Procédures sévères

Du dextran sulfate de sodium versé dans l'eau de boisson pendant quatre à dix jours, une phase de rétablissement, puis le cycle recommencé jusqu'à trois fois sur soixante jours : 600 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. L'inflammation intestinale provoque une diarrhée, un mal-être général et une cachexie, effets que le porteur donne pour certains et "nécessaires" puisqu'il s'agit d'un modèle pathologique. Entre-temps les souris reçoivent des candidats médicaments sur animal vigile et jusqu'à un prélèvement sanguin par jour. Toutes sont tuées à la fin de chaque expérience pour prélever les organes et mesurer les dommages intestinaux.

Objectifs

Les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI) : maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique, se caractérisent par l’inflammation de la paroi d’une partie du tube digestif, due à une dérégulation du système immunitaire. Les MICI touchent principalement les jeunes adultes (20-30 ans). En France, plus de 200'000 personnes sont concernées. Ces maladies se présentent sous forme de crises avec des périodes de rémission. Chez environ 15% des patients, les crises sont sévères : leur intensité peut imposer l’hospitalisation, l’arrêt de l’alimentation, un traitement par perfusion pendant quelques jours ou encore un recours à de la chirurgie. Bien qu’il n’existe pas de traitement pour guérir ces maladies, les médicaments actuels permettent de mieux contrôler la maladie et d’améliorer la qualité de vie des patients. Malheureusement, le plus souvent, les traitements finissent par être inefficaces et il faut alors changer. De plus, environ 20% des patients développent des manifestions extérieures au système digestif telles que de l’arthrite, du psoriasis. C’est pour cela qu’il est important de comprendre ces pathologies et de trouver de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant de stopper l’avancée de la pathologie et améliorer la vie des patients. Ce projet a pour but de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques pouvant avoir un effet bénéfique dans les MICI dans un modèle de colite induite par DSS (dextran sodium sulfate) chez la souris.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont: 1- une meilleure compréhension des mécanismes d'action impliqués dans les MICI. 2- le développement de nouveaux médicaments pour traiter ces pathologies (=démontrer que le composé testé est actif dans un modèle expérimental de la pathologie ciblée et d’évaluer ses éventuels effets secondaires avant son passage en phases cliniques).

Procédures

Dans ce modèle, l'agent inducteur de la colite sera du dextran sodium sulfate (DSS) donnée par voie orale, dans l'eau de boisson (1-6%), pendant 4 à 10 jours. Le rétablissement post-induction sera évaluée. Durant cette période, aucun DSS ne sera présent dans les biberons. La phase de rétablissement durera entre 2 jours à 2 semaines après le pic d'inflammation. Afin de mimer des crises et donc, une inflammation chronique, des cycles d'induction et rétablissement pourront être réalisés (3 cycles maximum et total de 60 jours maximum). Les candidats médicaments seront administrés aux animaux vigiles par différentes voies, avec 1 à 3 minutes par administration (douleur équivalente à une piqure d'aiguille). Si des prélèvements de sang doivent être réalisés en cours d'étude, ils seront effectués sur animal vigile ou sous anesthésie (environ 2min par prélèvement). Les prélèvements de sang seront de maximum une fois par jour. En cas de prélèvement sanguin terminal, il se déroulera sous anesthésie et analgésie locale (durée entre 4 et 6 minutes). De façon mineure, d'autres nuisances sont possibles. En effet, la manipulation des animaux vigiles pour induire l'anesthésie et administrer les composés à tester peuvent engendrer un stress mineur de courte durée.

Impact sur les animaux

L'inflammation intestinale et les dommages transitoires ou permanents sur les intestins vont provoqué un mal-être générale, de la diarrhée et une cachéxie. De façon mineure, d'autres nuisances sont possibles. En effet, lors de certaines administrations nécessitant une aiguille, telles que l'induction de l'anesthésie ou l'administration d'un candidat médicament, les animaux pourront aussi subir une douleur légère et brève liée à la piqûre avec une aiguille. Enfin, la manipulation des animaux vigiles pour induire l'anesthésie et administrer les composés à tester peuvent engendrer un stress mineur de courte durée.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque expérience afin de procéder à des prélèvements d'organes et donc, d'évaluer les effets des candidat médicament sur l'inflammation digestives et systèmiques et les dommages intestinaux.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin et ses conséquences locales sur le tractus digestifs et systémiques. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’Homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, les rongeurs dont la souris est l'espèce la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Compte tenu de la variabilité du modèle, le nombre d’animaux minimal et suffisant pour réaliser une analyse statistique est estimé à 10 par groupe.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un hébergement en groupe, • la détermination des points limites. • Un suivi quotidien du poids et des signes cliniques des animaux (suivi du poids, consistance des fèces, état physique: aspect pelage + yeux et activité motrice). S'agissant d'un modèle pathologique, l'apparition de signes cliniques est certaine et nécessaire. Cependant, un recours aux procédures d’euthanasie sera effectué dès l'atteinte des points limites.

Choix des espèces

La souris fait partie des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour les modèles animaux de la recherche biomédicale. En effet, les rongeurs et l'Homme partagent de nombreuses similarités anatomiques, physiologiques et génétiques (plus de 90% de gènes en communs). De plus, les souris sont des animaux de petite taille, facile d'entretien, avec des cycles réproductif et de vie courts. Par conséquent, la souris est la plus couramment utilisée dans la recherche médicale et notamment, dans les modèles d'inflammation intestinales. Animaux adultes (âge supérieur à 8 semaines). Ce projet n'a pas pour objectif d'étudier les effets des candidats médicaments sur l'animal à d'autres stades de développement. Les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin chez l'Homme touche principalement des personnes adultes (20-30 ans).

Une mortalité soudaine de 80 % est attendue chez les animaux non traités, précédée de troubles neurologiques, d'une perte de tonus et de mousse aux orifices buccaux et nasaux. 120 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Pendant cinq semaines, ils subissent cinq anesthésies, une infection au virus Nipah par le nez ou l'abdomen, des écouvillonnages buccaux, puis un prélèvement de sang dans le cœur qui précède la mise à mort, pour tester des fragments d'anticorps contre un virus sans vaccin ni traitement. Le porteur décrit le hamster doré comme le modèle de référence depuis vingt ans et affirme que les tests in vitro ne portent que sur un organe, l'étude d'un anticorps passant "obligatoirement" par un modèle animal.

Objectifs

Le virus Nipah est un agent hautement pathogène ayant émergé dans les années 90 en Asie du Sud- Est, contre lequel il n’existe pas à l’heure actuelle de vaccin ou de traitement. Ce virus est responsable d’encéphalites sévères et/ou de syndromes respiratoires chez l’humain, avec un taux de mortalité relativement élevé (jusqu’à 75% selon les souches). Ce pathogène constitue un problème de santé publique majeur. La maladie induite par ce virus figure sur la liste de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) des maladies prioritaires en matière de recherche et développement. Dans le cadre de la collaboration entre une équipe de recherche et une société développant le traitement, une série d’anticorps polyclonaux dirigés contre une protéine du virus a été produite. L’activité neutralisante des anticorps sera évaluée dans un premier temps par test de seroneutralisation. Ce projet propose d’évaluer le potentiel de protection des anticorps. L’efficacité du traitement sera évaluée sur modèle hamster doré, en comparant des groupes traités à un groupe contrôle d’animaux non traités. L’objectif est de déterminer la voie d’intérêt d’infection par le virus, l’efficacité de la dose et le schéma d’administration (dans le temps) du traitement.

Bénéfices attendus

Dans le contexte d’absence de traitement ou de vaccin, le développement et l’évaluation de ces anticorps permettraient d’identifier un candidat à visée thérapeutique. Ces anticorps pourraient ensuite être potentiellement utilisés chez l’Homme en contexte de traitement post-exposition chez les personnels de santé ou manipulateur du virus, ou en traitement curatif chez les patients.

Procédures

Les animaux de chacune des procédures seront en expérimentation pour une période de cinq semaines. Les animaux seront soumis à un nombre de 5 anesthésies (durée de 10 à 15 minutes), à une infection virale par voie intra-nasale ou intra-péritonale sous anesthésie (durée de 5 minutes), à un prélévèment par écouvillonnage buccal sous anesthésie (durée de moins de 5 minutes), et à un prélèvement sanguin par voie intra-cardiaque sous anesthésie qui sera suivi par l'euthanasie. Au cours de chaque anesthésie, les animaux seront pesés.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont une inflammation locale légère et transitoire au niveau de la zone d’injection, une gêne à la respiration suite à l’infection par voie intranasale et une irritation des muqueuses buccales suite aux prélèvements. Les animaux seront soumis à un maximum de 4 anesthésies générales sur une période de 28 jours (infection virale, traitement à Jour 0 et/ou Jour 1 post-infection et prélèvements buccaux) ce qui peut induire une hypothermie, un stress lié à l’induction de l’anesthésie dans la boite. Une légère anxiété peut être attendue suite à la manipulation quotidienne pour la pesée. Chez les modèles d’études caractérisés, l’infection par le virus engendre des atteintes neurologiques et des troubles respiratoires, relativement comparables à ceux observés chez les humains. Les animaux contrôles devraient développer les signes cliniques caractéristiques d’une infection par le virus, tels que de la fièvre, une perte de poids, une diminution de la locomotion et du toilettage, une perte de tonus ainsi que des troubles respiratoires et de potentiels signes neurologiques. Ces signes peuvent être accompagnés d’une mortalité soudaine (80%) avec très peu de signes précurseurs : l’observation de pavillons développés, redressés (c’est à dire placement des oreilles vers l’avant), de troubles neurologiques et/ou de présence de mousse au niveau des orifices buccaux/nasaux. Les animaux traités devraient présenter moins ou aucun signe clinique contrairement aux animaux contrôles.

Devenir

L'étude implique que les organes et les tissus puissent être prélevés sur l'ensemble des animaux de l'étude (n=120), ceux-ci étant répartis en divers groupes infectés et traités. Par conséquent, seule la mise à mort des 120 animaux de l'étude permettra d'obtenir des données statistiquement robustes.

Remplacement

Les méthodes alternatives dérivées de la culture cellulaire ou de l’animal tendent à recréer artificiellement ou à maintenir les interactions inter-cellulaires que nous pouvons retrouver dans un organisme mais ne permettent de se focaliser que sur un organe et pas sur un organisme vivant entier. Suite au développement et à la caractérisation des anticorps, la quantité d’anticorps sera déterminée par technique ELISA et l’activité neutralisante de ces anticorps sera évaluée par seroneutralisation par l'équipe collaboratrice afin d'obtenir les données préliminaires. Afin d’évaluer le potentiel thérapeutique de ces anticorps, ils doivent ensuite être confrontés dans un modèle plus complexe mimant l’infection par le virus. En effet ces tests in vitro ne permettent pas actuellement de répondre à des questions globales telles que la mise en place de la pathologie, le développement symptomatologique ou la mise en place de réactions immunitaires suite à un traitement et à une infection virale. L’étude de l’activité d’un anticorps sur un virus passe donc encore obligatoirement par l’utilisation d’un modèle animal.

Réduction

Afin de mesurer l’efficacité de la protection induite par le traitement suite à l’infection, l’ensemble des animaux sera mis à mort en fin de procédure afin de collecter des échantillons biologiques pour analyser les différents paramètres virologiques et immunologiques des animaux traités par rapport aux animaux non traités. Grâce aux résultats obtenus lors de précédentes études, les signes cliniques caractéristiques d’une infection par le virus chez les animaux non traités sont connus, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux contrôles à 6 pour chacune des voies d’infection, en respectant la parité (n= 6 animaux infectés par voie intra-nasale et n=6 animaux infectés par voie intra-péritonéale).

Raffinement

Les animaux seront hébergés par 3 dans des cages adaptées au système d’hébergement. Les conditions d’hébergement classiques sont maintenues. Des observations journalières seront réalisées afin d’évaluer l’état de chacun des animaux selon les signes cliniques attendus. Un système de vidéosurveillance permettra de visualiser les animaux pendant les périodes où les membres de l’équipe ne seront pas présents en laboratoire. Cette surveillance est réalisée dès que souhaité et en période de week-end (sur animaux avant infection). En cas de doute sur l’état d’un ou plusieurs animaux, une entrée en zone sera programmée pour procéder à une observation des animaux et à une possible décision d’arrêter le protocole.

Choix des espèces

Le hamster doré est le modèle de référence pour l’étude du virus Nipah. Il a été développé il y a quasiment 20 ans au laboratoire puis utilisé dans le cadre de divers projets collaboratifs et publié par de nombreuses équipes internationales. Les animaux seront agés de 7 à 8 semaines selon la disponibilité. Ces âges correspondent aux stades de développement des hamsters utilisés par la communauté scientifique pour les études pré-cliniques dans ce contexte et permet d’évaluer la réponse mise en place suite au traitement par anticorps sur système immunitaire mature.

Deux à trois interventions chirurgicales de deux à sept heures, puis une anesthésie par semaine pouvant durer six heures, pendant plusieurs mois : 34 marmousets sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue. Le porteur compte jusqu'à 36 mois entre la chirurgie d'implantation de la chambre d'imagerie crânienne et la mise à mort, et décrit un risque de douleurs, d'inflammation, d'infections, de difficultés respiratoires, de tremblements, d'abcès et d'œdème cérébral. Les animaux entraînés aux enregistrements en état vigile sont capturés et manipulés plusieurs fois par semaine, avec de la gomme arabique en récompense. L'objectif déclaré est de comprendre comment les neurones du cortex visuel encodent une scène visuelle, et le cerveau est prélevé à la fin, ce qui suppose la mise à mort de chaque animal.

Objectifs

Cette demande d'autorisation de projet fait suite à un projet déjà mis en place dans notre laboratoire et présente deux objectifs principaux. Il vise dans un premier temps à comprendre comment les neurones corticaux encodent différents attributs de la scène visuelle et interagissent ensemble pour générer une représentation globale de l'information, par exemple un simple objet en déplacement dans l'espace visuel. Ceci implique plusieurs sous-objectifs tels que le développement d'un protocole d'entraînement des animaux afin de pouvoir enregistrer l'activité neuronale pendant qu'ils réalisent une tâche visuelle simple, ainsi que le raffinement des procédures d'imagerie déjà mises en place dans notre laboratoire pour enregistrer cette même activité neuronale sous anesthésie. Ces deux modalités d'acquisition de données (éveillé et anesthésié) testées sur les mêmes animaux nous permettront ainsi d'obtenir des informations sur le fonctionnement des réseaux neuronaux qui sous-tendent la vision. Le second objectif de ce projet est de développer des outils et méthodes permettant l'acquisition de données d'électrophysiologie (activité électrique) des neurones du cortex visuel chez le marmouset couplées aux données d'imagerie optique.

Bénéfices attendus

En premier lieu, la réalisation de ce projet nous permettra d'accroitre nos connaissances fondamentales sur le système visuel et de mieux comprendre la manière dont le cerveau intègre et représente l'information visuelle et le rôle joué par certaines régions spécifiques du cerveau dans les comportements moteurs d'orientation des yeux. Par ailleurs, les informations collectées pourraient permettre d'améliorer les solutions mises en place chez certains patients. Elles pourront par exemple contribuer à améliorer les techniques d'appareillage prothétique et la performance en réhabilitation visuelle.

Procédures

Les animaux seront soumis à 2 ou 3 interventions chirurgicales pouvant durer de 2 à 7h. Ils pourront être par la suite anesthésiés une fois par semaine maximum, chaque anesthésie durant 6h au maximum (4h en moyenne). Ces sessions sous anesthésies seront conduites pendant plusieurs mois, mais la durée de l'expérience ne peut être prédéterminée à l'avance car elle dépendra de l'état de santé des animaux. C'est pourquoi la santé de chaque animal inclus dans ce projet sera suivie quotidiennement par du personnel formé, et leur état de santé réévalué tous les 6 mois. Nous estimons toutefois qu'une période de 36 mois entre la chirurgie d'implantation et la mise à mort de l'animal devrait suffire pour l'entraîner et acquérir toutes les données nécessaires. Aussi, les animaux qui passeront les mêmes expériences mais en étant éveillés devront être habitués et entraînés à passer ces exépriences. Cela implique qu'ils soient manipulés et capturés plusieurs fois par semaine.

Impact sur les animaux

Ces expérimentations impliquent plusieurs chirurgies, des anesthésies répétées dans le temps et une manipulation hebdomadaire voire quotidienne des animaux (entraînements vigiles, contention pour induction d'anesthésie, contention pendant les entraînements vigiles, enregistrements éveillés...) qui pourront induire du stress pendant les mois d'expérimentation. Du stress et des complications faisant suite aux chirurgies et anesthésies peuvent également survenir dans les jours qui suivent l'intervention (mise à jeun la veille de chaque anesthésie, isolement quelques heures en retour de chirurgie, douleurs, inflammation, infections, difficultés respiratoires, perte d'appétit, tremblements, abcès, oedème cérébral...).

Devenir

Pour avoir des données complètes sur le système visuel que nous étudions, le projet nécessite le prélèvement du cerveau à la fin de la procédure, et donc la mise à mort des animaux utilisés.

Remplacement

Ce projet requiert l'enregistrement de l'activité cérébrale à différentes échelles, c'est à dire à l’echelle d'une aire cérébrale mais avec une grande résolution spatiale (neurone) et temporelle (potentiel d’action). Les méthodes non-invasives ne permettent pas cet accès, et l'utilisation d'animaux ne peut donc être remplacée.

Réduction

Afin de minimiser le nombre d'animaux prévus pour réaliser cette étude, nous voulons faire passer les animaux par toutes les techniques d'imagerie optique dont nous disposons une fois qu'ils seront implantés de la chambre d'imagerie. Nous avons conscience que cela implique que les animaux restent plus longtemps dans le protocole (plusieurs mois entre l'entraînement aux tâches comportementales, les chirurgies, l'acquisition des données et la mise à mort) mais cela nous permettra de réduire considérablement le nombre d'animaux nécessaires pour répondre à toutes les questions scientifiques posées. De plus, les séances d'entrainement permettront d'habituer les animaux à leurs expérimentateurs, ce qui permettra de diminuer le stress de leur manipulation. L'expérience acquise sur les animaux associés au projet précédent nous a également permis d'améliorer nos techniques de chirurgie et notre matériel expérimental, ce qui permettrait pour ce projet de conserver une chambre d'imagerie sans tissus de repousse pendant plus de 200 jours (contre 100 jours estimés a priori sur la base des articles trouvés dans la littérature) chez la plupart des animaux, tout en gardant des animaux en très bonne santé, et par conséquent de réduire le nombre d'animaux sur la durée du projet.

Raffinement

La chambre d'enregistrement a déjà été raffinée, nous essayons de l'améliorer au fur et à mesure de l'expérience acquise. Cette chambre est composée d'un piston réglable en hauteur équipé d'une vitre courbe qui épouse la forme du cerveau sans le comprimer. Grâce à cette nouvelle chambre, nous espérons limiter la repousse de tissus généralement observée, et par conséquent réduire le nombre d'interventions pour retirer ces tissus, ce qui minimisera les risques d'infection et le nombre d'interventions nécessaires à leur réalisation. De plus, d'après nos observations, nous nous attendons à pouvoir garder cette chambre hermétiquement fermée pendant plusieurs mois, sans que cela n'impacte la santé ni les comportements des animaux. Nous nous attendons aussi à ce que l'expérience acquise au cours du projet permette le raffinement de nos techniques de chirurgie et donc une meilleure récupération post-opératoire, ainsi qu'un raffinement du bien-être tout au long de la période d'imagerie de ces animaux. Le nombre réduit d'anesthésies nécessaires à l'acquisition de données (1 fois 3h/semaine VS. 2 fois 6h/semaine prévu au commencement du projet) permettra aussi de limiter l'impact sur l'état de santé des animaux et de minimiser une potentielle habituation aux agents anesthésiants. Dans ces conditions, nous nous attendons à ce que les animaux ne montrent aucun signe clinique de mal-être lié aux anesthésies répétées. Les sessions d'imagerie sous anesthésie nous permettront aussi de continuer d'acquérir des données, tout en évitant le stress induit par la manipulation des animaux éveillés. L'état de santé des animaux inclus dans les protocoles sous anesthésie sera suivi de près et quotidiennement par du personnel formé et qualifié, et une évaluation du vétérinaire référent et de la SBEA sera réalisée tous les 6 mois afin de s'assurer qu'aucun signe clinique lié aux anesthésies répétées ne survient. En ce qui concerne les entraînements pour les séances éveillées d'acquisition de données, les animaux seront tous entraînés par renforcement positif avec de la gomme arabique (aliment présent dans le régime alimentaire des marmousets), ce qui permettra d'éviter toute restriction alimentaire ou hydrique. Enfin, les animaux seront hébergés en paires dans des volières adaptées et enrichies de plusieurs éléments (hamac, tunnels, nids suspendus, perchoirs...).

Choix des espèces

L'utilisation de primates ne peut être remplacée puisque le système visuel est un système complexe et nécessite d'être étudié chez une espèce au plus proche de l'espèce humaine pour les besoins de ce projet (le système visuel des rongeurs étant très différent de celui des primates). Le modèle marmouset nous permettra de travailler sur une espèce de primate non humain qui possède plusieurs avantages significatifs pour notre projet. C'est une espèce dont le système visuel est très proche de celui de l'humain, avec une hiérarchie des aires corticales supérieures identique. De plus, c'est une espèce lissencéphale ce qui permet d'utiliser l'ensemble de nos techniques d'imagerie sur tout le système visuel. Enfin, sa petite taille nous permet de l'utiliser pour des expériences d'imagerie biphotonique. Age : à partir de 12 mois (animaux matures), nous n'avons pas de contrainte d'âge pour ce projet. Poids : 0.3 à 0.5 kg

Pesées à chaque manipulation, puçées sous anesthésie, testées jusqu'à deux fois par semaine sur leur fonction motrice et neuromusculaire, injectées chaque mois et exposées trois fois à des traceurs radioactifs pour une heure d'imagerie, les souris de ce projet développent en plus spontanément une paralysie progressive. 596 souris transgéniques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur décrit une atrophie musculaire, des troubles de la marche et une dysfonction intestinale responsable d'un décès prématuré, tout en ramenant les nuisances liées aux actes expérimentaux à des douleurs au point d'injection et à un stress de manipulation. Toutes seront mises à mort pour prélever différents tissus, la décision étant prise après 48 heures sans amélioration chez les souris qui montrent des signes de mal-être.

Objectifs

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative caractérisée par une dégénérescence des neurones impliqués dans la motricité (motoneurones) et aboutissant à la mort dans les 2 à 5 ans suivant la détection des symptômes. Les mécanismes à l’origine de la maladie sont encore mal compris, et il n’y a aucun traitement efficace existant actuellement. Une caractéristique de la maladie est l’agrégation d’une protéine dans les motoneurones et les cellules gliales (cellules formant l’environnement des neurones). Donc, cibler ces agrégats et empêcher leur formation pourrait constituer une démarche thérapeutique d’intérêt. Nous avons récemment identifié un fragment d’anticorps (appelé intracorps) se fixant spécifiquement à la protéine concernée et qui présente des effets protecteurs in vitro. L’objectif de ce projet est d’évaluer ses effets in vivo dans un modèle murin de SLA. .

Bénéfices attendus

Pour la première fois, nous allons i) Apporter des données longitudinales sur ce modèle de SLA, utiles pour tout nouveau test de médicament et ii) Apporter des données sur les effets de l’intracorps.

Procédures

- Pesée lors de chaque manipulation (duree :

Impact sur les animaux

Les souris transgéniques, modèle de sclérose latérale amyotrophique, développent spontanément un phénotype neurodégénératif, avec des symptômes moteurs, des troubles de la marche, une perte de poids et une atrophie musculaire. Ce modèle développe également une dysfonction intestinale responsable d’un décès prématuré, qu’il est possible de prévenir par la mise en place d’une alimentation gélifiée. Les nuisances attendues liées aux actes expérimentaux réalisés sur les animaux sont les suivantes : Injection du placebo ou de l’intracorps: douleur au point d’injection. Nuisances liées à l’imagerie: stress lié à la manipulation, douleur au point d’injection du traceur ou risque d’hématome . Prélèvements sanguins: douleur mandibulaire au point de prélèvement ou risque d’hématome si prélévement par veine caudale. Tests comportementaux: stress lié à la manipulation.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour réaliser des analyses sur différents tissus prélevés.

Remplacement

Les modèles in vitro que nous utilisons pour nos projets sont inopérants dans une telle étude qui vise à étudier un organisme dans son ensemble. En revanche, l’intracorps a d’abord été testé dans des modèles cellulaires surexprimant la cible du médicament. Le candidat a démontré sa capacité à réduire l’aggrégation de la protéine dans ces modèles. Le candidat a fait l’objet d’un brevet sur sa séquence du fait de ses effets dans des modèles in vitro (publication en cours) et les essais pré-cliniques sont indispensables à la poursuite du développement du candidat.

Réduction

le nombre de groupe a été optimisé et le nombre d’animaux par groupe a été réduit à son maximum. De plus, l’utilisation de l’imagerie in vivo au cours du temps permet la réduction du nombre d’animaux utilisés. Huit groupes de 24 souris, soit 576 souris sur 5 ans + 20 souris d’entrainement seront utilisées dans le projet. Les effectifs ont été choisi sur la base d’une analyse bibliographique, de l’utilisation d’un test de puissance, de la prise en compte de la fragilité du modèle.

Raffinement

Les souris transgéniques développant des troubles de la dysfonction intestinale liés au développement de la maladie, de la nourriture gélifiée sera également mise à disposition dès le stade présymptomatique afin de prévenir l’apparition de ce symptôme. Les conditions d’élevage inclueront un enrichissement du milieu (papier absorbant, cabanes, et/ou tubes). Des habituations à la pièce d’expérimentation d’au moins une heure sont réalisées avant les tests comportementaux pour diminuer le stress des animaux. En cas de blessure, les animaux recevront un traitement analgésique jusqu’à la disparition des signes de douleur (Injection sous-cutanée d'un antidouleur ). La blessure est également désinfectée. Une surveillance accrue d’une semaine est réalisée pour suivre chaque souris montrant des signes de mal-être (hypothermie, prostration, etc...) et intervenir si nécessaire (injection sous-cutanée de solution saline à 37°C pour l’hydratation, nourriture appétente Des points limites sont appliqués : les animaux surveillés sont pesés et auscultés quotidiennement (hydratation, température, état de la blessure si blessures). Les points limites seront déterminés selon une grille de cotation. La décision de mise à mort est prise s’il n’y a pas d’amélioration dans les 48h. L’imagerie en tomographie d’émission de positons (TEP) est une méthode permettant de suivre l’évolution de la maladie sur un même sujet évitant ainsi l’évaluation par autopsie nécessitant des mises à mort à différents temps, ce qui constitue une mesure de réduction et de raffinement. Imagerie : Pendant 4 jours avant l’imagerie du radiotraceur, pour minimiser leurs stress, une habituation des animaux sera réalisée. Cette période d’habituation consiste pendant les 4 jours précédents l’imagerie à prendre l’animal en contention pour mimer l’injection du traceur en i.p., placer l’animal dans une cage maintenue à une température de 37°C pour une durée de 30 min, puis replacer l’animal dans sa cage. Le jour de l'imagerie l’induction d’anesthésie sera réalisée en gazeux et pendant les imageries les animaux seront maintenus à 1,8-2%. Une protection oculaire sera appliquée. L’animal sera maintenu durant toutes les expérimentations d’imagerie sur lit chauffant, le rythme respiratoire et la température corporelle seront surveillés. Dès son réveil, l’animal sera remis dans sa cage d’hébergement.

Choix des espèces

Il y a peu d’animaux modèle de la SLA, seul le modéle de souris transgénique possède les caractéristiques recherchées pour notre projet. Les modèles in vitro que nous utilisons pour d’autres projets sont inopérants pour notre étude qui vise à étudier un organisme dans son ensemble. Les souris seront reçues à leur 7ème semaine de vie. Ceci permettra de débuter le traitement avant le début d’apparition des symptômes de la SLA.

Injectés d'interleukine 1 bêta pendant leurs cinq premiers jours de vie pour provoquer une inflammation cérébrale, des souriceaux peuvent en mourir dans 5 à 10 % des cas. 3 508 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements de cerveau. Le projet teste un traitement donné au sevrage pour éliminer les cellules microgliales, puis évalue à 2 mois la mémoire par un test de peur qui associe une sonnerie à trois chocs électriques à la patte, et le comportement social par le choix entre un congénère inconnu et un objet. Une partie des souris subit à 45 jours une incision de la peau du crâne et une perforation de l'os pour l'injection d'un produit qui lèse le cerveau, opération qui peut entraîner, dans 10 % des cas, des infections, des troubles de la conscience persistants ou des troubles moteurs. Le porteur retient des souris blanches pour la taille des portées et les "qualités maternelles" des mères, censées limiter le stress des souriceaux injectés sans anesthésie.

Objectifs

La prématurité est la première cause de mortalité et de handicap chez les enfants de moins de 5 ans. Un lien causal entre infection maternelle et naissance prématurée a été mis en évidence. En effet, une réaction inflammatoire chez le fœtus peut entrainer une inflammation cérébrale et par conséquent, des lésions cérébrales connues sous le nom d’encéphalopathie du prématuré. Ces lésions favorisent ensuite l’apparition de troubles du développement neurologique, en particulier les troubles du spectre autistique. Parmi les acteurs clés de l'inflammation cérébrale, on retrouve les cellules microgliales ou microglies, cellules immunitaires résidentes du cerveau. La morphologie et les fonctions des microglies sont altérées lors d’un stimulus inflammatoire précoce, conduisant notamment à des altérations moléculaires et comportementales (diminution du comportement social) caractéristiques des troubles du développement neurologique. De plus, il a été montré dans des modèles animaux associant une inflammation néonatale à une deuxième agression cérébrale, cette fois à l’âge adulte, un phénomène de sensibilisation, aggravant l’intensité de cette 2ème agression. Le remplacement spontané de ces cellules microgliales altérée par de nouvelles cellules, après leur élimination par un traitement médicamenteux (que l'on nomme recolonisation microgliale), pourrait contribuer à la correction de certaines de ces anomalies dont le rétablissement de la maturité des neurones et du comportement social. Les objectifs de cette étude sont donc d’abord de préciser les conséquences de cette inflammation précoce sur la mise en place des structures cérébrales et le comportement chez les adultes des deux sexes, de déterminer le potentiel de ce traitement quant à la correction de ces troubles neurologiques, et ensuite d’étudier le rôle des cellules microgliales dans la sensibilisation à une 2ème agression à l’âge adulte, et de déterminer le potentiel thérapeutique de la recolonisation microgliale dans ce contexte.

Bénéfices attendus

Grâce à ce modèle souris d’inflammation précoce, nous déterminerons pour la première fois l'efficacité de l’élimination de cellules microgliales cérébrales altérées et leur remplacement pour traiter les troubles du développement neurologique. Ce projet apportera de nouvelles connaissances sur la capacité de cette approche à être appliquée dans une stratégie médicale précise. De plus, nous déterminerons pour la première fois l'efficacité de la stratégie de renouvellement des microglies sur l’intensité des lésions cérébrales pouvant survenir à l’âge adulte dans ce modèle de trouble du neuro développement en fonction du sexe. Ce projet apportera de nouvelles connaissances sur la capacité de cette approche à être appliquée dans une stratégie médicale précise.

Procédures

Les injections réalisées sur les souriceaux d’une molécule inflammatoire connue, l'interleukine-1beta (IL-1β), durant les 5 premiers jours de vie peuvent causer une douleur transitoire et locale. La séparation de leur mère le temps des injections peut causer un stress transitoire. Le traitement testé sera ensuite administré dans l’alimentation au sevrage des animaux à la troisième semaine de vie et pendant 3 semaines. Les animaux seront soumis à deux tests afin d’évaluer leur mémoire et leur comportement social à 2 mois. Pour la mémoire, les animaux recevront un léger choc électrique suite à une sonnerie à 3 reprises. Deux jours plus tard, ils seront placés dans cet environnement et leur comportement de peur lors du retentissement de cette sonnerie, se traduisant par une immobilisation de l’animal, sera évalué. En termes de comportement social, les souris auront le choix d’interagir avec un nouvel animal ou avec un objet, une préférence pour l’interaction avec l’animal est attendue. L’interaction avec le nouvel animal devrait susciter l’intérêt et constituera le critère d’évaluation (reniflements, etc.). Des animaux seront aussi soumis, à 45 jours de vie, à une chirurgie pour injection intracranienne d'un produit créant une lésion du cerveau : sous anesthésie générale, la peau du crâne est incisé, une perforation de l'os du crâne est réalisée, puis le produit en question est injecté dans le cerveau. A l’issue de la chirurgie, les animaux seront maintenus vivant 5 jours avant euthanasie pour réalisation d’analyses. Enfin, des animaux subiront une chirurgie à 60 jours afin de mesurer l’activité neuronale dans différentes zones du cerveau. Pour cela, les animaux seront endormis et un antidouleur leur sera administré. L’imagerie est ensuite effectuée. L’animal est ensuite euthanasié.

Impact sur les animaux

Pour les souriceaux durant la première semaine de vie, les injections peuvent causer une douleur transitoire et locale. Les injections induisent une inflammation, par conséquent les souriceaux peuvent présenter des signes de déshydratation, ont un retard de croissance, et un retard dans la pousse du pelage par rapport aux souris contrôles. Ces effets perdurent environ 2 semaines. Les injections peuvent également, mais rarement, entraîner une hémorragie interne dans l’abdomen, ou leur mort dans 5 à 10% des cas. Pour cette raison, l'apparition d'hémorragie sera particulièrement surveillée entre le premier et le 5e jour de vie. Bien que les injections durant les premiers jours de vie soient des gestes très rapides, ils peuvent induire un stress lié à la séparation avec la mère pendant ce laps de temps. Concernant le traitement médicamenteux pour éliminer les cellules microgliales, il sera administré pendant 3 semaines dans le régime alimentaire ou par injection pendant 5 jours selon les résultats d’une étude préliminaire. Les effets indésirables qui pourraient survenir incluent un changement de la structure du visage et du crâne. Les tests comportementaux peuvent également induire un stress chez l’animal, en particulier le test comprenant un choc à la patte. Pour cela, nous avons déterminé les durées minimales nécessaire afin d’étudier ces comportements pour minimiser la présence de nos animaux dans des environnements qui pourraient impacter leur bien-être. La chirurgie n’induira pas de nuisances, l’animal étant endormi par anesthésie et sa douleur contrôlée par un antidouleur, il est ensuite euthanasié. Concernant les injections intracrâniennes du produit créant une lésion cérébrale, il s’agit d’une chirurgie pouvant entrainer des douleurs (incision de la peau du crâne et perforation de l'os du crâne) qui sera pris en charge par administration d'un traitement antidouleur, et dans de rares cas (10%) : - des infections du site opératoire - des troubles de la conscience persistants - des troubles moteurs. Ces complications peuvent entrainer un défaut d’hydratation et d’alimentation des animaux. Une surveillance spécifique est donc mise en place post procédure.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés aux stades d’intérêt (Jour 42 et 60 après leur naissance) pour les analyses. Les prélèvements de cerveaux permettront d'étudier de manière approfondie l’inflammation cérébrale et l’efficacité du traitement pour la protection du cerveau en développement.

Remplacement

L’étude de la complexité de la réponse inflammatoire au niveau cérébral, ses conséquences et son traitement requiert l’utilisation d’un organisme vivant complet avec une maintenance du milieu physiologique et des interactions entre les différentes cellules et organes à plusieurs stades de développement. Pour cela, cette étude n’est envisageable qu’in vivo.

Réduction

Le nombre minimum d’animaux est utilisé pour traiter des données statistiquement exploitables. De ce fait, il est nécessaire d’avoir n=10 animaux par groupe expérimental, avec 10% d’animaux supplémentaires dans les groupes recevant la molécule inflammatoire, compte-tenu de la mortalité probable due à l’inflammation. Une seule et même analyse sera dupliquée seulement en cas de variabilité. Les études de mises au point de nos techniques sont également indispensables et comptent le nombre minimum d'animaux. Les analyses requièrent des processus de préparation différentes, un seul et même prélèvement ne peut donc pas servir pour plusieurs analyses.

Raffinement

Les mères et les souriceaux sont hébergés dans des cages enrichies en essuie-tout pour qu’elles puissent y faire leur nid. Les femelles souris blanches ont d’excellentes qualités maternelles, ce qui constitue un bon choix pour minimiser le stress des souriceaux qui subiront la procédure d’injection, même si c’est un acte peu douloureux, réalisé sur animal sans nécessité d’anesthésie. Après le sevrage les animaux seront hébergés avec un maximum de 6 animaux par cage. Pendant les 5 jours d’injection, on surveillera la fréquence respiratoire, la recoloration des extrémités, et le tonus ; à distance de l’inflammation on réalisera une surveillance régulière pour détecter une fluctuation importante du poids ou des troubles du comportement (isolement, agressivité). Si l’un de ces points limites est atteint, les animaux concernés seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires. À la fin de l’étude les animaux seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires.

Choix des espèces

Le choix de la souris est pertinent d’un point de vue scientifique en termes de reproductibilité, des connaissances biologiques de l’espèce et du temps de reproduction. L’administration de l’interleukine-1β permettra d’étudier les voies impliquées dans la neuroinflammation et établir des stratégies neuroprotectrices. Cette inflammation au niveau du cerveau pendant les 5 premiers jours de vie permet de simuler une inflammation pendant la grossesse chez l’Homme. Suite à l’inflammation, les cellules altérées dans le cerveau seront éliminées par un traitement chez les souris avant l’adolescence et remplacées spontanément par des nouvelles cellules. La correction des troubles structuraux et comportementaux sera ensuite étudiée à l’âge adulte (2 mois). En plus d’une connaissance bien établie sur le développement neurologique chez la souris, les souris blanches présentent de nombreux avantages pour une étude développementale tels que le nombre de souriceaux par portée, qui permet de réduire le nombre de femelles gestantes, ainsi que les qualités maternelles de la mère.

Infectées par Pseudomonas jusqu'au sepsis, les souris traversent quarante-huit heures que le porteur décrit comme les plus critiques en douleur et en mortalité, le modèle conduisant à la mort de l'animal en l'absence de traitement. 560 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever des organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. L'objet est de tester l'activité antibactérienne d'anticorps polyclonaux contre une bactérie responsable de près de 10 % des infections nosocomiales et souvent résistante aux antibiotiques. Le porteur annonce une analgésie et une surveillance trois fois par jour pendant les deux premiers jours, sans préciser la dose bactérienne administrée, le nombre de groupes, ni le calcul qui aboutit à 560 souris, dont il écrit seulement que l'effectif "doit permettre de faire des analyses statistiques robustes".

Objectifs

Pseudomonas est une bactérie responsable de près de 10% des infections nosocomiales. Les infections à pseudomonas sont en augmentation et sont généralement associées à des résistances aux antibiotiques. Elles représentent ainsi une réélle menace pour la santé publique. L'objectif de ce projet est d'évaluer l'activité antibactérienne d'anticorps polyclonaux dans un modèle murin de sepsis (réponse inflammatoire généralisée associée à une infection grave).

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de valider l'activité antibactérienne des anticorps polyclonaux et de proposer une alternative thérapeutique dans un domaine ou le besoin médical est important. Ce projet pourrait aussi ouvrir la voie à de nouvelles stratégies de lutte contre les infections bactériennes.

Procédures

Les traitements se feront par voie intrapéritonéale ou sous-cutanée. Une contention légère sera faite par du personnel qualifié sur les souris pour l'administration des traitements, afin de ne pas engendrer de stress sur les souris. Ces manipulations ainsi que les piqures ne dureront que quelques secondes et la souris sera rapidement remise avec ses congénères.

Impact sur les animaux

Le modèle utilisé ici conduit à la mort de l’animal en l'absence de traitement. Il s'accompagne d'une l’inflammation locale et systémique, source de douleur et d’inconfort. Il est donc classé comme procédure sévère. Les premières 48 heures qui suivent le challenge bactérien sont les plus critiques en termes de douleur et de mortalité. A partir de 48h, l’état des souris s’améliore avec une chute des nuisances et de la mortalité.

Devenir

Après chaque expérimentation, les animaux seront mis à mort et des organes d’intérêt pourront être récupérés pour compléter les analyses.

Remplacement

Si des tests in vitro permettent d'évaluer l'activité des nouvelles thérapies, les études chez l'animal restent indispensables pour valider leur potentiel thérapeutique dans un environnement physiologique. Ces études permettent aussi de repérer une éventuelle toxicité des traitements et éclairent sur les modes d'action engagés.

Réduction

Le nombre d'animaux prend en compte le besoin de réduction (règle des 3R) et les contraintes statistiques liées au modèle et aux analyses qui seront réalisées. Le nombre d’individus par cohorte doit permettre de faire des analyses statistiques robustes.

Raffinement

Une étape d’acclimatation de 12 jours minimum sera systématiquement réalisée à l’arrivée des animaux pour éliminer le stress dû au transport et permettre l’habituation aux nouveaux locaux et personnels animaliers avant tout acte sur l’animal. En outre, les animaux sont maintenus dans un cycle jour/nuit de 12h/12h avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Le nombre d’animaux par cage est de 5 pour limiter le stress de la surpopulation. Des frisottis sont placés dans la cage pour permettre aux souris de s’enfouir et se cacher. Des signes cliniques et points limites ont été définis afin de monitorer objectivement la souffrance des animaux au cours du modèle. La douleur sera évitée par injection d'analgésiques en fonction des signes cliniques observés ou en euthanasiant les animaux. Les premières 48h qui suivent le challenge bactérien sont les plus critiques en termes de douleur et de mortalité. Une attention particulière sera donc apportée durant cette période avec une surveillance des souris 3 fois par jour. Cette surveillance pourra être renforcée avec augmentation de la fréquence des passages si besoin. Une analgésie sera aussi appliquée 3 fois par jour durant les 48 premières heures du modèle (la première injection sera réalisée 15 minutes avant le challenge bactérien). A partir de 48h environ, l’état des souris traitées doit s’améliorer. L'analgésie sera alors décidée en fonction de l'état des animaux en prenant en compte les éléments suivants: morphologie générale, poids, paupières, aspect des larmes, aspect de la zone urogénitale, apathie, comportement en groupe, activité de la respiration.

Choix des espèces

Le modèle de sepsis décrit dans ce projet a été validé et caractérisé dans des publications. Nous travaillerons avec des souris femelles (les souris femelles étant plus légères elles permettent d'utiliser moins d'anticorps).

La mise à mort est déclenchée dès qu'une souris perd 20 % de son poids, convulse, se paralyse, se prostre ou n'arrive plus à se déplacer. 68 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacune reçoit une greffe intracérébrale de cellules de glioblastome au cours d'une intervention chirurgicale d'environ trente minutes, et la tumeur provoque ensuite une perte d'appétit, une malnutrition puis une perte de poids, le porteur ne qualifiant de "douleur légère de courte durée" que les injections. Il vise à comprendre le rôle d'une molécule, A2B5, dans la réponse immunitaire, ce qui "permettrait" selon lui de nouvelles thérapies contre une tumeur cérébrale aujourd'hui sans traitement curatif.

Objectifs

A2B5 est une molécule exprimée par les cellules tumorales de glioblastome (tumeur cérébrale). L'objectif est d’analyser le rôle de la molécule A2B5 dans la réponse immunitaire. Pour cela, nous étudierons l'impact de l'expression de A2B5 dans l'activation du système immunitaire et dans le développement de la tumeur.

Bénéfices attendus

Le glioblastome est une tumeur cérébrale est une pathologie fatale (médiane de survie de 1 an) et pour laquelle il n’existe aucun traitement curatif. Une meilleure compréhension du rôle joué par la molécule A2B5 (exprimé par la tumeur) dans les mécanismes immunitaires permettrait la mise en place de nouvelles thérapies pour les patients atteints de glioblastome.

Procédures

Les animaux recevront une greffe intracérébrale de cellules tumorales de glioblastome (68 animaux, une seule intervention de 30 minutes environ). Les greffes intracérébrales sont des procédures chirurgicales.

Impact sur les animaux

La manipulation, contention des animaux, les injections d'anesthésiques pour la réalisation de la craniotomie sont générateurs de stress pour les animaux. Par ailleurs les injections entrainent également une douleur légère de courte durée. La progression tumorale induite par la maladie (glioblastome) provoque à terme une perte d'appétit, donc une malnutrition et finalement une perte de poids.

Devenir

L'ensemble des souris impliquées dans ce projet feront l’objet d’une analyse du système immunitaire et de l'évolution tumorale, ce qui nécessitera leur mise à mort.

Remplacement

Les nombreux partenaires (cellulaires et moléculaires) des processus dynamiques immunitaires et tumoraux nécessitent une approche expérimentale in vivo car il n’existe pas à ce jour de système suffisamment fiable pour mimer cette complexité biologique.

Réduction

Le nombre d'animaux prévu dans chaque groupe est basé sur un calcul d'effectif permettant de prédire que nous avons 80% de chance d’obtenir un résultat statistiquement significatif.

Raffinement

La détection de toute souffrance de l’animal sera assurée et le niveau de souffrance évalué en fonction d’une grille de score. Les animaux seront euthanasiés dès l’apparition d’un signe de détresse (perte de poids supérieure ou égale à 20% du poids initial, convulsions, paralysie, prostration, difficulté à se déplacer). Pour le bien-être de l'animal, les souris seront logées selon les normes requises avec un enrichissement (copeaux de bois, dômes) et en groupes de 5 individus par cage afin d’éviter le stress de l’isolement.

Choix des espèces

Les données bibliographiques démontrent que le modèle murin est le plus adapté pour aborder les questions relatives aux tumeurs cérébrales et à l'immunité tumorale. Les tumeurs de glioblastome générées dans ce modèle animal précis sont particulièrement similaires aux tumeurs humaines. Les souris seront réceptionnées à l’animalerie à l’âge de 6 semaines et utilisées à l’âge de 7 semaines, en accord avec les protocoles décrits pour ce modèle physiopathologique classique.