Procédures sévères

Pour observer le rôle de protéines sécrétées par les neurones dans la maladie de Parkinson, 360 souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Elles passent trois fois des tests d'openfield, d'empreintes de pas et de reconnaissance d'un nouvel objet, subissent un prélèvement de sang par mois à partir de dix mois sur animal éveillé, puis une injection intracrânienne sous anesthésie d'un virus qui installe la maladie. Le porteur prévoit aussi, en l'absence de résultats, une injection de d-amphétamine suivie d'une heure d'observation en enceinte ouverte. La perte de coordination, les tremblements, l'anxiété et l'altération cognitive figurent parmi les effets attendus, et la surveillance se résume à "plusieurs grilles de points limites" dont aucun critère n'est donné.

Objectifs

La maladie de Parkinson (MP) est l'une des maladies neurologiques les plus fréquentes, se manifestant par la perte de certaines cellules du cerveau et la formation de structures anormales appelées corps de Lewy. Les symptômes de la MP incluent des problèmes moteurs progressifs. Environ 10 % des cas de MP ont une cause génétique connue, tandis que la plupart potentiellement liée à des facteurs environnementaux et génétiques encore inconnus. Nous cherchons à mieux comprendre cette maladie complexe et à élargir les options de traitement limitées actuellement. Notre équipe se concentre sur l'étude de certaines protéines libérées par les cellules, qui représentent une partie importante de notre biologie. D'après nos recherches et celles d'autres scientifiques, certaines protéines impliquées dans les sécrétions cellulaires, semblent jouer un rôle dans la MP, ainsi que dans la libération anormale de protéines. Nous utiliserons des modèles murins spécialement conçus pour étudier ces gènes dans les cellules du cerveau liées à la dopamine. L'objectif est de mieux comprendre comment ces protéines influent sur les cellules nerveuses et de découvrir des pistes pour de nouveaux traitements.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche vise à apporter des éclaircissements essentiels sur la maladie de Parkinson et ses mécanismes sous-jacents en utilisant des souris génétiquement modifiées qui n'ont jamais été étudiées auparavant. À court terme, ce projet propose d'explorer le rôle des sécrétions cellulaires, un phénomène en plein essor dont nous ne connaissons pas encore le rôle dans la maladie de Parkinson. Pour ce qui est du long terme, ce projet pourrait permettre d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et d'aider à la prise en charge des patients souffrant de la maladie de Parkinson.

Procédures

Des souris génétiquement modifiées, ainsi que leurs groupes de contrôle, seront soumises à des tests comportementaux. Ces test seront répétés trois fois et dureront entre 5min et 60min selon les tests, afin de ne pas perturber les animaux, ces tests seront répartis sur plusieurs semaines. A partir de 10 mois, les souris subiront un prélévement mensuel de sang afin de détecter des biomarqueurs connus de la MP (5min par souris). En cas d'absence de résultats significatifs, les souris receverons une injection unique de d-amphétamine pour perturber leur système dopaminergique et induire un phénotype. Les souris recevront une injection intrapéritonéale de d-amphétamine, puis elles seront immédiatement placées dans une enceinte ouverte pour réaliser un test de comportement de 60min. Plus tard, ces mêmes souris subiront une injection unique intracranial sous anesthésie d'un virus exprimant le gène induisant la maladie de parkinson. La procédure durera 30 min par souris. Après un mois d'expression du gène mutant, les souris subiront à nouveau les tests comportementaux (openfield, footprint, reconaissance de nouvel objet). Les prélèvements sanguins seront effectués sur animal vigile, une fois par mois à partir du début des expériences de comportement jusqu’à la mise à mort.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables seront principalement liés à une potentielle douleur et un stress associé aux injections d’amphétamine et d’anesthésiques, les prélèvements sanguins mensuels peuvent aussi être une source de stress pour les souris. La souffrance liée à l'injection de vecteurs viraux et l’induction de parkinsonisme chez les souris font parti des effets indésirables prévus (perte de coordination des mouvements et des tremblements, altération cognitive, anxiété).

Devenir

A l'issu des expériences de comportement, les animaux seront mis à mort, cette étape est nécessaire pour réaliser des prélèvements post-mortem et effectuer des expériences complémentaires, telles que l'extraction de vésicules extracellulaires et la caractérisation des altérations dans les différentes lignées génétiquement modifiées par immunohistochimie. Ces analyses sont cruciales pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires de la maladie de Parkinson, notamment en évaluant l'effet des différentes mutations génétiques sur la sécrétion non conventionnelle et leur rôle dans la maladie de Parkinson.

Remplacement

Afin d'éviter l'utilisation de modèle murin, nous avons jusqu'à maintenant utilisé des modèles de culture cellulaire.Ces modèles nous ont permis de mieux caractériser la nature des sécrétions cellulaires et leurs impacts sur d'autres cellules. En parallèle de l'utilisation de souris, le projet continuera de faire appel à des modèles de culture cellulaire génétiquement modifiés. L'effet du sécrétome de cellules délétées pour les gènes de sécrétion sera évalué sur des neurones en culture. Néanmoins, ce projet impliquant des modèles murins cherche à caractériser la nature et le rôle des sécrétions cellulaires in vivo dans le contexte de la maladie de Parkinson. À ce jour, les modèles de cellules seuls ne permettent pas de répondre à ces questions.

Réduction

Afin d’utiliser le minimum possible de souris, nous nous sommes basé sur les publications étudiant des phénotypes moteurs chez la souris, ansi que des tests statistiques. Les contrôles des différentes lignées pourront être rassemblés dans l’analyse statistique par la suite, permettant une réduction des effectifs. Nous réaliserons des analyses statistiques afin d’en tirer le maximum de resultats.

Raffinement

Les soins sont toujours effectués par les mêmes expérimentateurs et animaliers afin de réduire le stress des animaux. Lors de la procédure d’injection de virus exprimant la protéine responsable de la maladie de parkinson, un traitement préalable et en post opératoire par antalgique est prévue. Au cours de notre étude, plusieurs grilles de points limites seront mise en place afin d’éviter au maximum la souffrance de l’animal.

Choix des espèces

Ce projet repose sur l'utilisation de modèles murins génétiquement modifiés, une approche essentielle pour étudier in vivo la maladie de Parkinson. Le modèle murin permet d'explorer les mécanismes de la maladie dans un contexte biologique proche de l'homme. L'observation du comportement de ces souris, via des tests spécifiques, joue un rôle central. Elle permet d'identifier des troubles moteurs et de comprendre comment cette mutation génétique pourrait jouer un rôle dans la maladie de Parkinson. Étant donnés les résultats donnés par les précédents modèles murins constitutifs, nous pensons que dans ce modèle conditionnel, la neurodégénération devrait survenir lors de stades tardifs (6 à 12 mois). D'autres modèles murins impliquant des gènes démontrés comme impliqués dans la maladie de Parkinson ont montré des signes de neurodégénération à partir de 10 mois. C'est pourquoi nous commencerons nos expériences de comportement sur des souris adultes de 10 mois

Le rat Sprague Dawley est choisi pour sa taille, assez grande pour que la lésion vise le segment médullaire T4 plutôt que le T3. 25 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une chirurgie d'une heure à une heure quinze leur sectionne la moelle épinière et les laisse paralysés de l'arrière-train pendant soixante jours, incapables de vider leur vessie seuls, exposés aux infections urinaires, à l'obstruction stomacale et à des épisodes brutaux d'hypertension, pendant que leur pression artérielle est mesurée sous anesthésie toutes les deux semaines et la force de leurs pattes avant testée chaque semaine. Le porteur qualifie la procédure de lourde, handicapante et sévère, et prévoit de tuer tous les rats à l'issue en prélevant un maximum de tissus pour éviter d'avoir à recommencer.

Objectifs

Les lésions de la moelle épinière (LM) sont un problème de santé important dans le monde, touchant des individus jeunes et en bonne santé. Outre les déficits moteurs bien connus, les sujets présentent une altération majeure du contrôle du système cardiovasculaire ainsi que des problèmes de régulation de la température interne. Les conséquences sur la qualité et l’espérance de de vie sont extrêmement préjudiciables, impliquant une réelle prise en charge. Chez les rats présentant une lésion de la moelle épinière, l'administration quotidienne pendant 28 jrs d’une molécule similaire à un neuromodulateur, la sérotonine, favorise la récupération motrice. Outre ce rôle démontré, la sérotonine est connue pour jouer également un rôle dans le tonus des vaisseaux sanguins ou la rythmicité cardiaque. L'utilisation chronique de cette même molécule sur 28 jours a confirmé les précédentes études sur la locomotrice mais a aussi mis en évidence une amélioration des fonctions cardiovasculaires. Si ces résultats sont prometteurs et pourraient être utilisés dans de prochaines études cliniques, il est malgré tout nécessaire d’approfondir les données afin de mieux caractériser notre modèle murin. Nous souhaitons donc faire un suivi longitudinal sur 60 jours de rats présentant une lésion de la moelle épinière pour voir l’évolution des paramètres cardiovasculaires dans le temps sans traitement.

Bénéfices attendus

Les lésions hautes de la moelle épinière présentent une incidence dramatique sur tous les aspects de la vie quotidienne individuelle. Outre les déficits sensori-moteurs, des troubles cardiovasculaires importants sont présents chez ces individus. Certains troubles comme les dysreflexies autonomes (épisodes soudains d'hypertension et de bradycardie réflexive) peuvent mettre en jeu le pronostic vital du patient. Le but du projet est l'amélioration des conditions de vie des patients présentant une lésion haute de la moelle épinière par une réduction des épisodes de dysfonctionnement cardiovasculaires et une amélioration de la capacité de rétention urinaire..

Procédures

Tous les animaux subiront une lésion haute de la moelle épinière entraînant une paralysie des membres postérieurs (n=20) pendant 60 jours : la chirurgie dure 1heure à 1h15 maximum. Ensuite chaque animal sera anesthésié pendant 1h15 (1h d'enregistrement plus la stabilisation) toutes les 2 semaines afin de mesurer la pression artérielle avec un tensiomètre. Enfin, toute les semaines, la force des membres avant sera mesurée grâce à un test (on fait s'agripper les animaux sur une grille penchée et on mesure le temps durant lequel l'animal tient). Cette mesure prend en moyenne 3 à 5 minutes. Au total les animaux subiront 8 tests de mesure de la force, 4 anesthésies courtes pour la mesure de la pression artérielle et 1 anesthésie pour chirurgie.

Impact sur les animaux

20 animaux subiront une chirurgie de la moelle épinière entraînant une paralysie complète des membres arrières. La conséquence de cette paralysie est une mobilité réduite, une impossibilité de vidanger leurs vessies, seuls, des troubles cardiovasculaires (dysfonctionnements des paramètres cardiovasculaires avec des épisodes de dysreflexies autonomes - épisodes soudains d'hypertension et de bradycardie réflexive), des risques infectieux liés à l'impossibilité de vidanger la vessie et des risques d'obstruction stomacale lié à la réduction de la motilité intestinale (capacité de l'intestin à faire avancer les aliments dans le tractus intestinal). Le risque infectieux est surtout présent pendant les 10 jours post-opératoire et le risque d'obstruction stomacale dure entre 4 et 5 jours post-opératoire. Les autres conséquences de la lésion médullaire dure sur l'ensemble du temps du projet, soit 60 jours.

Devenir

La procédure subie par les animaux est lourde, handicapante et sévère, ils seront donc tous euthanasiés à l'issu de la procédure. Il est donc important de ne pas devoir refaire des expérimentations pour faire de possibles exploitations immuno-histologiques. Nous avons donc fait le choix de récupérer un maximum de tissus à l'issu de l'expérimentation pour de possible exploitations futures.

Remplacement

Ce projet éthique s'inscrit dans un projet scientifique plus vaste où des études préliminaires ont mis en évidence l'implication du système sérotoninergique (5-HT) dans les épisodes cardiovasculaires dysfonctionnels qui apparaissent à la suite d'une lésion haute de la moelle épinière. L’organisation du système sérotoninergique est complexe avec de nombreux types ou sous-types de récepteurs différents qui se retrouvent à plusieurs niveaux tant centraux que périphérique. Il n'existe pas de modélisation de ce système qui permettrait de prédire les effets la lésion dans notre modèle

Réduction

Nous avons déterminé le n des lots en fonction des premiers résultats obtenus dans le précédent projet. Nous ne pouvons faire des tests statistiques de détermination du n puisque l'objectif principal du projet n'est pas une comparaison de lots mais un comparatif avec des résultats obtenus par une équipe américaine sur une souche différente de rats. Malgré cela, nous ferons une comparaison pour savoir si nous avons un effet sexe dans nos résultats (eu égard au fait qu’il existe des différences importantes dans la régulation du système cardiovasculaire entre mâles et femelles). Il va falloir n=7 animaux par lots (avec ce nombre, nous avons été en mesure de faire des statistiques claires lors de notre précédent projet éthique). Toutefois, la complexité de l'expérimentation nous oblige à prévoir une marge d'erreur que nous aimerions ne pas avoir à utiliser (n=10 animaux par sexe). Le système de mesure de pression artérielle permet de faire un suivi longitudinal jusqu'à J60 post-chirurgie sans avoir à euthanasier des individus à chaque temps. Cela réduit d'autant le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les soins post-opératoires sont basés sur notre expérience de cette technique ainsi que sur des publications de raffinement écrites par les quelques équipes travaillant sur des sujets similaires au nôtre. Il a été validée par la Structure de bien-Etre Animal et l'équipe vétérinaire. Les animaux sont anesthésiés par voie gazeuse (isofluorane). Nous utilisons une analgésie multimodale (morphinique, anti-inflammatoire et anesthésiques locale) pendant 5 jours minimum (sauf la lidocaïne qui n’est donnée que 48h), nous avons adapté les cages qui ont été usinées à façon pour s'adapter à la paralysie des animaux (eaux proche du sol, mangeoire basse, tapis souple agrippant dans la cage pour aider à la mobilité, alimentation liquide pendant 4 jours pré et post-opératoires pour pallier aux problèmes gastriques, vidange manuelle de la vessies de 1 à 4 fois par jour en fonction de la récupération des animaux et antibiothérapie post-opératoire pour éviter les infection urinaires. Des points limites stricts ont été mis en place avec l'aide de l'équipe vétérinaire.

Choix des espèces

Nous avons choisi le rat car c'est un mammifère de petite taille dont la physiologie reste proche de l'humain mais qui reste suffisamment grand pour permettre de bien repérer le tronçon médullaire que nous étudions. En effet, la lésion médullaire doit se faire au plus bas de la vertèbre T3 pour cibler le tronçon T4 et non le T3 (sur le haut de la vertèbre T3). Enfin, depuis 2019, notre modèle est le rat Sprague Dawley et ce projet éthique est la suite d'un projet scientifique plus global. Les animaux seront implantés à 225-275gr soit à 8/9 semaines d'âge environ. Les individus subissant des lésions de la moelle sont souvent de jeunes adultes (cf. description du projet) d'où le choix de la tranche d'âge. Nous avons aussi une contrainte de limite de poids (200gr) pour la pose du capteur de télémétrie.

880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur leur provoque un accident vasculaire cérébral par injection de thrombine ou par application de chlorure de fer sur l'artère cérébrale moyenne, puis les suit à l'IRM à 24 heures et à 5 jours, avec perte de poids, douleurs postopératoires et déficits fonctionnels ou cognitifs attendus. Une partie des souris est rendue diabétique, le diabète étant traité comme facteur de comorbidité de l'AVC. Il indique avoir déjà validé en microfluidique la fixation de ses microparticules de fer sur les caillots, et 880 souris subissent malgré tout un AVC provoqué pour tester trois agents théranostiques.

Objectifs

L’enjeu de ce projet est d’améliorer la prise en charge et de réduire les effets secondaires chez les patients diabétiques associés à l'administration du r-tPA, traitement gold standard des accidents vasculaires cérébraux (AVC) de type ischémique. Pour cela, nous avons développé un nouvel agent théranostique les IO@PDA@tPA. Ce sont des microparticules de fer biodégradables et biocompatibles visibles par imagerie par résonnance magnétique (IRM) couplés au r-tPA. Ce nouvel agent théranostique a montré un réel potentiel dans le traitement des AVC ischémiques en augmentant la recanalisation du vaisseau obstrué et en diminuant la taille de lésion avec une dose 5 fois inférieure à celle utilisée en clinique sur des souris SWISS. Cependant, plusieurs études ont démontré que le r-tPA possède une efficacité limitée dans les caillots riches en plaquettes. C'est pourquoi nous avons développé in vitro deux autres outils théranostiques afin d'améliorer la prise en charge des AVC ischémiques quel que soit la nature du caillot. Ainsi, ce projet a 2 objectifs : -Evaluer l’efficacité des IO@PDA@tPA sur le traitement des AVC ischémiques chez les souris diabétiques. Pour ce faire, nous étudierons ce nouvel outil sur deux modèles d’AVC ischémique, reproduisant différentes physiopathologies. Les IO@PDA@tPA seront testés à différentes doses. -Evaluer le potentiel thérapeutique de deux autres molécules candidates ayant déjà montré leur efficacité dans les caillots riches en plaquettes. Ces deux molécules seront dans un premier temps testées sur des souris swiss après induction d'un AVC ischémique puis dans un second temps sur des souris swiss diabétiques. Ces molécules candidates seront également couplées aux microparticules de fer biodégradables et biocompatibles, testées à différentes doses. Cette étude nous permettra de déterminer la dose minimale permettant le traitement des AVC ischémiques chez les souris diabétiques tout en évitant les effets secondaires associés à ce facteur de comorbidité

Bénéfices attendus

D’un point de vue scientifique, cette étude va permettre des recherches translationnelles ou appliquées menées pour le diagnostic et le traitement des AVC chez l'Homme. Les procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, l’étude d’un potentiel traitement ischémique doit s’effectuer sur des modèles in vivo. De plus, les méthodes in vitro de ce projet aident à la réduction du nombre d’animaux. La technique des microfluidiques nous a permis l’étude de la fixation des IO@PDA@tPA; IO@PDA@ADAMTS13 et IO@PDA@DNase aux caillots et de visualiser leur dégradation. Ainsi l’efficacité de ce couplage est déjà évaluée et validée avant d’avoir recours aux animaux limitant ainsi leurs nombres.

Procédures

Les animaux seront soumis à 2 modèles d'AVC ischémique différents, le modèle thrombine d'une durée moyenne de 30 minutes et 1 fois par animal et le modèle chlorure de fer (application d'une compresse imbibée de chlorure de fer sur l'artère cérébrale moyenne permettant la formation d'un caillot) d'une durée moyenne de 30 minutes et 1 fois par animal. Tous les animaux auront un suivi à l'IRM (imagerie par résonnance magnétique) d'une durée moyenne de 10 minutes à 24h et un second suivi à 5 jours après induction de l'AVC ischémique.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient : *Pour le modèle thrombine : - perte de poids - douleurs post opératoires - stress - déficits fonctionnels et/ou cognitifs. *Pour le modèle chlorure de fer : - perte de poids - douleurs post opératoires - stress – déficits fonctionnels et/ou cognitifs. *Pour le suivi à l'IRM : -stress. Tous les animaux auront un suivi attentif et régulier par l’expérimentateur et le personnel animalier qualifié (prise journalière du poids des animaux, observations des animaux dans la cage en s’assurant de leur bien-être (grimace scale, prise alimentaire et boisson).

Devenir

Tous les animaux issus des procédures d'AVC ischémique seront mis à mort afin de prélever le cerveau et étudier les processus inflammatoires par cytométrie en flux et immunohistochimie.

Remplacement

Les procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, l’étude d’un potentiel traitement ischémique doit s’effectuer sur des modèles in vivo. De plus, les méthodes in vitro de ce projet aident à la réduction du nombre d’animaux. La technique des microfluidiques, la technique du clot lysis ou encore de l'halo assay nous a permis l’étude de la fixation des IO@PDA@tPA; et des deux nouveaux agents théranostiques aux caillots et de visualiser leur dégradation. Ainsi l’efficacité de ce couplage est déjà évaluée et validée avant d’avoir recours aux animaux limitant ainsi leurs nombres.

Réduction

Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux nécessaire pour atteindre le résultat souhaité. Basée sur les études précédemment réalisées aux laboratoires, du traitement gold standard des AVC ischémiques (r-tPA: cette molécule permet la lyse des caillots dans les vaisseaux sanguins empêchant le sang de circuler dans le cerveau), il est attendu pour le groupe "contrôle" une lésion de 19 mm3 plus ou moins 4,5 et pour les groupes traités, un volume de lésion de 10mm3.

Raffinement

Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les animaux sont hébergés dans des cages standards aux normes européennes. Le bien-être des animaux est contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne et hebdomadaire permettra de détecter tout signe clinique de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à cette détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son et ne présentent aucun « sickness behavior syndrom ». Les animaux seront également placés dans un environnement enrichi : 3 souris par cage, coton, paillettes, petites maisons. Les animaux seront également pesés tous les jours pour surveiller leur poids et mis à mort si une perte de poids de plus de 15% est observée et/ou si un score sur l’échelle de la douleur (grimace scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle. Tout le matériel et consommable utilisé dans cette procédure expérimentale sera neuf (comme les seringues et aiguilles) et soigneusement nettoyé et désinfecté pour les réutilisables (pinces métalliques). Durant l'induction de l'AVC, les souris seront sous anesthésie générale, sous analgésie et sous anesthésie locale sur la peau au niveau de la chirurgie. Les yeux de la souris seront couverts afin de ne pas l'éblouir avec la lampe de la loupe binoculaire. Après la chirurgie d'induction de l'AVC, les souris disposeront de croquettes humides dans une coupelle au sol pour faciliter la prise de nourriture et l'hydratation.

Choix des espèces

La souris (mus musculus) est l’espèce animale dont la physiopathologie de l'AVC ischémique est bien définie. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier notre nouvel outil théranostique sur l'AVC ischémique et son impact sur le diabète en tant que facteur de comorbidité. Le stade de développement des animaux est de 8 semaines pour un poids compris entre 35 et 40g. Nous effectuerons donc notre modèle sur des jeunes adultes. Le choix de ce stade de développement est basé sur les données de la littérature et les précédentes études réalisées au laboratoire.

Les souris suivies cinq jours qui perdent plus de 15 % de leur poids, ou dont le score de grimace dépasse 7 pendant les 48 heures critiques, sont mises à mort. 1 000 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Chacune subit une chirurgie provoquant un AVC dans l'artère cérébrale moyenne droite, reçoit une injection, passe une IRM pour une partie d'entre elles, et finit par une mise à mort par exsanguination et perfusion intracardiaque. Le porteur classe lui-même comme sévères les douleurs postopératoires et les déficits fonctionnels ou cognitifs attendus, tout en affirmant que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement et n'émettent aucun son audible.

Objectifs

Ce projet a pour but d'évaluer l'orage cytokinique se produisant à la suite d'un AVC. A la suite d’un AVC, le système inflammatoire s’active et produit différentes molécules. Cela perdure pendant plusieurs jours, voire semaine. L’inflammation se met en place au niveau de l’organisme entier et donc du cerveau. L’étude de la production de ces molécules inflammatoires n’a jamais été réalisée à ce jour. Il existe dès lors une nécessité d’évaluer, en pré-clinique, leur production dans le temps afin de mieux décrire l’inflammation au niveau cérébral et systémique. L’objectif étant de pouvoir découvrir potentiellement de nouveaux biomarqueurs de ce processus inflammatoires. Aujourd’hui l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) est le seul traitement pharmacologique utilisé dans le cadre de l’AVC. Le tPA interagit avec un récepteur retrouvé dans de nombreux organes. Cette interaction module le système inflammatoire. De fait, le tPA en tant que traitement peut donc affecter le système inflammatoire et affecter la production des molécules inflammatoires. L’unité d’accueil travaillant particulièrement sur l’axe d’interaction entre le tPA et ce récepteur, celui-ci sera pris en compte pour voir de quelle manière il peut influencer l’orage cytokinique post-AVC.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour bénéfice principal la définition d'un ou plusieurs biomarqueurs de l'inflammation post-AVC. La finalité de ce projet serait d'utiliser ce/ces biomarqueur(s) en clinique pour une meilleure prise en charge des patients. De plus, l'identification de l'orage cytokinique permettra de mieux jauger l'intervention de différents traitements nécessaires au bien-être des patients et pouvant avoir des effets variables suivant le patient considéré.

Procédures

Chaque animal se verra induit une chirurgie provoquant un AVC au niveau de l'artère cérébrale moyenne droite. Ils auront tous une injection du traitement (rtPA ; solution saline) après l'induction de l'ischémie. Tous les animaux issus des groupes "24h" et "5 jours" passeront un IRM afin d'évaluer différents paramètres associés à l'AVC et notamment le volume de lésion. Enfin, la totalité des animaux sera mise à mort par exsanguination et perfusion intracardiaque au terme des temporalités nécessaires à la caractérisation de l'orage cytokinique.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effet indésirables étant susceptibles d'apparaître chez les animaux seraient : - une perte de poids anormale (nuisance modérée associée à l'état post chirurgie) - des douleurs post-opératoire (nuisance sévère associée à la chirurgie) - du stress induit par les déplacements des cages, la chirurgie, la manipulation des animaux par l'expérimentateur, les situations de réveil (nuisance modérée) - des déficits fonctionnels et/ou cognitifis (nuisance sévère associée à la chirurgie)

Devenir

A l'issu de la procédure, les animaux seront mis à mort par exsanguination pour prélèvement de sang et des organes nécessaires au projet.

Remplacement

Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. L'AVC est une pathologie complexe faisant intervenir de nombreux différents types cellulaires. Aujourd'hui, il est possible de représenter seulement des caractéristiques très particulières de l'AVC, généralement séparées les unes des autres. Il est par exemple possible de faire de la mise en culture cellulaire de neurones soumises à un protocole d'hypoxie afin de mimer l'effet de la réduction d'apport en oxygène que subissent les neurones in vivo. Il est également possible de réaliser de la micro-fluidique pour modéliser les caillots sanguins (à partir de sang humain) et évaluer différentes constantes de dynamiques associées à leur formation et leur dégradation. Toutefois, cette technique de permettrait pas d'intégrer le système inflammatoire et les cellules cérébrales afin d'étudier la production de cytokine suite à un AVC par exemple. Dans l'optique de travailler sur la production de cytokine associée à un AVC, une pathologie neuro-vasculaire globale, il n'est pas encore possible de modéliser l'ensemble de l'unité neuro-vasculaire pour avoir un résultat qui sera extrapolable à l'humain. De plus l'utilisation d'un organisme complexe est nécessaire au vu du fait que des cytokines pourraient être produites par des organes lymphoïdes primaires et secondaires. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l'espèce. L'ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons dans le contexte de l'AVC rend la souris indispensable à la réalisation de ces procédures. La physiopathologie de l'AVC étant globalement établie chez cette espèce, son utilisation n'en est que normale.

Réduction

Notre projet ne nous permet pas d'utiliser d'autres moyens que l'expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d'utiliser le nombre minimal d'animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité. En fonction de l'expérimentateur (habilité, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse. Dans chaque phase du projet, le minimum d'animaux a été prévu afin d'arriver à des résultats qui soient en adéquations avec les tests statistiques prévus lors de ce projet en prenant en compte un pourcentage d'animaux nécessaire à l'apprentissage. Pour les groupes d'animaux passant un IRM ("24h" et "5 jours"), des comparaison seront réalisées entre les souris traitées et non traitées. Entre toutes les souches de souris, pour ces mêmes groupes et ces mêmes résultats, les différences de volume de lésion seront établies. En résumé, pour toutes ces comparaisons, dès lors que les résultats nous le permettront, le nombre d’animaux utilisés pourra être réduit. De plus, le nombre d'animaux a été obtenu à partir de la spécificité et de la sensibilité des méthodes utilisées, ainsi que de nos travaux précédemment publiés dans la littérature. De plus l'utilisation de techniques d'imagerie non invasives permet de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les animaux sont hébergés dans des cages aux normes européennes avec un environnement enrichi (coton, paillettes, petites maisons) avec 5 souris par cage selon la directive 2010/63/UE. Les animaux seront anesthésiés et analgésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limités fixés au préalable. Le bien-être des animaux est contrôlé 7J/7 pour détecter tous signes cliniques de souffrance et agir rapidement pour y mettre fin. L'ensemble des connaissances et des acquis du laboratoire montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent soin de leur pelage, n'émettent aucun son audible à l'oreille humaine et ne présentent aucun "sickness behavior syndrom". Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l'accès à l'eau et à la nourriture sera ad libitum. Les animaux du groupe mis à mort 5j post-chirurgie seront pesés quotidiennement pour surveiller leur poids et mis à mort si une perte de poids de plus de 15% est observée et/ou si un score sur l'échelle de la douleur (grimace scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques aux modèles. Tout le matériel et consommable utilisé dans ces procédures expérimentales seront neufs, soigneusement nettoyés et désinfectés pour les réuitiliser (pinces métalliques). Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu'à la mise à mort de l'animal. Le jour de la chirurgie, afin de réduire le stress, les animaux seront emmenés dans la salle de chirurgie a minima 30 minutes avant celle-ci. Les cages y seront stockées dans une armoires ventilée spécifique, et dédiée, permettant de les maintenir dans un environnement avec une température et pression contrôlées. De plus, la sédation de l'animal pré-chirurgie sera faite sur une paillasse de sédation de type vétérinaire pour réduire au maximum le temps d'induction. Après la chirurgie, les animaux seront placés dans une enceinte de réveil chauffée et ventilée, isolés les uns des autres dans l'espace au maximum pendant 2h pour diminuer le stress dû au réveil. Toutes les douleurs des animaux sont prises en compte par une couverture anesthésique et analgésique adaptée.

Choix des espèces

La souris (Mus Musculus) est l'espèce animale la plus étudiée dans le domaine du développement et les techniques employées sont bien connues. L'anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connus et sont proches de celles de l'Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L'ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Il n'existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l'Homme. Les souris seront âgées de 8 à 12 semaines, correspondant à un âge de jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature pour les études précliniques sur l'AVC.

Une grille en cinq critères, notée de 0 à 15, doit déterminer le moment où les souris atteintes de méningiome seront tuées avant le terme prévu. 276 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacune subit une chirurgie crânienne d'une heure pour recevoir dans le crâne des cellules de méningiome ou un virus recombinant, puis jusqu'à six injections sous la peau du crâne, et peut développer perte de motricité, amaigrissement et crises convulsives. Le projet vise à établir le rôle des cellules immunitaires des méninges dans la progression de ces tumeurs, en vue de futures immunothérapies chez l'être humain.

Objectifs

Les méningiomes sont les tumeurs primitives du système nerveux central les plus fréquentes chez l'adulte. Les formes de haut grade ont une fréquence élevée de mutation d'un gène particulier ( NF2). Ces formes représentent un quart des méningiomes avec des récidives multiples associées à une survie réduite sans option médicamenteuse ou d’immunothérapie disponible. Les méninges jouent un rôle clé dans la communication neuro-immunitaire . Les données récentes, montrent une infiltration fréquente des méningiomes non graves par des cellules immunitaires. Notre hypothèse est que le microenvironnement immunitaire méningé régule la progression maligne des méningiomes et leur comportement d’échappement à la surveillance immunitaire. Nos principaux objectifs sont d’utiliser nos modèles de souris de méningiomes de différents grades de malignité et d'évaluer le rôle des populations immunitaires méningées dans l'initiation et la progression du méningiome.

Bénéfices attendus

Notre projet va permettre de caractériser précisément le rôle du microenvironnement immunitaire dans la malignité des méningiomes-NF2 en manipulant les cellules immunitaires des méninges, pour pouvoir ultérieurement potentialiser les approches thérapeutiques associées à l'immunothérapie dans les méningiomes agressifs chez l’homme

Procédures

Pour chaque expérience, les souris vigiles adultes seront d’abord injectées en sous cutanée avec un antidouleur 30 mn avant, puis en intra-péritonéal avec du chlorure de sodium pour hydratation avant l’anesthésie. Ces gestes rapides et maitrisés par l’opérateur ne sont pas douloureux à part la piqure de l’aiguille. Puis les souris seront anesthésiées par anesthésie gazeuse avant la procédure chirurgicale. La procédure chirurgicale sera d’injecter en intra- cranial des lignées cellulaires de méningiome ou de virus recombinant afin d’induire les méningiomes. Durée 1h préparation 30 mn. Puis une semaine après l’intervention : - les souris de la procédure 2 seront seront injectées en sous-cutanée au niveau de la peau du crâne (Durée : 3 minutes, préparation : 10 minutes) répétée 3 fois (1 par semaine pendant 3 semaines ) ou 6 fois (tous les 2 jours sur 12 jours) suivant le produit injecté pour la déplétion en cellules immunitaires. Les souris de la procédure 3 seront injectées en intra péritonéal (Durée : 3 minutes, préparation : 10 minutes) une seule fois pour l’activation d’une sous population de cellules immunitaires. A la fin de chaque procédure les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire en fin de protocole en vue des prélèvements. .

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent développer des symptômes cliniques liés à la présence de méningiomes malins, pas bénins. Les symptômes observés chez l’animal peuvent être : une perte de motricité empêchant l'alimentation, un amaigrissement, des crises convulsives. Les gestes pratiqués chez les souris dans ce projet incluent les nuisances suivantes : les risques anesthésiques lors de l’injection sous durale tels que dépression cardio-vasciulaire, hypothermie, hypocvolémie, sécheresse cornéenne et douleurs post-opératoires. Les animaux pourront ressentir un stress lié à la contention et une douleur de très courte durée lors de l’introduction de l’aiguille pour les injections intra-péritonéales ou sous- cutanées dans les expériences de modulations des cellules immunitaires. Les signes cliniques potentiels seront soulagés par l'administration d'anti-douleurs et le suivi des points limites par du personnel qualifié. Aucune nuisance ne sera liée au génotypage. Le génotypage s’effectuera grâce à des techniques non invasives : soit en associant un prélèvement de tissu pour le génotypage (poinçon d’oreille)qui sera confondu avec la méthode d’identification , soit l’identification par bague à l’oreille et le prélèvement de follicule pileux. Dans les deux cas ces techniques sont considérées comme étant sous le seuil réglementaire.

Devenir

L'euthanasie de tous les animaux à la fin de l'ensemble des procédures est justifiée par la nécessité de réaliser une analyse histologique complète du cerveau pour répondre aux objectifs du projet.

Remplacement

Les modèles in vitro et sur animaux invertébrés ne permettent pas l'obtention de méningiomes avec un aussi grand niveau de complexité et de reproduction de la pathologie humaine que les modèles murins déjà existants. La complexité du cerveau des souris est nécessaire pour une observation comparative avec le cerveau humain.

Réduction

Nous avons réduit au maximum le nombre d’animaux utilisés (Nombre total : 276 animaux) pour nous permettre de générer des données statistiques solides. Nous aurons des résultats d’animaux expérimentaux à comparer aux résultats obtenus sur les animaux dits « contrôles ». Cela permet d'avoir une évaluation rationnelle du nombre d'animaux pour pouvoir effectivement observer l'effet escompté.

Raffinement

A la réception des animaux en provenance de l’extérieur, une procédure d’acclimatation d’une semaine aux nouveaux locaux sera réalisée. Les souris seront hébergées dans des animaleries protégées, conçues dans le respect de la réglementation et des principes éthiques liés à l'utilisation d'animaux à des fins scientifiques et exemptes d’organismes pathogènes spécifiques. Au courps de la procédure ,les souris seront réchauffées sur tapis chauffant pendant la chirurgie, elles auront un accès facile à de la nourriture humide (contenant 70% d’eau) , des antidouleurs et des bâtonnets à ronger pour améliorer leur rétablissement. Un suivi de l’ensemble des animaux sera effectué quotidiennement par l’équipe zootechnique et par un des membres de l’équipe de recherche. Le bien- être et la douleur des animaux seront évalués par une grille de score selon 5 critères pour donner un score global d’évaluation de la douleur noté entre 0 et 15 : 1-Apparence et Grimace 2- Comportement naturel 3- Evolution pondérale 4-Comportement provoqué 5- Site de la chirurgie. Une surveillance post opératoire dédiée est réalisée afin d’identifier des signes de souffrance physique ou morale, l’apparition des points limites, et également l’apparition de signes d’infection générale ou du site opératoire.

Choix des espèces

Le modèle animal est le seul moyen de pouvoir manipuler le micro-environnement des méningiomes bénin ou malin, notamment en raison de l'absence de cultures cellulaires de méningiomes en général et plus particulièrement avec le profil mutationnel désiré et les différents composants du micro-environnement.