Procédures sévères

Injectées sans anesthésie de cellules leucémiques dans la veine de la queue, 960 souris de six à huit semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Une ponction de moelle osseuse au fémur, sous anesthésie, suit l'évolution de la maladie, puis les souris malades reçoivent jusqu'à cinq jours de chimiothérapie par injections dans l'abdomen et la queue, elles aussi sans anesthésie, et une partie passe en imagerie. La rate gonfle et peut gêner leurs déplacements, le porteur jugeant possible qu'elle "cause des douleurs" même si les signes visibles en sont rares, et la chimiothérapie peut leur faire perdre du poids, avec un poil terne et parfois le dos voûté pendant deux à trois jours. L'objectif est de comprendre comment une protéine participe à la mort des cellules leucémiques sous chimiothérapie, et les souris sont tuées au plus tard quatre mois après l'injection, plus tôt si elles franchissent un point limite, pour prélever rate et moelle osseuse.

Objectifs

Les agents de chimiothérapie utilisés pour soigner les patients atteints de leucémie (cancer du sang) ont des mécanismes d’action variés, mais leur action précise et majoritaire est encore incertaine. Le projet a pour objectif de mieux comprendre les effets de la chimiothérapie classiquement utilisée pour soigner les leucémies. Nous étudierons en particulier l’importance d’un gène qui participe à la mort des cellules cancéreuses lorsque les patients sont traités avec la chimiothérapie. L’objectif est de comprendre par quels mécanismes la protéine issue de ce gène peut entrainer la mort des cellules cancéreuses.

Bénéfices attendus

Chez les patients atteints de leucémies, les rechutes sont très fréquentes après les traitements par chimiothérapie, en particulier chez les personnes âgées de plus de 60 ans. Les progrès à faire passeront par une meilleure compréhension des mécanismes d’action précis des chimiothérapies, qui pourront alors être améliorées. Ce projet permettra d’approfondir les connaissances sur la chimiothérapie et son mode d’action. Comprendre la manière dont la chimiothérapie conduit à la mort des cellules cancéreuses permet de travailler sur l’amélioration des traitements à plus long terme.

Procédures

Pour mettre en place le modèle de leucémie, les animaux seront soumis à une injection des cellules leucémiques par intraveineuse dans la queue. Cette procédure dure environ 20 secondes et se fait sans anesthésie. L’apparition de la maladie sera suivie par ponction de moelle osseuse (qui est le site d’expansion de ces cellules cancéreuses). Ce prélèvement sera fait au niveau du fémur, dans une patte arrière. Il se fait sous anesthésie et dure environ 2 à 3 minutes. Quand les souris commenceront à être malades, elles seront traitées avec une molécule administrée par injection dans l'abdomen (environ 5 à 10 secondes) et une molécule administrée en intra-veineuse dans la queue (environ 20 à 30 secondes). Ces procédures sont faites sans anesthésie. Pour une partie des souris, des séances d'imagerie seront réalisées (suivi des cellules cancéreuses dans l'animal vivant). Après injection d'une solution permettant de visualiser les cellules d'intérêt (injection dans l'abdomen; durée de 20 secondes), les souris sont anesthésiées puis placées dans un équipement d'imagerie avec maintien de l'anesthésie. Des images sont enregistrées sur une durée de 10 minutes maximum, avant l'arrêt de l'anesthésie et le réveil de l'animal.

Impact sur les animaux

La manipulation des souris pour le traitement engendre un stress, le souris pouvant être traitées quotidiennement pendant maximum 5 jours. Quand la leucémie se développe, la rate des souris grossit (splénomégalie). Cela peut gêner leur mobilité normale. On peut aussi penser qu’elle cause des douleurs même si des signes visibles de douleur ne sont que rarement présents en cas de splénomégalie faible ou modérée. Quand les souris sont traitées avec la chimiothérapie, elles peuvent perdre du poids à partir du troisième jour du traitement. Elles ont alors le poil moins régulier et parfois le dos voûté. Ces effets ont une durée de 2 à 3 jours.

Devenir

Tous les animaux seront systématiquement euthanasiés au maximum 4 mois post-injection si pas d’atteinte du point limite. Les organes cibles de la prolifération des cellules cancéreuses (rate, moelle osseuse) seront prélevés en post-mortem pour une analyse au niveau cellulaire.

Remplacement

Nous avons au préalable testé la chimiothérapie sur des modèles de cellules cancéreuses en culture. Le passage dans l’animal est maintenant nécessaire pour reproduire les conditions physiologiques d’un organisme proche de l’homme, pour confirmer et approfondir les hypothèses.

Réduction

Nous utilisons un nombre suffisant et optimal d’animaux par groupe pour avoir des différences statistiquement significatives entre les groupes. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés, différents temps de traitement seront testés en même temps afin de comparer les différents groupes testés à un seul et unique groupe contrôle.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes pour respecter leur comportement naturel. Ils seront surveillés quotidiennement, et une grille d’évaluation, tenant compte de leur apparence de leur comportement et d’un suivi clinique, sera tenue chaque semaine de façon à définir des points limites de douleur/souffrance suffisamment précoces pour déclencher le recours à l’euthanasie si ces points limites étaient atteints. Ce suivi sera quotidien lors de la phase de traitement. En cas de perte de mobilité, l’accès à la nourriture sera facilité. Les cages seront enrichies pour améliorer le bien-être des animaux. La ponction de moelle osseuse ainsi que l'imagerie seront réalisées sous anesthésie générale avec maintien de la température corporelle (utilisation de support à 37°C).

Choix des espèces

La souris est un petit mammifère suffisamment proche de l’Homme pour les expériences menées dans ce projet. Le gène étudié ainsi que la fonction de la protéine qui en découle sont très proches entre l’homme et la souris. Les molécules testées sont à administrer par différentes voies, toutes disponibles sur l’espèce animale choisie. De plus, le contrôle de leur bien-être au quotidien est facilité car les signes de souffrance/douleur ont été bien caractérisés chez cette espèce. Les leucémies touchent des cellules à un stade précoce de leur développement, ce qui nous conduit à utiliser des souris jeunes adultes de 6 à 8 semaines pour nos expérimentations.

Des cellules tumorales sont implantées sous la peau du flanc, puis chaque souris reçoit trois à six injections de produit en trois semaines, la tumeur est mesurée tous les deux jours et l'animal pesé avant et 24 heures après chaque injection. 1 080 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, pour tester des molécules immunostimulantes contre le cancer. Le porteur décrit une croissance tumorale en général bien tolérée, avec des lésions cutanées pouvant aller jusqu'à l'ulcération et la nécrose, et une gêne respiratoire dans le modèle de métastases pulmonaires. Toutes sont mises à mort à la fin de chaque procédure, au motif qu'elles ne peuvent être ni réutilisées, ni replacées, ni adoptées.

Objectifs

Notre organisme se défend à chaque instant contre des attaques extérieures grâce à la surveillance de notre système immunitaire. Néanmoins, en cas de cancer, ce dernier ne parvient pas à empêcher le développement de la maladie. Les traitements d’immunothérapie anticancéreuse vise donc à réactiver le système immunitaire c’est-à-dire à réapprendre aux cellules immunitaires à reconnaître et à détruire les cellules tumorales, cellules anormales à notre corps. Notre projet s’inscrit dans ce domaine par la recherche de solutions thérapeutiques innovantes qui s’attaquent à la cellule tumorale, mais également à son environnement immunitaire. Pour ce faire, nous développons des molécules immunostimulantes qui sont dans un premier temps sélectionnées in vitro à l’aide de tests cellulaires (criblage sur lignées cellulaires rapportrices et mise en œuvre de co-culture mimant les intéractions entre les cellules tumorales et les cellules immunitaires). Cependant, l’évaluation thérapeutique de molécules candidates sur des modèles in vivo demeure nécessaire pour comprendre leur mode d’action. C’est la raison pour laquelle, nous avons recours à divers modèles de tumeurs implantées chez la souris permettant de mimer la pathologie tumorale humaine. Ce projet a donc pour but de : - évaluer l’efficacité de nouvelles molécules à activité anti-cancéreuse - étudier les mécanismes mis en jeu dans la réponse immunitaire anti-tumorale - appréhender la sécurité de la molécule candidate dans des modèles expérimentaux de cancer.

Bénéfices attendus

En premier lieu, ce projet nous permettra d’établir des corrélations entre les réponses obtenues sur nos modèles cellulaires in vitro et la réponse anti-tumorale sur un organisme entier. Cela permettra ainsi de mieux comprendre les mécanismes des voies de l’immunité innée mis en œuvre dans la réponse anti-tumorale du candidat médicament et éventuellement de comprendre les mécanismes de résistance à certains traitements. D’autre part, ces expérimentations in vivo, dont le bénéfice principal attendu est une diminution significative du volume tumoral constituent un prérequis indispensable afin de consolider la preuve de l’efficacité du candidat médicament avant d’envisager son utilisation dans le cadre d’essais cliniques. Ces études précliniques permettent d’appréhender la toxicité de la molécule candidate, en identifiant les effets indésirables qui pourraient empêcher une molécule de passer en phase de développement clinique. Selon les résultats du projet, nous pourrions découvrir de nouvelles stratégies thérapeutiques bénéfiques en immuno-oncologie et proposer ainsi de nouvelles molécules à la communauté scientifique pour lutter contre le cancer chez l’homme, enjeu majeur de santé publique.

Procédures

Les animaux subiront différents types d'actes, injections ou prélèvements qui ne requièrent que quelques secondes à quelques minutes par animal. En fonction du produit thérapeutique testé, chaque animal aura : soit 3 injections ; soit 6 injections de produit avec 2 injections/semaine sur une durée de 3 semaines pour lesquels la douleur est modérée à sévère du fait de la répétition. Pour les interventions pouvant induire un stress chez l’animal, elles seront réalisées sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Pour les modèles sous-cutanés, les nuisances principales attendues sont liées à la progression tumorale (d’une durée maximale de 7 à 10 jours) qui peut s’accompagner de lésions cutanées d’intensité légère (inflammatoire) à sévère (nécrose) selon le type de tumeurs (l’ulcération de la tumeur ou perte de substance de la peau, étant la lésion la plus grave). La progression tumorale peut également engendrer une gêne dans le déplacement de la souris car l’injection des cellules tumorales génère une masse au niveau du flanc de la souris. Le volume tumoral est mesuré tous les 2 jours et un volume maximal a été déterminé comme critère d’arrêt de la procédure. Normalement, la croissance de la tumeur est bien tolérée par les souris, mais peut dans des cas rares, être associée à une perte de poids, une activité anormale, entraînant une nuisance d’intensité moyenne à sévère. Dans le cas du modèle métastatique pulmonaire, la nuisance d’intensité sévère associée à ce modèle est un inconfort respiratoire lié à la dissémination métastatique dans les poumons, observé uniquement à un stade évolutif tardif. D’éventuels effets secondaires des traitements anti-cancéreux tels que chimiothérapies ou immunothérapies sont possibles, mais il n’est pas attendu d’effet secondaire important avec les molécules évaluées dans ce projet. Quant aux effets prévus, concernant les animaux traités avec le produit thérapeutique, il est attendu une diminution du volume tumoral voire une disparition totale des tumeurs.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.

Remplacement

Afin de mettre au point des traitements plus efficaces, seuls les modèles in vivo nous permettent de comprendre les mécanismes complexes au sein d’une tumeur, alors que l’utilisation de lignées cancéreuses en culture est insuffisante pour comprendre les relations/interactions permanentes entre les différents types cellulaires dans un organisme entier. En effet, les tests biologiques sur cellules (in vitro) permettent de connaître rapidement l’activité recherchée mais ne permettent pas d’appréhender l’efficacité d’un produit thérapeutique ni son innocuité sur un organisme entier. Le recours à des animaux est justifié par la nécessité d’avoir un système immunitaire complet pour mesurer l’index thérapeutique et la réponse immunitaire antitumorale de nos molécules. L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques occupe donc encore aujourd'hui une place centrale en immuno-oncologie.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés dans une expérimentation sera de 46 au maximum. Ce nombre est réduit à son minimum soit 6 ou 10 animaux/groupe dans le cas des modèles sous-cutanés ou 8 animaux/groupe dans le cas du modèle métastatique. Il a été déterminé à partir de publications évaluant des biomolécules d’immunothérapie sur les mêmes modèles animaux utilisés dans ces procédures et il est suffisant pour mettre en évidence des différences significatives sur le volume tumoral, notre critère majeur. Cela permet également de limiter la répétition des études (réduction du nombre d’études) et de pouvoir gérer techniquement l’expérimentation (surveillance clinique plus adaptée du fait d’un nombre limité d’animaux) tout en gardant suffisamment d’animaux par groupe pour réaliser des études statistiques significatives. Le nombre maximal d'animaux considéré pour ce projet est par conséquent de 1080 souris, sur une durée maximale de 5 ans

Raffinement

Parmi les mesures spécifiques prises, nous privilégions l’utilisation de l’anesthésie gazeuse pour la sédation car elle permet une anesthésie de très bonne qualité, sûre et réversible ainsi qu’un réveil rapide. En effet, pour minimiser le stress et la douleur liés aux injections ou aux prélèvements sanguins, les animaux sont anesthésiés lors de la mise en œuvre de ces actes. D’autre part, nous mettons en œuvre des soins per-opératoires qui contribuent à raffiner nos procédures : vérification de la profondeur d'anesthésie ; surveillance de la fréquence respiratoire ; utilisation de tapis chauffant durant l’implantation des cellules tumorales ou les injections intra-veineuses et les prélèvements sanguins ; utilisation de gel oculaire protecteur durant l’anesthésie ; utilisation d’une lampe chauffante et de fibre naturelle de coton durant la phase de réveil. Enfin, nos procédures requièrent une surveillance accrue en plus d’une surveillance quotidienne : avant et 24h après chaque injection du produit thérapeutique, les animaux sont pesés afin de mettre en évidence une éventuelle toxicité aigüe et 4h après chaque injection, les animaux sont réexaminés. Un examen clinique individuel sur chaque animal est réalisé tous les 2 ou 3 jours au cours duquel la taille des tumeurs est mesurée et l’état général de l’animal est observé. Afin de prévoir l’apparition de la douleur, nous avons établi des points limites précoces (critères d’interruption) ainsi qu’une grille de score qui déterminent les actions à mener en cas de souffrance avérée de l’animal. Cette grille prend en compte 1) le comportement de l’animal dans la cage, 2) l’apparence générale, 3) les fonctions physiologiques et 4) l’inspection et la taille de la tumeur. Grâce à cette grille de score, les éventuels signes cliniques de douleur (locale ou générale) sont détectés et un traitement local ou systémique d’analgésique est appliqué pour y remédier. Dans le cas exceptionnel de douleur non maitrisée par ces traitements post-opératoires, les animaux sont immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

La souris est actuellement l’organisme-modèle le plus utilisé en recherche biomédicale et en cancérologie : en effet, très peu de modèles en cancérologie existe chez l’espèce rat (cancer de la prostate). Elle présente de nombreux intérêts : sa taille, sa courte durée de vie et son rythme rapide de reproduction par rapport à d’autres organismes-modèles. De plus, les souris développent des pathologies tumorales spontanées ou induites, similaires à celles présentes chez l’homme (mécanismes physiopathologiques comparables, biomarqueurs similaires) et ces mammifères présentent une forte homologie phylogénétique avec l’homme (90%). Elles permettent également de produire un grand nombre d’individus identiques (syngéniques), ce qui permet d’assurer une meilleure reproductibilité des conditions expérimentales. En outre, elles présentent des caractéristiques physiologiques qui permettent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Enfin, du fait de leur taille (20-25g) par rapport au rat, cela permet une manipulation plus aisée et de réduire les quantités de molécules à utiliser. Ces expériences seront réalisées sur des souris adultes mâtures âgées de 8 à 12 semaines. Le stade adulte ou adulte mâture est celui où les pathologies cancéreuses se développent et où le sytème immunitaire est totalement fonctionnel.

Une perte de poids de plus de 15 % ou un score supérieur à 7 sur l'échelle de grimace déclenche la mise à mort. 920 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus. La moitié d'entre elles reçoit une prothèse crânienne posée en quarante-cinq minutes, puis toutes sont intoxiquées par un composé organophosphoré et passent une à trois heures par séance sous IRM ou imagerie ultrasonore. Le porteur indique que l'intoxication peut provoquer fasciculations, mâchouillements, chute du tonus musculaire, tremblements généralisés et mort, et présente ces travaux comme une réponse à la menace des armes chimiques et aux 300 000 décès annuels par pesticides.

Objectifs

Bien que très réglementée, l’utilisation de composés organophosphorés (OPs) est courante dans l’agriculture où sont utilisés des pesticides tels que le chlorpyrifos. L’incidence d’intoxication passive, active ou accidentelle avec des pesticides OPs est associée à près de 300 000 décès annuels dans le monde pour près de 3 millions de cas d’intoxication reportés. Plus inquiétant, l’utilisation en 2017 d’armes de guerres neurotoxiques contenant des OsP (Sarin en Syrie et VX en Malaisie), démontre une menace toujours actuelle pour les populations civile et militaire. Sur le plan physiopathologique, l’intoxication aigue aux OP entraîne l’inhibition irréversible des cholinestérases augmentant la concentration d’acétylcholine dans l’ensemble de l’organisme ce qui conduit à une hyperactivité du système nerveux central (SNC) qui peut engendrer des œdèmes cérébraux, de la neurodégénérescence et des crises épileptiques voir la mort. Si le traitement d’urgence permet de stabiliser les victimes, son efficacité au niveau du SNC est limitée. De plus certaines victimes peuvent être exposées à de faibles doses d’OPs sans présenter les symptômes de la phase aigue mais présentent des déficits cognitifs à long terme. Très peu d’études se sont intéressées aux effets des faibles doses sur le système neurovasculaire. Ainsi, ce projet vise à mieux comprendre l’impact d’une intoxication aux OPs au sein de l’unité neurovasculaire (UNV) à court et moyen terme. De plus, améliorer nos connaissances sur ce domaine nous permettra de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques et diagnostiques.

Bénéfices attendus

D’un point de vue scientifique, cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales mais aussi translationnelles ou appliquées menées sur la physiopathologie des intoxications aux composés organophosphorés. Les procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.

Procédures

(Souris Mus musculus ; n=460) : Modèle d’intoxication - Induction de l’intoxication +/- traitements (durée : 1h). - Evaluation de l’inflammation cérébrale et de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique (BHE) par imagerie par résonnance magnétique (IRM) (durée : 1h/mesure). - Evaluation des conséquences fonctionnelles par imagerie Doppler et functional ultrason imaging (fUS) sous anesthésie (durée : 1h/mesure). (Souris Mus musculus ; n=460 ) : Modèle d’intoxication vigile - Pose de prothèse crânienne/récupération (durée : 45min). - Induction de l’intoxication +/- traitements (durée : 1h). - Evaluation des conséquences fonctionnelles par imagerie fUS vigile (durée : 1-3h/mesure).

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient pour toutes les procédures : une perte de poids, des douleurs post-opératoires, du stress, des déficits fonctionnels et/ou cognitifs. De plus, l’intoxication aux organophosphorés est susceptible d’induire des symptômes caractéristiques tels que : l'arrêt d’activité, des fasciculations (contractions involontaires des muscles), mâchouillements/bâillements, chute du tonus musculaire, dos vouté, tremblements généralisés allant jusqu’à la mort de l’animal.

Devenir

L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure afin de générer des tissus permettant des observations histologiques ou par quantification protéiques.

Remplacement

Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, des approches in silico ne permettent pas d’obtenir le même niveau de sensibilité. De même, des approches in vitro ne permettent pas de reproduire la complexité d’un modèle in vivo. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées concernant la physiopathologie d’une intoxication aux OPs.

Réduction

Avant de procéder à une telle étude, une approche statistique a été réalisée afin de s’assurer d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité. De plus, des méthodes d’études non-invasives telle que l’imagerie (IRM, fUS…) sont utilisées dans ce projet afin de faire un suivi longitudinal des animaux, permettant de recueillir de nombreuses données sans augmenter le nombre d’animaux. Dans ce projet, le nombre minimum d’animaux a été défini en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, à partir de nos expériences précédentes, de nos données sur chaque modèle et des données disponibles dans la littérature. En fonction de l'expérimentateur (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse en fonction de son aisance. L’ensemble des échantillons collectés permettra un partage de tissus, une réutilisation et donc une réduction du nombre d'animaux nécessaires.

Raffinement

Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Le bien-être des animaux sera contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne permettra de détecter tout signe clinique de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à une éventuelle détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire pour les techniques utilisées dans ce projet montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine Une fois entrés en protocole, les animaux seront pesés tous les jours pour surveiller leur poids et mis à mort si une perte de poids de plus de 15% est observée et/ou si leur score sur l’échelle de la douleur (Mouse Grimace Scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle. L’hébergement des animaux s’effectuera au moins 7 jours avant le début des procédures pour minimiser leur stress. Les animaux sont hébergés dans des cages standards aux normes européennes (type IV. La nourriture, la boisson et la litière sont changés une fois par semaine. Néanmoins, ces changements pourront être effectués plus fréquemment si nécessaire. De plus, une maison en carton et des produits nécessaires à la nidification seront placés dans les cages des animaux. La litière et les enrichissements du milieu d'hébergement des animaux permettront de réduire leur stress et de faciliter leur thermorégulation. Durant la mise en place des modèles, les souris seront sous anesthésie générale et sous analgésie. Après chirurgie, les souris seront placées dans des enceintes post opératoires chauffées avant d’être remises dans leurs cages propres et disposeront de croquettes humides dans une coupelle sur le sol de leur cage ou bien encore de la nourriture gélifiée pour faciliter la prise de nourriture et l'hydratation pendant la période post-opératoire. Des gommettes de couleurs seront collées sur les étiquettes des cages afin d’assurer une surveillance adaptée (ex : rouge après une procédure chirurgicale pour une surveillance plus importante).

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences et notamment dans le cadre de développement de stratégies diagnostiques et de thérapies pharmacologiques. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour non seulement étudier les effets de l’intoxication aux composés organophosphorés sur le SNC mais également pour tester l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques. Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’Homme. Les animaux utilisés seront âgés de 8 à 10 semaines et auront un poids compris entre 35 et 40g lors de l’intoxication. Nous choisissons des animaux de cet âge afin de pouvoir comparer les données existantes au laboratoire et dans la littérature, puisque le modèle d’intoxication au NIMP a été développé chez des animaux ayant un stade de développement identique.

Des cristaux d'urate monosodique sont injectés dans l'abdomen de 600 souris pour y déclencher une péritonite en moins de vingt-quatre heures. Les procédures sont classées en souffrance sévère. Le porteur annonce pourtant des douleurs aiguës limitées à moins de deux heures après l'injection, après quoi les animaux ne présenteraient plus aucun signe de douleur, et il recopie son paragraphe sur la réduction à la place de tout argument sur le remplacement. Toutes les souris sont tuées à l'issue pour récupérer le liquide péritonéal et différents organes, à raison de dix études de soixante animaux sur trois ans.

Objectifs

La goutte est une maladie inflammatoire particulièrement prévalente causée par la formation de dépôts articulaires et péri-articulaires de cristaux d’urate monosodique (UMS ou MSU). La goutte représente le rhumatisme inflammatoire chronique le plus fréquent en France. L’objectif de ce projet est d’utiliser un modèle murin permettant de reproduire les phénomènes de la goutte le plus prédictifs possible afin de refléter la pathologie et de pouvoir évaluer des nouveaux traitements. Le modèle consiste en l’injection intra-péritonéale de cristaux d’urate monosodique (MSU) chez des souris. Un lavage péritonéal est ensuite réalisé pour analyse des cellules recrutées. Les principales caractéristiques du modèle sont son délai de réalisation court (≤ 24h).

Bénéfices attendus

Ce projet a pour finalité la mise au point d’un modèle d’inflammatoire chez la souris qui récapitule les aspects clés de la goutte chez l’homme. Ce modèle permettra par la suite de sélectionner des molécules thérapeutiques grâce à un modèle préclinique prédictif permettant de transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. II sera possible d’étudier les mécanismes inflammatoires de la goutte dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre.

Procédures

Les animaux seront pesés avant induction et l’étude durera au maximum 24h. La péritonite est induite par un seul traitement en intrapéritonéale. Des composés chimiques ou biologiques seront administrés aux animaux par voie : intramusculaire et intradermique (anesthésie (5-10 minutes), avec analgésie, maximum 2 sites/jours), orale sur animaux vigiles (1 minute) maximum 4 fois par jour espacé de 6h, sous cutanée (anesthésié, 1 heure, ou vigile, 1 minute) maximum 3 sites par jours, intrapéritonéale (anesthésié, 1 heure, ou vigile, 1 minute) maximum 4 fois par jour, intraveineuse vigile ou anesthésié (anesthésié, 5-10 minutes, ou vigile, 1-2 minutes) maximum 2 fois par jour. Le nombre, le volume et la fréquence d’administration suivront les recommandations de SBEA (Structure du bien-être animale). Des prélèvements de sang, d’urine ou de fèces pourront être réalisés (3 minutes sur animal vigile, 1 heure si anesthésie. Le nombre et la fréquence des prélèvements seront adaptés à la durée de la procédure(24h) et suivront les recommandations du comité d’éthique.

Impact sur les animaux

Dans ce modèle d’inflammatoire, des douleurs aigues transitoires (< 2 heures), après administration du MSU sont attendues ensuite les animaux ne présentent plus de signe de douleurs Les animaux recevront un traitement par voie intrapéritonéale (MSU) et pourront subir des prélèvements de sang à l’aiguille, ce qui pourrait induire une douleur et un stress léger. La douleur générée sera limitée à la piqure d’une aiguille. Au cours d’une étude, les animaux seront manipulés. Les mesures de poids entraînent un stress que l’on peut considérer comme faible. Le jour de la randomisation, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cela pourra engendrer un stress de 1-2j.

Devenir

Après les procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération du liquide péritonéale et différents organes, nécessaires pour évaluer l’efficacité des composés testés sur les maladies d’intérêt.

Remplacement

Le nombre minimum suffisant permettant d’observer des différences significatives sur les paramètres d’intérêt est systématiquement utilisé. En pratique, ces nombres ont été déterminés sur la base de la littérature sur le sujet et d’expériences préalables dans nos laboratoires. En moyenne, une étude comprendra 60 animaux. Nous estimons effectuer environ 10 études sur 3 ans. Dans le modèle, il a été démontré que 6 à 10 animaux sont nécessaires en fonction des paramètres d’intérêt, afin d’observer des différences sur ces paramètres. Le nombre élevé d’animaux prévu est lié au nombre d’études élevé prévues pour tester un grand nombre de composés et de schémas d’administration et au nombre d’animaux par étude. Dans la mesure du possible, le maximum d’analyses compatibles sera effectué sur les mêmes tissus afin d’éviter de multiplier les animaux nécessaires. Afin d’éviter de multiplier les groupes contrôles, dans la mesure du possible si plusieurs composés doivent être testés ils le seront au cours de la même étude.

Réduction

Le nombre minimum suffisant permettant d’observer des différences significatives sur les paramètres d’intérêt est systématiquement utilisé. En pratique, ces nombres ont été déterminés sur la base de la littérature sur le sujet et d’expériences préalables dans nos laboratoires. En moyenne, une étude comprendra 60 animaux. Nous estimons effectuer environ 10 études sur 3 ans. Dans le modèle, il a été démontré que 6 à 10 animaux sont nécessaires en fonction des paramètres d’intérêt, afin d’observer des différences sur ces paramètres. Le nombre élevé d’animaux prévu est lié au nombre d’études élevé prévues pour tester un grand nombre de composés et de schémas d’administration et au nombre d’animaux par étude. Dans la mesure du possible, le maximum d’analyses compatibles sera effectué sur les mêmes tissus afin d’éviter de multiplier les animaux nécessaires. Afin d’éviter de multiplier les groupes contrôles, dans la mesure du possible si plusieurs composés doivent être testés ils le seront au cours de la même étude.

Raffinement

Les actes douloureux seront réalisés avec analgésie. Les actes moins stressants (autres administrations et prélèvements) seront réalisés sous anesthésie sauf si la contention génère moins de stress ou si l’anesthésie n’est pas possible (administration orale). Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité de la procédure est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Un système d’alerte est mis en place pour statuer sur la mise à mort de l’animal. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans la procédure. Des points limites supplémentaires seront ajoutés en cas de détection d’effets non prévus de l’induction des maladies et/ou en cas de mise en place de méthodes plus raffinées d’évaluation de la souffrance des animaux.

Choix des espèces

- L’administration du MSU en intrapéritoneale chez des souris est bien documentée dans la littérature. - Pour ce modèle inflammatoire, il faut utiliser des souris immunocompétentes. - De plus, diverses souches de souris immunocompétente sont disponibles pour l’établissement de ce modèle. Les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7-8 semaines lors de leur première manipulation). Des animaux adultes sont utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte pour faciliter l’induction de la maladie. Les animaux adultes pourront mieux supporter le traitement ainsi que les éventuels effets secondaires des composés testés.

22 miniporcs femelles de huit semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées au trentième jour pour prélever leur intestin. Irradiées une fois pendant dix minutes après un transport de trois heures sous anesthésie, elles subissent huit prises de sang, une chirurgie de prélèvement de graisse abdominale, une injection des cellules obtenues à partir de cette graisse et un examen endoscopique de trente minutes. Le porteur décrit les atteintes attendues, crampes abdominales, nausées et vomissements dès un à trois jours, puis entre une et six semaines des diarrhées hémorragiques abondantes, de la fièvre et des septicémies, l'apparition des diarrhées signalant selon lui des dommages sévères pouvant engager le pronostic vital. Il fait valoir un "besoin crucial" de traitements rapides face à un accident nucléaire ou un "acte de malveillance", en s'appuyant sur une preuve de concept déjà obtenue chez la souris.

Objectifs

Ce projet multi-établissement a pour objectif de proposer un nouveau traitement par thérapie cellulaire utilisant un produit issu de la graisse en cas de syndrome gastrointestinal (consécutif à une rupture de la barrière intestinale) induit par l’irradiation à la fois pour le militaire ou la population victime lors d’une urgence radiologique, d’un accident nucléaire ou d’un acte de malveillance. Ce traitement est basé sur l’injection d’un produit de thérapie cellulaire la «fraction vasculaire stromale (SVF)» obtenue par digestion enzymatique de la graisse issue de lipoaspiration. Ce produit est une source riche en progéniteurs cellulaires et facile d’accès et cela extrêmement rapidement. Actuellement la prise en charge du syndrome gastrointestinal (SGI) ne reste que symptomatique. La rapidité d’apparition des premiers symptômes dépend de la vitesse de renouvellement des cellules constituant les tissus lésés mais aussi de la radiosensibilité des cellules souches. Chez l’homme, les doses supérieures à 6 Gray (unité de la dose délivrée) sur un large volume d’organes touchés induisent principalement une destruction de la moelle osseuse et des lésions gastro-intestinales, entraînant diarrhée, déshydratation, septicémie, hémorragie intestinale engageant le pronostic vital dans les 10 à 15 jours après l'exposition. Il existe un besoin crucial de mesures thérapeutiques efficaces et rapides pour la gestion du SGI. Il a été démontré que l’injection de la SVF avait un bénéfice thérapeutique objectivé sur plusieurs paramètres (reprise de poids, restauration de la perméabilité intestinale) et amélioration de la survie dans un modèle murin de SGI. Ce projet est en synergie avec les nouvelles stratégies en termes de santé, à savoir l’utilisation de produit de thérapie cellulaire à des fins de régénération tissulaire. La SVF d’obtention rapide et ne nécessitant pas de temps de culture cellulaire préalable à son injection est actuellement en essai clinique et est compatible pour le traitement d’urgence dans les 24 heures après l’irradiation. L’objectif de ce projet est de valider l’efficacité thérapeutique de la SVF sur le cochon pour un passage en clinique. Ce projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

La preuve de concept a été établie que l’injection de la SVF dans un modèle murin de SGI avait une efficacité thérapeutique en améliorant la survie des souris de 80%. Actuellement de nombreux essais cliniques utilisant la SVF sont en cours (ostéoarthrite, diabète de type 2, sclérodermie, maladie pulmonaire obstructive, maladie de Crohn). Face à l’enjeu géopolitique (contexte d’accident nucléaire ou acte de malveillance) l’objectif de ce projet est de progresser vers la clinique pour le traitement en urgence du SGI.

Procédures

Sous anesthésie générale, seront réalisées : - Une prise de sang sera effectuée à J-4 avant l’irradiation et à J1, 3, 7, 10, 15, 21, et 30 soit 8 prélèvements (temps de prélèvement entre 5 et 10 min) (EU2). - Une irradiation, une seule fois pour une durée de 10 min (EU1) - Une chirurgie de prélèvement de graisse (temps de procédure 20 min) (EU2) - Une injection de SVF (cellules issues de la graisse prélevée) (10 min) (EU2) - Un unique examen endoscopique de 30min (EU2) Des injections d'antibiotiques sont réalisées tous les 3 à 5 jours, au besoin, de préférence lors d'une intervention sous anesthésie générale, ou sur animal vigile (EU2).

Impact sur les animaux

Les cellules de la moelle osseuse sont détruites chez l'Homme pour des doses d'irradiation comprises entre 2 et 6 Gy et conduisant à un défaut d'immunité, défaut de production de plaquettes et de globules rouges. Le syndrome gastro-intestinal survient pour des doses supérieures à 6 Gy (corps entier). Les symptômes majoritaires sont des crampes abdominales et des diarrhées ainsi que des nausées et des vomissements. Des céphalées peuvent également apparaître. L’apparition des nausées, de la fatigue, des crampes abdominales, des vomissements est attendue entre 1 et 3 jours après l'irradiation. L’apparition des diarrhées indique des dommages sévères et peuvent engager le pronostic vital. De 1 à 6 semaines après l’exposition, peuvent survenir d’abondantes diarrhées hémorragiques, de la fièvre, des infections ou septicémies.

Devenir

Tous les porcs sont mis à mort à la fin du protocole à J30 post-irradiation pour des prélèvements tissulaires post-mortem d’intestin pour un examen de la réparation intestinale.

Remplacement

Le passage à la clinique nécessite des animaux de grande taille et autres que le modèle rongeur. Il a été montré que la physiopathologie du syndrome gastro-intestinal sur le porc est similaire à celle observée chez l’homme. La production de cellules issues des tissus graisseux (pour la production du traitement cellulaire) en quantité suffisante est un paramètre limitant, le choix s’est porté sur le miniporc qui est un porc de taille réduite permettant l’injection de cellules en concentration compatible avec leur préparation au sein d’un laboratoire de recherche. Le passage de cette étude en clinique nécessite d’utiliser des modèles in vivo. Le remplacement par des modèles in vitro n’est donc pas possible.

Réduction

Pour atteindre la pertinence statistique, les groupes des miniporcs irradiés et traités par la thérapie cellulaire sont classiquement constitués de 6 à 7 individus pour pallier les variabilités inter-individus des animaux et également du greffon injecté et pour éviter ainsi d’avoir à renouveler plusieurs fois l’expérimentation. Le nombre d’animaux choisi pour ce projet est nécessaire et suffisant pour exploiter d’un point de vue statistique les résultats obtenus. Les cochons seront leur propre donneur de graisse, étant donné que les injections de SVF ne peuvent se faire qu’en autologue dû à la présence de cellules immunitaires, ce qui limite le nombre de cochon. Des mesures de la numération formule sanguine seront effectuées à J-4 avant l’irradiation afin d’avoir des valeurs sanguines des cochons avant tout traitement.

Raffinement

Les box d’hébergement seront enrichies en objets (balles en plastique au sol et au mur). Les paramètres d'ambiance dans les hébergements sont contrôlés. Les animaux seront anesthésiés pour les interventions (irradiation, prélèvements sanguins) et mis à mort selon la réglementation en vigueur. Des points limites sont définis et seront appliqués pour mettre fin dans les délais les plus brefs à toute anomalie, toute douleur, toute souffrance, toute angoisse ou tout dommage durable qui pourraient être évités tout au long des procédures expérimentales. Les animaux seront acclimatés pendant une période de deux semaine (habituation à la présence et au contact de l’Homme lors du change des boxes, distribution de caresses et de morceaux de pomme), puis transférés par un transporteur autorisé sous anesthésie dans des cages possédant un revêtement évitant tout glissement des animaux et en voiture climatisée jusqu’à la plateforme d’irradiation (temps transport/irradiation estimé à 3 heures). Une surveillance quotidienne pendant toute la durée de l’expérimentation sera effectuée par les techniciens animaliers et basée sur la prise alimentaire, la présence des troubles digestifs (diarrhée), de la posture et du comportement (animal prostré) : - Pesée des animaux toutes les semaines pendant la durée de l’expérimentation - Les signes de douleur/stress sont définis comme une réduction de la consommation alimentaire et/ou troubles digestifs, modification des signes locomoteurs (prostration, ne pas remuer la queue, manque de curiosité, changement dans le schéma de vocalisation normal au toucher). Si au cours de l’expérience un animal montre des signes caractéristiques de souffrance, il sera retiré de l’expérimentation et mis à mort selon les méthodes approuvées en limitant le plus possible la douleur, la souffrance et l'angoisse des cochons, par une personne compétente de l'établissement hébergeur. Une grille de score sera établie pour chaque animal. Lors des prélèvements sous anesthésie de graisse en zone abdominale et des injections de cellules au niveau de la veine de l’oreille et les examens endoscopiques les animaux sont suivis par un monitoring cardiaque et respiratoire. Afin de palier à tout risque d’infection lié aux prises de sang les cochons reçoivent un antibiotique par voie intramusculaire à chaque intervention. De plus afin de palier au risque de vomissements lié à l’irradiation abdominale un anti-émétique sera donné avant l’irradiation.

Choix des espèces

Le passage à l’étape clinique nécessite des animaux de grande taille. Il a été montré que la physiopathologie du syndrome gastrointestinal sur le porc de taille réduite (de type miniporc) est similaire à celle observée chez l’homme. De plus étant donné que la production de cellules en quantité importante est un paramètre limitant, le choix s’est porté sur le miniporc de 8 semaines qui est un porc de taille et de poids réduit permettant l’administration de cellules en concentration compatible avec leur production. Les porcs seront des femelles afin d’éviter des conflits et donc risques de blessure, qui sont plus fréquents chez les mâles. Le risque de blessure doit être absolument évité chez ces animaux qui auront un système immunitaire et de coagulation affaibli après irradiation et par conséquent un risque de mortalité augmenté. Les animaux seront pris après sevrage (soit 2 mois post naissance). Etant donné que le nombre de cellules à greffer est fonction du poids de l’animal, il faut donc des animaux le plus jeune possible avec un poids proche de 5-7 kg environ pour pouvoir greffer environ 10 millions de cellules (quantité compatible avec la production à partir du prélèvement de graisse.

Plongés vingt-quatre heures dans un volume d'eau réduit et non renouvelé contenant la bactérie de la furonculose, 1 330 alevins de truite arc-en-ciel de deux grammes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue. Le protocole vise une mortalité d'environ 50 %, qui survient en général dans les 24 à 72 heures après l'infection. Le porteur écrit que cette méthode "reste néanmoins moins stressante" qu'une injection intrapéritonéale, et prévoit une mise à mort dite compassionnelle pour les poissons qui nagent sur le flanc, saignent au niveau de la face ou montrent une détresse respiratoire. L'enjeu du projet est un dossier d'autorisation de commercialisation auprès de l'EFSA, pour une gamme d'aliments probiotiques destinée à l'aquaculture.

Objectifs

La finalité de ces travaux est de mettre sur le marché une nouvelle génération d’aliments à destination des principales espèces aquacoles (truites arc-en-ciel, daurades royales, bars européens, maigres), utilisable de la larve au stade adulte, qui sera composée de bactéries marines encapsulées dans un support issu de ressources marines locales, dans une logique d’économie circulaire « de la mer à la mer ». L’objectif de cet essai est l’évaluation de l’efficacité de ces bactéries candidates probiotiques sur une espèce d’eau douce, la truite arc-ciel, face à la furonculose, une infection bactérienne qui provoque d’importantes mortalités en élevage.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à développer des probiotiques adaptés pour les élevages de poissons d’eau douce comme la truite arc-en-ciel, avec l'objectif d'améliorer les taux de survie et de croissance des stades larvaires et leur capacité de défense à des infections. Les résultats obtenus seront couplés à ceux déjà disponibles et en cours d'acquisition sur d’autres espèces de poissons marins (bar commun, daurade royale et maigre) et permettront d'établir un dossier de demande d'autorisation de commercialisation de ces probiotiques pour ces différentes espèces auprès de l'Agence Européenne de Sécurité Alimentaire (EFSA).

Procédures

Les poissons seront pesés et mesurés sous anesthésie à l’issu de la phase de supplémentation avec les probiotiques. L’infection expérimentale sera réalisée post-supplémentation par balnéation avec la bactérie pathogène dans un volume réduit d’eau pendant 24h. 12 individus par condition (4/bassins) seront prélevés et mis à mort à J0 (avant l’infection), 24h et 15 jours après l’infection.

Impact sur les animaux

Les poissons seront pesés et mesurés sous anesthésie à l’issu de la supplémentation avec les probiotiques. L’infection bactérienne nécessite une balnéation de 24h dans un volume d’eau réduit et non-renouvelé pouvant induire un stress chez les animaux. Cette méthode d’infection reste néanmoins moins stressante qu’une injection intrapéritonéale qui nécessite une anesthésie. L’infection provoque une mort rapide des animaux les plus sensibles, en général dans les 24 à 72h post-infection. Aucun effet néfaste des probiotiques aux concentrations utilisées dans un support algal n’est attendu.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort à l'issu de la procédure.

Remplacement

Le potentiel de ces bactéries marines comme probiotiques contre des pathogènes aquacoles a été mis en évidence par des essais in vitro et par l’analyse de leurs génomes (identification de gènes codant pour des protéines antimicrobiennes , absence de gènes codant pour une résistance à un antibiotique ou un biocide, …). Afin de valider ce potentiel, des essais In vivo sur des espèces cibles telle que la truite arc-en-ciel - reflétant la complexité du système d’interaction hôte/pathogène - sont nécessaires afin d’obtenir une autorisation de commercialisation de ces probiotiques pour la pisciculture auprès de l’Agence Européenne de Sécurité Alimentaire (EFSA).

Réduction

Cette procédure expérimentale sera menée en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en conservant une pertinence scientifique et statistique. Le nombre d'animaux nécessaires prend en compte la variabilité fréquemment observée entre des bassins (5 à 10%), qui nécessite de réaliser les essais à minima en triplicat. Les prélèvements à effectuer en cinétique (qui réduisent le nombre de poissons / bac) et les mortalités induites par l'agent pathogène lors de l'épreuve infectieuse (environ 50%) ainsi que les densités. La sélection de la souche pathogène virulente et la concentration bactérienne permettant d'atteindre une mortalité d'environ 50% seront réalisées sur un maximum de 130 animaux. L'épreuve infectieuse avec la souche pathogène choisie sera ensuite menée sur 400 poissons supplémentés par condition, chiffre permettant de suivre la mortalité générée et de réaliser des prélèvements. Le nombre total d’alevins de truite sera donc au total de 1330 individus.

Raffinement

Les mesures de raffinement viseront à assurer des conditions optimales d’hébergement des animaux, à savoir, un volume d'eau adapté en circuit ouvert avec une oxygénation suffisante en fonction du nombre d'animaux par bassin, un rythme jour/nuit naturel, la présence de suffisamment de congénères pour exprimer un répertoire comportemental riche, une distribution d’aliment adapté à leur stade de développement deux fois par jour. Une importance particulière sera donnée à l’observation des animaux, 3 fois par jour (1 fois/jour le week-end, sachant que les infections auront lieu en début de semaine pour limiter les mortalités sur les week-end), pour identifier les animaux en détresse et réaliser, si nécessaire, une mise à mort compassionnelle. Les infections bactériennes expérimentales peuvent provoquer une mort rapide sans qu'il soit possible d'observer des symptômes cliniques. Pour éviter toute souffrance, les animaux présentant un comportement de nage anormal marqué avec des périodes sur le flanc / sur le ventre et/ou des signes de détresse respiratoire avancée et/ou des hémorragies faciales / au niveau des flancs et/ou des signes nerveux seront mis à mort de manière compassionnelle selon une grille de points limites.

Choix des espèces

La truite arc-en-ciel est une des espèces d’eau douce la plus produite en Europe et en France. Chez les salmonidés, et en particulier chez la truite arc-en-ciel, la furonculose est une infection bactérienne qui provoque d’importantes mortalités et des pertes économiques marquées dans les élevages. Il s’agit d’alevins de truites arc-ciel de 2-3 mois (immatures à ce stade) qui feront environ 2g. C’est lors de leur premier stade de vie que les alevins sont les plus fragiles. Ces alevins auront été supplémentés en probiotiques dès l’ouverture de leur bouche, étape à laquelle leur microbiote intestinal se forme. La supplémentation en probiotiques sur ces 1ers stades de vie apparait pertinente pour mettre en évidence leurs effets sur la formation du microbiote intestinal et leur résistance à une infection bactérienne expérimentale.