Procédures sévères

Enfermées seules en cage pendant vingt-six semaines au maximum pour que leur prise alimentaire soit mesurée, 3 360 souris subissent des prises de sang à la mandibule ou à la queue, jusqu'à trois en quatre semaines, et pour certaines une biopsie de tissu adipeux. Elles sont toutes tuées pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, l'isolement prolongé et un jeûne pouvant atteindre seize heures constituant l'essentiel des atteintes. Le projet cherche à mettre au point une restriction intermittente en méthionine à base de protéines végétales, transposable à l'humain pour prévenir l'obésité. Le porteur écrit que ces régimes "ne doivent pas entraîner de nuisance", tout en indiquant qu'il n'est pas exclu que les souris réduisent fortement leur consommation pour des raisons de goût ou de digestibilité.

Objectifs

L’utilisation de différents types de restrictions nutritionnelles comme stratégie de nutrition préventive fait l’objet d’études depuis de nombreuses années. Il a été montré, chez la souris, qu’une restriction en méthionine, un acide aminé indispensable (AAI), était efficace pour prévenir l’obésité et le diabète de type 2. Chez l’Homme, une étude menée chez des sujets obèses montre qu’une semaine de restriction en méthionine présente des effets bénéfiques sur la régulation d’acteurs majeurs du métabolisme tels que FGF21 (Fibroblast Growth Factor 21). Le FGF21 est une hormone qui joue un rôle central dans la régulation du métabolisme. Dans le contexte de la restriction en méthionine, l’augmentation de l’expression du gène codant pour la protéine FGF21 est sous la dépendance de la protéine ATF4. Si la restriction peut être gérée par l’organisme sur le court terme, elle s’avère délétère si elle est trop importante. En conséquence, l’application à l’Homme de la restriction en méthionine n’est pas sans poser des problèmes. D’autant que ces régimes de restrictions reposent sur l’utilisation d’acides aminés libres qui rencontrerait une faible acceptabilité chez l’Homme du fait de leurs propriétés organoleptiques. Nous proposons de développer une stratégie de restriction en méthionine qui soit transférable à l’Homme. Il s’agira de résoudre les problématiques de l’utilisation des acides aminés libres dans les régimes et de la restriction continue. Il s’avère que certaines protéines végétales présentent un faible contenu en méthionine. Des données obtenues (non publiées) au sein de l’équipe montrent chez la souris que la consommation sur un repas de ce type de protéines entraine une augmentation de l’expression de gènes cibles d’ATF4 dont FGF21. De plus, une étude récente a démontré chez la souris que la consommation intermittente d’un régime à base d’acides aminés libres restreint en méthionine entrainait une sécrétion de FGF21 et une amélioration de paramètres métaboliques. Afin d’appliquer la restriction en méthionine à l’Homme, nous souhaitons développer chez la souris une stratégie de restriction intermittente utilisant une source de protéine végétale et tester son efficacité dans un modèle d’obésité.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à poser les bases d’une stratégie de nutrition préventive reposant sur la consommation de sources de protéines végétales qui soit transposable à l’homme. L’originalité de ce projet est de tirer parti de la composition déséquilibrée en AAI des protéines végétales. Ce concept d’un effet santé bénéfique des protéines végétales de par leur composition déséquilibrée n’a jamais été évalué. Les résultats obtenus à la fois chez les femelles et les mâles permettront 1) De faire la preuve de concept qu’une restriction intermittente en méthionine via la consommation de protéines végétales peut reproduire les effets d’une restriction continue en méthionine dans la prévention de l’obésité. L’objectif sera par la suite de tester cette stratégie dans des modèles animaux plus représentatifs du contexte dans lequel une telle stratégie pourrait être envisagée chez l’Homme. En effet, ce type de stratégie nutritionnelle s’adresserait à des individus présentant une prédisposition/sensibilité au développement de l’obésité. 2) De mieux caractériser chez les mammifères les effets et les mécanismes associés à la consommation d’un régime restreint en méthionine dans un contexte physiologique (régime contenant des protéines et non des acides aminés libres). Ces données permettront d’établir des pistes de recherche quant à des effets bénéfiques de la restriction en méthionine via la consommation de protéines végétales autres que la prévention de l’obésité. 3) D’identifier de nouveaux marqueurs de la restriction en méthionine associés à ses effets bénéfiques dans la prévention de l’obésité. De telles données seront précieuses pour étudier chez l’Homme ce concept de restriction intermittente en méthionine.

Procédures

L'ensemble des souris seront mises en cage individuelle, la durée maximale d'isolement sera de 26 semaines (habituation et expérimentation). Elles subiront toutes des prises de sang en sous mandibulaire, la durée de prélèvement sera de moins d’une minute. Des souris subiront des prélèvements de sang à la queue qui dureront chacun moins d’une minute. Certaines de ces souris subiront également une biopsie de tissu adipeux périgonadal qui durera environ 2 minutes. Le nombre de prélèvements sera dépendant de la durée des expérimentations, ce paramètre sera défini en cours de projet en fonction des différents paramètres métaboliques et physiologiques. Plusieurs prélèvements sanguins sur animal vigil pourront être réalisés (3 maximum sur une période de 4 semaines) un maximum de 7,5% du volume total sanguin de la souris sera prélevé avec un intervalle minimum d'une semaine entre chaque prélèvement. Le coté pour la prise de sang en sous mandibulaire sera alterné à chaque prélèvement.

Impact sur les animaux

Les nuisances que les interventions vont entrainer sont les suivantes : (1) douleur au point de piqûre d’aiguille, (2) jeûne de 16h maximum et (3) hébergement individuel pendant la durée des expériences pour les 3 procédures. Pour les expériences réalisées, les souris doivent être hébergées en cages individuelles pour éviter les interactions afin de pouvoir mesurer précisément la prise alimentaire. Les régimes de restriction à base de protéine végétales ne doivent pas entrainer de nuisance, il n'est pas exclu que pour des raisons de qualités organoleptiques ou de digestibilité les souris diminuent fortement leur consommation d'un tel régime.

Devenir

Les analyses pratiquées dans ce projet telles que la mesure de l'expression des gènes au niveau de différents organes nécessitent la mise à mort de l'ensemble des souris.

Remplacement

Ce projet consiste à développer une approche nutritionnelle de restriction en méthionine basée sur l'utilisation de protéine végétales dans un but de prévenir le développement de l'obésité. Il n’existe pas de modèle alternatif aux animaux pour réaliser ce projet. Ces travaux nécessitent également des analyses invasives (prélèvement d'organes). Il est donc indispensable d'avoir recours à l'expérimentation animale pour pourvoir mener à bien ce projet.

Réduction

Sur la base d’études précédentes, nous prévoyons un nombre d’animaux égal à 10 par groupe qui est nécessaire et suffisant pour obtenir la puissance statistique requise pour l’exploitation de nos données. Les données seront analysées statistiquement par ANOVA et/ou test de Student (traité vs témoin).

Raffinement

Durant l'étude, tout sera mis en œuvre pour minimiser le stress auquel les animaux sont soumis, notamment dû à leur isolement en cages individuelles. Des traitements analgésiques seront appliqués aux souris subissant une biopsie. Durant l'étude, tout sera mis en œuvre pour minimiser le stress auquel les animaux sont soumis, notamment dû à leur isolement en cages individuelles. Pour limiter l’isolement, des cages transparentes avec grilles mais ouvertes seront utilisées et seront disposées côte à côte pour permettre une interaction sociale (odeurs, vocalises…), des éléments d'enrichissement du milieu seront mis à disposition (tube plastique rouge et/ou bille métallique). Les points limites pour permettre de limiter la douleur à son minimum, sans remettre en cause les résultats du projet, sont : une perte de poids supérieur à 20% du poids initial, un arrêt de l’alimentation pendant plus de 2 jours ou un signe de souffrance (prostration, poil hérissé et toutes modifications comportementales traduisant une souffrance). Des anesthésies à l'Isoflurane ou Zoletil/Xylasine seront réalisés lors des biopsies durant une procédure ou des prélèvements d’organes à l’issue des procédures

Choix des espèces

Ce projet propose de développer une nouvelle stratégie de restriction en méthionine. Jusqu’à présent la très grande majorité des études visant à caractériser les effets bénéfiques de la restriction en méthionine sur le métabolisme ont été réalisées chez les rongeurs. Ces derniers sont les modèles les plus adaptés dans les études abordant des problématiques de nutrition et de métabolisme à visée humaine et nécessitant un nombre important d'animaux. Le choix de la souris se justifie notamment par l'utilisation d'un modèle transgénique dans cette étude (GCN2 KO). Les souris seront utilisées au stade adulte. L'objectif de ce projet est de développer à terme une stratégie nutritionnelle de restriction chez l'Homme. En l'état actuel des connaissances les stratégies de restrictions nutritionnelles sont envisageables principalement chez l'adulte et non chez l'individu en croissance.

2 400 rongeurs, 1 200 souris et 1 200 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Sous anesthésie de cinq à dix minutes, chacun est tatoué et reçoit une plaie par biopsie de la peau, parfois une greffe de cellules ou de tissus, parfois la pose d'un cathéter dans un vaisseau pour perfuser des substances en continu, avec jusqu'à quatre administrations par jour et des prises de sang répétées. Le porteur classe le projet en souffrance sévère à cause de la durée d'isolement des animaux, et annonce des retombées pour le psoriasis, la dermatite atopique ou les plaies liées au diabète. Il conclut que la cicatrisation ne peut pas être reproduite in vitro parce qu'elle s'accompagne de modifications physiopathologiques et micro-environnementales spécifiques.

Objectifs

Le projet vise à explorer de nouvelles approches pour accélérer et optimiser la cicatrisation. Il existe une variété de modèles précliniques possibles qui peuvent être utilisés pour imiter des plaies aiguës ou chronique, par exemple liées au diabète ou à la nutrition. Celles-ci peuvent être induites par de nombreuses techniques différentes, l'excision ou l'incision étant les plus courantes. Une amélioration des méthodes de cicatrisation est particulièrement importante lors de pathologie aigus ou chronique comme le diabète. Parmi les modèles de cicatrisations, le modèle de cicatrisation excisionnelle est souvent utilisé et présente un intérêt pour évaluer des substances pharmacologiques permettant d'améliorer la cicatrisation. L’objectif est d’identifier de nouvelles stratégies pour favoriser sur la régénération tissulaire et la réduction des cicatrices. En intégrant des techniques biomédicales avancées, telles que la thérapie génique, la médecine régénérative, et les biomatériaux innovants, des substances innovantes ces tests permettront de comprendre les mécanismes sous-jacents du processus de cicatrisation chez les rongeurs pour améliorer à terme la qualité et la vitesse du processus de guérison chez le patient et donc améliorer la qualité de vie des ceux-ci.

Bénéfices attendus

Ces différents modèles sont nécessaires à la découverte et la mise sur le marché de nouveaux médicaments sûrs et efficaces pour traiter certaines affections cutanées (psoriasis, allergie, dermatite atopique, démangeaisons) ou améliorer la cicatrisation. Par exemple, même si les corticoïdes, appliqués par voie topique ou orale, sont fréquemment utilisés pour traiter de nombreuses affections cutanées, ces derniers ne restaurent pas la barrière que constitue l’épiderme. Leur utilisation est de plus fréquemment accompagnée d’une immunosuppression, ce qui a pour conséquence de prolonger leur utilisation à des doses fortes entrainant ainsi de nombreux effets secondaires (atrophie de la peau, augmentation du risque d’infection). Pour ces raisons, de nouveaux traitements, sans effets secondaires majeurs, sont en développement.

Procédures

Les animaux subiront une anesthésie d’environ 5 à 10 min pendant laquelle ils seront tatoués et les biopsies seront réalisées. Des greffes de cellules ou tissus pourront être réalisés et demanderont une anesthésie gazeuse complémentaire de 10 minutes. Pour le suivi du poids des animaux et de taille des plaies ainsi que l’administration de substances, les animaux seront contentionnés pendant 2 à 3 minutes ou anesthésiés pendant 5 minutes (anesthésie gaseuse avec un maximum de 5 fois/semaine) pour les imageries. Les mesures du poids des animaux (1 minute) seront réalisées jusqu’à 3 fois par semaine. Les administrations d’éléments d’essai pourront être réalisées jusqu’à 4 fois par jour (environ 1 minute par administration). De plus, une procédure de cathétérisation de vaisseaux sanguins sous anesthésie gazeuse pourra être aussi réalisée afin de réaliser des infusions de substances en continu, procédure d’une durée de 10 minutes. Des prélèvement de sang pourront être réalisés sous anesthésie gazeuse, procédure d’une durée de 10 minutes, ou sans anesthésié sous contention, procédure d’une durée de 2 à 3 minutes Ces actes sont réalisés sur l’ensemble des animaux par étude.

Impact sur les animaux

Plusieurs effets indésirables inhérents au processus inflammatoire ou une gêne induite par la cicatrisation pourront apparaître pendant une étude comme une potentielle douleur et/ou démangeaison post-opératoire niveau de la zone de cicatrisation ou de la température. De plus, un stress pourra être généré par une phase d’isolement des animaux, de chirurgie, de prélèvement sanguin ou d’administration de substances.

Devenir

La procédure de cicatrisation chez le rat et la souris est classée sévère du fait de la durée d'isolement des animaux. De plus, des prélèvements terminaux (comme la peau, du sang …) seront généralement réalisés pour analyse à la fin de la procédure. Ainsi, les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure car elle ne permet pas un maintien des animaux en vie dans de bonnes conditions de santé.

Remplacement

Ce modèle ne peut pas être remplacé par des méthodes alternatives car la cicatrisation s'accompagne de modifications physiopathologiques et micro-environnementales spécifiques ne pouvant actuellement pas être reproduites in-vitro, ces modifications étant nécessaires pour l'étude des efficacité. De plus, les traitements utilisés subissent toutes les différentes phases incluant administration, distribution, métabolisme et élimination, étapes ne pouvant être reproduites in-vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour chaque test sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet, la comparaison par rapport à une substance de référence, et un effectif suffisant de façon à obtenir une puissance statistique suffisante pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des tests. Dans cet objectif, une analyse sera réalisée afin d’estimer le nombre d’animaux nécessaire pour observer une cicatrisation efficace mesurée d'au moins 50% par rapport au groupe contrôle.

Raffinement

Le raffinement des méthodes expérimentales afin de réduire au maximum la souffrance animale est mis en œuvre grâce à l'utilisation de points limites clairement établis (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids, …), permettant d'euthanasier tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse. Le programme d’anesthésie, d’analgésie et de chirurgie (incluant oxygène à concentration ajustable et des tapis chauffants) est défini en accord avec un vétérinaire et/ou la cellule bien-être, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. Il est aussi mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de jouets, litière, objets de nidification, objets à ronger ou mastiquer, présence de congénères.... En cas de doute, une évaluation approfondie sera réalisée quotidiennement jusqu’à normalisation ou jusqu’à atteinte des points limites. Tous les points limites et leur cotation sont décrits dans un formulaire interne. Cette observation inclue une surveillance de l'aspect général, l’aspect du pelage, des yeux, la posture, les réactions de l’animal sous stimulation, la respiration l’appétit, l’état d’hydratation, les tremblements ou convulsions… Une évaluation interne incluant la cellule de bien-être animal pourra permettre de réévaluer et d’adapter à postériori la catégorie si nécessaire.

Choix des espèces

La cicatrisation représente un processus complexe impliquant une série de mécanismes de signalisation cellulaire entrainant une prolifération cellulaire et un inflammation. Aujourd’hui encore, les rongeurs rats et souris demeurent essentiels afin d’étudier les processus de cicatrisation et comprendre les mécanismes moléculaires impliqués. De plus, le choix des espèces est basé sur la bibliographie scientifique, les modèles expérimentaux étant largement décrits chez le rat et la souris. Principalement rongeurs sevrés, âge variant entre 3 semaines et 6 mois, conformément aux données historiques, à la bibliographie scientifique.

Un rein retiré en début d'expérimentation pour concentrer l'action des anticorps sur celui qui reste, puis six injections d'anticorps humains dans le sang en soixante-dix jours et des prélèvements de sang et d'urine deux fois par semaine : six minipigs adultes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur attend des dépôts dans les glomérules et une perte de fonction rénale, et fixe comme critères de mise à mort une perte de 20 % du poids en 72 heures, une protéinurie supérieure à 3 g/L ou une immobilité totale de plus de 24 heures. Une première étude pilote menée sur des hamsters n'avait produit aucun signe clinique, ce qui a conduit l'équipe à passer au porc. Tous les minipigs sont tués à l'issue, leurs organes servant à établir le lien entre ces anticorps et l'atteinte rénale.

Objectifs

La polyneuropathie démyélinisante chronique (PIDC) est une maladie auto-immune du système nerveux. Plusieurs cibles des anticorps dirigés contre soi ont été découvertes, parmi lesquelles des protéines présentes sur les neurones. La survenue concomitante chez certains patients d’une maladie neurologique et d'une maladie auto-immune du rein, pouvant aller jusqu’à la perte totale de la fonction rénale, est connue de longue date. Ces deux maladies (neurologique et rénal) concomitantes ont souvent été décrites, mais leur lien n'a jamais été établi. L’objectif principal de cette étude pilote est de confirmer, sur un modèle porcin, l'implication des anticorps auto-immuns dans cette maladie rénale en reproduisant la maladie chez le porc. De plus, il s'agit d’analyser les dysfonctionnements aux niveaux clinique et tissulaire provoqués par ces anticorps, afin de mieux connaître cette maladie et d'améliorer ensuite le diagnostic et les traitements chez l'homme.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de confirmer le caractère pathogène des anticorps dirigés contre certaines protéines dans le développement d’une atteinte rénale. Nous espérons démontrer que l’injection des anticorps induit des modifications biochimiques (protéinurie, élévation de la créatininémie) et histologiques (dépôts dans les glomérules) chez le porc, conduisant au développement d’une maladie rénale. Ce travail de recherche ouvrira de nouvelles perspectives dans le dépistage de l'atteinte rénale de cette maladie et sur la prise en charge thérapeutique.

Procédures

Les animaux seront impliqués dans une seule procédure qui se déroulera en plusieurs étapes sur une durée de 70 jours. Des injections d'anticorps dans la circulation sanguine des animaux auront lieu 6 fois au cours des 70 jours pour induire une maladie rénale. Des prélèvements sanguins et urinaires auront également lieu deux fois par semaine jusqu'à la fin de l'étude. Les injections et les prélèvements réalisés deux fois par semaine ne dureront pas plus de 10 minutes. Les animaux seront anesthésiés pour chaque intervention afin d'éviter la douleur et diminuer leur angoisse. L'un des deux reins des animaux sera retiré en début d’expérimentation pour optimiser l’action des anticorps sur le rein restant. Cette chirurgie ne durera pas plus d'une heure et sera réalisée sous anesthésie générale avec une gestion rigoureuse de la douleur.

Impact sur les animaux

Pour les porcs ayant reçu des injections d'anticorps, des nuisances liées à l'apparition d'une maladie rénale et/ou neurologique peuvent apparaitre. Cependant, grâce à notre expérience clinique acquise auprès des patients présentant cette symptomatologie et dans le but de préserver le bien-être des animaux, nous avons prévu de mettre en place des critères d’interruption des interventions expérimentales basées sur des paramètres mesurables non invasifs. Une perte de poids de 20 % par rapport au poids des 72h précédentes, une protéinurie glomérulaire supérieur à 3g/L, ou une détérioration de l’état général de l’animal avec immobilité totale de plus de 24h (risque d'escarres) seront des critères d’euthanasie.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure. Les animaux ne pouront pas être réutilisés, replacés ou adoptés puisque leurs organes sont nécessaires à l'étude de la pathogénicité des anticorps.

Remplacement

L’objectif principal de cette étude est de démontrer que l’injection d'anticorps humains induit chez le minipig des modifications biochimiques quantifiables (protéinurie, majoration de la créatinémie et baisse de l’albuminémie) similaires à celles observées chez l’homme et conduit à une maladie rénale histologique. Les modèles in vitro ne permettent pas de prendre en compte l’atteinte de différentes structures du rein ni des autres organes. Cette étude ne peut pas se limiter à une approche cellulaire in vitro ou à d'autres alternatives. Le modèle minipig a été choisi car la validation in vitro de la capacité des anticorps humains à reconnaître la protéine ciblée sur des tissus nerveux et rénaux s'est avérée concluante sur ces animaux.

Réduction

Le modèle de minipig visant à recréer une maladie rénale avec des injections d'anticorps étant unique, il est difficile de prévoir quels seront les changements sur les différents paramètres cliniques et anatomopathologiques testés. Le nombre d’animaux a été réduit à 3 animaux par groupe, soit 6 animaux au total, pour la réalisation de cette étude pilote. C’est un test de faisabilité visant à induire cliniquement une maladie rénale avec des anticorps sur un minimum d’animaux.

Raffinement

Nous attachons une grande importance aux conditions d’hébergement et à la qualité de vie des animaux. Ainsi, une période d'acclimatation d'une semaine sera mise en place à l’arrivée des animaux. Ils seront hébergés en groupe afin de limiter leur stress. Une zone de repos couverte de litière, permettant de s'allonger tous ensemble et de répondre à leur comportement de fouissement, leur sera accessible. De plus, ils auront des jouets suspendus à mordiller. Lors des phases d'injections de substances et de prélèvements, une anesthésie courte sera réalisée afin de prévenir la souffrance et l’angoisse de l’animal. Pour l'opération chirurgicale, une anesthésie générale et une gestion rigoureuse de la douleur seront mises en place. Nous avons prévu de mettre en place des critères d’interruption des interventions expérimentales basés sur des paramètres mesurables non invasifs. Une perte de poids importante, une baisse de la fonction rénale, une infection ou une détérioration de l’état général de l’animal avec immobilité seront des critères d’interruption.

Choix des espèces

Nous avons préalablement recherché in vitro la présence de la protéine cible dans les reins des animaux utilisés en routine dans les animaleries : souris, rats, lapins et cochons d’Inde, mais aucun d’entre eux ne l'exprime. Seuls le hamster et le porc expriment cette protéine dans leurs reins. Une première étude pilote a déjà été réalisée sur le hamster. Celle-ci a montré une absence de signes cliniques pathologiques suite aux injections d’anticorps, probablement due à la faible concentration de cette protéine dans les reins de ces animaux, contrairement à l’Homme et au Porc. Notre choix s'est donc ensuite porté sur le modèle porcin, car il est plus représentatif de l'Homme. Nous travaillerons sur des minipigs car cela permettra d'avoir des animaux adultes (24-30 mois) afin de correspondre à l'âge des patients humains souffrant de maladies neurologiques et rénales simultanément.

Rendus dépendants à l'alcool par consommation libre, inhalation de vapeurs ou injections dans l'abdomen, puis maintenus seuls en cage pendant huit semaines à un an, 4 480 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue. Une partie reçoit des canules implantées dans le crâne sous anesthésie, passe jusqu'à six IRM de deux heures et subit des tests de compulsion où l'accès à l'alcool s'accompagne de chocs électriques ou d'un goût amer de quinine. L'alcoolisation commence à quarante-cinq jours, ce qui correspond au milieu de l'adolescence chez le rat, et se poursuit jusqu'à un an. Le porteur écrit que la consommation volontaire d'alcool "ne conduit à aucune souffrance ou douleur" chez ses animaux et compare les chocs électriques à l'électricité statique ressentie en sortant d'une voiture, dans un projet qu'il classe lui-même en souffrance sévère.

Objectifs

Nos objectifs scientifiques sont de découvrir le rôle du système glymphatique dans l’addiction à l’alcool, aussi nommée le « Trouble de l’Usage d’Alcool » (TUA), d’étudier les atteintes du système glymphatique provoquées par l’alcool et d’étudier si des molécules thérapeutiques potentielles améliorant le fonctionnement du système glymphatique peuvent diminuer les symptômes de l’addiction. Le TUA reste aujourd’hui un défi pour la santé publique à l’échelle internationale, étant donné les conséquences sanitaires de la consommation d’alcool (cancers, maladies cardiovasculaires et digestives, déficits cognitifs, démences précoces et troubles neurocomportementaux). L’addiction est marquée par le passage d'une consommation hédonique à une consommation compulsive avec perte du contrôle de sa consommation, conduisant peu à peu le patient dans un cycle pathologique de phases d’abstention et de rechute. Pendant les phases d’abstinence, l’individu expérimente un syndrome de sevrage fortement aversif et dysphorique qui précipite la rechute. Notre hypothèse de travail propose que l’amélioration du fonctionnement du système glymphatique pourrait constituer une piste thérapeutique pour traiter les symptômes spécifiques de l’addiction (par exemple, la compulsion, les rechutes) mais également les troubles cognitifs et anxieux observés dans le TUA. Le système glymphatique vient compléter la barrière hemato-encéphalique et permet l’existence d’un flux de liquide cérébrospinal dans le parenchyme cérébral, qui permet le drainage des déchets métaboliques . Il a été montré que ce système est impliqué dans les pathologies neurodégénératives (Alzheimer par exemple) provoquant une accumulation de déchets et une neuroinflammation causant la mort neuronale. Or, dans le cadre du TUA, l’alcool provoque le développement de démences précoces (encéphalopathie de Wernicke et syndrome de Korsakoff), ainsi que de la neuroinflammation. Par ailleurs, des études ont montré qu’un potentialisateur de la circulation de liquide cérébrospinal permet de réduire la sévérité du syndrome de sevrage. Nous souhaitons tester dans quel mesure le système glymphatique serait impliqué dans les troubles addictifs, anxieux et cognitifs présents chez les patients atteint de TUA.

Bénéfices attendus

Le rôle du système glymphatique dans la mise en place de l'addiction à l'alcool, dans le maintien des comportements addictifs et en tant que piste thérapeutique anti-addiction n'a jusqu'ici pas été exploré. Ceci est en particulier dû au fait que ce système a été découvert récemment, pendant la décennie 2012-2022. Les travaux publiés montrent que le système glymphatique est très important dans la gestion de la neuro-inflammation cérébrale. Or cette dernière est un élément clé dans le développement et le maintien des pathologies addictives. Du fait de notre expertise dans la mise en place des modèles animaux d'addiction à l'alcool et de la possibilité d'accéder à leur étude par IRM petit animal, nous pensons que ce projet pourrait conduire à des résultats enrichissants sur la physiopathologie de l'addiction à l'alcool et conduire à de nouvelles approches thérapeutiques, non seulement pour traiter l’envie irrépressible de consommer, le risque de rechute et favoriser la réduction des consommations, mais également pour prendre en charge les déficits cognitifs présents chez les patients souffrant du TUA.

Procédures

Les animaux seront exposés à l'alcool par différents biais (consommation libre, inhalation ou injection) sur des périodes allant de 8 semaines jusqu'à 1 an. Certains animaux subiront une chirurgie sous anesthésie générale et avec analgésie pré-opératoire pour l'implantation de canules (environ 30 min) dans des zones d'intérêt (structure cérébrale ou cisterna magna). A la suite de quoi les rats seront soumis à des tests comportementaux (anxiété, cognition et addiction) et, éventuellement, des prélèvements sanguins sous anesthésie générale (environ 2 min, maximum 6/rat, 2 semaines minimum entre chaque prélèvement). Lors de l'acquisition d'image par IRM (environ 2 heures, maximum 6 acquisitions par rat sur une vie entière), les animaux seront anesthésiés par voie gazeuse pour éviter tout mouvement.

Impact sur les animaux

Les animaux seront isolés pendant toute la durée de l'expérimentation (8 semaines à 1 an), ce qui peut entraîner un stress social chez le Rat. D'expérience, les étapes de consommation volontaire d'alcool ne conduisent à aucune souffrance ou douleur chez nos animaux. Les phases qui vont faire subir aux rats une certaine douleur sont : - les procédures chirurgicales visant à implanter des canules intracrâniennes. Il s’agit ici uniquement de douleurs post-opératoires de cicatrisation, le port de canules intracérébrales pendant plusieurs mois n’entrainant pas de douleur. - les injections intra-péritonéales répétées. Les phases qui vont faire subir aux rats un certain inconfort sont : - les chocs électriques, (réglés à une faible intensité, évoquant une sensation désagréable mais non douloureuse comparable à celle de l’électricité statique sur une voiture après un trajet, utilisés lors des tests de compulsion) - L’inconfort engendré par l’absorption de quinine lors des tests d’aversion. - L’inconfort engendré par les phases de sevrage et de privation d’alcool.

Devenir

Afin d'analyser les cerveaux des animaux, nous devons réaliser leur mise à mort pour prélever les cerveaux.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode de substitution aux expériences comportementales: Nous n'avons pas à notre disposition de modèle computationnel ou in vitro des symptômes du Trouble de l'Usage d'Alcool, des troubles cognitifs et mnésiques ni des troubles anxieux. Pour les aspects neurochimiques, nous ne disposons pas de modèle in vitro ou computationnel des mécanismes d’adaptations neuronales induites dans le cerveau par l'usage excessif et prolongé d'alcool pendant plusieurs mois. Notre recherche vise à caractériser le fonctionnement du système glymphatique sans alcool et chez le rats rendus dépendants à l'alcool , pour lequel nous ne disposons pas de modèle computationnel à ce jour.

Réduction

Pour réduire au minimum le nombre de rats, les groupes seront constitués de 10 rats pour un groupe expérimental donné. Pour les expériences comportementales de mémoire (comme par exemple le test "Reconnaissance d'un nouvel objet"), le nombre de rats sera augmenté à n=12 en raison des fortes variabilités interindividuelles. Pour les expériences incluant la tâche d’apprentissage de l’auto-administration et la tâche de compulsion, que certains rats n’apprennent pas, on augmente le n à 18 rats par groupe pour n=12 à la fin. L'étude par IRM de flux (Imagerie par Rénonance Magnétique),est une IRM fonctionnelle sur l'animal vivant. Aussi cette approche nous permettra d’étudier le même animal à plusieurs étapes du protocole, ce qui permet de REDUIRE le nombre d’animaux étudiés car il n’est pas nécessaire d’euthanasier les rats à chaque temps étudié. Nous avons prévu d’étudier 10 molécules d’intérêt différentes. Les 3 premières sont 1. un amplificateur du système glymphatique , 2. un amplificateur du courant hydrique généré par les aquaporines et 3. un agent anti-inflammatoire, ce dernier ayant déjà fait l’objet de publications au laboratoire. Ces 3 molécules sont bien identifiées, non toxiques, et un intérêt thérapeutique est pressenti au vu des analyses bibliographiques. Si les résultats obtenus sur ces 3 premières cohortes montrent une efficacité sur l’addiction, alors nous poursuivrons l’étude de leurs mécanismes d’action sur les 7 autres cohortes avec des molécules analogues connues, de façon à identifier la cible pharmacologique précise de l’effet obtenu. Les cohortes ne seront pas utilisées pour une étude toxicologique de molécules inconnues. Les doses toxiques des substances étudiées et les gammes de doses efficaces seront trouvées dans la littérature scientifique.

Raffinement

Les 3 modèles animaux utilisé (le modèle d’inhalation de vapeurs d’alcool ; le modèle EPA; l'intoxication par injection intrapéritonéale d'alcool), sont hautement validés dans la littérature scientifique pour fournir des supports efficaces de mise au jour de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le domaine des addictions. Pour raffiner notre méthodologie, nous incluons des critères d'interruption d’expérimentation. En cas de signes de souffrance, une analgésie sera mise en place. La persistance de signes de douleur, entrainera une décision de mise à mort de l'animal. Les méthodes d’anesthésie et de mise à mort seront effectuées dans des conditions réduisant au maximum le stress. Pour limiter le stress provoqué par l’isolement des rats, nous mettrons en place un enrichissement inter- espèce. Notre mode expérimental d'étude par IRM fonctionnel (ici, l'IRM de flux) nous permet de RAFFINER notre mode expérimental avec une méthodologie non invasive. Toutes les procédures chirurgicales seront réalisées avec des soins permettant de réduire au maximum la douleur pendant et après l'opération. Dans le but d’améliorer la condition des animaux, nous réaliserons un enrichissement inter-espèces lors des périodes d’isolement et un enrichissement environnemental sera installé dans les cages (tube carton et bâtonnets de bois à ronger) durant toute la vie des rats, en plus de leur litière de rafle de maïs (COB12 de serlab)..

Choix des espèces

L’espèce que nous utiliserons est le Rat. Nous réaliserons trois modèles reproduisant les symptômes de l’addiction chez le Rat : Le modèle dit d'inhalation de vapeur d'alcool; le modèle "d'Effet de Privation d'Alcool" (EPA), et le modèle par injections intrapéritonéales d'alcool. Le choix de l’espèce Rat est motivé par des travaux précédents qui ont montré la forte validité de ces modèles dans la recherche de nouveaux traitements. Dans le modèle EPA, le choix du Rat est motivé par le fait que les Rats présentent des comportements plus stables que la Souris. Dans le contexte des addictions, plusieurs symptômes de l’addiction sont évalués par le test comportemental d’auto-administration opérante d’alcool, ou l’on propose à l’animal de travailler (en appuyant sur une pédale dans une enceinte d’auto-administration) de façon à obtenir une « récompense » (ici, l'éthanol). Pour ces tests, le gold standard est le modèle « Rat ». Nous allons réaliser notre étude sur des rats âgés environ de 45 jours au début des administrations d'alcool: cet âge correspond au milieu de l'adolescence du rat, qui s'étend de 30 à 60 jours. Cette période correspondant environ chez l'Homme à l’âge de 16-18 ans. Les rats seront gardés au laboratoire jusqu’à l’âge maximum de 1 an, et les expériences d'IRM, de comportement seront réalisées sur les rats adultes. En France en 2022, 80 % des jeunes de 17 ans ont consommé de l'alcool au moins 1 fois dans l'année passé et 36% des personnes de 17 ans ont connu au moins une ivresse dans le dernier mois (publication OFDT 2023). L'age précoce des premières alcoolisations est une donnée épidémiologique classique en Europe et constitue d'ailleurs un facteur de risque supplémentaire pour devenir alcoolodépendant : 10% de risque d'avoir un TUA en population générale, contre 15 % de risque si les premières alcoolisations ont eu lieu avant 15 ans. Dans notre objectif de modéliser la pathologie alcoolique, nous allons donc commencer les premières expositions à l'alcool chez des rats adolescents, pour mimer les caractéristiques épidémiologiques de l'addiction à l'alcool.

Injectées d'hormone à trois reprises pour développer leur endomètre, puis tuées pour qu'on le leur prélève, des souris donneuses fournissent les fragments utérins qu'on injecte dans l'abdomen d'autres souris, munies la veille d'une mini-pompe implantée sous anesthésie. 2 400 souris femelles vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur attend une perte de poids d'environ 15 % et une douleur persistante, qu'il mesure jusqu'à trois fois par semaine au filament de Von Frey et sur plaque chauffante, une heure par séance. La mise à mort sert à récupérer les organes et de grands volumes de sang, pour juger de l'effet de molécules candidates sur une endométriose provoquée en laboratoire.

Objectifs

L’endométriose est une maladie touchant environ 10% des femmes en âge de procréer. En France, il est estimé que 2.5 millions de femmes sont touchées. Il s’agit d’une maladie inflammatoire chronique de l’appareil génital féminin se caractérisant par une dissémination et un développement de muqueuse utérine (endomètre) en dehors de l’utérus. Les lésions peuvent se situer au niveau de la paroi musculaire de l’utérus (myomètre), des ovaires, ou dans la paroi abdominale sur le péritoine. Ces lésions sont associées à de la fibrose. Cette maladie entraîne des douleurs cataméniales importantes (dysménorrhée), des douleurs pelviennes, abdominales, ombilicales, lombaires chroniques, et une infertilité. Il n’existe pas à ce jour de traitement de l’endométriose, d’où l’importance de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Ce projet a pour but de développer un modèle murin (souris) d’endométriose profonde, la forme la plus grave d’endométriose. L’objectif est donc d’obtenir des lésions d’origine endométriale, encapsulées dans les tissus et/ou organes abdominaux environnants, et présentant des signes de métaplasie en muscles lisses, et des signes de fibrose importants. Une étude pilote sera réalisée afin de vérifier l’induction d’endométriose et que ces lésions remplissent les critères de l’endométriose profonde. Dans un second temps, des candidats de traitement de l’endométriose seront administrés aux animaux afin de tester leur efficacité.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de tester de nouveaux agents chimiques ou biologiques candidats pour une utilisation en préventif ou en curatif sur l’endométriose profonde. A terme, cela permettra l’introduction en clinique de nouvelles stratégies thérapeutiques pour cette maladie pour laquelle les options sont pour le moment limitées voire absentes.

Procédures

Ce projet vise à tester des molécules chimiques ou biologiques dans un modèle d’endométriose chez la souris. Pour mettre en place l’endométriose, un groupe de souris donneuses recevra trois injections de benzoate d’estradiol à D-7, D-5, D-3 qui développeront l’endomètre, puis ce groupe sera euthanasié pour récupération du tissu utérin. Plusieurs groupes de souris receveuses seront pourront être implantés ou non avec une mini-pompe osmotique délivrant de la substance P ou du sérum physiologique à D-1,. La pose sera réalisée sous anesthésie générale, avec administration d’analgésiques : dérivé morphinique (Buprénorphine) et alpha2. La plaie sera ensuite désinfectée régulièrement et un cicatrisant (Dermaflon crème) pourra être appliqué. Si besoin, la suture sera reprise sous anesthésie à l’isoflurane. Ces souris recevront ensuite à D0 une injection intrapéritonéale de fragments utérins issus des souris donneuses. La substance P participera à la mise en place de l’inflammation caractéristique de l’endométriose. Les souris receveuses pourront recevoir un composé chimique ou biologique à tester, ou un placebo : Administrations intra veineuses, intra vaginales, intrapéritonéales, sous cutanées sous anesthésie générale si nécessaire ; intra musculaires, intra dermiques sous anesthésie générale avec analgésie systématique (buprénorphine) Administration per os : gavage sous contention Des tests visant à quantifier la douleur abdominale des animaux seront réalisés (1 heure maximum par animal, maximum 3 fois par semaine). Des prélèvements de sang et de tissu (après la mort) pourront être réalisés in vivo afin de doser des paramètres d’intérêt de la maladie et donc d’évaluer l’efficacité des composés administrés sur le développement de l’endométriose. Tous les animaux seront euthanasiés en fin de protocole.

Impact sur les animaux

Dans ce modèle, nous suspectons une douleur persistante modérée ou sévère transitoire, et des pertes de poids transitoires, c’est pourquoi il sera classé en sévère. Ce degré sera revu suite à l’étude pilote. Nous nous attendons à observer une perte de poids transitoire chez les animaux du fait de l’inflammation générée, environ 15%, au début de l’induction de la maladie (pendant la première semaine), avec ensuite une reprise de poids. Nous nous attendons aussi potentiellement à observer des signes de douleur chez les animaux, en particulier au début de l’induction de la maladie. Des tests de douleur pourront être réalisés et génèreront un stress et une douleur modérée. En début d’étude, les animaux seront randomisés pour créer des groupes homogènes en poids, ce qui sera à l’origine de remaniements des groupes et donc un stress léger. La pose de mini pompe osmotique nécessitera une cicatrisation de la plaie chirurgicale suturée.

Devenir

Après les procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’efficacité des composés testés sur la maladie d’intérêt.

Remplacement

Les molécules chimiques ou biologiques qui seront évaluées dans ce projet auront dans la mesure du possible été au préalable sélectionnées dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité apparente. Elles auront si possible aussi été sélectionnées sur leurs propriétés pharmacocinétiques in vivo. Cependant, l’ensemble de ces données est insuffisant pour prédire l’efficacité in vivo des molécules, car recréer in vitro une pathologie complexe est difficile, notamment lorsque différents types cellules et/ou tissus sont impliqués. L’efficacité réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée in vivo en choisissant le modèle animal se rapprochant le plus de la pathologie telle que décrite chez la femme.

Réduction

Un nombre minimum de 8 souris receveuses adultes par groupe sera par exemple nécessaire pour pouvoir observer une réduction significative de l’étendue des lésions et de leur fibrose suite à un traitement. Ce nombre pourra monter jusqu’à 16 en cas d’ajout d’autres paramètres devant être mesurés comme le dosage des cytokines, d’autres colorations en histologie et/ou l’expression de gènes dans les lésions, certaines analyses étant incompatibles les unes avec les autres. Cette analyse sera effectuée au moyen du test ANOVA. Par ailleurs, on comptera entre une et deux souris donneuses par souris receveuses selon le nombre de lésions visées par receveuse.

Raffinement

Le poids des animaux sera suivi au moins 2x/semaine, et quotidiennement en cas de perte de poids >10%. En cas de perte de poids constatée >10% sur certains animaux, un gel nutritif ou de l’eau gélifiée et de la nourriture seront placés au fond de toutes les cages. Les pertes de poids >20% ou persistantes (15 à 20% pendant 3 jours consécutifs) seront un point limite. Indépendamment des tests comportementaux (Von Frey, hotplate), une grille de scoring de douleur a été mise en place et sera raffinée après la première étude (cf procédure). Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Un système d’alerte est mis en place pour statuer sur la mise à mort de l’animal. Nous nous attendons aussi potentiellement à observer des signes de douleur chez les animaux, en particulier au début de l’induction de la maladie. Dans ce cas, un traitement antalgique (buprénorphine) pourra être administré. Les AINS seront évités afin de ne pas modifier l’induction de la maladie. En cas de test de hotplate, un animal ne présentant pas de réponse au test sera systématiquement retiré de la plaque au bout d’une minute de contact. Une habituation à la plaque la veille sera prévue (30 secondes à une minute). Une habituation au plancher grillagé du test de Von Frey sera prévue la veille (30min) et sera mise en place avant les tests à chaque mesure (30min). En début d’étude, les animaux seront randomisés pour créer des groupes homogènes en poids, ce qui sera à l’origine de remaniements des groupes. Les animaux seront surveillés afin de détecter des signes d’agressivité ou de stress. Les animaux agressifs seront séparés de leurs congénères, et en cas de stress des enrichissements supplémentaires seront apportés. Les animaux seront monitorés matin et soir. La pose éventuelle de mini pompe osmotique nécessitera une cicatrisation de la plaie chirurgicale suturée. La plaie sera inspectée quotidiennement jusqu’à complète cicatrisation. En cas de besoin, une désinfection pourra être réalisée, ainsi que l’application d’une crème cicatrisante. En cas de déhiscence de plaie dans les trois jours post-chirurgie, la plaie pourra être reprise en suture. En cas de non cicatrisation de la plaie et de persistance au-delà d’une semaine d’une plaie déhiscente, l’animal concerné sera euthanasié.

Choix des espèces

- Les modèles d’endométriose sont bien documentés chez la souris. - Les études de toxicité pour toute nouvelle molécule chimique ou biologique devant être réalisées a minima sur une espèce rongeur (par exemple la souris), la connaissance de la dose active dans un modèle rongeur (par exemple la souris) est une donnée critique qui permet de calculer la fenêtre thérapeutique entre la dose active sur la pathologie et la dose toxique dans la même espèce. Des femelles sevrées (jeunes adultes de plus de 6 semaines) seront utilisés, le modèle d’endométriose profonde étant bien décrit chez les animaux adultes.