jacents à la FCD à partir d'un modèle murin (souris), ce projet aspire ainsi à révéler de nouvelles voies thérapeutiques pour traiter les patients pharmacorésistants souffrant de FCD.

Procédures

Notre projet de recherche vise à étudier la Dysplasie Corticale Focale (FCD), une pathologie humaine bien décrite, modélisée chez la souris, afin d'examiner les anomalies cérébrales, les crises épileptiques résultantes, et de tester un traitement potentiel basé sur la thérapie génique. Pour modéliser la FCD, nous traiterons des souris au stade embryonnaire, chez des femelles gestantes (non épileptiques) pour induire la FCD (30-45 minutes par femelle, sous analgésie et anesthésie) chez ces embryons. Ainsi, les souris FCD présentent des crises épileptiques comme les patients souffrant de la même pathologie. Pour l'analyse par imagerie, certaines de ces souris recevront à la naissance une injection cérébrale d'une sonde fluorescente (moins de 5 minutes, sous anesthésie). Plusieurs jours après (5 au minimum), un petit dispositif d'observation sera installé (en 30 minutes, sous analgésie et anesthésie) pour imager le cerveau des souriceaux et des adultes ; les enregistrements seront réalisés par période de 10-30 minutes par jour, pendant 5 jours maximum sur des animaux vigiles. Pour analyser les crises d’épilepsie, un autre groupe de souris recevra un dispositif permettant l’enregistrement de l’électroencéphalogramme (EEG) (en moins de 30 minutes, sous analgésie et anesthésie). Après une semaine de récupération, les enregistrements EEG seront réalisés sur une période de 7 à 15 jours sur des animaux vigiles. Pour tester la thérapie génique, une injection sera effectuée dans le cerveau (15 minutes, sous analgésie et anesthésie), au moins 3 semaines avant l'EEG ou l'imagerie. À la fin des expériences, les cerveaux de toutes les souris seront prélevés sous anesthésie profonde. Il faut souligner qu’à chaque étape, une attention particulière est portée au respect des normes éthiques et au bien-être animal. Des mesures de suivi, d'analgésie, et de soins post-opératoires sont systématiquement appliquées pour minimiser la douleur et le stress des animaux.

Impact sur les animaux

Un des effets indésirables potentiels pourra être lié aux crises d’épilepsie chez les souris ayant développée une Dysplasie Corticale Focale (FCD) (environ 1-5/jour), induite par un traitement local au niveau du cerveau lors de leur développement à l’état embryonnaire. Certaines souris subiront également des chirurgies spécifiques et nécessaires à nos techniques d’imagerie cérébrale et de suivi de l’activité électrique du cerveau par électroencéphalographie. Enfin, certaines souris seront soumises à des tests comportementaux basés sur des comportements naturels et spontanés bien établis et reconnus.

Devenir

A la fin des procédures expérimentales, l’étendue de la Dysplasie Focale Corticale (FCD) doit être vérifiée et quantifiée par une analyse histologique du cerveau des souris FCD. Pour réaliser cette analyse histologique, les animaux sont euthanasiés selon les procédures réglementaires et les principes des 3Rs.

Remplacement

L'objectif du projet est de décrire et d'étudier l'activité de la malformation du cerveau résultant de la Dyspalsie Focale Corticale (FCD) à partir d'un modèle murin (souris) et de tester l'efficacité de la thérapie génique sur les mécanismes pathologiques et handicapants de la FCD (fonctionnement cérébral altéré, crises d'épilepsie, altérations du comportement) par une analyse multidimensionnelle (imagerie cérébrale, EEG, analyse comportementale), afin de pouvoir proposer de nouvelles alternatives thérapeutiques pour améliorer la qualité de vie des patients. Du fait de cette analyse multidimensionnelle, il n'est donc pas possible de substituer les souris FCD par des modèles alternatifs (c-a-d des modèles qui serait générés in vitro, comme des cultures neuronales par exemple). En effet, les rongeurs reproduisent fidèlement les caractéristiques cardinales de la FCD décrites chez les patients souffrant de cette pathologie, et ils constituent par conséquent un modèle de choix pour l'analyse du fonctionnement cérébral, des crises d'épilepsie, et du comportementale (mesures des performances cognitives, de l'humeur et sensorimotrices).

Réduction

Dans le cadre de notre engagement envers les principes des 3Rs, le calcul du nombre d’animaux nécessaires au projet a été déterminé par une approche statistique. De plus, les expériences seront réalisées avec un souci permanent de réduction du nombre d’animaux. La méthode utilisée d’imagerie cérébrale in vivo permet l'enregistrement d'un très grand nombre de neurones (plusieurs centaines) par souris, et donc de diminuer le nombre d'animaux utilisés. Une même portée sera utilisée par plusieurs expérimentateurs, les nouveau-nés non utilisés pour les études développementales seront utilisés dans le cadre d'études menées chez l'adulte, et mâles et femelles seront utilisés. De plus, des souris seront incluses dans des études longitudinales et le coté contra-latéral, non-FCD, servira de contrôle. Pour finir, une part de l’étude sera également menée sur des tranches de cerveau de souris FCD permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisée in vivo pour l’expérimentation. L'ensemble de ces points permettra de diminuer de façon importante le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les expériences seront réalisées avec un souci permanent de raffinement des procédures expérimentales. Le raffinement inclue tout d'abord la mise en place par la formation du personnel sur les techniques de manipulation douce et minimisation de la douleur et de la souffrance, une surveillance et un ajustement continu des soins pour une prise en charge personnalisée. Ainsi, le bien-être des animaux, la croissance staturo-pondérale, l'aspect général et le comportement seront suivis de façon spécifique, qu'il s'agisse de souris adultes, gestantes et de leur progéniture. Lors de la chirurgie, la douleur et le stress, sera prise en charge par l'utilisation d'analgésiques, d'antiinflammatoires, d'anesthésie locale et générale, et le maintien des animaux sur un tapis chauffant pour préserver leur température corporelle. En post-chirurgie, la douleur et la souffrance sera aussi prise en charge avec l'utilisation d'analgésiques, d'antiinflammatoires, durant les 3 premiers jours. Le niveau de souffrance et de douleur sera établi à l'aide d'une grille spécifique pour établir un score; si le score atteint une certaine limite préétablie, l'animal en souffrance sera euthanasié. Il faut souligner qu'une attention particulière sera portée aux nouveau-nés en particulier après leur réintroduction au sein de la portée. Les mères et leur nouveau-nés, opérés ou non, seront hébergés avec de la nourriture et de l'eau ad libidum dans des armoires ventilées, et sous environnement contrôlé, dans des cages enrichies d'igloos cartonnés et de mini-rouleaux de papier foisonnant permettant aux souris de faire des nids. Les animaux sevrés et les adultes seront hébergés dans les mêmes conditions à 3-5 animaux par cage après avoir séparé les mâles et les femelles.

Choix des espèces

Les raisons d'utiliser des modèles murins sont nombreuses. Dans nos expériences, les souris présentent une organisation morpho-fonctionnelle suffisamment complexe et évoluée pour permettre de tirer des conclusions générales sur la mise en place de malformations du cerveau lors du développement et de leurs conséquences à l’âge adulte, en particulier dans un contexte pathologique comme la Dysplasie Focale Corticale (FCD), qui est une pathologie développementale. Ainsi, pour analyser les anomalies qui se mettent en place lors du développement, nous utiliserons des souris à différents âges postnataux incluant les différents stades de développement (0-40 jours postnataux) ainsi que des animaux adultes (2-4 mois).