Procédures sévères
Etude d’hydrogels théranostiques en cancérologie
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
Pour tester un réservoir de médicament injecté au cœur d'une tumeur cérébrale, 513 rats reçoivent une greffe intracrânienne de cellules tumorales, dont 504 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. L'injection de cellules ou d'hydrogel dure dix minutes, suivie de trois séances d'imagerie IRM et rayons X d'une heure à une heure trente sous anesthésie. Le porteur indique que la croissance tumorale provoque une douleur modérée et une perte de poids à partir de deux semaines après l'implantation, et prévoit d'injecter des deux côtés du cerveau quand c'est possible pour que chaque animal apporte deux informations au lieu d'une. Tous sont tués pour prélever les cerveaux, une grille de cotation de la douleur déclenchant la mise à mort de ceux qui atteignent un point limite.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer une nouvelle stratégie de traitement des tumeurs cérébrales. Celle-ci consiste à injecter au cœur de la tumeur un réservoir à médicament qui permet de libérer le médicament au fil du temps. La réponse au traitement anti-cancéreux est suivi par imagerie en temps réel. Ce suivi par imagerie pendant le traitement anti-cancéreux pourrait permettre d’obtenir une évaluation immédiate de l’effet du médicament.
Bénéfices attendus
Le bénéfice est que ce nouveau mode de traitement directement dans la tumeur du cerveau devrait maximiser l’efficacité thérapeutique du médicament anti-cancéreaux tout en minimisant les effets secondaires. Les cancers du cerveau (tumeurs cérébrales) sont parmi les cancers les plus fréquents chez les enfants. Ils sont une cause de mortalité et de morbidité importante tant chez l’enfant que chez l’adulte. La mortalité des tumeurs cérébrales agressives (type glioblastome) est systématique et rapide. La durée de survie de patients atteints de tumeur cérébrale aggressive est d’environ 15 mois, et il n’existe aucune stratégie thérapeutique efficace à ce jour. Il est donc urgent de développer de nouveaux traitements, permettant de mieux prendre en charge les patients.
Procédures
L’étude implique une injection de cellules tumorales et / ou une injection d’hydrogel (durée de l'injection : 10 min). L’étude implique également la réalisation de 3 sessions d’imagerie durant entre 1h et 1h30 (imagerie IRM et rayons X), réalisées sous anesthésie également.
Impact sur les animaux
La greffe intracrânienne de cellules tumorales, conduite sous anesthésie, engendre une douleur modérée – La procédure expérimentale d'IRM, qui sera utilisée pour caractériser la tumeur, engendre une douleur légère et est conduite sous anesthésie. La phase terminale est réalisée sous anesthésie profonde (procédures sans réveil) – la croissance tumorale engendre une douleur modérée et fait l'objet d'un suivi et d'une grille de points limites particulière.
Devenir
Les animaux ayant suivi l'ensemble des expériences auxquels ils sont destinés seront tous mis à mort afin de prélever les cerveaux pour analyses des tissus.
Remplacement
Aucune préparation in vitro ne permet de reproduire une tumeur cérébrale dans son environnement dans le cerveau avec les différentes cellules, les vaisseaux sanguins, la pression cérébrale, le système immunitaire.
Réduction
Plusieurs mesures sont appliquées pour permettre la réduction du nombre d'animaux utilisés dans ce projet. Grâce à une approche statistique, le nombre d'animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe sans compromettre les objectifs du projet. Nous réaliserons, lorsque cela est possible, des injections des deux côtés du cerveau afin que chaque animal apporte deux informations au lieu d'une, ce qui permet là aussi de diminuer le nombre d'animaux.
Raffinement
Une semaine d'acclimatation est prévue à l'arrivée des rats avant toute expérience. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur. Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance (notamment, suppression de la douleur grâce à l’administration d’antalgiques). Des points limites de douleur ont été définis. En cas d'atteinte d'un point limte, les animaux seront euthanasiés. La chirurgie et l'imagerie seront réalisées sous anesthésie générale. De plus, concernant la chirurgie et afin de prévenir toute douleur post-opératoire, une injection d’un anesthésique local sera effectuée ainsi qu’une injection d'un analgésique avant la procédure chirurgicale puis toutes les 24 heures si l’état de l’animal le requière. La croissance tumorale implique une perte de poids, notamment à partir de deux semaines après implantation. Les animaux auront accès à une nourriture hypercalorique et hydratée fournie par l’animalerie.
Choix des espèces
Le rat est une espèce adéquate car il existe un degré de similitude important avec le cerveau humain. De plus, le cerveau du rat est suffisamment gros pour permettre d’obtenir des images assez résolues et de réaliser des implantations de tumeur puis d’hydrogels dans de bonnes conditions de préservation des tissus sains. Les modèles tumoraux les plus reproductibles et les plus rapides, conduisant à une utilisation optimisée, plus efficace et sur un plus petit nombre d’animaux, sont disponibles essentiellement chez le rat. Cela concerne en particulier la littérature abondante en imagerie. Les lignées de cellules tumorales chez le rat que nous utiliserons représentent un modèle validé pour étudier les effets de la chimiothérapie sur l'environnement tumoral. Nous validerons nos protocoles de traitement (les plus optimisés, efficaces, sûrs et transférables en clinique) sur quatre modèles tumoraux, permettant d'élargir et de faire progresser nos connaissances dans le domaine. Enfin, l’ensemble des animaux utilisés seront adultes afin de travailler sur un cerveau mature et stable. Nous avons l’expérience sur les modèles de tumeur et sur les injections d’hydrogel à cet âge.
Evaluation de l’efficacité d’une formulation administrée par voie orale à 2 doses sur le traitement de la colite ulcérative chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Tués à l'issue d'une procédure unique pour qu'on prélève leur côlon et les matières fécales qu'il contient, 40 rats vont être utilisés dans cette étude. Trente-deux d'entre eux subissent sous anesthésie une induction d'ulcération colique de quarante minutes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, les huit autres recevant une substance neutre. Suit un gavage quotidien pendant six jours, puis cinq minutes en isolement dans un dispositif mesurant l'activité exploratoire pour évaluer la douleur ressentie. Le porteur décrit un inconfort et une douleur "notoires", avec perte de poids et posture prostrée, et indique qu'aucun antidouleur ne sera administré parce qu'il interférerait avec les résultats de l'étude.
Objectifs
La colite ulcéreuse ou rectocolite hémorragique (RCH) fait partie des deux principales maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI) avec la maladie de Crohn, et affecte l'extrémité distale du tube digestif, côlon et rectum. La colite ulcéreuse se classe parmi les maladies inflammatoires parce qu'elle occasionne une inflammation, des plaies, des saignements et une déstructuration sur les parois internes du côlon. L’inflammation s’accompagne de la formation d’ulcères pouvant saigner et produire du mucus ou du pus. Les personnes atteintes de colite ulcéreuse doivent être attentives au risque d’anémie car lorsque la maladie est grave, les pertes de sang peuvent être abondantes, pertes que l’on peut compenser grâce à des suppléments en fer. Des facteurs génétiques et environnementaux influenceraient l’apparition de cette maladie. Le stress et les intolérances alimentaires peuvent déclencher les symptômes chez certaines personnes, mais ces facteurs ne seraient pas à l’origine de la maladie. Des complications liées à l’usage à long terme de certains médicaments peuvent survenir (ostéoporose, cataracte, hypertension, diabète...), médicaments qui peuvent aussi augmenter le risque d’infection. L’objectif de cette étude est d’évaluer l’efficacité d’une formulation ayant des propriétés anti-inflammatoires et antidouleur, administré par voie orale à 2 doses, chez des rats soumis à l’induction d’une ulcération colique. Les effets observés seront comparés à ceux obtenus chez des rats traités avec un placebo ou avec un traitement anti-inflammatoire intestinal de référence. A l’issue de l’étude, les rats seront euthanasiés et le colon et la matière fécale qu’il contient seront prélevés pour la réalisation d’analyses biologiques.
Bénéfices attendus
La réalisation de cette étude va permettre d’évaluer les effets d’une formulation à 2 doses différentes chez le rat soumis à l’induction d’une ulcération colique expérimentale, et de comparer ces effets avec un placebo et un traitement anti-inflammatoire intestinal de référence utilisé pour le traitement de la colite ulcéreuse. Les données des différents paramètres suivis au cours de l’expérimentation, poids corporel, prises alimentaire et hydrique, ainsi que les données comportementales relévées quotidiennement concernant l’activité, la posture, l’aspect de la fourrure et l’ouverture des yeux dans la cage d’habitation, l’évaluation comportementale effectuée à la fin de l’expérimentation pour mesurer l’activité exploratoire, et les analyses biologiques qui seront effectuées sur le colon et la matière fécale prélevés en fin d’expérimentation, permettront d’appréhender les effets bénéfiques ou non de traitements avec cette nouvelle formulation sur ses activités anti-inflammatoire intestinale et antidouleur chez le rat. Cela permettrait d’envisager la réalisation d’une étude clinique chez l’Homme avec cette formulation, et à terme de proposer une nouvelle thérapie pour le traitement de la colite ulcéreuse.
Procédures
Les 40 rats nécessaires à la réalisation de ce projet seront placés à jeun pendant 12 heures avant l’induction de l’ulcération colique. L’ulcération colique sera induite par administration dans le colon d’une substance permettant l’induction de cette pathologie. Elle sera effectuée sur 32 des 40 rats placés sous anesthésie générale et nécessitera environ 40 minutes pour être réalisée. Les 8 autres rats ne subiront pas l’induction de l’ulcération colique mais ils seront également placés sous anesthésie générale pendant 40 minutes environ et recevront une administration de substance neutre dans le colon. Après induction de l’ulcération colique, un traitement par voie orale avec les composés à évaluer sera effectué quotidiennement pendant 6 jours sur les animaux vigiles, geste effectué en moins d’1 minute par une personne expérimentée. Un test comportemental sera effectué à la fin de l’expérimentation pour évaluer la douleur ressentie par les animaux. Chaque rat sera placé pendant 5 minutes dans un dispositif expérimental permettant d’évaluer plusieurs paramètres comportementaux.
Impact sur les animaux
La mise à jeun des animaux la veille au soir de l’induction de l’ulcération colique, pendant une durée de 12 heures, nécessaire pour que l’ensemble des animaux soient dans les mêmes conditions physiologiques et que leur colon soit vide de matière fécale, va induire une légère perte de poids des animaux. L’induction de l’ulcération colique va quant à elle induire un inconfort des animaux et une douleur ressentie notoires, se traduisant par une perte de poids modérée liée à une diminution de la prise alimentaire, voire également de la prise hydrique, et des modifications du comportement des animaux avec une activité moindre, une posture plus prostrée, une fourrure plus hérissée et des yeux moins ouverts, ainsi qu’avec une diminution de l’activité exploratoire. Le traitement avec la formulation à évaluer devrait limiter cet inconfort et cette douleur ressentie et donc les effets sur les différents paramètres mesurés, tout comme le traitement anti-inflammatoire intestinal de référence comme nous l’avons démontré dans de précédentes études. L’évaluation comportementale effectuée à la fin de l’expérimentation par la mise en place des animaux individuellement dans un dispositif expérimental pendant 5 minutes, va engendrer un stress modéré des animaux par l’isolement et la perte des interactions sociales entre congénères durant ce laps de temps..
Devenir
A l’issue de l’unique procédure expérimentale, les 40 rats seront euthanasiés afin de permettre le prélèvement de du colon et de la matière fécale contenue dans celui-ci pour la réalisation d’un ensemble d’analyses.
Remplacement
Des études préliminaires effectuées in vitro sur des cultures de cellules intestinales ont permis de sélectionner la formulation ayant démontré les effets anti-inflammatoires les plus probants. Nous souhaitons donc maintenant confirmer ces effets anti-inflammatoires dans un modèle bien caractérisé de colite ulcérative. Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant d’évaluer les effets de substances sur l’inflammation intestinale qui est un processus complexe impliquant le système digestif, le système immunitaire et le microbiote intestinal, et sur l’évaluation comportementale. Cela ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal..
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet et permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé à partir des résultats d’études précédemment menées par notre laboratoire sur ce modèle expérimental de colite ulcérative ayant montré des effets "forts" de traitements sur l’inflammation intestinale générée, l’évolution pondérale et les paramètres comportementaux évalués dans un test comportemental à la fin de la période de traitement. Nous utiliserons ainsi 8 animaux par groupe expérimental. A l’issue des expérimentations, une analyse statistique de l’ensemble des données générées sera réalisée.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles. Les rats seront placés à 2 par cage dans des cages transparentes avec des briques d’Aspen et du papier kraft comme enrichissement, et ils auront accès à la nourritue et à l’eau ad libitum. Une attention toute particulière sera portée aux animaux après l’induction de la colite ulcérative, lors de la réalisation des traitements et la réalisation de l’évaluation comportementale. Les animaux seront observés plusieurs fois par jour tout au long de l’expérimentation par du personnel qualifié, week-end et jours fériés inclus. Un suivi quotidien de leur poids et de leurs consommations alimentaire et hydrique sera effectué tout au long de l’expérimentation, de même qu’une observation spécifique de leur comportement dans leur cage pour évaluer le niveau de douleur ressentie au travers de l’observation de leur activité, de leur posture, de l’état de leur fourrure et de l’ouverture de leurs yeux. Cela permettra ainsi d’évaluer l’effet antidouleur de la formulation testée sur la pathologie induite et de la comparer à celui des autres groupes de traitement. L’évaluation de la douleur ressentie se fera également par la réalisation d’un test comportemental 24 heures après le dernier traitement oral et juste avant leur euthanasie, pour évaluer l’activité exploratoire des animaux au travers de différents paramètres. Le but de cette étude étant d’évaluer les effets anti-inflammatoires de la formulation qui sera testée, il ne sera pas possible d’administrer de traitement antidouleur qui interférerait avec les résultats de l’étude et leur interprétation. Cependant, la surveillance de points limites définis permettra d’isoler voire d’exclure éventuellement des animaux avec une prise en charge en conformité avec les recommandations éthiques.
Choix des espèces
Le rat est un modèle très utilisé pour les études dans le domaine de l’inflammation et notamment le modèle d’ulcération colique qui est reconnu par la Communauté Scientifique Internationale, et pour les études sur le comportement. C'est donc l’espèce animale la plus appropriée pour ce type d’étude. Les animaux seront de jeunes rats âgés de 8-9 semaines et d’un poids de 225-250 g à l’arrivée au laboratoire et de 9-10 semaines et d’un poids de 250-275 g pour la réalisation des expérimentations, correpondant à l’âge et au poids de rats que nous utilisons pour la réalisation d’expérimentations sur ce modèle de colite ulcérative.
Développement de modèle murin de souffrance hépatocytaire et implication de FAT10/UBD
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
5 440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 2 448 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, chacune pouvant subir plusieurs prélèvements de sang par incision de la queue espacés de quinze jours, puis un prélèvement rétro-orbitaire terminal. Un agent chimique administré de façon chronique installe une fibrose puis une cirrhose du foie, avant qu'une infection ne fasse basculer les animaux du stade compensé au stade décompensé, que le porteur décrit comme irréversible. Les régimes obésogènes utilisés peuvent faire apparaître des nodules du foie évoluant vers un carcinome, et il reconnaît que cela peut causer des douleurs, tout en écrivant que l'injection chronique de l'agent fibrosant, elle, n'en provoque pas. Les souris sont retirées du protocole et tuées lorsqu'elles perdent 15 % de leur poids ou présentent prostration, poil hirsute, vocalisation ou morsures.
Objectifs
Les maladies chroniques du foie comprennent un large spectre de maladies pour lesquelles il n’existe pas de thérapies pharmacologiques à l’heure actuelle. Ces maladies chroniques se caractérisent le plus souvent par un état inflammatoire chronique du foie qui entraîne une altération de la fonction et de l’identité des hépatocytes, cellules majoritaires du foie, conduisant au développement d’un état fibrotique pouvant évoluer juqu’au stade de Cirrhose, voir d’hépatocarcinome (HCC). Les causes majeures de ces pathologies sont les MAFLD (Metabolic dysfunction Associated Fatty Liver Disease), les maladies du foies liés à l’alcool ou encore les hépatites virales et bactérienne. La cirrhose hépatique est un stade important du développement de la fibrose hépatique qui est retrouvée dans la majorité de ces pathologies hépatiques et qui représente le stade irréversible de la maladie. Un événement précipitant (infection, alcool) peut chez les patients cirrothiques entrainer une perte aigüe de la fonction hépatique défine comme ACLF (Acute on Chronic Liver Failure). L’absence de thérapies efficaces démontre l’importance de mieux comprendre et caractériser les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans le développement de ces défaillances hépatocytaires. De nombreuses études de la littérature, ainsi que des données prélimiaires obtenues au laboratoire ont montré le rôle important de la protéine FAT10 dans le développement et l’installation de ces pathologies. En effet, il a été démontré que FAT10 était surexprimé dans le foie de patients atteints de ASH (Alcooholic steatohepatitis), de MASH (Metabolic dysfunction Associated to SteatoHepatitis) et d’hépatite virale. Des résultats d’études menées au laboratoire ont montré que FAT10 interagit avec le récepteur nucléaire, Pparα (, afin d’inhiber son action sur le métabolisme des lipides et l’inflammation et contrôlait également la senescence de l’hépatocyte au cours de la MASH. Ainsi, l’objectif de ce projet de recherche est de déterminer si la modulation d’expression de FAT10 module la souffrance hépatocytaire et la progression des maladies chroniques du foie, tels que la MASH, la ASH (Alcoholic SteatoHepatitis), l’ACLF ou encore la réponse hépatique à une infection bactérienne (Sepsis)
Bénéfices attendus
Ce projet cherche à mettre en évidence le rôle de FAT10 dans la souffrance hépatocytaire et le développement et la progression de la MASH et l’ACLF. La compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires contrôlés par FAT10 dans ces pathologies pourrait permettre de déterminer FAT10 comme une cible thérapeutique intéressante pour soigner les pathologies hépatiques, où à l’heure actuelle, il n’existe aucune thérapie.
Procédures
Des prélévements sanguins seront réalisés avant le début des différents protocoles ou en fin de protocoles, soit après légère incision de la queue pour des prélévements au cours du protocole, alors que des prélévements en rétro-orbitaire seront réalisés en fin de protocoles avant l’euthanasie des animaux. L’ensemble de ces prévelements sera réalisé sur animal anesthésié par isoflurane, sauf au moment des différents tests métaboliques (GTT, ITT, PTT) car l’utilisation d’un anesthésique perturbe le métabolisme de l’animal. Sur un même protocole, les souris pourront subir plusieurs prélévements sanguins à la queue avec au moins 2 semaines de délai entre deux prélévements. Pour d’autres protocoles, des injections intra-péritonéales ou gavages seront réalisé sur animaux vigiles. Pour finir, les souris seront anesthésiées, suivi immédiatement d’une mise à mort pour des prélévements d’organes.
Impact sur les animaux
La lignée C57BL6/J utilisée dans nos différentes procédures ne présente aucun probléme physique ou physiologique. Ainsi, peu de nuisances ou d’effets indésirables sont attendus dans les procédures qui seront mises en œuvre pour la réalisation de ce projet de recherche. L’utilisation de régimes induisant la MASH chez l’animal peut conduire à l’apparition de nodules hépatiques pouvant évoluer vers un carcinome hépatique pouvant causer des douleurs à l’animal au cours du protocole. La mise en place de régimes obésogènes dans un modèle murin peut également entrainer des problèmes de prise alimentaire et donc le développement de faim et de malnutrition de l’animal. L’utilisation de modèles permettant le développement de la souffrance hépatocytaire et notamment les modèles qui permettent d’étudier l’ACLF nécessitent l’administration chronique d’un agent chimique qui permet d’induire la fibrose hépatique et la cirrhose, suivi d’un épisode infectieux qui va permettre de passer d’un stade compensé (asympotomatique) à un stade décompensé (stade irréversible). Il est bien établi que l’injection chronique de l’agent chimique n’induit pas de douleur à l’animal. L’épisode infectieux étant susceptible d’entrainer des réactions inflammatoires avec possibilités de fièvre et d’autres symptomes de souffrance de l’animal, elle sera effectuée le matin afin de pouvoir effectuer une observation accrue de l’animal le jour de l’infection. L’ensemble des procédures vont également nécessiter la prise des animaux en contention, pouvant provoquer un stress léger à l’animal. Ainsi, pendant l’ensemble de la durée de l’étude, le bien-être des animaux sera estimé quotidiennement et l’observation de signes de douleurs ou de mal-être entraînera la sortie du protocole de l’animal et sa mise à mort. Une attention particulière sera portée aux paramètres cliniques définissant les points limites de nos expériences : 1) perte de poids de 15% et 2) modification de l’apparence physique et du comportement (prostation, infection, poil hirsute, vocalisation et comportement agressif avec morsure).
Devenir
A l’issus des différentes procédures mise en place dans ce projet de recherche, l’ensemble des animaux seront mis à mort pour analyses.
Remplacement
Ce projet de recherche est mis en place à partir d’études préliminaires réalisée sur des lignées cellulaires. Ces études ont montré un rôle important de la protéine FAT10 dans les cellules du foie. Cependant, les maladies du foie associées à une dysfonction hépatique sont des pathologies complexes impliquant de nombreux organes autres que le foie. Ainsi, l’utilisation d’un modèle animal (modèle murin) nous permettra de reproduire au mieux la physiopathologie et de mieux comprendre le rôle clé joué par la protéine FAT10 dans la souffrance hépatocytaire, ainsi que le développement et la progression des maladies chroniques ou aïgue du foie.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été réduit au maximum, sans toutefois compromettre l’analyse statistique des résultats. De plus, une analyse appronfondie de la littérature permet également d’éviter des répétitions d’expériences inutiles.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum lorsqu’ils ne sont pas nourris avec un régime alimentaire induisant un contexte physiopathologique. Si les animaux ne sont pas nourris ad libitum, une vigilance accrue sera accordée à la quantité de nourriture restante dans la cage. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de maisons. La définition précise des points limites précoces, ainsi qu’une surveillance quotidienne pendant tout le protocole permet de limiter l’apparition d’une souffrance ou d’une atteinte de l’état général de la souris. En cas d’atteinte de ces points limites, les animaux seront sortis de l’étude et mis à mort.
Choix des espèces
La souris (mus musculus) est l’espéce que nous avons choisi car de nombreuses données de la littérature sont disponibles sur ce modèle d’étude. De plus, cette espéce est fréquemment utilisée pour étudier les pathologies telles que la MASH ou l’ACLF. Elle présente de nombreux avantages : facilité d’élevage, possibilités d’utiliser des modéles génétiquements modifiés et sont sensibles aux régimes alimentaires et aux traitements pharmacologiques induisant la MASH et l’ACLF. Les souris seront utilisées à l’âge adulte de 12 semaines car les souris adultes offrent une une meilleure homogénéité et une meilleure réponse aux inductions des pathologies métaboliques via un régime « spécial » ou des pathologies caractétisées par une souffrance hépatocytaire induite par des stimulations chimiques.
Evaluation de l’efficacité de composé dans des modèles de maladies auto-immunes
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Une injection sous anesthésie déclenche chez des rats une forme de sclérose en plaques ou de polyarthrite rhumatoïde, avec une faiblesse de la queue et une paralysie des membres passagères, une inflammation des articulations, une perte de poids et parfois une nécrose au point d'injection. 2 940 rats vont être utilisés, tous tués à la fin de l'expérience, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et chacun peut recevoir en 35 jours jusqu'à 140 administrations et 73 prises de sang. Les composés testés sont en développement, et des molécules déjà commercialisées ou en essai clinique servent à juger, écrit le porteur, la "prédictivité des modèles mis en œuvre". Il évoque des tests comportementaux sans les nommer, et ne décrit un traitement contre la douleur que pour deux des quatre procédures.
Objectifs
Les maladies auto-immunes résultent d’un dysfonctionnement du système immunitaire qui conduit ce dernier à s’attaquer aux constituants normaux de l’organisme. L’ensemble de ces pathologies touchent environ 5 à 10% de la population mondiale avec une forte prévalence pour les femmes (80%). Ces maladies évoluent de façon chronique tout au long de la vie, avec des alternances de phases de crises et de rémissions. A ce jour, plus de 80 maladies auto-immunes ont été décrites. Parmi les plus fréquentes, on peut citer la sclérose en plaque et la polyarthrite rhumatoïde. En première intention, les principaux traitements sont basés sur des médicaments appelés immunosuppresseurs. Malheureusement, ces traitements entravent également les réponses immunitaires physiologiques destinées à lutter contre les infections et ont d’autres effets secondaires potentiellement sérieux. Actuellement, l’objectif de la recherche médicale reste de mettre au point des traitements efficaces avec moins d’effets secondaires. Des biothérapies se développent, elles sont le plus souvent utilisées lorsque la maladie ne répond pas suffisamment aux immunosuppresseurs. Cette recherche se concentre sur le développement de thérapies qui ciblent spécifiquement le processus pathologique concerné et qui interférent avec des fonctions précises de la réponse immunitaire, fonctions qui sont impliquées dans la pathogénie de la maladie. Afin de modéliser ces pathologies, différents modèles animaux sont validés par la communauté scientifique. Ces modèles permettent d’étudier les mécanismes physiopathologiques des maladies auto-immunes et permettent ainsi de développer de nouveaux traitements. Ils sont en général basés sur la stimulation d’une réponse immunitaire connue de la maladie. Dans ce projet, nous nous proposons d’utiliser différents modèles de maladies auto-immunes pour tester des composés en cours de développement. Les procédures mettrons en oeuvres des modèles de sclérose en plaque ou des modèles de polyarthrite rhumatoïde.
Bénéfices attendus
Avec ce projet nous espérons participer à la sélection de nouveaux traitements pour traiter les maladies auto-immunes que sont la sclérose en plaque et la polyarthrite rhumatoïde. De plus comme nous testons également des molécules déjà sur le marché ou en phase clinique, nous participons à une meilleure connaissance de la prédictivité des modèles mis en œuvre.
Procédures
En fonction de la procédure réalisée les animaux subirons au maximum une injection sous anesthésie induisant la pathologie puis 35 scorages de leur état clinique (2 min) ou 15 scorages de l’inflammation et 15 mesures sous anesthésie du volume de l’oedème au niveau des pattes postérieures (3 min). Tous les scorages sont effectués sur animaux vigiles. Ils pourront être amenés à recevoir un maximum de 140 administrations (dont le traitement anti-douleur, sous anesthésie pour les administration intraveineuse) et de 1 à 73 prélèvements sanguins sur la période de 35j en ne dépassant pas les recommandations éthiques en termes de volume prélevé et en garantissant le délai de récupération réglementaire.
Impact sur les animaux
Les pathologies induite provoquent de façon transitoire une faiblesse de la queue et une paralysie des membres. Les administrations répétées ainsi que les potentiels prélèvements sanguins peuvent induire des désagréments au niveau des sites d’administration et de prélèvement comme une douleur passagère ou une irritation, une inflammation, une induration mais aussi un phénomène de mâchonnement et de fausse route pour la voie per os. Un stress lié aux différentes manipulations (administration de composés, contention, …) et tests comportementaux peut également apparaitre. Si le prélèvement terminal de sang nécessite une mise à jeun (
Devenir
L'ensemble des animaux seront mis à mort à la fin de l'expérience. Une partie des animaux est mise à mort pour faire des prélèvements, l’autre partie ne peut pas être replacée ou ré-utilisée car les animaux sont traités avec des substances à long terme.
Remplacement
Le développement des maladies auto-immunes et de leurs symptômes sont des phénomènes complexes qui mettent en jeu plusieurs acteurs (système immunitaire, microbiote, système nerveux, muscle, …) et différents processus. Actuellement aucune méthode de remplacement n’est disponible pour étudier les problématiques du présent projet. Néanmoins, les molécules testées dans ce projet ont fait l’objet d’une sélection sur des tests in vitro afin de choisir celles qui ont le plus fort potentiel thérapeutique.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’informations scientifiques par test. C’est pourquoi, très souvent, des prélèvements post-mortem seront associés aux études in vivo dans l’objectif de soutenir les données obtenues par des analyses histologiques. Au regard de notre expertise, de la littérature et de la variabilité inter-individuelle et d'une éventuelle différence à l’exposition aux traitements, les groupes expérimentaux seront constitués de 10 à 15 animaux selon la procédure. Des analyses statistiques finales seront réalisées.
Raffinement
Le bien-être des animaux est primordial durant les expérimentations. Ainsi un certain nombre de mesures sont mises en œuvre notamment l’inclusion de phase d’acclimatation (minimum 1 semaine) avant toute expérimentation. Les animaux sont hébergés dans des conditions optimales afin de réduire au maximum le stress lié à la captivité et aux expérimentations. Nous portons une attention particulière à ce que les animaux puissent exprimer certains de leurs comportements propres. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux. De plus, l’environnement des animaux est enrichi par un tunnel en carton pour leur permettre de se cacher et des boules de bois pouvant servir de jeu et de matériel à ronger. Les inductions, les mesures d’œdème et le prélèvement de sang sont réalisées sous anesthésie. Dans les procédures 1 et 2, dès le jour 7, de la nourriture en gel est mise à disposition des animaux afin de facilité la prise alimentaire lors du pic de la pathologie. Dans les procédures 3 et 4, dès l’apparition de l’inflammation jusqu’à la fin de l’expérience la douleur des animaux est prise en charge par un traitement biquotidien. De plus nous avons établis des points limites spécifiques à chaque procédure afin de soustraire l’animal à une douleur qui n’est pas en relation avec les signes attendus du projet. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec notre SBEA pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.
Choix des espèces
Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des rats non transgéniques. Les différents modèles décrits dans ce projet sont largement utilisés chez le rat pour lequel le matériel est adapté et les résultats pertinents. Les maladies auto-immunes peuvent apparaitre à tout âge mais la prévalence est la plus importante chez les jeunes adultes. Nous utiliserons donc des rats d’environ 10 semaines au début de l’expérience.
Étude in vivo de la pharmacocinétique de la dexaméthasone administrée localement par un implant d’oreille moyenne dit « Turbo Ear Cube » chez la gerbille de Mongolie.
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
Pour tester un implant d'oreille moyenne censé délivrer un corticoïde dans l'oreille interne, 75 gerbilles de Mongolie vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Chaque animal est opéré des deux oreilles au cours d'une chirurgie de 45 à 60 minutes sous anesthésie générale, subit trois à huit séances de mesure de l'audition de 20 à 30 minutes chacune, puis un prélèvement de liquide au sommet de la cochlée de 40 à 50 minutes. Le porteur ne retient qu'un seul effet néfaste, la perte auditive liée à l'implantation du dispositif. Il énumère par ailleurs les signes qui déclencheraient un traitement à la buprénorphine, poil hérissé, voussure dorsale, vocalises, perte de poids de plus de 10 %, avant d'écrire que cette situation est "peu probable" au motif d'une chirurgie "peu invasive et peu douloureuse", alors que le projet est classé sévère.
Objectifs
Selon l'OMS, 360 millions de personnes souffrent de déficience auditive handicapante (5 millions en France). Les traitements médicaux destinées a l’oreille interne par voie systémique sont limitées par l’existence de la barriere hémato-cochléaire qui empeche le principe actif d’atteindre sa cible. L’objectif de l’étude est le développement d’outils de délivrance de principes actifs via la fenêtre ronde.
Bénéfices attendus
Nous espérons que le prélèvement de liquide périlymphatique à l’apex cochléaire permettra une analyse précise et fiable de la pharmacocinétique du médicament. Nous nous attendons à mettre en évidence des concentrations plus élevées en dexaméthasone avec l’implant d’oreille moyenne, sans gradient de concentration baso apical et avec une concordance de gradient histo-biochimique. Nous espérons mettre en évidence une durée prolongée de délivrance de la dexaméthasone dans le groupe « long terme ».
Procédures
- Potentiels évoqués auditifs (PEA) réalisés sous anesthésie générale pour une durée totale de 20 à 30 minutes maximum. Toutes les gerbilles avant la chirurgie puis à 1 semaine et 1 mois post opératoire et à 2 mois, 3 mois, 4 mois, 5 mois et 6 mois pour le groupe "long terme". Cela correspond à 3 interventions dans le groupe "court terme" et 8 interventions dans le groupe "long terme". - Chirurgie d'implantation du dispositif d'oreille moyenne sous anesthésie générale pour une durée totale de 45 à 60 minutes selon la courbe d'apprentissage : toutes les gerbilles avec le dispositif chargé en dexaméthasone dans une oreille, la moitié des gerbilles bénéficiera du dispositif non chargé en dexaméthasone dans l'oreille controlatérale et l'autre moitié bénéficiera d'une injection transtympanique de dexaméthasone dans l'oreille controlatérale. Ainsi, chaque gerbille bénéficiera d'une seule intervention au cours de laquelle les 2 oreilles seront opérées. - Prélévement péri lymphatique à l'apex cochléaire sous anesthésie générale de chaque oreille soit une durée totale de 40 à 50 minutes : à 1 mois pour le groupe "court terme" et à 6 mois pour le groupe "long terme". Chaque gerbille bénéficiera d'une seule intervention au cours de laquelle le prélèvement sera réalisé sur les 2 oreilles.
Impact sur les animaux
Perte auditive lié à l'implantation du dispositif d'oreille moyenne.
Devenir
L'ensemble des 75 animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de réaliser le prélévement puis l'analyse en immunofluorescence et en histologie des cochlées.
Remplacement
Il s'agit d'une étude de délivrance d'un produit au sein de l'oreille interne, il n'existe pas d'alternative non animale pour la réalisation de ce type d'étude. Seul un modèle animale vivant peut nous permettre d'étudier la pharmacocinétique du dispositif au sein de l'oreille interne.
Réduction
Un nombre d'animaux suffisant (30 par groupe) a été choisi pour pouvoir réaliser des tests statistiques paramétriques, qui sont plus robustes (Tests t de Student et ANOVA). Les deux oreilles de chaque animale sera utilisé : l'une bénéficiera du principe actif l'autre bénéficiera de la technique de référence ou sera utilisé comme controle négatif.
Raffinement
En cas de signe(s) de souffrance (hyperactivité ou isolement, indifférence par rapport au milieu extérieur, diminution du comportement exploratoire, fuite ou défense à la manipulation, poil hérissé par absence de toilettage, voussure dorsale, vocalises, perte de poids supérieure à 10 %) un traitement analgésique sera mise en place précocément par injection intrapéritonéale de Buprénorphine (Vétergésic® ou Buprécare®) à raison de 0,03 mg/kg toutes les 6 à 8 heures. Cette situation est peu probable car il s'agit d'une chirurgie peu invasive et peu douloureuse.
Choix des espèces
La gerbille de Mongolie est un excellent modèle animal en audiologie et otologie pour 4 raisons : - spectre auditif étendu aux basses fréquences, ce qui en fait le rongeur (avec le Chinchilla) qui présente le spectre auditif le plus proche de l'Homme, - bulle auditive (zone qui contient les oreille moyennes et internes) naturellement hypertrophiée, ce qui en fait un bon modèle chirurgical pour ces régions, - rareté des épisodes d'otites moyennes aiguës, ce qui en fait un bon modèle pour l'évaluation non infectieuse des chirurgies otologiques, - ancienneté d'utilisation du modèle depuis de nombreuses années par notre équipe nous permettant d'acquérir une certaine expertise le concernant. Les gerbilles de Mongolie auront environ 10 mois, ce qui constitue le meilleur compromis entre un âge adulte donnant des animaux de taille suffisante pour faciliter la microchirurgie et un âge suffisamment jeune permettant de s’affranchir des problèmes de presbyacousie. En effet, la gerbille de Mongolie est un excellent modèle animal de presbyacousie. Son audition est adulte à partir de 18 jours et la presbyacousie débute vers 18 mois, avec une élévation du seuil de 10 dB SPL vers 22-24 mois et une franche perte auditive (20 à 30 dB SPL) à 36 mois de vie.
Etude, par imagerie intravitale, du rôle des HEV (high endothelial venule) induit par le vaccin H107e sur la migration, le positionnement et l’expansion des cellules immunitaires chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système respiratoire
2 240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 960 subissant une chirurgie du thorax suivie de cinq heures d'observation au microscope sous anesthésie, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger pour 640 d'entre elles, modéré pour 640 et sévère pour 960. 1 600 sont infectées par la tuberculose au moyen d'un nébuliseur, maintenues éveillées en contention pendant 40 à 45 minutes dont 17 minutes d'exposition à la bactérie. 1 600 reçoivent aussi deux injections vaccinales sous anesthésie générale à quatre semaines d'intervalle, l'anesthésie provoquant selon le porteur une hypothermie et une déshydratation. Ce qu'il attend du projet, comprendre comment se forment des vaisseaux qui recrutent des lymphocytes dans les lésions pulmonaires, reste une étape de connaissance fondamentale, l'optimisation de vaccins étant renvoyée au conditionnel.
Objectifs
Dans certaines maladies, des structures liées au système immunitaire appelées structures lymphoïdes tertiaires (TLS) apparaissent comme la conséquence d'agressions locales qui ne se résolvent pas, comme les infections chroniques, les maladies auto-immunes et certaines formes de cancer. Les TLS sont des structures qui ressemblent aux ganglions lymphatiques avec le même type d'organisation, des zones de lymphocytes B et des zones de lymphocytes T dans lesquelles on retrouve des veinules particulières appelées HEV . Ces dernières sont des portes d'entrées privilégiées pour les lymphocytes. Lors de l’infection par l’agent pathogène Mycobacterium tuberculosis (M. tb) chez l’Homme, des TLS pulmonaires se forment autour des lésions créées par la bactérie. Bien que les mécanismes soient encore méconnus, les TLS semblent posséder une capacité protectrice lors de l’infection par M. tb. L’hypothèse du projet présenté ici s'appuie sur cette observation et a pour but de comprendre comment les HEV se mettent en place lors de ces infections et si elles peuvent permettre une meilleure infiltration de lymphocytes dirigés contre la bactérie au sein des lésions afin d'améliorer la réponse immunitaire contre la bactérie. Enfin, la démonstration du caractère protecteur des TLS vis à vis des infections par M. tb permettrait d’optimiser le dévéloppement de vaccins favorisant la formation de ces structures au cours de l’infection.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de : (i) comprendre les mécanismes de formation et de fonctionnement des structures lymphoïdes tertiaires (TLS) dans le contexte de l’infection par Mycobacterium tuberculosis (M. tb) ; (ii) identifier des voies d'induction de TLS dans des pathologies pulmonaires infectieuses afin d'améliorer la réponse immunitaire contre ces infections.
Procédures
Dans ce projet, 1600 souris seront vaccinées sous anesthésie générale. Le vaccin sera administré deux fois au total, espacé d’une durée de quatre semaines entre chaque injection. Chaque injection ne durera pas plus de 10 secondes. L’infection par aerosol de Mycobacterium tuberculosis concerne 1600 souris parmi lesquelles 960 auront aussi été vaccinées. L'infection est réalisée sur des animaux vigiles à l’aide d’un nébuliseur. Les souris seront mises en contention pour une durée maximale de 40 à 45 minutes, dont 17 minutes correspondent à l’infection par l’agent pathogène. Les 960 souris vaccinées et infectées seront soumises à une chirurgie pour effectuer de la microscopie sur les poumons ainsi qu'à 2 ou 3 injections intraveineuse sous anesthésie générale. Ces 960 souris seront aussi soumises toujours sous anesthésie générale à une injection de serum physiologique en intrapéritonéale pour un maintien de l'hydratation. Chaque injection ne durera pas plus de 10 secondes. La chirurgie ne durera pas plus de 20 minutes et l’acquisition au microscope ne dépassera pas une durée de cinq heures.
Impact sur les animaux
Les souris qui sont vaccinées et celles qui sont soumise à une chirurgie subissent du stress dû à l’injection et à l’anesthésie. Les lignées de souris démontrées comme étant susceptibles à l’infection par Mycobacterium tuberculosis (M. tb) subissent une perte de poids suite à l’infection. L’anesthésie nécessaire pour la chirurgie et la microscopie provoque une hypothermie et une déshydratation chez la souris.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de chaque procédure car ces derniers nécessitent le prélèvement de rate (procédure 2 et 3) ou sont classées comme des procédures sévères.
Remplacement
Nous nous intéressons dans ce travail au rôle de vaisseaux appelés HEV dans le recrutement de cellules du système immunitaire, les lymphocytes dans des lésions pulmonaire liées à des infections bactériennes. Cela ne peux pas être réduit à des modèles en culture cellulaires car ces études nécessitent l'organisme entier avec la circulation sanguine, le système respiratoire et le système immunitaire. Nous devons donc travailler sur des organismes vivants et suffisamment proche de l’homme.
Réduction
Dans ce projet, un nombre maximum de 2240 animaux sera utilisé. Afin de s’inscrire dans la logique de réduction, nous avons intégré des points de décisions d'aller ou non de l'avant dans notre projet. Ainsi certaines étapes pourront être suivies de décisions de poursuite ou d’arrêt de l’étude en fonction des résultats obtenus. Le nombre d’animaux utilisé pour chaque groupe a été déterminé par nos études antérieures et celles de la littérature. Il est de 10 animaux dans chaque groupe étudié, un nombre d’individus suffisants pour obtenir des résultats statistiquement significatifs
Raffinement
La stratégie de raffinement est premièrement fondée sur l’utilisation de points limites précoces, prédictifs et adaptés. Le suivi des animaux est réalisé par les expérimentateurs ou l’équipe de zootechnie quotidiennement (aspect externe, comportement, pesée). Les procédures d'injections et de chirurgie ont été optimisées afin de générer le moins de stress et de douleurs aux animaux. Pour ces chirurgies, les animaux sont anesthésiés et un analgésique est administré pour gérer la douleur. Les conditions d’hébergement et les méthodes expérimentales utilisées sont les plus appropriées pour réduire au maximum toute angoisse ou dommage durable que pourraient subir les animaux.
Choix des espèces
La souris est un modèle largement utilisé pour étudier l’immunité anti-infectieuse de par son fort degré de convergence des paramètres de l'immunité et de la pathologie chez l'Homme, par rapport aux autres espèces envisageables. De plus, le recours au modèle murin dans la microscopie est très répandu grâce aux divers modèles permettant la visualisation, le suivi et l’identification des populations de cellules d’intérêt. Nous n’utiliserons pour ce projet que des souris adultes âgées de 8 à 12 semaines au début des procédures. A ce stade de développement, les souris ont un système immunitaire suffisamment mature.
Oestradiol et cachexie chez la souris Apc
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
300 souris Apc, qui développent une cachexie cancéreuse entre onze et quinze semaines, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré pour la moitié et sévère pour l'autre. Les femelles subissent une ablation des ovaires de quinze minutes, puis l'implantation sous la peau d'une pastille d'œstradiol, un prélèvement de sang et une mesure de force musculaire de trente minutes qui exige une incision de la peau. Le porteur indique que l'ablation des ovaires entraîne à elle seule une perte de poids et de masse musculaire de 2 à 5 %, celle-là même que le protocole cherche à mesurer. Il conclut que "seul un modèle animal murin permet de reproduire la complexité des mécanismes biologiques mis en jeu", après avoir écarté tout système in vitro en une phrase.
Objectifs
Le déconditionnement musculaire désigne une perte de masse et de force musculaire qui peuvent être observées dans différentes situations pathologiques (cancer, myopathie, insuffisances cardiaque, rénale ou respiratoire). Dans le cas du cancer, ce déconditionnement musculaire est extrêmement marqué (on parle de cachexie associée au cancer) et constitue un facteur majeur contribuant à la réduction de l'état de santé et de la qualité de vie des patients. Connaitre les mécanismes responsables du déconditionnement musculaire associé au cancer et développer des stratégies thérapeutiques pour lutter contre ce déconditionnement constituent un des enjeux actuels majeurs de la recherche en cancérologie. Nos données préliminaires obtenues dans un modèle murin de cachexie associée au cancer, la souris Apc, suggèrent l'existence d'un dimorphisme sexuel dans le développement de la cachexie, les souris âgées de 15 semaines ne faisant ni l'experience d'une perte de masse musculaire ni celle d'une perte de force musculaire. Par ailleurs, des données de la littérature indiquent que
Bénéfices attendus
En déterminant le rôle protecteur potentiel des oestrogènes face au développement de la cachexie associée au cancer, ce projet permettra de développer notre compréhension des mécanismes mis en jeu lors de la cachexie, et de proposer des stratégies d'intervention basés sur l'utilisation de modulateurs de l'activité du récepteur aux estrogènes.
Procédures
Pour déterminer si l'oestradiol exerce un effet protecteur face au déconditionnement musculaire des souris femelles, les souris femelles seront soumises aux interventions suivantes sous anesthésie gazeuse : ovariectomie (durée totale 15 min), implantation sous-cutanée de pastilles contenant de l'oestradiol (durée totale 3 min), prélèvement sanguin (5 min), mesure de force musculaire (30 min). Les prélèvements tissulaires (15 min) sont réalisés sous anesthésie chimique. Pour déterminer si l'oestradiol exerce un effet protecteur face au déconditionnement musculaire des souris mâles, les souris mâles seront soumises aux interventions suivantes: implantation sous-cutanée de pastillescontenant de l'oestradiol (durée totale 3 min), prélèvement sanguin (5 min), mesure de force musculaire (30 min), prélèvements tissulaires (15 min).
Impact sur les animaux
La procédure d'ovariectomie ainsi que l'implantation de la pastille sont réalisées avec administration de brupénorphine pour limiter les suites douloureuses de l'intervention. Une observation des animaux sera réalisée toutes les 2 heures pendant 6H00 après l'ovariectomie, puis toutes les 24H00 afin de déceler l'apparition des signes généraux évocateurs de souffrance. Le cas échéant une ré-administration de buprénorphine pourra être effectuée. L'ovariectomie est étant elle-même à l'origine d'une légère perte de poids et de masse musculaire (de l'ordre de 2 à 5%), nous serons donc particulièrement vigilants à l'apparition de tout signe évocateur d'une souffrance animale. Une courbe de suivi de masse corporelle sera effectuée en mesurant leur poids tous les 2 à 3 jours. Les mesures de forces musculaires impliquent une approche chirurgicale nécessitant une incision au niveau de la peau. Afin de limiter les souffrances des souris, une anesthésie profonde à l'isofurane sera effectuée depuis le début de l'approche chirurgicale jusqu'à l'injection d'un mélange d'anesthésique et analgésique pour réaliser les prélèvements tissulaires.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort de façon éthique au terme de chaque procédure afin de procéder à des prélèvements tissulaires.
Remplacement
La cachexie associée au cancer est un processus catabolique multifactoriel sollicitant de nombreux tissus, le muscle bien évidement, mais aussi le système neuroendocrinien (axe gonadotrope). Un système expérimental in vitro ne permettrait pas de reproduire la complexité de ces régulations. Seul un modèle animal murin permet de reproduire la complexité des mécanismes biologiques mis en jeu.
Réduction
Nous avons avons utilisé un teste statistique en ligne afin de déterminer la taille du groupe optimale pour obtenir des résultats ayant une force statistique suffisante robuste. Afin d'anticiper le cas rare où une interruption précoce de la procédure serait nécessaire pour certains animaux, nous prévoyons des lots de 15 animaux par groupe. Ces animaux supplémentaires ne seront inclus qu’en cas de besoin afin d’obtenir au final les 14 animaux par groupe nécessaire à la significativité des résultats. Cette stratégie expérimentale permet le meilleur respect possible de la règle des 3R.
Raffinement
Le bien-être animal est une préoccupation majeure lors de la réalisation de nos expérimentations. Dans ce projet, nous veillerons à ce que l'hébergement des animaux leur permettent d'avoir un enrichissement (paille, bois et coton) suffisant et stimulant pour réaliser leur nid. Les animaux seront hébergés à 3 individus par cage dans un local à température contrôlée avec un cycle lumière/obscurité de 12H00. Les souris auront libres accès à l'eau et à la nourriture. Afin de réduire le stress des animaux, les souris seront habituées aux expérimentateurs qui les manipuleront de façon bi-hebdomadaire (suivi de poids). Nous serons aussi particulièrement vigilants à l'apparition de tout signe évocateur d'une souffrance animale. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée afin de déceler l'apparition des signes généraux évocateurs de souffrance. Les animaux seront scorés sur 3 critères, le changement de poids corporel, l'apparence physique, et le comportement.
Choix des espèces
Les données dans le domaine de la cachexie associé au cancer ont largement été obtenue chez la souris. Par ailleurs, l'ensemble des techniques nécessaires à la réalisation de ce projet a été développé chez la souris. En travaillant chez la souris, nous pourrons donc interpréter nos données à la lumière des données publiées dans le domaine et nous éviterons toute étape de mise au point préalable qu'aurait nécéssité l'utilisation d'un autre modèle animal. Par ailleurs, la cachexie associée au cancer est un processus multifactoriel systémique mettant en jeu de nombreux tissus (muscle, tissus endocriniens, système nerveux central). Un système expérimental in vitro ne permettrait pas de reproduire la complexité de ces régulations. Les souris seront utilisées à partir de l'âge de 11 semaines correspondant à un stade précachectique chez les souris mâlesApc. La fin de procédure aura lieu a l'âge de 15 semaines correspondant à une stade cachexie modérée chez les souris mâles Apc. La cachexie sé développent entre l'âge de 11 et 15 semaines, un traitement pendant cette période permettra de vérifier l'efficiacité de l'oestrogénothérapie.
Evaluer l’efficacité thérapeutique d’un nouveau traitement contre les complications des radiothérapies cérébrales sur un modèle de souris C57BL/6J – 2/3
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Le crâne des souris est irradié sous anesthésie gazeuse, dix minutes par séance, puis leur mémoire et leur locomotion sont testées quatre fois sur six mois. 644 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs structures cérébrales, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger pour 98 d'entre elles, modéré pour 378 et sévère pour 168. L'objet est de tester des vésicules extracellulaires issues de cellules souches contre les troubles de l'attention et de la mémoire qui touchent 50 à 90 % des patients dans les six mois suivant une radiothérapie cérébrale. Le porteur provoque donc délibérément des lésions du cerveau, mais sa liste des nuisances attendues ne retient que le stress du transport, un inconfort transitoire après les injections et les effets possibles des anesthésies répétées.
Objectifs
La radiothérapie dans le traitement des tumeurs cérébrales peut conduire à la mort de cellules non tumorales comme les cellules constituant les vaisseaux sanguins et les neurones. En effet, chez 50-90% des patients suite au traitement de tumeurs du cerveau par radiothérapie il est observé dans les 6 mois des troubles neurologiques avec des troubles de l’attention, de la mémoire ou de la résolution de problèmes. Il est donc indispensable de proposer de nouveaux traitements afin d’améliorer la qualité de vie des patients. Dans ce projet, nous allons évaluer l’efficacité thérapeutique des vésicules extracellulaires issues de cellules souches mésenchymateuses (CSM) pour limiter les impacts de la radiothérapie. Les CSM sont un type de cellules souches adultes très utilisées en médecine dite régénérative. Elles ont la capacité de se renouveler pour créer des cellules spécialisées capable de réparer la fonction d’un organe. Elles sont prélevées chez une personne à partir de la moelle osseuse ou de la graisse corporelle. Elles sont mises en culture puis administrées à l’homme. Cependant, cette stratégie thérapeutique cellulaire a ses limites telles que la transplantation autologue des CSM (prélèvement et administration chez la même personne). Cette technique limite le nombre de patients pris en charge en raison du temps nécessaire à la mise en culture. On note surtout une efficacité des cellules diminuées en fonction de l’âge et de facteurs de risques associés (hypertension, cholestérol). Les cellules peuvent être aussi inutilisables si elles ont été irradiées lors du traitement par radiothérapie. Des études ont démontré que l’effet thérapeutique des CSM serait majoritairement lié à la sécrétion de vésicules extracellulaires (VE). Elles sont produites en grand nombre par les CSM suite à leur activation par des facteurs stimulants. Une production de VE in vitro permet de s’affranchir des limites liées à l’utilisation des CSM via le patient. Les VE sont stockées et conservées sous forme lyophilisée simplifiant leur administration. Les VE permettent de limiter la destruction des vaisseaux sanguins (qui est observée après exposition aux rayonnements ionisants) et donc pourraient permettre de limiter le développement des troubles cognitifs.
Bénéfices attendus
Les bénéfices que ce projet apportera sont multiples tel que - une nouvelle thérapie non-invasive - une réduction des troubles cognitifs (troubles de l’attention, de la mémoire ou de la résolution de problèmes) - une amélioration de la qualité de vie. .
Procédures
Prélèvement sanguin 1 fois sous anesthésie gazeuse isoflurane avant euthanasie, durée du prélèvement sanguin 15 secondes, Prélèvement sanguin répétés sous anesthésie gazeuse isoflurane, durée du prélèvement sanguin 15 secondes Perfusion intracardiaque sous anesthésique, durée 15 minutes Irradiation cérébrale sous anesthésie gazeuse : 10 min sous anesthésie gazeuse isoflurane Administration intra-veineuse sous anesthésie : environ 1 min par administration Les animaux subiront plusieurs fois les interventions qui suivent à différents temps. Tests comportementaux (mémoire, locomotion) réalisés 4 fois sur une période de 6 mois Analyse échodoppler sous anesthésie : 10 min.
Impact sur les animaux
Pour les irradiations (EU2), les animaux étant anesthésiés pour limiter les mouvements, il peut y avoir un effet des anesthésies répétées et les effets potentiels de l’anesthésie sur les variables physiologiques. Pour les administrations et les prélèvements (EU1), même si les animaux sont légèrement anesthésiés, il est possible de noter un inconfort transitoire immédiatement après l’administration. Il peut être noté après des difficultés à respirer, une atteinte des yeux. Pour les transports, il peut être noté un stress chez les animaux suite aux changements des conditions environnantes. Pour les analyses d’imagerie des vaisseaux cérébraux (EU3), les animaux étant anesthésiés pour limiter les mouvements, il peut y avoir un effet des anesthésies répétées et les effets potentiels de l’anesthésie sur les variables physiologiques. Pour les tests de comportements (EU2), il peut être noté un stress chez les animaux suite aux changements des conditions environnementales.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de réaliser les prélèvements des structures cérébrales.
Remplacement
Le nouveau développement de stratégie thérapeutique doit être validé sur des modèles précliniques (modèles animaux). En effet, lors des demandes d’Autorisation de mise sur le marché (AMM) ou des médicaments de thérapie innovante auprès de l’ANSM les études précliniques (modèle rongeurs, porcins ou primates) sont demandés. De plus, les modèles in vitro (culture isolée de cellules en boîte de pétri) ne permettent pas d’évaluer le réseau vasculaire ni les troubles cognitifs. Par conséquent l’utilisation d’un modèle murin est indispensable pour valider notre approche thérapeutique.
Réduction
Les modèles d’expérimentation animale présentent une certaine variabilité de réponse. De plus le retour d’expérience des médecins, chercheurs et biostatisticiens déterminent qu’un nombre de 12 ou 15 animaux dans chaque groupe expérimental est nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement robustes afin de valider notre nouvelle thérapie.
Raffinement
Un suivi quotidien des animaux sera réalisé par les personnes compétentes impliquées dans ce projet, afin d’appliquer les points limites pour réduire la souffrance des animaux. De plus, lors de leur transport, les animaux seront placés dans des boites avec sciure, coton et gel qui remplace l’eau et les croquettes (5 animaux par boites de transport, nous ne mélangeons pas les groupes d’animaux). Si un animal présente des signes de souffrance, une mise à mort anticipée sera réalisée. Pour les techniques (échodoppler, irradiation et injection) les animaux seront maintenus sous anesthésie gazeuse.
Choix des espèces
Afin de développer et proposer des thérapies, nous sommes dans l’obligation d’utiliser un modèle in vivo. Le modèle murin sélectionné pour ce travail est le plus pertinent puisqu’il est le plus utilisé dans les études précliniques. Également, nous avons déjà démontré dans différents modèles murins soumis aux rayonnements ionisants l’efficacité thérapeutique des VE-CSM dans les processus de néovascularisation et la réparation tissulaire. Enfin, nous maîtrisons les techniques indispensables afin d’évaluer les paramètres vasculaires, inflammatoires et cognitifs pour démontrer l’efficacité de notre traitement. De plus, les animaux seront utilisés entre 8/12 semaines, correspondant au stade adulte. Ce stade a été choisi afin d’éviter une hétérogénéité liée à l’âge qui pourrait modifier les paramètres étudiés. A cet âge les animaux présentent des réseaux vasculaire et neurologique matures et stables. Les animaux seront utilisés entre 8/12 semaines, correspondant au stade adulte. Ce stade a été choisi afin d’éviter une hétérogénéité liée à l’âge qui pourrait modifier les paramètres étudiés.
Evaluation de l’efficacité de la combinaison de techniques innovantes en radiothérapie et immunothérapie
- Recherche appliquée
- Cancers
Les rats qui atteignent un point limite de la grille de score sont mis à mort, seuil d'autant plus proche que le critère d'évaluation retenu est la durée de survie après irradiation. 198 rats vont être utilisés, la moitié dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués pour évaluation histologique. Une tumeur cérébrale leur est implantée sous quarante-cinq minutes d'anesthésie, puis le crâne est irradié deux semaines plus tard, ce qui provoque apathie, perte de poids et ulcérations du cuir chevelu pendant cinq à six jours. Le porteur écrit que la preuve de concept de ces techniques de radiothérapie existe déjà et situe le projet sur le chemin d'éventuels premiers essais cliniques.
Objectifs
La radiothérapie est l’une des méthodes les plus efficaces et les plus utilisées pour traiter les cancers. Au moins 50% des patients atteints d’un cancer sont traités par radiothérapie durant leur maladie. Le principal défi de la radiothérapie est de parvenir à déposer une dose curative dans la tumeur tout en s’assurant que les tissus sains environnants soient préservés dans leur intégrité. Pour certains types de tumeurs radiorésistantes comme les gliomes (tumeurs cérébrales), la radiothérapie ne peut être que palliative. Pour parvenir à une dose de radiation curative, le risque de dommages graves aux tissus sains est trop élevé pour pouvoir être considéré. Dans ce contexte, notre objectif principal s’inscrit dans l’amélioration des traitements de radiothérapie. Dans le cadre de ce projet, nous nous focaliserons sur des techniques innovantes utilisant de nouvelles modalités de traitement qui ont montré un intérêt significatif dans la préservation des tissus sains (même à des doses très élevées) ainsi qu’un effet très efficace sur le contrôle de la croissance tumorale et une activation efficace du système immunitaire chez des rongeurs. Nous cherchons à améliorer encore l’indice thérapeutique de ces techniques innovantes qui utilisent du fractionnement spatial de la dose en les combinant avec des nouvelles substances immunomodulatrices telles que des gels polymères chargés de nanotransporteurs de gènes pour l’expression forcée de molécules immunostimulantes. Nos critères d’évaluation pour l’efficacité de la technique vont porter sur l’ augmentation de la survie des animaux
Bénéfices attendus
Ce projet pionnier a un fort impact sociétal. Il explore des techniques novatrices en radiothérapie (RT), avec moins d’effets secondaires dans les tissus sains et permet un contrôle tumoral égal ou supérieur à la RT conventionnelle Le gain en matière d'épargne/récupération tissulaire contribuera à l'élimination du principal obstacle dans les traitements de cancer par RT : les doses de tolérance des tissus normaux. A la fin du projet, nous disposerons d'études radiobiologiques complètes qui nous permettront de procéder à des essais cliniques pouvant bénéficier à des patients qui actuellement reçoivent un traitement seulement palliatif ou pour lesquels les conséquences sur les tissus sains sont très impactantes pour leur qualité de vie et pouvant également ouvrir une voie vers un traitement efficace des tumeurs très radiorésistantes comme les gliomes. En outre, les connaissances biologiques acquises permettront d'améliorer d'autres techniques de RT et peut-être de changer certains des paradigmes de la RT conventionnelle. La preuve de concept de ces techniques innovantes existe déjà, le projet est sur la voie qui va de la conception de l'idée aux éventuels premiers essais cliniques.
Procédures
Dans un premier temps, des cellules tumorales seront implantées dans le cerveau de rats anesthésiés (anesthésie environ 45 minutes). 13 jours après l’implantation des cellules tumorales, les animaux recevront des injections de traitements 5 à 7 jours post irradiation, sous anesthésie générale (durée de l’anesthésie : 30 minutes). 14 jours après l’implantation des cellules tumorales les animaux seront irradiés sous anesthésie générale (durée de l’anesthésie : 20 minutes) au niveau du cerveau . Tous les rats implantés dans le cerveau avec des cellules tumorales seront imagés 1 fois 1 à 3 jours avant irradiation sous anesthésie générale (durée de l’anesthésie : 3-4 minutes) afin de s’assurer de la présence de la tumeur.
Impact sur les animaux
L’implantation intracérébrale de cellules tumorales aura pour conséquence le développement d’une tumeur dans le cerveau. Suite à ces chirurgies et à l’irradiation, des signes d’ apathie peuvent apparaître, suivis d’une perte de poids transitoire et d’une réduction de la mobilité pendant 3 à 5 jours. Les animaux peuvent présenter des dépilations voire des croûtes et même des ulcérations au site d’irradiation pendant 5 à 6 jours.
Devenir
tous les animaux seront mis à mort pour une évaluation histologique.
Remplacement
Nos critères d’évaluation pour l’efficacité de la technique vont porter sur la préservation des tissus sains environnants la tumeur et sur le contrôle de la croissance des tumeurs irradiées. De même, les mécanismes inflammatoires et vasculaires induits par l’irradiation ne pourront être étudiés que dans la globalité d’un organisme vivant intégré. Il est donc impossible de faire nos d’études avec des approches in vitro ou en utilisant des organoïdes. Aussi, le recours à des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans ce projet et il nous est indispensable de développer des modèles animaux.
Réduction
Le nombre d'animaux à utiliser a été calculé à l'aide d'outils statistiques. Ce nombre est ajusté au plus bas mais permet tout de même de pouvoir conclure.
Raffinement
Un délai minimum d’une semaine est respecté entre la réception des animaux et la mise en place des procédures expérimentales pour leur permettre de s’adapter à leur nouvel environnement. Une étape de socialisation des rats sera mise en place avant toute expérimentation : les rats seront manipulés quotidiennement pour les habituer au manipulateur et à la préhension et permettre ainsi une réalisation plus aisée et moins stressante des procédures expérimentales par la suite. Dans un souci de raffinement, nous veillerons quotidiennement au bien-être des animaux (une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux) pour permettre la détection de signes précoces de détresse ou de mal-être (détail des points limites appliqués dans la description de la procédure). L’ensemble des procédures sera réalisé sous anesthésie générale associée à des analgésiques adaptés aux interventions chirurgicales mises en place. Suite à l’irradiation des signes de détresse ou de mal-être peuvent apparaître, suivis d’une perte de poids et d’une réduction de la mobilité pendant quelques jours (3 à 5 jours). Pour y remédier, des aliments appétants seront ajoutés dans la cage. Les animaux peuvent présenter des dépilations voire des croûtes et même des ulcérations sur le dessus de la tête, à l’endroit de l’irradiation pendant quelques jours (5 à 6 jours), une crème, apaisante cicatrisante sera administrée sur la peau pour permettre la cicatrisation (au minimum 1 semaine, application quotidienne). En cas d’atteinte d’un point limite, conformément à la grille de score, les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
Les rongeurs sont particulièrement utilisés en cancérologie et dans les études de radiothérapie car il s’agit d’espèces génétiquement caractérisées et pour lesquelles les références bibliographiques sont très nombreuses dans la littérature ayant trait au domaine de la radiothérapie. Notre projet va nécessiter de travailler sur des rats chez lesquels la taille plus importante du cerveau va être plus adaptée aux types d’irradiation proposés dans le cadre des procédures expérimentales. Les procédures seront réalisées sur des animaux adultes de 6-7 semaines, âge compatible avec un développement suffisant et la possibilité de garder les animaux assez longtemps pour permettre une étude des effets à long terme de l’irradiation.
Caractérisation de nouveaux modèles de l’autisme chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Porteuses de mutations décrites comme identiques à celles trouvées chez des personnes autistes, 2 259 souris vont être utilisées, dont 80 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 1 728 un niveau modéré. Les actes vont de la biopsie du bout de la queue et du tatouage jusqu'à une chirurgie de trente minutes, en passant par des gavages, des prises de sang avec risque d'hémorragie et six tests comportementaux dont l'un dure deux heures. Certains animaux reçoivent des substances qui peuvent provoquer un état cataleptique et épileptique pendant quarante minutes. Toutes sont tuées pour que leurs tissus soient analysés par biochimie et imagerie, le porteur ne consacrant qu'une phrase au remplacement, l'étude du comportement exigeant selon lui "l'organisme entier".
Objectifs
Les troubles du spectre de l’autisme sont des troubles du neurodéveloppement qui touchent 1 à 2% de la population. Ils sont caractérisés, entre autres, par des altérations dans le développement des capacités cognitives, de communication et d'interaction sociales. Ils constituent un véritable handicap pour le patient et malheureusement, à ce jour, il n’existe aucun traitement curatif car les causes de cette pathologie restent encore mal connues. Notre objectif est de caractériser de nouveaux modèles de souris ayant des mutations identiques à celles observées chez les patients et d’identifier des mécanismes pouvant être à l’origine des troubles du spectre de l’autisme et qui pourront être ciblés à l’avenir pour le développement de nouvelles thérapies.
Bénéfices attendus
Notre travail vise à identifier les déficits présents chez des souris modèles des troubles du spectre de l’autisme. Ce projet apportera des données importantes pour mieux comprendre les mécanismes mis en jeu dans cette pathologie et ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour leur traitement.
Procédures
-Injections intra-péritonéales et sous-cutanées (entre 1 et 6 fois; durée 30 seconds) - identification par tatouage, biopsie de l’extrémité de la queue, prises de sang : stress et douleur légère de courte durée (1 fois, durée 30 seconds) - prises de sang : stress, douleur légère et risque d’hémorragie (1 fois, durée 1 minute) - chirurgie sous analgésie et anesthésie générale (1 fois, durée 30 minutes) - Administration de médicaments qui peuvent causer un état cataleptique et épileptique (1 fois, durée 40 min au maximum, généralement 10-20 mins) - Gavage: stress (1 fois, durée 10 seconds) - Tests de comportement : stress (6 tests, entre 5 min et 2h selon le test)
Impact sur les animaux
Injections intra-péritonéales et sous-cutanées, identification par tatouage, biopsie de l’extrémité de la queue : stress et douleur légère de courte durée Prises de sang : stress, douleur légère et risque d’hémorragie Chirurgie : douleur, perte de sang Injection de certaines drogues peuvent causer un état cataleptique et épileptique Gavage : stress et risque de fausse route Tests de comportement : stress
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérience parce que nous aurons besoin d’analyser le tissue avec des méthodes biochimiques et d’imagerie.
Remplacement
Cette étude nécessite une approche comportementale qui n’est possible qu’à l’échelle de l’organisme entier, nous devons donc faire appel à des modèles animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est le minimum nécessaire permettant une analyse statistique robuste des résultats et a été déterminé grâce à une analyse de puissance statistique et aux données collectées au cours d’expériences précédentes. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Pour éviter toute souffrance, les procédures de chirurgie se feront sous analgésie et anesthésie générale. Les souris seront observées régulièrement et une grille précise d’évaluation des points limites sera utilisée. Tout signe de douleur, souffrance, angoisse ou stress chez les animaux sera soulagé avec des analgésiques. Les souris seront logées à raison de 5 compagnons (frères, sœurs) par cage dans un environnement enrichi.
Choix des espèces
L’espèce souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier la physiologie des mammifères dans une population homogène d’animaux. Les souris présentent un système nerveux suffisamment développé pour permettre une extrapolation des résultats à l’espèce humaine. De plus, les modèles transgéniques utilisés dans ce projet ont été créés chez la Souris. Pour toutes maladies neurodéveloppementaux il est important de comparer des animaux adolescents avec des animaux adultes car certains phénotypes se manifestent seulement avant l’âge adulte. Donc, nous utiliserons des animaux seront injectés au stades adolescents (6 semaines) et adultes (3 mois).
Etude de l’effet de nouvelles cibles thérapeutiques dans un modèle de sepsis induite par ligature et la perforation du caecum chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Le cæcum ligaturé puis perforé pour déclencher un sepsis, 1 800 souris se réveillent avec une douleur que le porteur qualifie lui-même de sévère, suivie de douleurs inflammatoires aiguës à mesure que l'infection progresse. Chaque animal reçoit ensuite jusqu'à vingt-huit administrations de composés, et toutes sont tuées pour prélèvement d'organes, de tissus et de sang. L'objet est de tester des antibiotiques et des anti-inflammatoires candidats, dans un domaine où le porteur rappelle que le seul médicament autorisé depuis vingt ans a été retiré du marché en 2011. La rubrique consacrée au raffinement ne décrit que l'hébergement, les cages ventilées, l'eau et la nourriture à volonté, sans mentionner un seul point limite ni la moindre analgésie.
Objectifs
Le sepsis est considéré comme un dysfonctionnement d'organes potentiellement mortel, résultant d’une réponse dérégulée de l'hôte à l'infection, et dont la forme la plus grave est le choc septique. Le sepsis s’accompagne d’une production exacerbée de médiateurs inflammatoires. On parle par exemple d’un « orage cytokinique » pour évoquer la production massive de cytokines (médiateurs chimiques qui permettent la communication entre nos cellules), qui affectent le fonctionnement des organes vitaux de manière aigue, et peuvent entrainer des séquelles fonctionnelles à plus long terme. Ainsi, environ 25% des patients qui survivent à un sepsis présentent des altérations cognitives plus de 3 mois après. Le sepsis affecte principalement les individus déjà fragilisés, les nouveau-nés et les personnes âgées, mais peut atteindre des personnes sans affection préalable. Au niveau mondial, on estime à 11 millions le nombre de décès par an des suites d’un sepsis. Les projections dans l’avenir suggèrent un doublement du nombre de cas d’ici cinquante ans, en particulier en raison du vieillissement de la population. Ce projet a pour but de tester de nouveaux médicaments antibiotiques et/ou anti-inflammatoires dans un modèle animal de sepsis qui sont à l'heure actuelle trop peu nombreux.
Bénéfices attendus
Les patients atteints de sepsis sont généralement admis en soins intensifs, où ils reçoivent des antibiotiques et les supports nécessaires au maintien des fonctions vitales. Depuis plus de vingt ans, malgré des progrès considérables accomplis dans la compréhension de la physiopathologie associée au sepsis, aucune nouvelle thérapie spécifique au sepsis n’a vu le jour. De très nombreux essais cliniques coûteux se sont achevés par des échecs, et le seul nouveau médicament autorisé spécifiquement dans cette indication (Xigris®) a été finalement retiré en 2011, faute d’une démonstration convaincante de son efficacité. Ce projet a pour but de tester de nouveaux médicaments antibiotiques et/ou anti-inflammatoires dans un modèle animal de sepsis afin de proposer aux patients de nouveaux traitements. Des prélèvements de tissus/organes/sang seront ensuite effectués pour des dosages immunologiques.
Procédures
Les animaux vont être soumis à une chirurgie (15 min/souris), des administrations des composés (max 14 à 28 administrations selon la voie d'administration, durée: 30 secondes) ainsi qu'un prélèvement de sang (durée 30 secondes).
Impact sur les animaux
La partie chirurgicale avec ligation et perforation du caecum induit une douleur sévère au réveil qui va conduire à des douleurs inflammatoires aigues liées au développement de la pathologie. Les traitements induiront une douleur légère dans le cas de traitements en gavages à modérée dans le cas de traitements en intraveineuses. La douleur pourra générer une perte de poids qui sera suivi quotidiennement.
Devenir
Tous les animaux de la Procédure sont mis à mort à la fin de l’expérimentation afin de prélever les organes, tissus, sang pour des analyses, dosages immunologiques. Ces différents dosages et quantifications vont permettre de valider le modèle ainsi que l'analyse de l'efficacité des différentes molécules testées
Remplacement
Nous proposons dans ce projet de tester de nouvelles molécules thérapeutiques dans un modèle de sepsis induite par ligature et la perforation du caecum chez la sourisLes souris sont les plus petits animaux chez qui la réponse inflammatoire peut être étudiée et pour lesquels les tests précliniques permettant de caractériser les réponses immunitaires au niveau cellulaire et moléculaire sont les plus développés. Les méthodes substitutives à l’expérimentation animale telle que la culture cellulaire ou la modélisation informatique ne peuvent être utilisées ici puisque nous testons des molécules candidat médicament. Aucun modèle expérimental in vitro ou aucune modélisation informatique n’est à même de remplacer l’animal entier pour étudier l’efficacité de molécules thérapeutiques et les interactions entre les différents acteurs cellulaires et moléculaires des réponses inflammatoires.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement significatifs évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations. Le test statistique utilisé pour déterminer les différences entre chaque groupe va changer selon la distribution des échantillons. Le projet pourra comporter jusqu’à 10 études, incluant au maximum 180 souris, soit 1800 animaux au total.
Raffinement
Les animaux sont suivis quotidiennement et les souris seront hébergées dans des cages en portoir ventilé dès leur arrivée. Les cages seront changées le jour de l'induction avant chirurgie, pour limiter les risques d'infection. Elles auront un accès à l’eau et la nourriture ad libitum et auront un cycle jour/nuit pendant toute la durée de l’expérimentation.
Choix des espèces
La souris est un animal pour lequel les outils génétiques, les anticorps spécifiques permettant la caractérisation des réponses immunitaires au niveau cellulaire/moléculaire sont les plus développés. Notre établissement hébergeur utilise des souris, ce qui donne de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. La souris c’est : -99% de similitude avec le génome Humain -aucun gène manquant ou supplémentaire susceptible de modifier l’intensité de l’inflammation obtenue -la plus utilisée dans le monde, permettant une continuité et un moyen de comparaison par la communauté scientifique internationale -C'est l’animal de laboratoire le plus utilisé par la communauté scientifique et pour les études précliniques, selon les références bibliographiques. Les animaux sont utilisés au stade adulte (minimun 8 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature (développement thymique achevé). Les paramètres étudiés étant l’inflammation et son mécanisme, une souris juvénile ou trop âgée induira un biais dans l’expérimentation.
le dialogue entre les astrocytes et l’endothélium, un acteur clef de la physiopathologie de la neuro-inflammation
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Du lysat de myéline est injecté sous la peau du dos, suivi de deux injections de toxine, pour déclencher une maladie auto-immune du système nerveux central qui paralyse le train arrière. 1 680 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées pour prélèvement d'organes, après un génotypage par tatouage des pattes et section de l'extrémité de la queue entre le septième et le dixième jour de vie. D'autres subissent une chirurgie stéréotaxique de moins de vingt minutes pour recevoir un composé inflammatoire dans le cerveau, l'ensemble visant à comprendre le rôle des astrocytes et des cellules des vaisseaux dans la sclérose en plaques. Le porteur qualifie la paralysie du train arrière de non douloureuse, annonce un suivi quotidien du score de J0 à J45 et une mise à mort dès le point limite atteint, sans dire à quel degré de paralysie ce seuil est fixé.
Objectifs
La sclérose en plaques est une maladie inflammatoire du Système Nerveux Central (SNC) d'origine autoimmune associée à une demyélinisation et une perte axonale, responsable d'une neurodégérescence chez les patients. Aujourd'hui, 2,3 millions de personnes dans le monde sont affectés par cette maladie qui touchent principalement les sujets jeunes de moins de 50 ans. La cause de la sclérose en plaques reste inconnue et il n'existe pas de traitement curatif contre cette maladie. De plus, il est important de noter que les options thérapeutiques actuelles disponibles pour prévenir les formes sévères de la sclérose en plaques sont principalement des immunothérapies (par exemple le Natalizumab (Tysabri®)) dont le mécanisme d'action conciste à bloquer l'activité et/ou l'infiltration des cellules inflammatoires dans le parenchyme cérébral. Malheureusement, l'utilisation de ces therapies est limitée du fait de leur effets indésirables associés notamment une diminution de l'efficacité du système immunitaire et une toxicité hépatique et rénale. Ce projet a pour objectif de mieux comprendre la physiopathologie de la sclérose en plaques, ce qui est primordial pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Plus précisément nous nous attacherons à mieux comprendre le rôle de l'unité gliovasculaire, c'est à dire des cellules endothéliales et des astrocytes dans le SNC en contexte neuro-inflammatoire aigu et chronique. A plus long terme nous souhaitons identifier de possibles stratégies thérapeutiques ciblées au niveau de l'unité gliovasculaire jusqu'à présent peu explorées et exploitées pour fournir des alternatives originales et sûres aux traitements actuels que représentent les immunothérapies dans la prise en charge des rechutes et de la progression de la sclérose en plaques.
Bénéfices attendus
Mieux comprendre comment les cellules endothéliales et les astrocytes se comportent au cours de la sclérose en plaques. Ces cellules composent une barrière (la barrière hémato-encéphalique) qui sépare le sang circulant du cerveau mais en contexte de sclérose en plaques, leur comportement est modifié et elles ne jouent plus leur rôle de barrière. Cela va favoriser le passage de cellules immunitaires dans le cerveau depuis le sang et va également rendre ces cellules immunitaires plus agressives au cours du développement de la maladie. Nous allons plus précisément analyser les interactions entre les astrocytes, les cellules endothéliales et les cellules immunitaires à différents endroits (au niveau du vaisseau sanguin, dans l’espace entre le vaisseau et les astrocytes et dans le tissu cérébral lui-même). Nous allons analyser l'activation, la migration et la prolifération des cellules endothéliales, des astrocytes et des cellules immunitaires et leur production de composants délétères dans la sclérose en plaques. L’objectif à long terme est d’Identifier de nouvelles cibles thérapeutiques personnalisées pour les patients atteints de sclérose en plaques. En effet la sclérose en plaques est une maladie hétérogène avec des formes variées probablement dues à des mécanismes multiples.
Procédures
Toutes les souris seront génotypées entre J7 et J10 après la naissance. Pour cela, chaque animal est tatoué au niveau des pattes avec un numéro d'identification unique puis l'apex de la queue est prélevé pour réaliser le génotypage de l'animal. La durée pour réaliser le prélévement de l'apex sous contention est de quelques secondes et la durée pour réaliser le tatouage sous contention est de moins de 20 secondes. Les animaux avec les génotypes d'intérêt sont ensuite selectionnés pour réaliser les expérimentations. Toutes les souris subiront 1 série de 5 injections intrapéritonéales (1 par jour pendant 5 jours) pour induire le knockout. Chaque injection dure moins de 30 secondes. Pour le modèle de sclérose en plaques chez les souris: les animaux subiront deux injections sous cutanée de lysat de myéline en haut et en bas du dos associées à 2 injections intra-péritonéales de toxine (la première 2h après les injections de myeline, et la seconde 24h après). Les deux injections de myeline combinées durent moins de 30 secondes et les injections intra-péritonéales de toxine moins de 10 secondes chacune. Pour le modèle d'injection stéréotaxique chez la souris: les animaux subiront une injection sous cutanée d'analgésique avant la chirurgie (la chirurgie stéréotaxique dure moins de 20 min par animal). Suite à la chirurgie, les souris recevront trois injection d'anti inflammatoire en sous cutané. Chaque injection sous cutanée dure moins de 10 secondes.
Impact sur les animaux
Injections intra-péritonéale pour induire le knockout: administrations répétées pendant 5 jours consécutifs pouvant induire un stress lié à la contention ainsi qu'une douleur légère lors des injections. Induction de l'encéphalomyélite expérimentale autoimmune: 2 Injections sous cutanées non douloureuses (en haut et en bas du dos) associées à 2 injections intra-péritonéales pouvant induire une douleur légère lors de l'injection. Les souris étant habituées pendant deux semaines avant l'induction, le stress est minimal pour les animaux (l'absence de stress chez les animaux est essentiel pour avoir une réponse uniforme et cohérente à l'induction de la maladie). La paralysie du train arrière est non douloureuse mais peut s'accompagner d'un stress chez l'animal qui doit être surveillé quotidiennement. Injection stéréotaxique: injection sous cutanée non douloureuse d'un analgésique avant la chirurgie pouvant entrainer un stress chez l'animal lié à la contention. Cependant les animaux sont habitués avant la chirurgie notamment à la contention pour minimiser ce stress. Les animaux reçoivent ensuite 3 injections sous cutanées d'anti inflammatoire en post-opératoire pour empêcher l’apparition de douleur associée à l'acte chirurgical. Là encore cela nécessite la contention des animaux.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort afin d'effectuer le prélèvement d'organes.
Remplacement
La sclérose en plaques est une maladie complexe faisant intervenir de nombreux types cellulaires dans le cerveau (cellules endothéliales, astrocytes, péricytes, neurones, oligodendrocytes) et dans le sang (cellules immunitaires comme les lymphocytes). L'étude de l'ensemble de ces cellules et plus encore leurs interactions ne peut pas à l'heure actuelle être réalisées uniquement avec des tests in vitro de culture cellulaire. Le recours à un être vivant, mammifère, présentant des caractéristiques partagées avec l'homme est donc nécessaire et les rongeurs représentent un modèle de choix pour réaliser une analyse in vivo complémentaire des autres expériences.
Réduction
Le nombre d'animaux a été calculé à l'aide d’un logiciel qui nous permet de limiter au maximum le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des différences significatives entre les groupes comparés (concernant le score de paralysie dans le modèle de sclérose en plaques chez la souris notamment). Le nombre de souris par groupe et par analyse, calculé par le logiciel, est de 10. Il faut noter cependant que nous ne pourrons pas faire toutes les analyses sur une seule souris. Pour le modèle de sclérose en plaques chez la souris, il faudra 3 lots de 10 souris par groupe pour 3 temps soit 90 souris totales par groupe. Pour le modèle d'injection dans le cerveau d’un composé inflammatoire, il faudra 3 lots de 10 souris pour 3 temps soit 30 souris total pour chaque groupe. Ce chiffre est conforté par notre propre expérience et par celle de la communauté scientifique s'intéressant à la sclérose en plaques, 10 animaux par lot et par analyse sont nécessaires pour obtenir des résultats exploitables statistiquement aussi bien pour les mesures de la paralysie et les analyses histologiques et moléculaires. Pour réduire le nombre d'animaux, aucune expérience déjà publiée ne sera reproduite. Les manipulations seront réalisées par du personnel technique entrainé de façon à réduire la variabilité des résultats donc le nombre d'animaux nécessaires.
Raffinement
L’hébergement des souris sera réalisé dans des conditions qui limiteront le stress et l’inconfort (animalerie agrée, personnels formés, cage de 3 à 6 animaux maximum en portoir ventilé avec libre accès à l’eau et à la nourriture ainsi qu’un environnement enrichi avec igloo cartonné et serpentins de papier à dérouler). La souffrance des animaux sera réduite par l'usage d'anesthésiques et d'antalgiques adaptés pour la réalisation des gestes douloureux. D'autre part, les animaux seront surveillés quotidiennement par le zootechnicien, le responsable du bien-être animal ou l'expérimentateur. Dès le début des expérimentations, une fiche bien-être est ouverte. Y sont gradés l'apparence, la perte de poids, les signes cliniques et le comportement. Les animaux sont surveillés quotidiennement par l’expérimentateur ou le zootechnicien (Y compris le week-end). Si ce n'est pas l'expérimentateur, lui-même qui détecte un signe de souffrance ou de mal être, il sera immédiatement alerté. En fonction du score, la cage est identifiée avec une carte « à surveiller » et surveillée plus fréquemment (2-3 fois par jour) ou bien si le score est plus élevé, les souris reçoivent un traitement antalgique avec mise à disposition de nourriture humide associé au nettoyage/re-fermeture des plaies (si nécessaire) et à des visites plus fréquentes de l’expérimentateur (toutes les deux heures). Lorsque le score atteint le point limite, l’animal est mis à mort immédiatement par le zootechnicien/l'expérimentateur. Pour les animaux avec la sclérose en plaques, un scoring quotidien sera réalisé entre J0 et J45. Dès que les animaux montreront les premiers signes de paralysie, l'expérimentateur mettra à leur disposition des croquettes mouillées sur le sol de la cage. La déshydratation sera évaluée quotidiennement par pincement de la peau du cou et de l'hydrogel sera utilisé comme source d'eau dès les premiers signes de déshydratation.
Choix des espèces
Pour l'étude de la sclérose en plaques, la souris est le modèle animal de choix en terme de susceptibilité à l'induction mais également pour le développement de symptômes très proches de ceux observés chez l'homme. Cela permettra, à terme, d'extrapoler les résultats, obtenus lors de notre étude pré-clinique chez la souris, à l'homme. La souris est un modèle de mammifère à sang chaud dont l'organisation structurale des vaisseaux du cerveau présente de nombreuses similitudes avec l'organisation des vaisseaux du cerveau chez l'homme. La souris est à ce jour la seule espèce de mammifère pour laquelle il est possible, en routine, de modifier le génome afin de créer des modèles d'études de maladies humaines. Les souriceaux seront génotypés à J7-J10 après la naissance. Des souris adultes âgées de 8 semaines (début du protocole) à 5 mois (fin du protocole) seront ensuite utilisées pour les expérimentations. Notre objectif n'est pas d'étudier des processus développementaux mais des processus physiopathologiques.