Procédures sévères
Altérations myocardiques localisées à l’origine de la mort subite d’origine cardiaque chez le porc
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
194 cochons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et chacun passe sous anesthésie générale pour deux IRM d'environ 2 heures, deux cartographies électriques du cœur d'environ 1 h 30, la création d'un infarctus, puis le prélèvement de son cœur, au cours duquel il est tué. Les secondes séances d'IRM et de cartographie ont lieu à son retour, après un délai suivant l'infarctus que le porteur ne précise pas, et 140 d'entre eux reçoivent aussi un boîtier de télémétrie implanté. L'infarctus peut provoquer une insuffisance cardiaque ou une fibrillation ventriculaire, et les réveils une désorientation et une apathie. Le porteur annonce que le projet "devrait permettre" de prévenir la mort subite par des défibrillateurs implantables ou des traitements anti-arythmiques. La création de l'infarctus concerne les 194 cochons, mais la répartition fournie, 54 par ischémie-reperfusion et 48 par occlusion progressive, n'en couvre que 102.
Objectifs
Les principaux objectifs du projet sont de comprendre les mécanismes cellulaires et tissulaires impliqués dans les troubles électriques à l’origine de la mort subite cardiaque (SCD), et d’identifier les sujets à risque en caractérisant les signaux électriques cardiaques directement liés à ces anomalies en les détectant de manière non invasive à la surface du corps. Notre objectif est donc d’identifier des marqueurs électriques directement à la surface du corps de manière non-invasive afin d’améliorer la qualité de vie.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre la prévention de la mort subite cardiaque par des défibrillateurs implantables ou des traitements anti-arythmiques.
Procédures
Imagerie non invasive IRM : sous anesthésie générale concerne 194 animaux ; 2 fois pour chaque animal : avant la création de l’infarctus et au moment du retour de l’animal avant le prélèvement durée environ 2h par examen. Cartographie de contact : sous anesthésie générale concerne 194 animaux ; 2 fois pour chaque animal : avant la création de l’infarctus et au moment du retour de l’animal avant le prélèvement durée environ 1h30 par examen. Implantation du boitier de télémétrie : sous anesthésie générale concerne 140 animaux ; juste une fois avant la création de l’infarctus durée environ 1h par implantation. Création d’un infarctus : sous anesthésie générale concerne 194 animaux ; juste une fois, environ 2h pour chaque création. concerne 54 cochons qui auront un infarctus créé par ischémie reperfusion et 48 cochons par occlusion progressive. Prélèvement simple du cœur : sous anesthésie générale, concerne 194 animaux ; 1 fois pour chaque animal car le prélèvement entrainera la mise à mort de l’animal, durée environ 30 min par prélèvement.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables éventuels peuvent être liés aux anesthésies (hypothermie) réalisées aux différentes phases du projet notamment lors du réveil de l'animal (désorientation, apathie). La création de l’infarctus pourra également entraîner des effets indésirables au niveau cardiovasculaire tels que l’insuffisance cardiaque ou la fibrillation ventriculaire. De plus, des saignements pourraient apparaitre aux sites d’introduction des cathéters au niveau de la patte avant (pour la perfusion de médicaments et d’agents de contraste) et au niveau de la veine fémorale (guide pour la cartographie de contact).
Devenir
Afin de prélever le cœur et d’effectuer des études fonctionnelles (cartographie optique) et structurales ex vivo (histologie, micro-scanner, etc.), qui nous permettront de mieux comprendre les caractéristiques électrophysiologies de l’infarctus, l'ensemble des animaux seront euthanasiés.
Remplacement
Le REMPLACEMENT des animaux n’est actuellement pas possible. En effet, l'étude des mécanismes physiologiques complexes dans leur globalité nécessite d’avoir recours à un modèle animal et il n'existe pas à ce jour de modèle de modélisation pour répondre aux objectifs.
Réduction
Une attention sera portée à la REDUCTION du nombre de ces animaux utilisés dans les projets de réaffectation (mutualisation avec d’autres projets). Dans cet objectif de réduction, nous ferons également en sorte que chaque animal soit son propre contrôle dès que cela sera possible.
Raffinement
Le RAFFINEMENT du projet et le respect du bien-être animal reposent sur plusieurs mesures : - les animaux sont hébergés dans des locaux agréés et bénéficient de surveillance et soins quotidiens dispensés par du personnel compétent et soucieux du bien-être animal - les animaux sont habitués au personnel animalier afin de limiter tout stress - les animaux sont hébergés en groupes sociaux ce qui leur permet d’exprimer des comportements naturels. Ils disposent d’enrichissements adaptés (Kong, balles, jouets en caoutchouc durs mastiquables...) - toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale (mise en œuvre et surveillée par du personnel dédié) et une analgésie adaptée est systématiquement mise en place - des critères d’alerte précis sont surveillés; si l’animal présente un signe d’appel, des mesures adaptées sont mises en place immédiatement (ajout d’analgésique par exemple). À chaque cas clinique inquiétant, un examen vétérinaire approfondi est mis en place à la suite duquel peut être envisagé un traitement médical, des examens complémentaires ou le cas échéant, la demande de l’euthanasie de l’animal.
Choix des espèces
Parmi les modèles animaux ayant des caractéristiques anatomiques et fonctionnelles proche de l’homme (mouton, porc, chèvre, chien), le porc a été retenu car (i) les équipes qui possèdent une très grande expérience sur la création du modèle d’infarctus avec cette espèce (ii) ce modèle animal est bien décrit et caractérisé et constitue donc une référence dans la communauté scientifique ; (iii) le personnel impliqué dans ce projet possède une expertise établie de la gestion de ce modèle animal. Les porcs seront utilisés à partir de 25kg car à ce stade ils possèdent des caractéristiques fonctionnelles et structurelles très proches de celle de l’Homme.
Interaction des virus influenza aviaires avec la réponse immunitaire des canards
- Recherche appliquée
- Maladies animales
Pour mesurer le rôle de l'immunité innée dans l'infection par les virus influenza aviaires, 144 canards sont infectés par voie intra-choanale, 96 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 48 un niveau modéré. Tous sont tués pour prélever les tissus lors d'autopsies programmées. Certains groupes reçoivent en plus une injection quotidienne dans l'abdomen, de la veille de l'infection au quatorzième jour, et tous subissent chaque jour pendant quinze jours un écouvillonnage du cloaque et de l'oropharynx. Le porteur écrit n'attendre aucun effet secondaire des traitements administrés, et ne décrit à aucun moment les signes cliniques de l'infection qui valent à 96 canards un classement en souffrance sévère.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de traiter des poulets et des canards avec des inhibtieurs de la réponse immuniraire innée afin de déterminer quelle est l'importance de la réponse immunitaire innée dans le contrôle de la réplication virale, le tropisme viral et la pathogenèse virale.
Bénéfices attendus
L’ensemble de ces procédures expérimentales permettra donc de déterminer quelle est l’importance de la réponse immunitaire innée dans le contrôle de l’infection des canards par des virus influenza présentant des degrés de pathogénicité variables. Ces résultats devraient permettre d’approfondir nos connaissances sur les facteurs d’hôte impliqués dans l’interaction hôte-virus afin dans un deuxième temps d’étudier comment ces facteurs d’hôte pourraient influencer la transmission des virus influenza entre individus à l’échelle d’un élevage et à l’échelle d’un territoire.
Procédures
Certains groupes de canards recevront des injections intrapéritonéales quotidiennes de molécules visant à inhiber la réponse immunitaire innée. Ces injections seront réalisées de jour -1 à jour 14. Certains groupes de canards seront inoculés par voie intra-choanale afin de les infecter avec des virus influenza à j0. Les canards subiront des écouvillons cloacaux et oro-pharyngés quotidiennement de jour 0 (écouvillons contrôles réalisés avant l’inoculation virale, le jour de l’inoculation) à jour 14.
Impact sur les animaux
Hormis les signes cliniques liés à l’infection par les virus influenza, nous n’attendons pas d’effets secondaires dus aux traitements médicamenteux administrés aux animaux, ceux-ci étant utilisés à des posologies et selon des voies d’administration utilisées dans d’autres espèces animales (souris en particulier). L’inclusion de groupes traités et non-infectés permettra d’identifier la survenue éventuelle d’effets indésirables dus aux traitements. Si des effets indésirables dus au traitement sont visibles, nous appliquerons les procédures liées aux points limites définis dans le protocole de cette étude.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés parce qu'ils sont infectés par des virus influenza aviaires et parce que nous souhaitons récolter des tissus lors des autospies programmées afin d'atteindre les objectifs du projet.
Remplacement
Il n’existe aucune méthode alternative permettant d’étudier les interactions entre variants dans différents tissus et l’impact de la réponse immunitaire innée. Les méthodes in vitro et ex vivo ne permettent pas de traduire la complexité d'un système immunitaire en interaction avec des sites anatomiques variés.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe est déterminé de façon à pouvoir évaluer, par des tests statistiques, les différences entre les groupes d’animaux, après quantification des charges virales et des niveaux de transcrits des gènes de l'hôte. Pour comparer des charges virales et les niveaux de transcrits des gènes de l'hôte, des groupes de 6 sont suffisants pour mettre en évidence des différences significatives, grâce aux tests statistiques adéquats.
Raffinement
Les procédures seront menées dans le respect des normes d’hébergement (taille des cages, densité etc.) spécifiées dans la directive 2010/ 63/ UE. Afin de réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux, les mesures suivantes sont appliquées : - Respect des normes d’hébergement (taille des cages, densité etc.) spécifiées dans la directive 2010/63/UE - Application de conditions d’ambiance en accord avec l’âge et l’espèce (température, éclairage, hygrométrie) ; - Enrichissement du milieu (cordelettes avec jouet (bouchon suspendu), possibilité pour les canards d’exprimer un comportement de toilettage à l’aide des dispositifs d’abreuvement. - Fourniture d’eau et d’aliment (adapté aux besoins d’entretien ou de croissance des oiseaux) sans restriction ; - Mise en place d’un suivi clinique rapproché par le vétérinaire responsable de l’essai et de points limites prédéfinis - Manipulation et contention des oiseaux par du personnel qualifié, notamment lors des interventions (injections ou prises de sang).
Choix des espèces
Afin d'étudier comment l’immunité innée influence le pouvoir pathogène des virus influenza aviaires dans l’espèce cible, ici l'espèce canard commun Anas platyrhynchos, qui a un rôle essentiel dans l'épidémiologie des infections aux virus influenza aviaires, il est nécessaire de l’étudier dans cette espèce. Cet objectif ne peut être atteint par des méthodes alternatives.
Efficacité de l’injection dans le liquide céphalo rachidien de cellules souches mésenchymateuses dans un modèle murin de sclérose en plaques
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Deux injections d'un peptide déclenchent une paralysie progressive chez 384 souris, qui reçoivent ensuite une injection de cellules souches dans le liquide céphalorachidien, jusqu'à quatre prélèvements de sang à la veine sous-mandibulaire et deux ponctions de liquide céphalorachidien. Toutes relèvent de procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et toutes sont tuées pour l'analyse des organes et du sang. Il s'agit d'évaluer la diffusion et l'efficacité d'une thérapie cellulaire dans un modèle murin de sclérose en plaques, maladie pour laquelle le porteur indique qu'aucun traitement ne ralentit la progression du handicap. Les symptômes sont notés sur une échelle de zéro à cinq, l'atteinte d'un point limite déclenchant la mise à mort de l'animal.
Objectifs
La sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune du système nerveux central (SNC) qui touche l’adulte jeune. Aucun traitement n’est actuellement disponible pour ralentir ou stopper la progression du handicap et le pronostic de la progression est très péjoratif sur le plan fonctionnel. Les Cellules Souches Mésenchymateuses (CSM) ont des capacités bien connues pour limiter l'action du système immunitaire et pour réparer des tissus endommagés. Dans ce projet nous souhaitons évaluer la diffusion de ces cellules dans le système nerveux lorsqu'elles sont injectées dans le liquide céphalo rachidien mais également leur efficacité dans un modèle murin de SEP.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer l’efficacité d'une thérapie cellulaire dans un modèle de neuroinflammation chez la souris mimant la sclérose en plaques.
Procédures
Les animaux développeront une Encéphalomyélite Autoimmune Expérimentale (EAE), c’est à dire une paralysie avec une phase d’aggravation avant une phase de rémission. Pour cela ils seront soumis à une injection du peptide capable de déclencher la maladie . La procédure dure 5 minutes par souris (temps d'anesthésie et d'injection). Deux injections sont réalisées à l'induction et 24/48h après . Une injection unique de cellules souches ou d’une solution contrôle sera réalisée dans le liquide céphalo rachidien (LCR) chez toutes les souris . La procédure sera couplée à un prélèvement de LCR et durera 15 minutes par souris (temps d’anesthésie, de prélèvement et d’injection). Des injections d'une molécule fluorescente seront également réalisées pour détecter la diffusion des cellules souches au bioimageur chez des souris anesthésiées. Des prélèvements sanguins sur ces animaux seront réalisés pour le suivi immunologique, maximum 4 prélèvements au niveau de la veine sous-mandibulaire par animal, distants au minimum de 7 jours. La procédure de prélèvement dure maximum 6 minutes par animal (1min de prélèvement, 5 min de compression du saignement). Deux prélèvements de LCR seront réalisés sur ces animaux anesthésiés, distants au minimum de 15 jours (15min) dont le premier qui sera couplé à l’injection de cellules ou de solution contrôle. Pour les deux prélèvements de LCR isolés, la procédure dure 10 minutes par souris (temps d’anesthésie et de prélèvement).
Impact sur les animaux
La procédure de déclenchement de l’EAE entraînera une paralysie progressive des animaux. Les animaux seront également soumis au stress lié aux multiples expérimentations. Les symptômes seront évalués et des actions adaptées seront mises en oeuvre pour soulager l'inconfort selon le score établi. Tout au long de l’étude, un suivi rigoureux du bien-être animal sera également effectué . Si l'un des points limites décrits dans ce projet est atteint, l’animal sera mis à mort selon une méthode réglementaire.
Devenir
La totalité des animaux expérimentés sera mise à mort afin de réaliser les études scientifiques sur les organes et sur le sang. La mise à mort sera réalisée par une personne autorisée et expérimentée .
Remplacement
Des études in vitro ont permis de caractériser l’effet immunosuppressif des CSM dérivés du tissu adipeux humain. Cependant leurs capacités immunosuppressives et leurs capacités de réparation par sécrétion de facteurs trophiques en contexte de neuroinflammation in vivo restent mal connues et nécessitent le recours à un modèle murin d’EAE.
Réduction
Un maximum d'informations et d'analyses seront réalisés sur les animaux (prélèvement de la rate, ganglions, sang, LCR, SNC) afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires. Nous travaillerons avec des groupes de 8 animaux par groupe pour obtenir des tests statistiques fiables. Le modèle EAE est déjà maitrisé au laboratoire, ce qui permettra donc d’utiliser moins d’animaux pour l’optimisation du protocole.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par groupe de 3 à 5 animaux, dans un environnement enrichi, avec du coton cardé, l'accès à la nourriture sera facilité dès les premiers symptômes de paralysie : nourriture au sol dans la cage, gel pour l'hydratation. Le modèle EAE étant dépendant du stress, les souris ne seront manipulées que par un nombre réduit de personnes, les cages changées au moment du suivi des animaux. Une anesthésie légère est utilisée pour l'injection du peptide immunisant pour éviter stress et inconfort au moment de l'injection qui est réalisée à 2 endroits pour éviter une réaction locale importante en cas d'injection unique. La procédure de déclenchement de l’EAE entraînera une paralysie progressive des animaux. Les symptômes seront évalués sur une échelle de 0 à 5 et des actions adaptées seront mises en oeuvre pour soulager l'inconfort selon le score établi. Tout au long de l’étude, un suivi rigoureux du bien-être animal sera également effectué . Si l'un des points limites décrits dans ce projet est atteint , l’animal sera mis à mort selon une méthode réglementaire.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix pour étudier les maladies auto-immunes et inflammatoires. L’efficacité de l’induction de l’EAE dans les souris a déjà été démontrée dans la littérature, et le modèle est maitrisé dans l’unité. L’acquisition des cellules effectrices du système immunitaire étant optimale à l’âge adulte, l’ensemble des expérimentations seront menées sur des animaux adultes (6-12 semaines). Une meilleure pénétrance est observée sur des souris à 8 semaines, cet âge sera privilégié afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires.
Etude des mécanismes de la réponse immunitaire de la truite arc-en-ciel aux virus, et des bases génétiques de sa sensibilité aux maladies virales
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Infectées par balnéation pendant deux heures, parfois huit à douze, ou par injection directe du virus, 3 700 truites arc-en-ciel subissent aussi jusqu'à six prélèvements de sang et trois immunisations. Toutes sont tuées à l'issue, 2 160 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 1 240 modéré et 300 léger. L'objectif tient en deux volets, produire des preuves de concept de vaccins ADN et ARN pour l'aquaculture et repérer les bases génétiques de la résistance aux virus, au bénéfice affiché d'entreprises françaises de sélection. Aucun point limite n'est décrit, alors que le porteur indique que les infections expérimentales peuvent conduire à la mort des poissons et présente le projet comme une amélioration du bien-être des poissons en élevage.
Objectifs
L'aquaculture représente une alternative aux prélèvements de poissons sauvages dans la nature pour l’alimentation humaine. Les maladies représentent un risque et une limitation majeure pour le développement d’une aquaculture durable. Pour améliorer les conditions d'élevage des animaux, diminuer ou annuler l'impact des maladies, le développement de nouveaux vaccins et la sélection d'animaux naturellement résistants constituent les deux approches majeures. Ce projet de recherche vise à mieux comprendre les mécanismes de défense des poissons pour développer de nouveaux vaccins contre des virus pour lesquels il n'en existe pas actuellement ou pour lesquels les vaccins existants ne sont pas efficaces. Les poissons sujets à infection expérimentale et /ou vaccination sont analysés par différentes approches immunologiques et moléculaires. Il vise aussi à identifier les bases génétiques de la résistance de la truite aux virus afin de pouvoir sélectionner de manière ciblée des animaux plus robustes et moins sensibles aux maladies. La sensibilité de différentes lignées de poissons à l'infection est déterminée et analysée. Les objectifs de ce projet sont donc (1) de produire des preuves de concepts de nouveaux vaccins, en particulier ADN et ARN, permettant de répondre au développement d’épidémies dans les élevages, et (2) de consolider les connaissances acquises sur la résistance génétique aux maladies virales. Les zones du génome impliquées dans la variabilité du caractère (QTL pour « quantitative trait loci ») ont été identifiées mais les mécanismes impliqués restent à valider pour permettre le développement de stratégies de sélection génomique optimisée. Trois types de vaccins (ADN, ARN, et vivant atténué) contre 3 virus d’importance majeure pour l’aquaculture (virus de la Septicémie Hémorragique Virale (VHSV), virus de la nécrose hématopoïétique infectieuse (IHNV) et alphavirus (SAV)) pourront être testés contre ces 3 virus et d’autres pour tester la spécificité de la protection (virus de la nécrose pancréatique infectieuse (IPNV), virus de l’anémie infectieuse du saumon (ISAV)), en association éventuelle avec 2 adjuvants alternatifs, ou sans adjuvant (selon les résultats initiaux obtenus avec chaque vaccin). Ce projet vise donc de manière claire à l’amélioration des conditions d’élevage en prévenant et en limitant l’impact des pathologies des poissons ; il nécessite de soumettre un nombre significatif d’animaux à des infections expérimentales.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus en fin de projet sont les suivants : - Compréhension des mécanismes de réponse à l’immunisation - Validation expérimentale de nouveaux vaccins contre différents virus de la truite arc en ciel - Identification et validation expérimentale de marqueurs génétiques et de mécanismes de résistance de la truite aux les virus, en particulier au virus de la Septicémie Hémorragique Virale (VHSV). Ces résultats seront utilisés pour prévenir les maladies ou réduire leur impact, et donc améliorer le bien-être des poissons en élevage. La prévention des pathologies est un élément essentiel du développement d’une aquaculture plus « durable ».
Procédures
Les immunisations ou infections expérimentales réalisées par injection sont réalisées sous anesthésie en moins de 15 secondes. Des prélèvements sanguins multiples sur un même individu peuvent être effectués chez les adultes ; ils sont espacés d’au moins 3 jours et leur nombre n’excède pas 6 au total (typiquement sur 6 mois d’expérience) ; ils sont effectués sous anesthésie, et la durée de l’intervention est typiquement de 30 secondes, l’anesthésie ne dure pas plus de 5 minutes. Les prélèvements de mucus cutané sont effectués sous anesthésie, et durent quelques secondes. Les infections par balnéation ne sont pas invasives et ne sont pas effectuées sous anesthésie, elles durent typiquement 2 heures, exceptionnellement 8 à 12heures. Liste des interventions : 3 immunisations, 6 prélèvements de sang, 2 prélèvements de mucus cutané au maximum. 1000 poissons 2 immunisations par injection, une épreuve virulente par balnéation, 6 prélèvements de sang au maximum : 450 poissons 2 immunisations par injection, une épreuve virulente par injection, 6 prélèvements de sang au maximum : 750 poissons 6 prélèvements de sang (maximum), 1 infection par balnéation : 750 poissons 6 prélèvements de sang (maximum), 1 infection par injection : 750 poissons
Impact sur les animaux
Le stress lié à la manipulation (tri, pesée, transfert, injection, imagerie) est compensé par anesthésie par bain. Les animaux sont mis à jeun 24 heures avant l’infection. Les infections expérimentales peuvent conduire à la mort des poissons.
Devenir
Tous les animaux de ce projet entreront dans un protocole d'infectiologie et ne pourront être réutilisés pour d'autres finalités, ils seront donc mis à mort en fin d'expérience.
Remplacement
Il n’existe pas de modèles cellulaires permettant d’étudier les réponses immunitaires systémiques des poissons, en particulier la protection induite par les vaccins. La compréhension des interactions entre le virus et son hôte nécessite de soumettre l’animal à une immunisation ou à une infection expérimentale. Le projet associé à cette DAP chez la truite arc-en-ciel ne peut donc être réalisé avec des méthodes alternatives. Seul un animal ayant un système immunitaire adaptatif permet d’évaluer l’efficacité d’un vaccin lors d’une épreuve d’infection expérimentale en quantifiant la protection apportée.
Réduction
Les infections par balnéation ou par injection permettent de comparer plusieurs conditions expérimentales (différentes souches de truite, différents protocoles d’immunisation etc). Les effectifs requis pour la mise en évidence de différences significatives de survie sont établis sur la base de l’expérience acquise, et pour satisfaire aux contraintes des tests statistiques pertinents. Les groupes sont de 30 individus. Pour réduire les effectifs requis et raffiner les protocoles, les poissons pourront être marqués individuellement et gardés dans un même bac de volume adapté, lorsque cela est possible (pas d’infection ou infection par un même virus). Ces marquages individuels permettent d’effectuer un suivi individuel de la réponse immunitaire, qui conduit à une diminution l'effectif des lots. Les poissons sont identifiés individuellement et leur réaction suivie par analyse d'échantillons de sang collectés de manière répétée, à des intervalles validés lors des projets précédents.
Raffinement
Les animaux sont observés au moins deux fois par jour. Une anesthésie par bain est réalisée avant de procéder aux injections ou avant prélèvement de sang/mucus.
Choix des espèces
La truite arc-en-ciel est le modèle classique de la pisciculture continentale européenne : c’est la principale espèce d’élevage en France. C’est aussi l’espèce de salmonidé dont le système immunitaire et les mécanismes anti-infectieux sont les mieux connus. C’est une espèce hôte naturel pour les virus que nous étudions. Enfin, il s’agit d’une espèce cible pour la sélection par les entreprises françaises impliquées. L’étude des réponses aux vaccins et plus généralement des réponses anticorps et cellulaires spécifiques, nécessitent que les poissons aient un système immunitaire mature ; de jeunes adultes sont donc utilisés pour ces expériences.
Explorer ou exploiter? Etude comportementale et contribution de l’axe cortico-striatale
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Rats : 568
La restriction hydrique s'arrête quand le poids descend sous 85 % de celui mesuré avant privation, seuil vérifié deux fois par jour. 812 souris et 568 rats sont privés d'eau pour être poussés à chercher des gouttes, 428 d'entre eux dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, les autres un niveau modéré. Une partie subit des lésions excitotoxiques du striatum par une chirurgie de une à deux heures, qui provoquent une hypophagie de 24 à 48 heures, ou des injections de virus dans le cerveau suivies de une à quatre injections de CNO, et les rats courent sur tapis roulant pour accéder aux récompenses. Tous sont tués pour examen histologique du cerveau, le porteur affirmant qu'il n'existe pas d'alternative non animale tout en construisant des modèles mathématiques qui simulent leur comportement.
Objectifs
Dans leur vie quotidienne, les humains et de nombreux autres animaux sont continuellement confrontés au dilemme d’effectuer/optimaliser des actions qui conduisent à l’obtention de récompenses (exploiter) ou de naviguer plus aléatoirement dans leur environnement pour acquérir de nouvelles connaissances sur des sources de récompenses alternatives, au risque de perdre du temps et de l'énergie (explorer). La compréhension des mécanismes qui contrôlent ce compromis entre exploitation et exploration est lacunaire, à la fois au niveau comportemental (quels sont les paramètres qui contraignent le comportement exploratoire versus exploitatif des animaux et quels aspects de leur comportement sont modulés) et des circuits neuronaux impliqués. Le but de ce projet est donc double. Tout d’abord, il sera de mieux caractériser le comportement d’exploration et d’exploitation de souris et de rats dans des situations expérimentales relativement éthologiques (compte tenu des contraintes associées aux expériences en laboratoire). Dans ce projet nous proposons de développer deux nouvelles tâches dites de "foraging" dans lesquelles des rongeurs doivent adapter leur balance d'exploration/exploitation (rester ou partir) en réponse à des manipulations de la dynamique des récompenses (timing et quantité) et de l'effort nécessaire pour exploiter et explorer. Ensuite, nous proposons de tester l'hypothèse selon laquelle différentes régions et circuits cellulaires le long de l'axe corticostriatal jouent un rôle clé dans la modulation du compromis entre exploration et exploitation, en contrôlant la sensibilité des animaux au temps et à l'effort. Plus précisément, nous examinerons comment l'activité des neurones de projection du striatum dorsomédian contrôle le comportement exploratoire et est finement régulée par la plasticité des entrées corticales et des circuits inhibiteurs locaux. De même, nous examinerons le rôle des neurones de projection du striatum dorsolatéral dans les phases d’exploitation et leur modulation par la plasticité des entrées corticales et des circuits inhibiteurs locaux.
Bénéfices attendus
Les mécanismes qui contrôlent les comportements d'exploitation et d'exploration sont généralement mal compris, et pourtant, ils régissent non seulement la manière dont les êtres humains prennent des décisions et dépensent de l’énergie (la leur lorsqu'ils font des efforts physiques et celle produite par la biosphère), mais aussi le fonctionnement de nos sociétés de consommation, qui est actuellement remis en question en raison de la surexploitation de certaines ressources. Notre projet sur la souris et le rat n'a pas la prétention d’être directement transférable au comportement humain, mais il semble que certains principes qui gouvernent le compromis entre exploration et exploitation soient communs chez les mammifères, en particulier les notions d'effort et de coût du temps, qui poussent parfois les animaux à gaspiller leur énergie sans bénéfice apparent immédiat et qui favorisent les récompenses immédiates. Ce projet utilise des rongeurs pour pouvoir effectuer des manipulations fines de contraintes comportementales (effort demandé, complexité des décisions, contraintes temporelles) dans des conditions relativement éthologiques. Ces manipulations sont cruciales pour comprendre comment ces contraintes influencent le compromis exploitation/exploration. Ensuite, l'utilisation du rongeur va également nous permettre de pouvoir faire le lien avec des circuits neuronaux qui peuvent être impliqués dans certains comportements pathologiques. En effet, notre équipe s’intéresse au rôle des circuits cortico-striataux dans les prises de décisions et le contrôle moteur, et le dysfonctionnement de ces circuits a été associé non seulement à des pathologies telles que la maladie de Parkinson (qui est caractérisée par un mélange de déficits moteurs et motivationnels) mais aussi à un grand nombre de comportements compulsifs (boulimie, etc.). Notre projet a donc pour objectif de mieux comprendre le fonctionnement d'une région du cerveau impliquée dans un grand nombre de maladies. Enfin, nous développons une approche éthologique du comportement animal qui se fonde sur le comportement de recherche de nourriture (foraging) qui est commun aux rongeurs et aux humains. Le développement de nouveaux tests comportementaux peut déboucher sur une amélioration générale de l'étude et la compréhension du comportement des rongeurs en laboratoire et une meilleure translation des résultats obtenus vers l'être humain.
Procédures
Les animaux vont subir des tests de comportements (foraging). En général les animaux feront 2 à 3 sessions par jour. Pour les souris les sessions durent 10 à 15 minutes. Pour les rats 1h. Les tests de comportements s'étaleront sur plusieurs semaines sans jamais excéder 2 mois chez la souris et 4 mois chez le rat avec des pauses le week-end. Certains animaux vont aussi subir une chirurgie pour réaliser des lésions excitotoxiques. Ces chirurgies dureront entre 1 et 2 heures. Certains animaux vont aussi subir une chirurgie pour injections des virus permettant des expériences de chémo-génétiques (DREADDS). Ces chirurgies dureront environ 1 heure. Pendant les expériences de comportement, ces animaux recevrons des injections IP de CNO pour activer les DREADDS et moduler l'activité des neurones ciblés. Entre 1 et 4 injections (espacées d'au moins 3 jours) seront effectuées en fonction des protocoles et des questions posées .
Impact sur les animaux
La manipulation d'une souris ou d'un rat par un expérimentateur est une source de stress de courte durée. De même, l'exposition à un nouvel environnement est généralement une source de stress passagère. L'utilisation d'un tapis roulant peut également être une source de stress. Les tests de comportement de foraging (recherche de nourriture) que nous développerons sont basés sur la recherche de gouttes d'eau. Pour reproduire les conditions naturelles de foraging, ces tests nécessitent une restriction hydrique, ce qui entraîne inévitablement un stress. Indépendamment de la durée des expériences de comportement, la restriction hydrique sera limitée à 5 jours consécutifs, avec des pauses de 2 jours les week-ends, où les animaux auront accès ad libitum à l'eau et à la nourriture. La durée des expériences de comportement variera en fonction des protocoles, entre 2 semaines et 2 mois. Les chirurgies permettant l'injection de virus (manipulations chémogénétiques) seront réalisées sous anesthésie générale profonde (voir détails plus bas) et nécessiteront des traitements pour limiter au maximum les douleurs post-opératoires. Les lésions neurotoxiques du striatum réalisées sous anesthésies générales sont connues pour induire une hypophagie pendant 24 à 48 heures après la chirurgie. Les expériences de manipulations chémogénétiques nécessiteront des injections intra-péritonéales de CNO.
Devenir
A l’issue de toutes les procédures, les animaux seront mis à mort afin de faire des examens histologiques de leur cerveau. Ces examens sont nécessaires pour quantifier l'expression des virus injectés (procédure #4) et la taille des lesions excitotoxiques (procédure #3 ) lorsque les animaux ont terminé les tests de comportements (procédures #1-2), ainsi que pour vérifier l'absence de malformation anatomique (les 4 procédures). Pour les souris destinées aux expériences d' électrophysiologie in vitro, la mise à mort est nécéssaire pour prélever le cerveau et réaliser les tranches.
Remplacement
Il n'y a pas d'alternative non-animale pour comprendre les mécanismes contrôlant le compromis exploration/exploitation. Nous allons cependant utiliser des modèles mathématiques pour analyser et simuler le comportement des animaux. Nous pourrons donc tester la validité de ces modèles et les modifier/améliorer. L'avantage des modèles est qu’ils permettent de réaliser des expériences in silico et de limiter le nombre d'animaux (voir ci-dessous). Ils permettent une quantification des données plus rigoureuse.
Réduction
Sans résultats préliminaires, il est impossible de prédire la taille des effets et donc le nombre d'animaux. Cependant en utilisant des analyses statistiques non paramétriques et des tests générant des intervalles de confiance (permutation et/ou bootstrap) et en se basant sur nos expériences antérieures, des groupes entre 8 et 20 animaux (moitié mâle, moitié femelle) devraient être largement suffisants. Clairement, nous ne nous attendons pas à ce que tous les animaux se comportent de la même manière. L'utilisation de modèles mathématiques pour capturer le comportement permet de bien caractériser cette variabilité interindividuelle et de faire des analyses de corrélations entre variables neuronales et comportementales. Là encore, un nombre d'animaux compris entre 8 et 20 doit permettre de voir apparaître des tendances de corrélations et le nombre d'animaux sera ajusté (si besoin un avenant sera fait).
Raffinement
Stress lié à la manipulation des animaux pendant les tests de comportement. Les animaux seront habitués progressivement à l’expérimentateur. Des sessions de familiarisation à l’environnement sont prévues. Pour les expériences chez le rat, la seule difficulté sera d'entraîner les animaux à traverser ce couloir lorsque le tapis roulant est en marche. Les animaux seront entraînés progressivement en commençant par des vitesses lentes. Le Stress lié à la restriction hydrique sera limité de deux manières. Les animaux recevront une quantité suffisante d'eau tous les jours. La durée et la difficulté des sessions comportementales seront adaptées à leurs besoins hydriques. Le poids des animaux sera vérifié quotidiennement, le matin et le soir, pour garantir qu'il reste stable et ne descende pas en dessous de 85 % du poids de l'animal avant la restriction hydrique. En cas de dépassement de cette limite, les animaux auront accès à de l'eau par leur biberon en quantité ad libitum, et ils ne reprendront les tests que si leur poids est supérieur à 85 % du poids avant la restriction. Pour les animaux subissant des injections intra-cérébrales de virus ou des injections d'agents excitotoxiques , les douleurs seront limitées par une chirurgie sous anesthésie générale, complétée par des antalgiques locaux et des analgésiques pré/post-chirurgie. Les rongeurs seront surveillés très attentivement en postopératoire pendant quelques heures (isolement avec lampe et couverture chauffante). Des injections de buprénorphine seront réalisées, en tenant que leur effet n'excède pas 12h. La cicatrisation et l’état général de ces animaux seront suivis attentivement tous les jours. Les points limites seront respectés si une souffrance est détectée (voir description des procédures). Suite aux lésions excitotoxiques du striatum, les animaux présentent typiquement un hypophagie pendant 48h. De la nourriture plus appétente est proposée dans la cage (croquettes mouillées, gelée énergétique). Pour limiter le stress associé aux injections IPs: 1) Avant les injections, les animaux seront habitués aux procédures 2) Si approprié (surtout pour les rats), les animaux seront brièvement anesthésiés (Isoflurane) et l’injection sera réalisée sur l’animal endormi. 3) Nous réduisons au minimum le nombre des injections intrapéritonéales.
Choix des espèces
La souris sera utilisée car il existe des lignées transgéniques qui permettent de cibler des circuits neuronaux spécifiques pour les manipulations chémo-génétiques. Les souris sont des "natural foragers". De plus, une partie du projet nécessite d'étudier la plasticité cortico-striatale après l'expérience d'une tâche de foraging avec différentes balances d’exploration/exploitation, avec des préparations ex-vivo établies chez la souris. Le projet s'intéresse à manipuler l'effort que doivent fournir les animaux pour obtenir des récompenses à l'aide d'un tapis roulant et d’examiner l’effet de ces manipulations sur les décisions et le contrôle de locomotion. Ces manipulations sont facilement réalisables sur le rat. Dans le futur, nous pourrions être amenés à faire des enregistrements d’activité électrophysiologique sur l’animal en comportement ce qui plus facile à faire chez le rat (stabilité des implants). Il est donc important que le travail comportemental soit fait sur cette espèce. Pour les expériences purement comportementales (avec on sans perturbations neuronales), les souris seront de jeunes adultes entre 8 et 14 semaines (handling à 8 semaines, durée maximale des tests de comportements : 6 semaines). Les rats auront entre 8 et 10 semaines au début des expériences (handling). La durée des tests comportementaux variera entre 1 et 2 mois (en fonction des paramètres manipulés). Certains rats les tests comportementaux avant et après lésions donc ils auront 6 mois à la fin de l'expérience. Les souris qui passeront les tests de comportement et qui seront utilisées pour les expériences d’électrophysiologie ex-vivo auront entre 5 et 7 semaines au moment des enregistrements électrophysiologiques et seront donc entraînées dans le test de foraging de P30-P45. L’utilisation de souris plus jeunes est nécessaire afin de maximiser le succès des expériences d'électrophysiologie ex-vivo (quantité et qualité des enregistrements en patch-clamp ex-vivo).
Evaluation pré-clinique de nouvelles cibles et molécules anticancéreuses seules ou associées dans les modèles murins de mélanome uvéal (MU)
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Injectées de cellules de mélanome uvéal humain dans le derme du flanc, 500 souris voient leur tumeur primaire retirée pour laisser les métastases se former, et 180 autres reçoivent ces cellules directement dans la rate au cours d'une intervention de trente minutes sous anesthésie. Elles reçoivent ensuite des molécules par voie orale ou injectée, d'une fois par semaine à deux fois par jour, subissent une imagerie sous anesthésie toutes les deux semaines puis chaque semaine, et des prélèvements sanguins au sinus rétro-orbital. 743 souris sont utilisées au total, dans des procédures toutes déclarées d'un niveau de souffrance sévère. Celles qui perdent plus de 18 % de leur poids entre deux évaluations sont tuées dans les 72 heures si leur état ne s'améliore pas, les autres à la fin de la procédure pour des analyses post-mortem.
Objectifs
Le cancer reste parmi les premières causes de décès dans le monde. Le mélanome de l’uvée est un cancer rare de l’adulte avec une incidence de 500 à 600 nouveaux cas par an en France. Même s’il existe des traitements efficaces pour éliminer la tumeur primaire (chirurgie ou radiothérapie), aucun traitement n’existe actuellement contre la phase métastatique de la maladie. L'évaluation des nouvelles thérapies disponibles aujourd'hui nécessite le développement des modèles pertinents. Un modèle métastatique a été développé dans le laboratoire suite à l’injection de cellules tumorales humaines sur souris ce qui permet la réalisation d’études pharmacologiques dont le potentiel prédictif clinique est très élevé. Ce modèle nous a permis d’observer le développement de métastases principalement au niveau hépatique mais également au niveau péritonéal dans certains cas. Ainsi elles constituent un outil primordial pour tester l’efficacité de nouveaux médicaments ou encore de nouvelles combinaisons ou schémas d'administration de médicaments. Ces essais précliniques ont différents objectifs : déterminer le type tumoral qui présentera le plus de bénéfice au traitement, déterminer les combinaisons et les fréquences d’administration qui seront les plus efficaces mais également effectuer des études moléculaires de la tumeur qui permettront d’expliciter le mécanisme d’action des molécules testées ou encore les mécanismes de résistance de ces tumeurs par rapport à ces thérapeutiques. Ces essais précliniques sont des phases préliminaires aux phases cliniques. Ils permettent d’orienter les développements futurs des nouvelles molécules et d’optimiser des traitements qui seront ensuite utilisés chez l’homme. Les modèles murins de mélanome uvéal de notre laboratoire représentent des tumeurs générées par injection de lignées cellulaires humaines tumorales. Ces tumeurs représentent la diversité de la maladie chez l’homme et sont utilisées dans le cadre de collaboration avec des partenaires pour évaluer des nouvelles drogues. L’évaluation de l’effet de ces molécules comprend l’étude de la tolérance qui permet de déterminer la dose des molécules ou des associations de molécules sur de petits groupes d’animaux jusqu’à l’étude de l’efficacité anticancéreuse de ces mêmes molécules.
Bénéfices attendus
Le mélanome uvéal (MU) est un cancer rare de l’adulte avec une incidence de 500 à 600 nouveaux cas par an en France. Dans la grande majorité des cas, le mélanome uvéal apparait suite à une surprolifération des mélanocytes au niveau de la choroïde, qui est une des couches de la paroi du globe oculaire. Mais il peut également survenir dans deux autres couches de l’œil, l’iris ou le corps ciliaire. Il représente 5% de tous les mélanomes et se distingue du mélanome cutané au niveau biologique et génétique. Il existe des thérapies efficaces comme la chirurgie et la radiothérapie pour éliminer la tumeur primaire. Cependant plus de 30% des patients développent des métastases principalement au niveau hépatique et péritonéal. Malheureusement il n’existe actuellement aucun traitement de référence contre la phase métastatique de la maladie. A la fin de l’expérience la tumeur primaire et les métastases seront prélevées pour étude post-mortem. Une partie sera congelée à sec pour analyse génomique et une autre sera fixée pour analyses histologiques. Le but de ces expériences in vivo est donc dans un premier temps de comprendre les mécanismes impliqués dans le développement du MU (croissance de la tumeur primaire ainsi que des métastases). Cette étude a également pour but de trouver un traitement afin de lutter contre la croissance de la tumeur au niveau de sa localisation initiale mais surtout d’évaluer l’efficacité de différentes « molécules actives » ou nouvelles cibles thérapeutiques sur le développement métastatique de la maladie. Ces avancées sont indispensables et majeures afin d’augmenter le pourcentage de survie des patients.
Procédures
>Injection intradermique sur animal vigile de cellules dans le derme de la souris au niveau du flanc droit / 1 fois en début d’expérience- 10 secondes / 500 souris >Injection intrasplénique sur animal anesthésié de cellules / 1 fois en début d’expérience / 180 souris. Durée de l’anesthésie : 30 minutes >Imagerie sur souris anesthésiées en gazeuse après injection de sonde colorimétrique en intrapéritonéal / 1 fois toutes les 2 semaines puis une fois par semaine tout au long de la procédure / 680 souris. Durée de l’anesthésie : 30 minutes maximum >Prélèvements sanguins sur animal vigile ou sous anesthésie gazeuse au niveau du sinus rétro-orbital / 1 fois en début d’expérience et 1 fois en fin d’expérience avant sacrifice / 680 souris - 20 secondes et durée avec anesthésie : 3 minutes >Injection/ingestion de molécules chimiques sur animal vigile / de 1 fois par semaine à 2 fois par jour selon le traitement tout au long de la procédure / 743 souris -10 secondes
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues lors des procédures chirurgicales seront celles liées à l’incision de la peau (nuisance modérée) ou du péritoine ou bien l’exérèse de la tumeur primaire (dans le but de développer les métastases par l’animal) (durée 5 minutes pour enlèvement de la tumeur primaire et 30minutes pour injection intrasplénique et souture de la péritoine (nuisance sévère). Lors des anesthésies, une baisse de température corporelle est observée chez la souris (nuisance légère) Des prélèvements de sang seront faits en sinus retro orbital sur animal anesthésié : durée 20 secondes et durée avec anesthésie : 3 minutes (nuisance légère) Les injections de cellules en intradermique ou l’administration de molécules par voie orale, intrapéritonéale, intraveineuse ou sous-cutané ou intramusculaire, ou enfin injection de la molécule pour visualiser les métastases ne provoquent pas de douleur chez les animaux au-delà de l’injection elle-même (durée10 sec maximum, nuisance légère). Par ailleurs, la croissance des tumeurs greffées au niveau des différents sites, pourraient provoquer une perte de poids ou une gêne pour se déplacer. Si une perte de poids rapide est observé (>18%) entre 2 évaluations, sans la présence de tumeur apparente, et qu’elle ne peut être récupérée par l’alimentation riche dans la cage et l’hydratation par voie sous-cutanée, cela est un signe de développement des métastases. Dans ce cas l’animal est euthanasié dans les 72h si aucune amélioration n’est observée (la perte de poids peut être considéré comme modérée et sévère si apparition de métastases). Pour visualiser les métastases on utilise l’imagerie sur souris anesthésiées en gazeuse après injection de sonde colorimétrique en IP (durée max 10 secondes) sous un volume de 100µL / 1 fois toutes les 2 semaines puis une fois par semaine tout au long de la procédure. Durée de l’anesthésie : maximum 30 minutes (la nuisance de l’imagerie est légère pour l’animal).
Devenir
Dans chaque procédure, les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem
Remplacement
L’efficacité antitumorale de tous les traitements est préalablement évaluée sur des cultures cellulaires (système in vitro). Seules les molécules ayant montré une efficacité in vitro sont alors ensuite utilisées in vivo. En effet il est nécessaire de valider l’effet observé dans un système intégré et tenant compte de la complexité d’un organisme vivant avec les multiples interactions, la toxicité possible ou encore la difficulté de la molécule à atteindre sa cible. L’injection de lignées cellulaires tumorales constitue l’outil d’analyse pharmacologique des nouveaux composés le plus proche de l’utilisation clinique aujourd'hui. Pour sélectionner les meilleurs composés antitumoraux, l'évaluation préclinique est une étape importante dans le développement d'un médicament avant son utilisation clinique. Cette évaluation conduit à optimiser les modalités thérapeutiques, prédire les effets du médicament en association et identifier des marqueurs de réponse ou de résistance. Les effets des thérapies testées sur la dissémination métastatique et sur les cellules initiatrices de tumeurs sont également étudiés.
Réduction
En se basant sur notre expérience, pour les expériences de toxicité, l’utilisation de 3 souris/dose est le minimum suffisant pour déterminer les effets secondaires des molécules. Dans les expériences d’efficacité, le nombre de souris correspond au nombre minimal requis pour avoir une différence significative. Ce nombre tient compte du taux de prise tumorale et l’hétérogénéité des réponses des animaux.
Raffinement
Les injections de cellules tumorales par voie intradermique sont peu invasives, avec un suivi de croissance tumorale facile et avec peu de manipulation. Les différentes procédures seront mises en œuvre de façon à engendrer le minimum de contraintes et de douleur aux animaux : - utilisation d’anesthésiques et d’analgésiques systématique lors des chirurgies. - Réduction de l’hypothermie lors de la chirurgie : tapis ou lampe chauffante - Addition d’alimentation hydraté en post-opératoire si besoin, hydratation supplémentaire de l’animal si perte de poids ou difficulté à se déplacer après chirurgie. - Si l’animal montre des signes de douleur des antalgiques lui seront administrés. - Les animaux seront surveillés pendant 24h lors des chirurgies. Par la suite, les animaux sont surveillés minimum 1 fois par semaine par le personnel. Pour faciliter le suivi des métastases nous allons utiliser l’imagerie dans la mesure du possible. Les traitements par différentes voies sont peu invasifs et se font sur animaux vigiles ; néanmoins si des signes de douleurs apparaissent lors de l’administration d’une molécule, celle-ci sera administrée sous anesthésie générale gazeuse. Une grille de score permettra d’évaluer de manière objective l’état des animaux et de définir les points-limite.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce a été fait pour plusieurs raisons : - La souris est un mammifère comme l’Homme et sa physiologie est proche de celle de l'Homme. - La réglementation demande à ce que tout développement de médicaments soit testé chez deux modèles animaux différents avant toute administration chez l’humain. La souris est le modèle le plus utilisé en première instance et il permet d’acquérir un grand nombre d’informations pour un investissement contrôlé. - L’existence de souches immunodéficientes chez la souris permet la greffe de cellules humaines sans risque de rejet. Cette greffe de cellules humaines est plus difficile dans d’autres espèces (le Zebrafish est moins permissif) Jeune adulte : L’injection a lieu entre 5 à 8 semaines. Les souris ont ainsi fini leur croissance mais sont suffisamment jeunes pour que la tumeur greffée puisse prendre sur les animaux car l’immunodéficience pourrait diminuer avec l’âge. De plus le temps de croissance des cellules tumorales MU est long ainsi que l’apparition des métastases. Les animaux à cet âge supportent également mieux le transport à partir de l’élevage jusqu’à l’animalerie ainsi que l’anesthésie, la chirurgie et les traitements
Études de l’activité immunomodulatrice d’un Immunoliposome chez la souris porteuse de cancer du sein
- Recherche appliquée
- Cancers
Pour mesurer l'effet immunomodulateur d'un nanomédicament associant une chimiothérapie et un anticorps anti-HER2, 260 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Une tumeur mammaire leur est greffée, qui peut métastaser, grossir et s'ulcérer. Les traitements sont injectés dans le sinus rétro-orbital chaque semaine pendant trois semaines, en changeant d'œil à chaque injection, avec un risque d'anémie, de neutropénie et d'hypersensibilité au point d'injection. La mise à mort intervient au point limite, fixé à 1 500 mm3 de tumeur, à une détresse respiratoire, à une prostration ou à une perte de poids supérieure à 15 %, et le porteur écrit qu'aucun stress ni souffrance particulière n'est attendu au cours des tests.
Objectifs
L'immunothérapie est révolutionnaire en oncologie mais ne fonctionne que chez un nombre restreint de patients. Ainsi il est essentiel de l'associer à des thérapies pouvant optimiser le terrain immunogène des patients. Notre objectif est alors double: - définir le caractère immunomodulateur de notre nanomédicament (immunoliposome contenant une chimiothérapie et un Anticorps monoclonal antiHer2) -définir à l'aide de modèles mathématiques, les modalités optimales (posologies et schémas thérapeutiques) d'association de notre nanomédicament avec l'immunothérapie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettrait d'amener des éléments de réponse quant aux modalités d'association des immunothérapies et nanomédicaments et ce afin de limiter les résistances actuelles observées avec les immunothérapies dans le cancer du sein.
Procédures
Greffe de cellules cancereuses murine sur animal anesthésié (1greffe par animal). Administration des traitements par voie intraveineuse au niveau rétroorbital (angle: 30 degrès avec une seringue de 26G, chez l’animal anesthésié par anesthésie gazeuse, avec des injections hebdomadaires pour les animaux concernés sur trois semaines maximum ,changement d’œil à chaque injection). Prélèvement sanguin, rate et tumeur
Impact sur les animaux
Les animaux seront greffés de cancer du sein pouvant métastaser, croitre et ulcérer. Les traitements peuvent également avoir des effet indésrables, notamment les liposomes chargés en docétaxel qui présente des effets indésirables hématologiques (neutropénie/anémie). L'injection de ces solutions lipidiques peut également être source d'hypersensibilité au site d'injection.
Devenir
Les animaux seront mis à mort une fois l'atteinte du point limite ou le prélevement sanguin et d'organes
Remplacement
En raison de l’absence de modèle in vitro relevant pour explorer toute la complexité de l’immunité tumorale, cette étude doit se faire sur l'organisme. La souris est alors le modèle rongeur le plus utilisé permettant de faire un suivi de croissance tumorale ainsi que de prélever sang/tumeur/rate.
Réduction
Notre projet comprend une étape de modélisation mathématique permettant de réduire le nombre de tests à effectuer pour définir les modalités d'association des immunothérapies à notre nanomédicament.
Raffinement
Le bien être animal est respecté: - temps d'acclimatation de 10 jours avant toute procédure - enrichissement des cages (dômes (Plast Hut) et cotons prédécoupés spécifiques/stériles (Cell Nest), - prévention de la douleur, réduction du stress (les manipulations telles que les administrations, prélèvements seront conduites sous anesthésie générale et aucun stress ou souffrance particulière n’est attendue au cours des diverses étapes des tests) - définition des points limites et évaluation quotidienne (volume tumoral au-delà de 1500mm3, difficultés respiratoires importantes, prostration, atonie, défaut d'alimentation avec perte de poids supérieure à 15%, ou toute autre manifestation de comportement anormal)
Choix des espèces
Les données de la littérature montrent que la souris est un bon modèle expérimental pour des études de pharmacocinétiques et d'immunomonitoring. De plus, toutes nos données d’efficacité et de pharmacocinétique de ce nanomédicament portent déjà sur cette espèce. Par ailleurs, la facilité de manipuler la souris dans un milieu confiné fait de cette espèce animale l’espèce la plus appropriée pour répondre aux questions posées. Des souris adultes (6 semaines d’âge). Par rapport à la pathologie étudiée (cancer du sein) qui touche exclusivement les populations adultes en clinique humaine, l’utilisation de souris adultes est retenue.
Etude de l’hétérogénéité de la réponse vasculaire (chez la souris C57BL/6J) pour prédire le risque de complications aux tissus sains après radiothérapie : impact du débit de dose.
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Irradiées au thorax entier à 18 Gy sous anesthésie, jusqu'à trente minutes pour le débit de dose le plus faible, 1 056 souris mâles sont ensuite gardées une semaine, un mois, trois mois ou six mois avant d'être tuées pour prélever leurs poumons. Le porteur indique que ce modèle provoque une fibrose à partir de trois mois et une mortalité de 20 à 25 %, et 180 souris subissent des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Celles qui perdent plus de 20 % de leur poids par rapport aux témoins sont mises à mort. L'objectif est de relier les réponses obtenues sur cellules en culture à celles observées in vivo, et le porteur écrit que le modèle prédictif ainsi construit pourrait à terme limiter le recours à l'expérimentation animale, ce qui suppose ici d'en irradier plus d'un millier.
Objectifs
L’objectif de ce nouveau projet est d’utiliser des mesures d’hétérogénéité de la réponse vasculaire pour prédire le risque de complications aux tissus sains après radiothérapie mais aussi d’établir des liens entre les réponses in vitro et in vivo pour valider la prédiction du risque de complications post-radiothérapie. Pour y parvenir, de nombreuses modalités d’irradiations en lien avec la clinique ont déjà été testées in vitro. Ainsi, nous souhaitons collecter et utiliser les données provenant de cellules endothéliales irradiées in vivo avec différentes modalités d’irradiations (variation d’énergie et/ou de débit de dose). La méthodologie développée permettra également de recueillir de nouvelles et nombreuses données sur les forts débits de dose. Enfin, à moyen et plus long terme, ce modèle de prédiction de risque pourra, grâce à sa méthodologie déclinable, être mis au service de l’expertise lorsque l’Institut est sollicité pour répondre à des problématiques de radioprotection, mais pour lesquelles il ne dispose pas de données biologiques et/ou scientifiques solides sur lesquelles s’appuyer pour donner son avis.
Bénéfices attendus
La méthodologie développée permettra de recueillir de nouvelles et nombreuses données in vivo sur les débits de dose. Ces données serviront également à établir des liens entre les réponses in vitro et in vivo pour valider la prédiction du risque de complications post-radiothérapie. Enfin, à moyen et plus long terme, ce modèle de prédiction de risque pourra, grâce à sa méthodologie déclinable, être mis au service de l’expertise de notre Institut, lorsqu’il est sollicité pour répondre à des problématiques de radioprotection, mais pour lesquelles il ne dispose pas de données biologiques et/ou scientifiques solides sur lesquelles s’appuyer pour donner son avis. Enfin ce modèle prédictif pourrait permettre à terme de limiter le recours à l’expérimentation animale, évaluant ainsi in vitro les risques associés à une nouvelle modalité d’irradiation inconnue.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés et irradiés localement (thorax entier) sous anesthésie (pendant 30 minutes maximum pour le débit de dose le plus faible qui sera testé). Ils seront par la suite maintenus 1 semaine, 1 mois, 3 mois ou 6 mois en groupe dans des cages d’hébergement dans les conditions classiques de l’animalerie. Au temps d’analyse défini, les animaux seront sédatés profondément pour être euthanasiés avant de procéder au prélèvement des poumons. Une partie des animaux seront imagés au micro-CT (sous anesthésie volatile : isoflurane) juste avant de procéder à l’euthanasie (groupes d’animaux servants à l’analyse histologique). Cet acte d’imagerie durera 10 minutes maximum. Aucune autre manipulation ou prélèvement ne sera effectué au cours de l’étude.
Impact sur les animaux
La dose de 18 Gy en thorax entier induit une fibrose caractérisée à partir de 3 mois environ post-irradiation. Ce modèle d’irradiation thorax entier à la dose de 18 Gy a été au préalable très bien caractérisé au sein du laboratoire. La mortalité observée sur ce modèle d’irradiation se situe entre 20 et 25 %. La sénescence et la fibrose radio-induites sont des processus nécessitant un délai suffisamment long pour se développer et s’installer. Aussi il est donc primordial de fixer des temps d’analyses jusqu’à 6 mois post-irradiation pour chacune des situations d’irradiations envisagées. Il conviendra donc de surveiller les animaux tout au long de l’expérience, a fortiori sur les points les plus tardifs pour détecter tout signe de détresse respiratoire ou de souffrance animale. Si tel était le cas, les animaux concernés seront euthanasiés.
Devenir
Euthanasie pour prélèvements post-mortem.
Remplacement
Il n’existe pas à ce jour d’alternative non animale pour étudier la réponse endothéliale dans leur environnement tissulaire. Le recours à l’expérimentation pour mener à bien ce projet est indispensable. Le but de cette étude est de conforter des données obtenues in vitro sur des cellules endothéliales afin d’implémenter un modèle de prédiction de devenir cellulaire suite à l’irradiation. A terme, si un tel modèle peut être établi il pourra devenir un outil d’alternative à l’expérimentation animale.
Réduction
Pour effectuer des tests statistiques sur des données histologiques des groupes de 8 animaux sont nécessaires afin d’en retirer une information robuste. Pour les analyses par cytométrie en flux spectrale des groupes de 8 animaux suffiront, car chaque analyse sera réalisée sur des dizaines de milliers de cellules (minimum 5 x 104 cellules par point), ce qui augmente significativement la puissance statistique. Les matrices de données générées par cytométrie en flux spectrale seront analysées par des outils statistiques de pointe dédiés et développés en collaboration avec le mathématicien/biostatisticien du service.
Raffinement
Concernant les conditions d’hébergement des animaux, des enrichissements seront placés dans les cages (tubes pour rongeurs, caches, copeaux, cotons,…). De l’eau dans des biberons ainsi que de la nourriture sous forme de croquettes seront disponibles ad libitum. Cet hébergement se déroulera dans des conditions de température et d’humidité régulées et contrôlées. Durant la totalité de l’expérience (arrivée des animaux jusqu’à l’euthanasie), un suivi quotidien des animaux sera assuré avec une attention particulière qui sera portée à tout signes comportementaux et cliniques montrant une souffrance animale (absence de mobilité, prostration, détresse respiratoire, …). Si ces signes anormaux sont observés, une euthanasie des animaux concernés sera réalisée. Concernant les irradiations, les souris seront maintenues endormies sous anesthésie volatile (isoflurane) durant chaque irradiation de manière à garantir leur sédation ainsi que leur immobilité. Puis les animaux seront pesés une fois par semaine afin de vérifier que la perte de poids ne dépasse pas 20 % par rapport au groupe témoin correspondant. Si tel était le cas, une euthanasie des animaux concernés sera réalisée.
Choix des espèces
Ce projet fera appel à des souris mâles âgées entre 8 et 10 semaines. Il s’agit d’un stade adulte (animaux de poids suffisant), classiquement utilisé dans les modèles d’irradiation localisées et permettant de se prémunir d’une hétérogénéité liée à l’âge. L’irradiation thorax entier de souris mâles est également un modèle pré-clinique parfaitement maîtrisé au sein du laboratoire depuis de très nombreuses années. Il sera néanmoins intéressant de poursuivre ultérieurement cette étude sur des souris femelles lors d’un futur projet.
Pharmacothérapies pour améliorer la structure-fonction artérielle dans des conditions physiopathologiques liées à des altérations des fibres élastiques (2/2)
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
2 475 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1 383 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et chacune passe neuf séances de quinze minutes de mesure de pression artérielle par manchon à la queue. Un tiers subit quatorze jours d'hypoxie intermittente, avec perte de poids et baisse de la prise alimentaire les premiers jours. Les deux autres tiers portent une délétion du gène de l'élastine ou de la fibrilline-1 qui altère leurs vaisseaux dès la naissance et peut conduire à des sténoses ou des anévrismes, et une partie est hébergée jusqu'à 24 mois pour l'étude du vieillissement, isolée quand les congénères meurent de vieillesse. Le porteur annonce que ces travaux permettront de proposer la stratégie thérapeutique la plus appropriée pour trois maladies humaines. Les organes vitaux, eux, sont prélevés sur chaque souris au cours d'une procédure sans réveil.
Objectifs
L'élasticité des grosses artères est essentielle pour permettre une perfusion correcte des tissus. Les fibres élastiques, responsables de l'élasticité artérielle, sont composées à 90% d'élastine (Eln) et à 10% de microfibrilles riches en fibrilline-1 (Fbn1), et ne sont produites que jusqu'à la fin de l'adolescence, ne faisant ensuite que fonctionner tout en se dégradant (avec perte d'élasticité artérielle) jusqu'à la fin de la vie. Cette dégradation de l'élasticité artérielle a des conséquences délétères majeures sur la fonction cardiaque, la pression et la circulation sanguines, et la perfusion des organes. C'est ce qui advient au cours du vieillissement normal, mais aussi dans les maladies génétiques liées à l'organisation anormale des fibres élastiques : syndrome de Williams-Beuren (rétrécissements artérielles dûs à la déficience en Eln) et syndrome de Marfan (anévrismes dûs à la déficience en Fbn1). Des études récentes ont également montré que l'altération des fibres élastiques et les dysfonctions artérielles correspondantes (dont la rigidification artérielle) sont associées à l'hypoxie intermittente générée par le syndrome d'apnée obstructive du sommeil, qui concerne 10-20% de la population générale et jusqu'à 30-50% des personnes âgées. Il a préalablement été démontré que 3 traitements pharmacologiques, administrés à des souris, peuvent, dans des situations fixées, protéger et/ou restaurer la production des fibres élastiques et diminuer la rigidité artérielle. Ces 3 traitements n'ayant jusqu'alors pas été appliqués dans les mêmes situations pathologiques, ce projet propose de comparer de manière systématique chez les mêmes souris l'efficacité des 3 traitements, dans trois modèles pathologiques présents au laboratoire, en fonction du sexe et de l'âge. Le but ultime est de proposer le traitement le plus efficace pour chacune des trois pathologies, chez les patients humains. Le projet sera mené dans 2 établissements utilisateurs qui apporteront chacun l'accès à des techniques spécifiques différentes.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche est motivé par l'importance en santé publique de la dégradation des fibres élastiques artérielles dans différentes situations physiopathologiques comme le vieillissement, la déficience génétique du gène de l'élastine ou de la fibrilline-1, ou l'hypoxie intermittente causée par le syndrome d'apnée du sommeil. Ceci conduit à des dysfonctions artérielles et à l'hypertrophie et l'insuffisance cardiaques induites, couplée à une hémodynamique altérée, une mauvaise perfusion et une dysfonction des organes. La réparation des fibres élastiques dégradées est donc un enjeu thérapeutique majeur. La littérature fait état de nombreux travaux à ce sujet (plusieurs milliers, motsclefs: elastic fiber artery), montrant l'intérêt général pour comprendre les mécanismes et améliorer ou restaurer l'élasticité artérielle. Les résultats obtenus sur ces modèles de souris permettront de vérifier et de comparer les efficacités des trois traitements pharmacologiques dans le maintien ou l'amélioration de l'élasticité artérielle et des paramètres physiologiques associés chez des animaux modèles de 3 pathologies humaines. Suivant la pathologie, le traitement le plus efficace pourra s'avérer ne pas être le même, et nos résultats permettront donc de proposer une nouvelle stratégie thérapeutique la plus appropriée chez les patients atteints par chacune de ces trois affections.
Procédures
1/3 des animaux seront exposés à la normoxie ou à l'hypoxie durant 14 jours avant leur mise à mort. Les autres animaux (2/3) ont un gène délété qui altère, dès la naissance, la plasticité et l'élasticité de leurs vaisseaux : 1/3 des animaux seront déficients pour le gène de l'élastine ou seront les animaux témoins de ceux-ci, et 1/3 des animaux seront déficients pour le gène de la fibrilline-1 ou seront les animaux témoins de ceux-ci. Dans chacun de ces 3 groupes d'animaux, les effets de 3 traitements pharmacologiques seront étudiés : un premier tiers des animaux de chaque groupe sera traité durant 3 mois avant la fin de l'étude par le premier traitement pharmacologique (dans l'eau de boisson), un deuxième tiers des animaux de chaque groupe sera traité durant 3 mois avant la fin de l'étude par le deuxième traitement pharmacologique (dans l'eau de boisson), et le dernier tiers des animaux de chaque groupe sera injecté dans la veine de la queue 3 fois à 5 jours d'intervalle juste avant la fin de l'expérimentation avec le troisième traitement pharmacologique ou du sérum physiologique (durée de l'injection 30 secondes). Tous les animaux seront soumis à des mesures de pression artérielle vigile (3 fois par jours pendant 3 jours, à raison de 15 minutes par session), non-invasives, par sphygmomanométrie à la queue (tail-cuff). La fonction cardiaque et aortique sera mesurée une fois, en fin de protocole, par échographie sous anesthésie gazeuse d'une durée moyenne de 30 minutes. A la fin de l'ensemble des procédures, des prélèvements d'organes seront réalisés sous anesthésie et analgésie, entrainant la mort des animaux. Ces organes seront utilisés par la suite dans des expériences de physiologie, de biochimie, d'histologie et de biologie moléculaire, et pour réaliser des cultures de cellules musculaires lisses vasculaires. De plus, les animaux mis en vieillissement pour former les groupes des souris âgées de 24 mois auront, par conséquent, un hébergement de longue durée. Les expériences d'échographie sur animal anesthésié seront réalisées dans l'EU2 ; toutes les autres expériences seront réalisées dans l'EU1, porteur principal du projet.
Impact sur les animaux
La mesure sur animal éveillé de la pression artérielle peut induire un léger stress. Les animaux en hébergement longue durée pour du vieillissement pourraient se retrouver isolés si leurs congénères venaient à mourir de vieillesse. La mise en hypoxie des animaux entraine une perte de poids les premiers jours le temps de l'adaptation à la restriction d'air de façon récurrente et répétée et une diminuation de leur prise alimentaire. Les animaux génétiquement modifiés ont une perte l'élasticité et de plasticité de leur vaisseaux pouvant conduire à des sténoses ou à des anévrismes. L'administration des traitements testés devraient limiter les effets délétaires de l'hypoxie ou celles induites par les modifications génétiques, voire améliorer la plasticité et l'élasticité vasculaire.
Devenir
Tous les animaux se verront appliquer un prélèvement d'organes vitaux terminal au cours d'une procédure sans réveil. Aucun animal ne restera donc en vie à la fin des procédures expérimentales. Ces prélèvements d'organes permettront des études d'artériographie de pression, d'histologie classique ou en microscopie synchrotron, de biologie moléculaire (expression des gènes et protéines liés aux fibres élastiques) et, concernant l'aorte, pour généréer des primocultures de cellules musculaires lisses vasculaires.
Remplacement
Remplacer : la mécanique et la réactivité vasculaires reposent sur une interaction fonctionnelle des systèmes nerveux et vasculaires, ainsi qu'une interaction entre les signaux circulants et les différents types cellulaires vasculaires, aussi bien que sur l'interaction entre les différents types de cellules vasculaires structurées de manière très précise dans la paroi, nécessitant forcément une approche in vivo. Aucune méthode alternative ne peut donc se substituer à l’utilisation des animaux pour la réalisation de notre projet car il requiert une approche intégrée.
Réduction
Réduire : Sur la base des résultats de nos expériences publiées antérieurement et du niveau de dispersion des données constaté chez les souris, le nombre de souris nécessaire à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre l’interprétation statistique de nos résultats : 12 animaux par groupe chez les adultes (16 par groupe à mettre en vieillissement pour obtenir 12 animaux agés, du fait du taux de décès spontané avant 24 mois) sont prévus mais le maximum de procédures expérimentales non-sévères seront réalisées sur tous les animaux, ce qui permet de ne pas devoir recourir à des groupes d'animaux séparés/additionnels pour réaliser des procédures différentes, sauf nécessité absolue due à l'impossibilité de réaliser de multiples études de physiologie sur différents organes vivants en même temps. Aussi, nous aurons besoin de constituer des groupes témoins non-traités pour chaque traitement, sans pouvoir les mutualiser de manière générale. Cependant, deux des traitements pharmacologiques étant tous deux simplement ajoutés à l'eau de boisson des animaux, nous constituerons des groupes témoins mutualisés pour ces deux traitements (animaux buvant de l'eau de boisson normale), ce qui permettra une réduction sensible du nombre d'animaux utilisés. Après la réalisation des procédures in vivo et l'euthanasie des animaux, nous allons collecter les organes et tissus de ces mêmes animaux pour les utiliser au cours des études ex vivo et in vitro post-mortem, rationnalisant encore ainsi le nombre des animaux utilisés. Enfin, un certain nombre d'expériences de signalisation cellulaire seront menées sur des primocultures de cellules musculaires lisses vasculaires issues de nos souris, ce qui permettra de réduire encore le nombre des animaux nécessaires pour atteindre nos objectifs.
Raffinement
Une attention générale sera portée à la qualité des méthodes d'anesthésie et d'analgésie des animaux. De plus, une surveillance attentive sera réalisée pendant l'hébergement et lors de la réalisation des procédures expérimentales afin d'évaluer en permanence les nuisances subies (douleur, stress, ...), de façon à pouvoir appliquer immédiatement un renforcement analgésique et/ou anesthésique si nécessaire et faire en sorte que ces nuisances soient absentes ou réduites à leur niveau minimum. Les conditions de l'hébergement de longue durée des animaux en vieillissement, seront particulièrement surveillées afin de limiter au maximum les risques de décès spontané liés à l'âge. L'organisation des cages sera optimisée (mise en place d’enrichissement supplémentaire pour les animaux âgés en situation d’isolement, croquettes mouillées au sol dans les cages pour les animaux âgés). Les conditions d'expérimentation seront aussi optimisées pour le confort des animaux, avec habituation à la contention (mesures de pression artérielle) et gel oculaire appliqué lors d'anesthésies longues (échographie). Des points limites prédictifs et précoces, gradés précis et adaptés, ainsi que des critères d'arrêt, sont définis, et un arbre décisionnel mis en place, permettant aux personnels de décider des actions à réaliser pour le bien-être des souris et l'application des points limites et critères d'arrêt définis. Les expérimentateurs et soigneurs seront formés pour appliquer ces procédures et règles de protection du bien-être animal, conformément à la règlementation. Aussi, les lignées de souris génétiquement déficientes pour l'élastine ou la fibrilline-1 sont à phénotype dommageable car les individus homozygotes meurent quelques jours ou semaines après la naissance. Les animaux homozygotes n'étant pas un objet de notre étude, ils ne seront pas produits, en n'effectuant que des croisements d'animaux de type sauvages avec des animaux hétérozygotes. En raison d'une mortalité intra-utérine partielle des animauxhétérozygotes pour l'élastine, les mères seront particulièrement surveillées en période périnatale (deux fois par jour au lieu d'une) de façon à détecter au plus vite tout problème et appliquer les mesures de soin ou critères d'arrêt définis. Le transport des animaux entre les 2 EU est fait par un expérimentateur compétent, en cage d'hébergement standard, temporairement occultée, avec eau, croquettes et enrichissement.
Choix des espèces
Nos travaux évalueront l'efficacité réparatrice de trois traitements pharmacologiques sur les fibres élastiques artérielles altérées dans des situations physiopathologiques existant chez l'Homme (déficits génétiques responsables des syndromes de Williams-Beuren et de Marfan, et hypoxie intermittente due à l'apnée obstructive du sommeil), en fonction de l'âge et du sexe. Notre étude concerne la physiologie cardiovasculaire et les fibres élastiques artérielles altérées dans des situations physiopathologiques existant chez l'Homme. Des modèles alternatifs d’animaux de classes phylogénétiques inférieures (drosophile, zebrafish, c-elegans) utilisés parfois en recherche fondamentale ne sont pas pertinents pour les questions scientifiques abordées dans ce projet. Les souris sont le modèle de référence utilisé en recherche fondamentale dans ce domaine, ce qui permettra une comparaison de nos résultats avec nos résultats antérieurs et avec la littérature. Les souris utilisées dans le cadre de ce protocole sont âgées de 6 mois (jeunes adultes) et de 24 mois (âgées), ce qui correspond aux âges ciblés pour une vérification optimale des potentialités thérapeutiques des trois traitements pharmacologiques sur nos modèles murins physiopathologiques.
Essais thérapeutiques de composés immunomodulateurs sur tumeurs solides
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
6000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacune manipulée un jour sur deux pendant plusieurs semaines. Tondue puis greffée d'une tumeur sous la peau, chaque souris reçoit deux injections de composés immunomodulateurs par semaine pendant au moins trois semaines, certaines derrière le globe oculaire, se fait peser et mesurer sa tumeur au pied à coulisse trois fois par semaine, subit quatre à cinq prises de sang et une biopsie quand la tumeur atteint 200 mm3. Le porteur travaille pour des laboratoires privés et publics qui commandent ces essais et fixent le rythme des injections. Il liste la douleur parmi les effets de la croissance tumorale puis conclut qu'aucun analgésique ne sera administré, une prise en charge de la douleur faussant la réponse immunitaire mesurée.
Objectifs
Les différents laboratoires privés et publics pour lesquels nous réalisons des prestations cherchent à connaître l’impact d’une tumeur sur le système immunitaire. Les essais thérapeutiques récents utilisant des composés pouvant activer ou inhiber le système immunitaire ont donné des résultats extrêmement prometteurs sur certains types de cancers tels que les cancers de la peau et leurs métastases (dissémination des cellules cancéreuses dans tout l’organisme). Les thérapies utilisant des anticorps (molécules générées par les cellules de notre système immunitaire pour se défendre contre les pathogènes), permettent également une diminution spectaculaire de la croissance tumorale. Ces composés et molécules modulant notre système immunitaire sont appelés « composés immunomodulateurs ». Les laboratoires s’intéressent donc particulièrement à la caractérisation de ces nouveaux composés ainsi qu’aux thérapies combinatoires pour atteindre un taux de succès plus élevé. L’objectif de ce projet est d’évaluer la réponse immunitaire suite au développement d'une tumeur dans des souris contrôles ou génétiquement modifiées permettant une description exhaustive et une caractérisation de toutes les cellules immunes infiltrant la tumeur et leur rôle dans le contrôle de la pousse tumorale, en présence ou non d'un traitement thérapeutique de composés immunomodulateurs.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à évaluer de façon qualitative et quantitative la capacité d’un modèle murin à rejeter une tumeur après un traitement immunothérapeutique (traitements qui impact la réponse du système immunitaire) en comparaison avec des animaux contrôles sans traitement. Ainsi, nous pourrons valider de nouveaux candidats dans le cadre d'immunothérapie. Nous pourrons également déterminer l'action anti-tumorale de ces nouveaux composés grâce à l'étude du système immunitaire et définir la dose optimale à injecter. Ces études présenteront une avancée majeure dans le traitement des cancers par immunothérapie.
Procédures
Les souris seront régulièrement manipulées lors de ce projet à raison d’un jour sur deux pour différentes raisons : - La préparation de la peau à J-1 : les souris seront préalablement tondues à l’aide d’une tondeuse. La tonte se fait sur souris vigiles (contention) (30 secondes/souris) -L’injection par voie sous-cutanée des cellules tumorales à J0 nécessitera une anesthésie générale des souris par voie chimique (durée anesthésie : 30-45min, durée injection : 2min/souris). -Les injections de composés permettant d’optimiser la réponse antitumorale du système immunitaire débuteront à J6 post-injection tumorale. Celles-ci auront lieu 2 fois/semaine sur 3 semaines minimum à la demande du partenaire. Suivant la voie d’injection recommandé par le partenaire, la contention sera utilisée, à l’exception de l’administration par voie intraveineuse (derrière le globe oculaire) qui nécessitera une anesthésie gazeuse des souris pour limiter le stress (injection : entre 30 sec et 1min/ souris). -Les suivis de poids auront lieu 3 fois/semaine sur souris vigile (souris manipulées et déplacées dans une balance à pesée dynamique) à partir de J0 jusqu’à la fin de la procédure (entre 30 sec et 1min/ souris). -Les suivis de mesures tumorales au moyen d’un pied à coulisse auront lieu 3 fois/semaine sur souris vigile (contention) à partir de J3 ou J5 suivant la voie d’injection des cellules utilisée jusqu’à la fin de la procédure (2min/ souris). -Les prélèvements sanguins (4 ou 5 au total au cours de la procédure expérimentale) auront lieu sur souris vigile (contention) afin d’évaluer l’efficacité du traitement sur le système immunitaire. Les prélèvements seront de 100μL en respectant à chaque fois une semaine d’intervalle minimum (1min/souris). -Une unique biopsie lorsque la tumeur a atteint 200mm3 nécessitera une anesthésie gazeuse des souris ainsi qu’une anesthésie locale au niveau du site de ponction de la biopsie (1min/souris).
Impact sur les animaux
1-Les tests de toxicité des composés immunomodulateurs seront effectués en amont par les partenaires. Les doses injectées n'induiront donc aucun effet indésirable sur les animaux dans le cadre de ce projet. 2-Les effets indésirables liés à la croissance tumorale : -Douleur -Mobilité réduite -Perte de poids 3-Les différents actes techniques pouvant engendrer du stress, nécessitant une contention ou une anesthésie tels que : La tonte, les pesées, les mesures tumoral, l’injection des cellules tumorales (réalisée sous anesthésie) , les injections des composés thérapeutiques (réalisées sous anesthésie suivant la voie d’administration choisis), la biopsie (réalisée sous anesthésie) et les prélèvement sanguin seront les plus court possible (contention) et réalisées par du personnel expérimenté et expert dans ces techniques afin de limiter les contraintes subies par l’animal.
Devenir
Selon les différentes Procédures expérimentales, quel que soit le protocole choisi, tous les animaux sélectionnés pour l’étude de l’ensemble des caractères apparents des cellules du système immunitaire seront mis à mort afin de procéder au prélèvement des organes et à leur analyse. Les animaux ne rentrant pas dans les critères de sélection définis par l’étude ou sortis de l’étude avant sa fin seront également mis à mort.
Remplacement
Dans ce type de projet, aucune méthode substitutive ou alternative ne nous permettrait de nous placer dans des conditions physiologiques similaires. En effet, le modèle testé dans le cadre de cette demande doit être évalué à l’échelle de l’organisme entier, permettant ainsi la mise en place de toutes les boucles de régulation impliquées dans ce type de réponse. Le modèle murin est donc un modèle de choix pour l'étude du système immunitaire grâce aux connaissances acquises et au nombre d'outils disponibles.
Réduction
Des expériences antérieures ont permis de déterminer la « variabilité de la mesure » afin de pouvoir calculer par un test de puissance le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre la significativité statistique. Le nombre utilisé pour ces expériences sera de 6 animaux par groupe afin d’avoir des données statistiques robustes et de limiter le nombre d’expérience. Le nombre de groupe sera amené à varier selon les besoins du partenaire, notamment si plusieurs molécules ou doses sont à tester. Les résultats seront ensuite analysés à l’aide de logiciel spécialisés et nous appliquerons selon la taille des groupes différents tests statistiques.
Raffinement
Les animaux en expérimentation seront hébergés en groupe de 5 individus maximum par cage et de même sexe. L’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Dans chaque cage, le milieu sera enrichi par l’ajout de deux éléments : - une maison en carton pour leur procurer un abri, - un nid compact de lanières de papier Kraft, que les souris pourront grignoter afin de se confectionner un nid. Un temps d’acclimatation d’une semaine sera respecté entre la réception des animaux et le début du protocole expérimental. Les souris seront observées quotidiennement par le personnel de zootechnie formé et qualifié et des points limites seront préalablement établis. En ce sens, une grille de score sera utilisée prenant en compte le comportement naturel et provoqué de l’animal, la variation pondérale et la caractérisation expérimentale (aspect et volume tumoral). Des points limites seront établis pour chaque observation lors de l’évaluation à l’aide de la grille de score (valeur maximale de la grille de score) qui entraineront la mise à mort de l’animal s’ils sont atteints. Dans ce projet nous étudions le système immunitaire, toute administration d’analgésique entrainerait un biais de la réponse cellulaire observée.En effet, les études animales évaluant la toxicité du paracétamol chez le rat et la souris, ont mis en évidence des lésions gastro-intestinales, des changements des nombres des cellules sanguines, une dégénération de la paroie du foie et du rein et une nécrose. De plus les effets du paracétamol sur la pousse tumorale sont en contradiction avec le projet et ses objectifs. Ainsi, nous ne pourrons pas utiliser d’analgésique.
Choix des espèces
Mammifères dont 99% des gènes sont similaire à ceux de l’homme, la souris est un animal de petite taille, à reproduction rapide et facile d’élevage. De plus, la communauté scientifique dispose de bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude soit riche d’enseignements permettant d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces, avec des applications cliniques potentielles pour l’homme. Par ailleurs, le modèle murin est un modèle de choix pour l'étude du système immunitaire grâce aux connaissances acquises et au nombre d'outils disponibles permettant de déterminer ainsi l’ensemble des caractères observable et apparents du système immunitaire. Enfin, nous utiliserons uniquement des animaux adultes, de plus de 8 semaines, avec un poids supérieur ou égal à 20g. Les animaux doivent en effet avoir un système immunitaire mature et un poids suffisant pour être stable au début du protocole et éviter les variations physiologiques non dues au protocole.
Elevage de la lignée murine MeCP2-T158M, modèle du Syndrome de Rett pour en étudier le phénotype et le développement de stratégies thérapeutiques.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Les souris de cette lignée portent une mutation du gène Mecp2 qui provoque chez elles une baisse de mobilité, des tremblements, une altération du rythme respiratoire et, chez les mâles, la mort vers treize semaines. 1190 souris vont être utilisées pour maintenir cette lignée modèle du syndrome de Rett, 595 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 595 un niveau sévère. La seule procédure décrite est un prélèvement de bout de queue pour le génotypage, le porteur ajoutant que "les souris sont déclarées en procédure légère" alors que la moitié de l'effectif est comptée en souffrance sévère. Toutes sont tuées vers quarante jours, avant l'apparition des signes, aucune ne pouvant être donnée ni transférée en raison de son phénotype.
Objectifs
Le syndrome de Rett (RTT) est un trouble du spectre autistique (TSA) causé par des mutations du gène MECP2. Plus de vingt ans de travaux ont permis d'établir que MeCP2 est une protéine jouant un rôle essentiel dans la physiologie neuronale et les comportements. Compte tenu de l'origine génétique du RTT et de la preuve de concept de sa réversibilité chez des souris à l’âge adulte, des efforts considérables ont été déployés pour concevoir des approches thérapeutiques visant à réexprimer MeCP2. Depuis que le lien entre MECP2 et RTT a été identifié, des milliers de mutations de MECP2 ont été découvertes. Or, le modèle le plus utilisé par la communauté scientifique est une souris totalement dépourvue de MeCP2. Un cas de figure qui n’est pas retrouvé chez l’homme. Il devient donc crucial d’étudier les modèles qui portent des mutations de MECP2 retrouvées chez les patientes pour développer des stratégies qui corrigent la pathologie dans ces contextes. Les souris porteuses de différentes mutations RTT peuvent présenter des symptômes communs mais parfois distincts, ce qui suggère que certaines mutations peuvent modifier des mécanismes spécifiques. La souris que nous voulons étudier porte une mutation de MECP2 qui est associée chez les patientes à une évolution clinique sévère et représente environ 10 % de tous les cas. Les souris qui portent cette mutation ont une durée de vie plus courte, une réduction du poids du cerveau, une altération de la coordination sensorimotrice et de l'équilibre, une réduction de la mémoire, une anxiété plus élevée et des troubles respiratoires. Notre équipe a pour projet d’importer ces souris, rendues disponibles via le Jackson Laboratory.
Bénéfices attendus
Ce projet s’intéresse au syndrome de Rett (RTT), une maladie du spectre autistique sévère et à son traitement. Nous souhaitons établir une lignée de souris qui porte une mutation de MECP2 très fréquente chez les patientes RTT pour tester ultérieurement l’impact d’une thérapie génique optimisée afin d’étudier les améliorations sur le plan comportemental, cellulaire et génétique. A ce jour des compagnies pharmaceutiques recrutent déjà des patientes Rett pour des essais cliniques de thérapie génique, hélas ces études ne tiennent pas compte du fait que toutes les mutations de MECP2 ne se valent pas et que l’impact du traitement peut varier d’une patiente à l’autre. Nous pensons qu’il est donc urgent d’étudier les effets de mutations spécifiques de Mecp2 et de la thérapie génique dans ce contexte. Une meilleure compréhension des des effets spécifiques de certaines mutations et l’élaboration de thérapies innovantes permettra de proposer cette approche thérapeutique chez les patientes porteuses de ces mêmes mutations.
Procédures
Prélèvement de bout de queue pour genotypage.
Impact sur les animaux
Le phénotype des souris qui seront étudiés ici est décrit dans la littérature de manière explicite et est connu de notre groupe. La progression de la pathologie est graduelle et se caractérise par 1) Apparition des symptômes (mâles: 6 semaines ; femelles : ± 20 semaines) incluant une baisse de la mobilité, du positionnement des pattes arrières, des tremblements, et une altération du rythme respiratoire (ces symptômes sont mesurés lors d’une évaluation hebdomadaire). 2) Perte de poids chez les mâles (par rapport aux sauvages, dès 4 semaines). Gain de poids (par rapport à leur naissance jusqu’à 6 semaines puis stagnation ± jusqu’au décès). 3) Réduction de la survie chez les mâles : décès autour de 13 semaines (une vigilance quotidienne est apportée autour de cette période). En bref, la pathologie se déclare plus tôt chez les souris mutantes mâles que chez les souris mutantes femelles qui bénéficient d’une autre copie (saine) du gène Mecp2. Les souris seront soumises à des procédures de gravite légère (génotypage, étude observationnelle). Environs 50% des animaux produits porteront les génotypes qui causent le développement d’un phénotype Rett. Toutefois, toutes les souris produites dans le cadre de la DAP d’élevage seront euthanasiées avant qu’elles ne déclarent des signes aux alentours de 40 jours. La notation de la sévérité des phénotypes Rett sera utilisée pour appréhender au mieux la date d’apparition des phénotypes.
Devenir
Toutes les souris seront euthanasiées. Seules les mâles hémizygotes et femelles hétérozygotes ont le potentiel de développer le phénotype Rett mais seront euthanasiées dès l’apparition du phénotype. Les souris sauvages des 2 sexes ne présenterons pas de phénotype dommageable. Les souris sont déclarées en procédure légère. Compte tenu du phénotype dommageable des souris 'Rett' aucune d’entre elles ne peut faire l’objet d’un don ou d’une « réutilisation ».
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Il n’existe pas, dans notre domaine, d’alternatives satisfaisantes aux méthodes expérimentales proposées dans ce projet (expériences in vivo sur l’animal). Le modèle animal est nécéssaire pour pouvoir étudier le comportement, la physiologie, mais aussi l’impact de la pathologie sur la morphologie et l’expression de gènes chez des cellules intégrées à des reseaux et un organisme vivant et donc soumise à un degré de complexité biologique ne pouvant pas etre atteint (à ce jour) par des méthodes in vitro, in cellulo, ou d’organoides.
Réduction
Des tests statistiques seront utilisés pour définir le nombre de souris suffisant pour dégager un résultat significatif à notre étude. En fonction de la distribution des données afin de comparer les différents groupes d’animaux entre eux. Les animaux produits dans le cadre de l’élevage seront euthanasiés avant qu’ils ne déclarent des signes de la pathologie aux alentours de 40 jours.
Raffinement
Afin de minimiser la souffrance, le stress et la détresse des animaux, des points-limites seront établis, entraînant la mise à mort anticipée de l’animal. Pour limiter le stress des animaux, ils seront manipulés par le (ou les) même(s) expérimentateur(s) et sur le même poste expérimental. Le transfert des animaux hors de la cage pour étude observationnelle se fera par méthode manuelle en plaçant les souris dans le creux de la main pour réduire le stress lié à la manipulation. Chaque animal bénéficiera d’une attention et de soins de qualité, par des chercheurs et zootechniciens qualifiés, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans un environnement enrichi (rafle de maïs, matériel de nidification + maison dans les cages d'accouplement + bâtons à ronger) assurant un accès constant à la nourriture et à l’eau de boisson. Les mâles hémizygotes étant viables mais non fertiles nous raffinons notre schéma de reproduction afin de ne maintenir que des cages de reproduction composées de femelles hétérozygotes.
Choix des espèces
Ce projet s’intéresse au syndrome de Rett, un trouble du spectre autistique et à son traitement. Nous souhaitons ici étudier les effets d’une mutation spécifique du gène Mecp2 pour ensuite tester une série de stratégies de thérapeutiques sur leur capacité à améliorer les symptômes de la pathologie. Une meilleure compréhension de ces mécanismes permettra la mise en place de nouvelles thérapies originales pour les patientes porteuses d‘une mutation qui engendre un tableau clinique sévère. L’étude nécessite donc l’étude de modèles comparables à la pathologie humaine. Il est donc indispensable pour la bonne réalisation de ce projet de recourir à l’utilisation d’un modèle souris mutantes. La souris réunie la capacité à travailler sur un modèle génétiquement modifié et chez qui nous pouvons étudier le comportement, la physiologie, mais aussi l’impact de la pathologie sur la morphologie et l’expression de gènes avec un degré de complexité biologique ne pouvant pas être atteint (à ce jour) par d’autres modèles ou méthodes.
Evaluation des effets des substances chimiques (toxicité aiguë) sur le poisson zèbre
- Protection de l’environnement
Déterminer la concentration d'un produit chimique qui tue la moitié d'un groupe de poissons en 96 heures : c'est l'objet de ces essais, pour lesquels 855 poissons zèbres juvéniles vont être utilisés. 705 d'entre eux subissent des procédures d'un niveau de souffrance sévère, les 150 autres un niveau léger. Ils sont plongés dans une eau chargée du produit à tester, sans nourriture pendant les quatre jours de l'essai et sans aucun enrichissement du bac, celui-ci risquant de relarguer des substances. Les survivants exposés sont tués, seuls les témoins pouvant être adoptés, et le porteur indique disposer au laboratoire d'un essai de substitution sur embryons que les autorités ne reconnaissent pas.
Objectifs
La production de substances chimiques n’a cessé d’augmenter depuis le siècle dernier et s’est inéluctablement accompagnée de rejets incontrôlés dans l’environnement, occasionnant de lourdes conséquences environnementales et sur la santé humaine, comme l’ont malheureusement montré de trop nombreuses catastrophes sanitaires et écologiques. Il apparaît donc essentiel de recueillir les informations sur leurs propriétés intrinsèques avant leur mise sur le marché, afin d’évaluer leur dangerosité ou leur innocuité vis-à-vis de l’environnement. C'est dans ce contexte que seront menées des études d'écotoxicité, selon des procédures bien cadrées et spécifiques, afin de s'assurer de l'innocuité des produits chimiques testés sur l'environnement (avant leur mise sur la marché) ou au contraire de révéler leur toxicité. Il s'agira ainsi d'évaluer l'innocuité ou la capacité de substances à générer des effets de toxicité aigüe sur les poissons, dans le but de déterminer, si possible, la concentration létale médiane (CL50), c'est-à-dire la concentration qui tue 50% d’un groupe de poissons après une certaine période d’exposition (96 heures en général).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet rentrent dans le cadre de l'évaluation de l'impact des substances chimiques sur l'environnement, visant à réduire l'utilisation de substances dangereuses pour l'environnement.
Procédures
Les animaux sont exposés à différentes concentrations de la substance chimique à tester via le milieu aquatique. Il n'y a pas de prélèvements ni de procédures chirurgicales.
Impact sur les animaux
Cet essai visant à déterminer la toxicité aiguë vis-à-vis des poissons, il est probable qu'un certain nombre d'individus meurent au cours de la procédure.
Devenir
Les poissons survivants exposés aux élément d'essai sont euthanasiés en fin de test car ils ne peuvent pas être réutilisés pour d'autres essais. Les témoins peuvent être adoptés, tout comme les poissons en stabulation non utilisés pour les tests (le cas échéant).
Remplacement
Des essais alternatifs comme par exemple l'essai de toxicité sur embryons de poissons peuvent être mis en place au sein du laboratoire. Toutefois, les modèles alternatifs ne sont pas reconnus par les autorités compétentes. L’acceptation ou non du modèle alternatif (embryon) revient aux autorités compétentes.
Réduction
Utilisation du nombre minimal d'individus recommandé (7 par traitement) par la ligne directrice utilisée pour l'essai. Possibilité de mutualiser les témoins négatifs si deux essais réalisés en parallèle. De plus, les essais sur gamme complète (généralement 5 concentrations d’exposition) classiquement utilisés dans les évaluations des risques peuvent être réduits à des essais limites (1 seule concentration seuil). Ceci permet de vérifier que le modèle poisson n'est pas plus sensible que les autres organismes testés sur la même susbtance (mico-algues et invertébrés) et de réduire d'un facteur 5 le nombre de poissons utilisés.
Raffinement
Diverses stratégies d’enrichissement sont mises en place afin d’améliorer le bien-être des poissons au sein de l’environnement dans lequel ils sont hébergés avant les tests (nourriture variée et/ou vivante (exemple : daphnies, artémies…) ; environnement extérieur décoratif (couleur / poster représentation environnement marin ...)). Les poissons maintenus au laboratoire font l’objet d’un suivi régulier de leur état de santé et des caractéristiques physicochimiques de leur eau d'aquarium. Les poissons ne doivent pas être nourris durant l'essai (durée 4 jours). L'environnement n'est pas enrichi durant les tests, car non réalisable techniquement (de plus, aucun élément décoratif ne doit être ajouté afin d'éviter les relargages éventuels de matière), mais dans tous les cas la présence de témoins négatifs (non traités avec la substance) permet de vérifier tout comportement anormal qui ne serait pas lié à la substance à tester. Toutes les manipulations sont réalisées par du personnel formé.
Choix des espèces
Les espèces utilisées sont celles préconisées dans les normes imposées par les règlementations. Les poissons utilisés sont au stade juvénile (entre 1 et 3 mois).