Procédures sévères

Deux chirurgies crâniennes de trois à cinq heures chacune, des injections quotidiennes de neurotoxine pendant six mois au maximum, puis une séance d'enregistrement d'une heure par jour cinq jours sur sept pendant douze mois : 6 macaques à longue queue sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue. Le MPTP leur provoque un syndrome parkinsonien permanent, avec rigidité musculaire, tremblements au repos, posture anormale et, selon la sévérité, des difficultés à s'alimenter, une perte de poids et des escarres. Chaque animal est capturé au collier dans sa volière et habitué à rester assis dans une chaise de contention, son cerveau étant retiré du crâne après sa mort pour localiser les sites d'enregistrement. Le porteur précise que le choix entre macaque à longue queue et macaque rhésus dépendra des possibilités d'approvisionnement, dans un contexte qu'il décrit comme une pénurie de singes pour la recherche.

Objectifs

Dans la maladie de Parkinson, le ralentissement et l’absence de mouvements volontaires s’accompagnent d’activités oscillatoires anormales dans un réseau de structures localisées sous le cortex cérébral, aussi appelé les ganglions de la base. Néanmoins, le lien entre ces activités oscillatoires pathologiques et les troubles moteurs caractéristiques de la maladie de Parkinson reste flou malgré des décennies de recherche. D'une part, la concomitance entre la réduction/abolition de ces activités oscillatoires suite à des traitements pharmacologiques et/ou à des procédures chirurgicales et l'amélioration clinique des troubles moteurs suggère un lien de causalité entre ces oscillations neuronales et la planification, le contrôle et la coordination des mouvements. D'autre part, il a été démontré que le ralentissement et l’absence de mouvements volontaires peuvent apparaître avant l'émergence des activités oscillatoires dans les ganglions de la base. De plus, les caractéristiques de ces oscillations neuronales peuvent varier en fonction des différentes structures qui composent le réseau des ganglions de la base. Notre plan de recherche est structuré en trois objectifs complémentaires. Le projet vise à (i) caractériser comment ces activités oscillatoires se produisent et comment elles se propagent dans les différentes structures des ganglions de la base chez des singes parkinsoniens effectuant des mouvements de bras volontaires en direction d’une cible; (ii) identifier le lien entre les caractéristiques de ces oscillations neuronales dans différentes structures du réseau des ganglions de la base et les mouvements normaux/anormaux; (iii) développer de nouvelles approches thérapeutiques permettant une inversion rapide et robuste des changements neuronaux et comportementaux.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à développer des approches thérapeutiques innovantes pour la maladie de Parkinson qui diffèrent significativement des thérapies actuellement disponibles et qui ne peuvent être développées sans une profonde compréhension mécanistique et quantitative de la façon dont le cerveau remplit ses fonctions ainsi que des mécanismes qui sous-tendent ses dysfonctionnements. Ce projet permettra de comprendre les mécanismes de génération et de propagation des activités oscillatoires anormales observées dans les ganglions de la base chez des singes après induction d’un syndrome parkinsonien et révèlera le lien avec les symptômes moteurs parkinsoniens. Ce projet sera donc extrêmement intéressant pour les personnes souhaitant développer de protocoles thérapeutiques originaux visant à restaurer le fonctionnement normal du cerveau. A terme, ce projet aidera à soulager les troubles moteurs des patients souffrant de la maladie de Parkinson tout en minimisant l'apparition d'effets secondaires et donc participera à améliorer leur qualité de vie.

Procédures

Chaque animal subira une IRM pour obtenir une image morphologique 3D du cerveau (30min de transport jusqu'à l'IRM et 180min de procédure). Chacun des animaux sera également soumis à deux chirurgies d'une durée de 3à 5h chacune. La première chirurgie permettra l'injections de particules virales inactivées dans le cerveau visant à modifier les caractéristiques des neurones, et l'implantation d'électrodes d'enregistrements pour recueillir l'activité de ces neurones. La seconde chirurgie permettra l'implantation d'électrodes permettant de délivrer différentes intensités de courant électrique dans le cerveau pour restaurer son fonctionnement normal. Chaque animal subira également une injection intramusculaire quotidienne d'une substance chimique inerte et sans danger pour l'animal visant à manipuler l'activité des neurones dont les caractéristiques ont été modifiées préalablement (une injection par jour d'environ 20 à 30s, 5 jours par semaines durant 3 à 6 mois environ). L'induction du syndrome parkinsonien chez les animaux se fera grâce à des injections quotidiennes intramusculaires (une injection par jour d'environ 20 à 30s pendant n jours) d'une neurotoxine (appelé MPTP) qui provoque des symptômes permanents de la maladie de Parkinson. Le nombre de jours d'injection et le dosage de cette neurotoxine dépendra de la progression du syndrome (mais n'excédera pas plus de 6 mois). Enfin, chaque animal participera à une séance quotidienne d'enregistrements électrophysiologiques de l'activité neuronale (une séance d'environ 1h par jour, 5 jours par semaine durant 12 mois environ).

Impact sur les animaux

La phase précoce de conditionnement et de l'entrainement (c'est-à-dire la capture de l'animal dans la volière à l'aide d'un colier, l'entrainement de l'animal dans la tâche comportemental) peut stresser les animaux. Au cours de la procédure IRM, les nuisances sont essentiellement liées à l'anesthésie qui peut entrainer une baisse de la température corporelle, des troubles respiratoires et/ou cardiaques. Durant le transport à l'IRM, il faut également être très prudent afin que l'animal ne se blesse pas (par exemple plaies/coupures ) avec la cage de transport. De plus, des douleurs et infections peuvent survenir suite aux interventions chirurgicales . Enfin, l'induction du syndrome parkinsonien provoquera l'apparition de symptômes moteurs (c'est-à-dire des difficultés à effectuer des mouvements, une rigidité musculaire, une posture anormale et des tremblements au repos). Par ailleurs, selon la sévérité de ces symptômes parkinsoniens, les animaux pourront présenter des difficultés à s'alimenter et à bouger pouvant donc entrainer une perte de poids et l'apparition d'escarres.

Devenir

Une fois la procédure terminée, les animaux seront profondément anesthésiés et euthanasiés afin de pouvoir effectuer des analyses histochimiques post-mortem qui sont indispensables pour localiser les sites d'enregistrements de l'activité neuronale et l'aspect du cerveau après l’induction du syndrome parkinsonien. Après constatation de la mort de l’animal, le cerveau sera retiré du crâne, congelé pour procéder aux analyses histologiques.

Remplacement

Notre projet a pour but de caractériser les dysfonctionnements qui se produisent dans le cerveau après induction d'un syndrome parkinsonien et de déterminer les conséquences sur le comportement afin de développer de nouvelles approches thérapeutiques pour les patients atteints de la maladie de Parkinson. Ce type de projet ne peut donc pas être effectué via des approches in silico, in vitro ou ex vivo et l'approche in vivo est indispensable. De plus, les singes ont un cerveau et des comportements semblables à l'homme ce qui permet de développer des tâches comportementales complexes et susceptibles de refléter les comportements humains. L'utilisation de rongeurs ou d’autres espèces de vertébrés n'est donc pas appropriée et nous sommes obligés d'utiliser des primates non-humains.

Réduction

Notre objectif est de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés pour la recherche. Nous y parvenons en planifiant soigneusement et en maximisant les données obtenues chez chaque animal. Ainsi, chaque animal sera son propre contrôle, ce qui diminuera par deux le nombre total d’animaux utilisé pour ce projet. Le nombre d'animaux a été choisi en fonction des pratiques standards qui combinent l'étude de l'activité neuronale et l'étude du comportement chez les primates non-humains. Enfin, notre stratégie de libre accès aux données sera essentielle non seulement pour les avancées scientifiques, mais aussi pour des raisons éthiques. En effet, il n'est pas nécessaire de réaliser davantage d'expériences sur les animaux si les données sont déjà disponibles quelque part dans le monde.

Raffinement

En début de protocole et durant 3 mois, l’expérimentateur habituera les animaux à sa présence (15-30min par jour, 5 jours par semaine). L’expérimentateur apprendra à l’animal à se laisser attraper par son collier à l’aide d’une canne et à rester calmement assis dans une chaise de travail (5 jours par semaine). Pendant la durée totale des expériences, les animaux seront maintenus en groupe et bénéficieront d'un environnement enrichi (jouets, musique). Le transport de l’animal vers la plateforme de bio imagerie située à 200m de l’animalerie se fera à l’aide d’une boîte de transport dédiée mise sur un chariot et protégée des regards extérieurs par une housse. L’animal anesthésié sera maintenu au chaud sous une couverture et bordé d’une bouillotte. Au total, la durée de l'examen sera de 30min de transport et 180min de procédure. Les chirurgies seront réalisées de façon stérile et sous anesthésie profonde. Une couverture antalgique en pré- et post-opératoire sera utilisée pour limiter la douleur de l’animal après l’intervention chirurgicale. Enfin, pour limiter la douleur que peuvent engendrer les incisions cutanées, nous administrons un anesthésique local avant incision. Pour le contrôle de la température, avant l’induction de l’anesthésie, une sonde sera insérée dans le rectum des animaux. De plus, durant la totalité de la chirurgie, les animaux seront placés sous une couverture (électrique) chauffante qui est régulée en fonction de la température corporelle. Suite aux chirurgies, les animaux seront quotidiennement observés durant 5 à 7 jours post-chirurgie par le personnel de l'animalerie sur des critères comme la posture de l’animal, son activité, son interaction, sa nutrition etc. Une attention toute particulière sera porté aux risques d'infections, d'abcès, d'œdèmes et d'inflammation. Durant l'induction du syndrome parkinsonien, les animaux seront également quotidiennement observés pour évaluer la sévérité de la maladie et induire un syndrome parkinsonien stable et modéré. Si les symptômes s'accentuent (difficultés à s'alimenter et à bouger, pouvant entrainer une perte de poids et l'apparition d'escarres), l'animal sera immédiatement sorti du protocole et séparé des autres animaux, de façon à sécuriser son hébergement et éviter qu’il se blesse. De plus, des précautions particulières seront prises telles que l'utilisation de matelas moelleux/alèses et de fréquents changements de position pour éviter les chocs et le développement d'escarres.

Choix des espèces

Contrairement à d'autres espèces de vertébrés (e.g., rongeurs), le macaque possède une organisation du cerveau semblable à celle de l'homme. De plus, le macaque possède un répertoire de comportements plus large et plus proche de celui de l'homme ce qui nous permet de développer des tâches comportementales complexes et susceptibles de refléter les comportements humains. L'utilisation du primate non-humain permettra donc de plus facilement transposer nos résultats à l’homme et reste donc indispensable dans le cadre de cette étude. De plus, les animaux utilisés pour ce projet seront âgés d’au moins 36-48 mois. A cet âge, on peut considérer que le développement du système nerveux central à atteint sa maturité. Ce paramètre est important à respecter puisqu’il nous permettra de comparer plus aisément les résultats obtenus chez ces animaux avec les caractéristiques observés chez l’homme à l’âge adulte. Notons que dans le contexte (européen et mondial) actuel de pénurie de singes pour la recherche scientifique, le choix du singe cynomolgus ou du singe rhésus dans ce projet dépendra des possibilités d'approvisionnement. Quoiqu'il en soit, nous n'attendons pas de différences majeures entre ces deux espèces.

Anesthésiées deux à trois fois pour recevoir dans la narine un probiotique puis une suspension de Pseudomonas aeruginosa, 845 souris développent une infection pulmonaire aiguë. Elles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, avec pertes de poids, chute de température et immobilité progressive sur sept jours au maximum. Le porteur qualifie de faible l'intensité de chaque geste pris isolément, préhension, anesthésie, injection d'analgésique, tout en reconnaissant que l'évolution de l'infection va jusqu'à une intensité sévère. Toutes les souris infectées sont tuées, précisément parce qu'elles ont subi cette infection pulmonaire aiguë.

Objectifs

Pseudomonas aeruginosa est une bactérie responsable d’infection pulmonaire grave chez les patients atteints de mucoviscidose, de bronchopneumopathie chronique obstructive et chez les patients en réanimation. Cette bactérie devient résistante à tous les antibiotiques habituellement utilisés. Aussi, il est capital de rechercher des alternatives thérapeutiques aux antibiotiques comme les probiotiques. Les probiotiques sont des microorganismes qui, administrés en quantités adéquates, exercent des effets positifs sur la santé. Nous avons pu valider une preuve de concept, suite aux résultats prometteurs d’une bactérie à potentiel probiotique actuellement en développement au laboratoire, et ayant une action protectrice vis-à-vis de l’infection pulmonaire à Pseudomonas aeruginosa. L'objectif du projet est de tester l'efficacité du probiotique à des souris ayant une infection pulmonaire à Pseudomonas aeruginosa.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet permettra de recueillir des données sur l’intérêt de l’utilisation de souches cliniques de Porphyromonas comme potentielles bactéries bénéfiques (probiotiques) à visée anti-Pseudomonas aeruginosa, pathogène clé de plusieurs pathologies respiratoires humaines étant à l’origine d’infections pulmonaires notamment dans la mucoviscidose ou la bronchopneumopathie chronique obstructive.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés deux à trois fois et recevront durant 1 minute du sérum physiologique ou un probiotique dans la narine puis la seconde fois une suspension bactérienne sur une durée de 1 minute. Si une troisième instillation est prévue, les souris recevront du sérum physiologique ou un probiotique durant 1 minute dans la narine.

Impact sur les animaux

Selon les procédures, les suivis quotidiens pourront durer de 3 à 7 jours. Ce projet peut induire un stress chez les animaux notamment lors de la préhension de l’animal, pour les suivis, les pesées et la prise de température (2 à 3 fois par jour maximum) : intensité faible, durée environ 1 min. Les animaux auront au maximum 3 anesthésies : Intensité faible, durée environ 2 min. Des pertes de poids et de température, une mobilité réduite voire, une inactivité après le début de l’infection pulmonaire peuvent être observées, elles sont d’intensité progressive avec l’évolution de l’infection pouvant aller jusqu’à une intensité sévère sur une durée de 7 jours maximum. Les analgésies par injection des animaux sont d’intensité faible et d’une durée d’environ 30 secondes.

Devenir

A l'issu du projet tous les animaux ayant été infectés, seront mis à mort. Et certains auront des prélèvements de tissus. Tous les animaux doivent être mis à mort, car ils ont subi une infection pulmonaire aigue.

Remplacement

Nous souhaitons observer dans cette demande un pourcentage de survie d’animaux à une infection pulmonaire causée par Pseudomonas aeruginosa mais également observer les effets aux niveaux tissulaires (poumons et autres) de l’instillation du probiotique sur l’infection à Pseudomonas aeruginosa. Les modèles cellulaires et/ou autres modèles in vitro ne permettent pas à ce jour de conclure sur la survie d’un animal ou des dommages tissulaires à une infection pulmonaire. Pour cette raison, nous faisons le choix de conserver le modèle animal. De plus, nous souhaitons étudier la sécurité du potentiel probiotique ce qui doit impérativement se faire sur un modèle animal.

Réduction

Lors des études de survies, l’analyse de la survie sera réalisée par des tests statistiques, le nombre de souris nécessaire par groupe est de 10 souris. Afin de réduire le nombre d’animaux, le nombre de souris dans notre groupe recevant uniquement notre probiotique est réduit au minimum car nous n’attendons aucune mortalité. Lors des procédures d’études de l’inhibition de Pseudomonas aeruginosa au niveau pulmonaire, le nombre de souris nécessaire afin de garantir une puissance statistique est de 6 souris minimum dans chaque groupe. Pour nos procédures de test du probiotique de manière curative 10 souris minimum sont nécessaires dans chaque groupe. Par ailleurs, dans nos procédures, nous nous limitons à une seule souche clinique de notre probiotique alors que plusieurs espèces sont décrites.

Raffinement

Avant toutes instillation intranasale, les animaux seront préalablement anesthésiés, une analgésie est mise en place en accord avec notre table se suivi de soin. De plus, un gel appétent contenant de l'analgésiant est déposé dans les cages 24h/24. Ce gel permet une analgésie continue pour les animaux tout au long de la journée. De plus, les points limites seront monitorés régulièrement (2 à 3 fois par jour) à l’aide d’une table de suivi de soins mise en place afin de réduire ou supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux.

Choix des espèces

Les souris ont été choisies, car leur sensibilité à Pseudomonas aeruginosa permet de provoquer une pneumonie tout en évitant une mortalité trop importante à 24h. Par ailleurs ce modèle a déjà été étudié au sein de notre équipe de recherche à plusieurs reprises. Les animaux utilisés seront âgés de 6 à 8 semaines, car c’est l’âge des souris du même modèle retrouvé dans la littérature. C’est également l’âge des souris utilisées dans de précédentes expérimentations réalisées dans notre équipe, ce qui nous permettra de conserver le même modèle d’étude pour l’interprétation de nos résultats.

Pour cartographier les réseaux de neurones inhibiteurs entre la moelle épinière et le cerveau, 224 souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. 64 subissent une chirurgie d'injection dans la moelle épinière, 60 en subissent deux, moelle épinière puis tronc cérébral, et 100 reçoivent une injection dans le tronc cérébral puis l'implantation d'une fibre optique. Ces dernières passent trois épreuves comportementales, un couloir, un plateau basculé à 45 degrés dix fois par jour pendant deux semaines et un tapis roulant, pendant que la lumière active ou inhibe leurs neurones. Les suites annoncées sont le saignement, la douleur postopératoire, l'infection des sutures, le déséquilibre et la perte de poids, quand le bénéfice tient en une phrase, des connaissances utiles à la compréhension du système postural.

Objectifs

Les interactions entre la moelle épinière et le cerveau sont responsables de nombreux comportements, plus particulièrement les comportements moteurs. Cependant les mécanismes d’interaction entre ces deux systèmes (moelle et cerveau) ne sont pas comlètement élucidés. La connaissance de l’anatomie et du fonctionnement de ces interactions reste essentielle à la compréhension des mécanismes locomoteurs. En effet, les réflexes permettant la position debout et la stabilité pendant les déplacements ainsi que les positions statiques sont contrôlés par ces interactions. Si le réseau de neurones excitateurs a bien été étudié et caractérisé, ce n’est pas le cas pour les interactions entre ce réseau dit « excitateur » et celui dit « inhibiteur ». Le but de cette étude est donc de comprendre comment sont anatomiquement organisés les réseaux de neurones inhibiteurs de la moelle épinière et du cerveau et de caractériser également leur fonctionnement. Dans ce but nous travaillerons sur le modèle murin, et plus particulièrement sur des souris génétiquement modifiées dont les neurones cibles ont été rendus facilement répèrables par des outils de génie génétique ce qui permettra leur ciblage pour les étudier. La souris possède un système locomoteur quadripède assez proche de l’homme, de par les structures cérébrales qu’il implique. Pour ce faire, nous allons utiliser des approches de marquage des projections neuronales entre la moelle épinière et le cerveau, ainsi que des approches fonctionnelles permettant d’activer ou d’inhiber les neurones cibles en utilisant la lumière.

Bénéfices attendus

Notre projet permettra une meilleure compréhension du système postural impliqué dans le maintien corporel d’un être vivant. L’étude anatomique et fonctionnelle de ce système d’adaptation apportera des connaissances utiles piur la compréhension de son fonctionnement en situation pysiologique et pathologique.

Procédures

-64 animaux seront soumis à 1 chirurgie d’injection dans la moelle épinière, d’une durée de 30 à 45 min sous anesthésie générale. -60 animaux seront soumis à 2 chirurgies : 1 injection dans la moelle épinière d’une durée de 30 à 45 min, puis 3 à 4 semaines après, 1 injection dans le tronc cérébral, chirurgie d’une durée de 1h. -100 animaux seront soumis à 2 procédures de chirurgies et 3 tests comportementaux : 1 injection au niveau du tronc cérébral (30min). 3 semaines après, 60 animaux seront soumis à une implantation de fibre optique au même niveau que le lieu d’injection précédemment mentionné (30min). Les 60 autres animaux seront implantés dans la moëlle épinière (1h) La stimulation optogénétique : durée et fréquence 30 sec toutes les minutes pendant 10 minutes Les animaux utilisés en comportement recevront 3 comportements différents : couloir (3 jours, 5x1min par jour), bascule (2 semaines, 10 basculements de 45° par jour), tapis roulant (6 jours, 4x 3 min).

Impact sur les animaux

Il s’agit de risques généraux suite à la chirurgie tel que le saignement, la douleur post-chirurgicale, l'infection au niveau de la suture, la réduction de la mobilité à court terme, le déséquilibre, la perte de poids.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérimentation pour l'étude histologique

Remplacement

En accord avec la Directive Européenne et le principe des 3Rs, nous avons réfléchi à nos expériences afin d'intégrer les approches alternatives. A notre connaissance, seuls les modèles mammaliens, et plus particulièrement la souris, répondent aux questions scientifiques posées par notre étude. Le recours donc au modèle animal « souris » est indispensable pour la réalisation de cette étude qui nécessite une évaluation comportementale et un ciblage de neurones spécifiques. Aucun modèle in vitro ne peut reproduire de telles conditions. Cependant, nous avons réalisé des études pilotes chez le xénope pour mettre au point les protocoles et s’assurer de leur fonctionnement avant de les adapter à la souris.

Réduction

Avant la mise en place de ce projet, nous avons réalisé des expériences pilotes pour la mise au point des injections spinales cervicales afin de diminuer au maximum le nombre d’animaux du projet. La réduction du nombre d’animaux a été prise en compte tout en conservant une signification scientifique statistique. Le nombre maximal, en prenant en compte les variations expérimentatles, ne dépasse pas ainsi 15 animaux par groupe pour l’étude fonctionnelle et 8 par groupe pour l’étude anatomique. De plus, nous utiliserons des souris mâles et femelles, ce qui permet d’inclure tous les animaux des portées.

Raffinement

Tous les protocoles sont réalisés par des experts dans le domaine et sont ainsi optimisés pour soulager le stress et la douleur des animaux. Les animaux sont hébergés en cage collective avec enrichissement du milieu (tunnel, maisonnette, cellulose pour le nid). L’utilisation d’anesthésique et d’analgésiques est prévue pour soulager les douleurs post-chirurgicales. De plus, de la nourriture enrichie est fournie pendant au moins 3 jours suivant la chirurgie. Les animaux seront surveillés quotidiennement par l'expérimentateur avec une surveillance renforcée après la chirurgie jusqu’à la fin de l’expérimentation avec la mise en place d’une réhydratation, un réchauffement, des traitements vétérinaires si besoin.Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter la souffrance des animaux, pour cela, les animaux seront suivis régulièrement pour détecter d’éventuels signes cliniques (perte de poids, apparence physique, comportements provoqués/non provoqués). En plus des points limites spécifiques sont déterminés suite à la chirurgie (poids, mobilité, respiration) et ce pendant 3 jours après la chirurgie. Les sutures seront particulièrement surveillées pendant la première semaine et seront reprises en cas d’ouverture.

Choix des espèces

Cette étude nécessite d’agir sur des neurones dont les modifications génétiques ne sont maitrisées n’existant que chez la souris, d’où le choix de cette espèce. Nous utiliserons des animaux adultes âgés de minimum 8 semaines et n’excédant pas 6 mois pour des raisons de conservation de mobilité optimale car nous nous interressons à l’organisation des réseaux locomoteurs matures et fonctionnels.

8 000 souris et 2 000 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une colite leur est provoquée par du dextran sulfate de sodium dans l'eau de boisson, par instillation intrarectale d'acide trinitrobenzènesulfonique après douze à seize heures de jeûne, par oxazolone, par bactéries ou par transfert de cellules immunitaires chez des souris immunodéficientes, avec diarrhée potentiellement hémorragique et pertes de poids marquées attendues. Certains protocoles courent jusqu'à vingt-deux semaines, avec pesée quotidienne dès l'apparition des signes cliniques. Le porteur explique l'effectif de 10 000 animaux par le nombre élevé d'études prévues pour tester un grand nombre de composés, sans autre justification chiffrée.

Objectifs

La colite inflammatoire se traduit par une diarrhée chronique consécutive à l’inflammation des parois de l’intestin. Elle peut être provoquée par des bactéries, des parasites, la prise de médicaments, le traitement par radiothérapie, la rectocolite hémorragique ou la maladie de Crohn. La rectocolite hémorragique est caractérisée par une inflammation de la muqueuse et sous-muqueuse du rectum et du colon. La maladie de Crohn entraîne plus de complications, car l’inflammation peut toucher le tube digestif entier, de la bouche jusqu’à l’anus, et créer une obstruction partielle de l’intestin. La colite post-radiothérapie s’observe surtout après irradiation dans la zone abdominale et pelvienne dans le cas de traitement anti-cancéreux. Les parasites et bactéries provoquent des colites spontanément résolutives, mais certains d’entre eux peuvent produire des lésions qui ressemblent à une maladie inflammatoire primitive. Ce projet a pour but de tester in vivo des composés chimiques ou biologiques dont le potentiel anti-inflammatoire aura été déterminé au préalable dans des tests in vitro. Pour cela, il est nécessaire de disposer d’un modèle rongeur où il est possible de créer un état inflammatoire du colon tel qu’on peut l’observer chez l’homme. Actuellement, l’arsenal thérapeutique disponible, notamment les anti-inflammatoires, ne permet pas de soigner correctement ces pathologies lourdes, et de multiples interventions chirurgicales sont nécessaires pour retirer au fur et à mesure les portions lésées de l’intestin. Malgré leur efficacité, les anti-TNF doivent être utilisés avec précaution dans ces pathologies car ils augmentent la survenue de maladies infectieuses. Il existe clairement un besoin thérapeutique pour soigner les colites inflammatoires. Pour réaliser ce projet, un travail important est réalisé au préalable in vitro sur des cellules humaines, ceci dans le but de sélectionner les meilleures molécules à progresser. Cependant, étant donnée la complexité des mécanismes impliqués dans les pathologies inflammatoires du colon, il est difficile de prédire le potentiel thérapeutique d’une molécule uniquement sur la base de résultats in vitro. Il est donc nécessaire d’utiliser un modèle animal qui reproduit les différents aspects de ces maladies, afin de pouvoir évaluer in vivo les meilleurs composés identifiés.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de tester de nouvelles molécules candidates pour une utilisation en préventif ou en curatif sur plusieurs maladies inflammatoires digestives : maladie de Crohn, rectocolite hémorragique, colite ulcéreuse... A terme, cela permettra l’introduction en clinique de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces maladies pour laquelle les options sont pour le moment limitées et imparfaites.

Procédures

Une colite pourra être induite par l’administration de Dextran sulfate sodium dans l’eau de boisson des animaux pendant 7 jours, combiné ou non à des anticorps (2 injections/sem, 5min par injection). Ces études dureront au maximum 4 semaines. Il est aussi possible d’administrer le DSS dans l’eau de boisson 3x5 j, avec 5 j sans DSS entre les cycles. Ces études dureront au maximum 8 semaines. Le Trinitrobenzenesulfonic acid pourra aussi être administré 1-2xpar voie intra-rectale (anesthésie générale, 1h), après 12-16h à jeun. Ces études dureront 2 semaines au maximum. L’oxazolone pourra être administrée 1x par voie sous cutanée ou topique, puis par voie intrarectale 1x. Des bactéries Citrobacter Rodentium (administration durant 5min) pourront être administrées. Ces études dureront au maximum 3 semaines. Chez des souris immuno-déficientes, le modèle aigu de colite (8 jours) est induit par administration d’un anticorps (injection unique, 5 minutes). En utilisant les mêmes souris immuno-déficientes, un modèle chronique de colite est inductible par injection de cellules immunitaires humaines ou murines (5min). Les études dureront au maximum 16 semaines. Des modèles de souris développant spontanément une colite peuvent aussi être utilisés. Ces études dureront au maximum 22 semaines. Les animaux seront pesés 2x/sem avant induction, puis une fois par jour à partir de l’induction ou de l’apparition des signes cliniques dans les modèles spontanés (5 minutes). Des composés chimiques ou biologiques seront administrés aux animaux par voie: intranasale et intratrachéale ou intrarectale (animal vigile, 5min, ou anesthésie, 1h), intramusculaire et intradermique (anesthésie, avec analgésie, 1h), orale sur animaux vigiles (1 minute), sous cutanée et intrapéritonéale (anesthésié, 1 heure, ou vigile, 1 minute), ou par minipompe osmotique posée lors d’une chirurgie sous anesthésie générale avec analgésie au préalable (anesthésié 1 heure). Des prélèvements de sang ou d’urine ou de fécès pourront être réalisés (3 minutes sur animal vigile, 1 heure si anesthésie). Des biopsies de peau pourront éventuellement être réalisées, sous anesthésie générale avec analgésie (1h30). Des endoscopies digestives pourront être réalisées, avec 12h à jeun, sous anesthésie générale (1h max). Les animaux pourront être mis à jeun avant et pendant l’administration puis la digestion de Dextran Isothiocyanate de fluorescéine (FITC) afin de mesurer la perméabilité digestive (à jeun total 12h).

Impact sur les animaux

Dans ces modèles de maladies inflammatoires digestives, de la diarrhée, potentiellement hémorragique, est attendue. Des pertes de poids marquées sont attendues. Les animaux pourront recevoir des traitements par toutes voies et avec toutes les fréquences d’administrations possibles, dans le respect des recommandations vétérinaires. Des prélèvements de sang pourront être effectués dans le respect des recommandations de voies et de volume. Pour induire la colite, les animaux pourront recevoir du TNBS ou de l’oxazolone par voie intrarectale, une à deux fois, après mise à jeun 12 à 16H. Des endoscopies pourraient être réalisées, sous anesthésie générale, avec mise à jeun de 12h. Dans le cas où du Dextran FITC serait administré, les animaux seront mis à jeun 12h maximum.

Devenir

Après les deux procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération de la peau et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’efficacité des composés testés sur les maladies d’intérêt.

Remplacement

Toutes les molécules chimiques ou biologiques qui seront évaluées dans ce projet auront été si possible au préalable sélectionnées dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Elles auront aussi si possible été sélectionnées in vivo chez le rongeur sur leurs propriétés pharmacocinétiques (vérification de la compatibilité avec une efficacité dans la maladie visée). L’ensemble de ces données est souvent insuffisant pour prédire l’efficacité in vivo des molécules, car recréer in vitro une pathologie complexe est difficile, notamment lorsque différents types cellules et/ou tissus sont impliqués. L’efficacité réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur en choisissant le modèle animal se rapprochant le plus de la pathologie telle que décrite chez l’homme.

Réduction

Le nombre minimum suffisant permettant d’observer des différences significatives sur les paramètres d’intérêt est systématiquement utilisé. En pratique, ces nombres ont été déterminés sur la base de la littérature sur le sujet et d’expériences préalables dans nos laboratoires. Dans tous ces modèles sauf l’oxazolone, il a été démontré que 8 à 11 animaux sont nécessaires en fonction des paramètres d’intérêt, afin d’observer des différences sur ces paramètres, sauf dans les modèles spontanés sur souris transgéniques dans lesquels 10 à 12 animaux seront nécessaires. Pour l’oxazolone, il faudra entre 10 et 20 animaux par groupe selon les paramètres à mesurer post mortem. Le nombre élevé d’animaux prévu est lié au nombre d’études élevé prévu pour tester un grand nombre de composés et de schémas d’administration et au nombre d’animaux par étude. Dans la mesure du possible, le maximum d’analyses compatibles sera effectué sur les mêmes tissus afin d’éviter de multiplier les animaux nécessaires. Afin d’éviter de multiplier les groupes contrôles, dans la mesure du possible si plusieurs composés doivent être testés ils le seront au cours de la même étude.

Raffinement

La diarrhée et le sang dans les selles seront suivis quotidiennement à partir de l’induction. Dans les modèles spontanés, ils seront suivis deux fois par semaine jusqu’à apparition des signes cliniques puis une fois par jour. Le poids des animaux sera suivi deux fois par semaine jusqu’à l’induction puis une fois par jour. Dans les modèles spontanés, le poids sera suivi deux fois par semaine avant apparition de signes cliniques / pertes de poids puis une fois par jour dès l’induction. Les actes douloureux seront réalisés avec analgésie. Les actes moins stressants (autres administrations et prélèvements) seront réalisés sous anesthésie sauf si la contention génère moins de stress ou si l’anesthésie n’est pas possible (administration orale). Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité des modèles et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Un système d’alerte est mis en place pour statuer sur la mise à mort de l’animal. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans les procédures. Des points limites supplémentaires seront ajoutés en cas de détection d’effets non prévus de l’induction des maladies et/ou en cas de mise en place de méthodes plus raffinées d’évaluation de la souffrance des animaux.

Choix des espèces

-L’administration du DSS ou du TNBS peut être réalisée sur des souris ou des rats, et est très bien documentée dans la littérature. -Pour créer un modèle de colite d’origine auto-immune, il faut utiliser des souris immuno-déficientes qui ne possèdent pas de lymphocytes T et B matures. -Les études de toxicité pour toute nouvelle molécule chimique ou biologique devant être réalisées à minima sur une espèce rongeur (rat ou souris), la connaissance de la dose active dans un modèle rongeur est une donnée critique qui permet de calculer la fenêtre thérapeutique entre la dose active sur la pathologie et la dose toxique dans la même espèce. Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum), étant donné que les modèles d’inflammation digestive d’intérêt sont bien décrits dans la littérature sur des animaux sevrés de plus de 6 semaines.

Six ou sept enregistrements électromyographiques de vingt minutes chacun, sur animal maintenu en contention et sans analgésie : 554 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. La moelle épinière de chaque souriceau est sectionnée complètement dans les premiers jours de vie pour provoquer une spasticité, puis chacun reçoit des injections dans les pattes arrière et dans le péritoine, également sans analgésie, le porteur indiquant que les animaux lésés ne ressentent plus la douleur dans leur arrière-train. 533 d'entre elles sont tuées pour prélever leurs tissus nerveux. La souche a été retenue parce que ses femelles ont un bon instinct maternel et prennent soin des nouveau-nés blessés, parce que les portées comptent douze à quatorze petits, et parce que les souriceaux, plus gros à la naissance, survivent mieux à la section de la moelle.

Objectifs

L'objectif principal de cette étude est de trouver un traitement efficace pour réduire la spasticité. La spasticité est un trouble moteur qui survient tardivement après une lésion de la moelle épinière. Elle se manifeste par une forte résistance musculaire à l’étirement, en raison d'une hyperexcitabilité du réseau de neurones qui connecte le muscle. Elle s’accompagne souvent de spasmes (mouvements involontaires) et d’une hypersensibilité à des stimuli sensoriels normalement bénins. Ce que l'on constate au niveau cellulaire, c'est une excitabilité anormalement élevée des neurones moteurs (MNs). Toutefois, les mécanismes moléculaires et cellulaires responsables de cela ne sont pas élucidés. Des travaux récents ont montré l'implication d'une famille de protéines présente à la surface des MNs, dans ce phénomène. Leur présence est fortement diminuée après la lésion de la moelle épinière, conduisant à une plus grande excitabilité du neurone et contribuant à l'apparition de la spasticité. En tentant de générer de nouvelles protéines à la surface du neurone grâce à l'outil génétique et en faisant une étude approfondie des mécanismes mis en jeu d'un point de vue fonctionnel et structurel, ce projet a pour but de diminuer la spasticité du réseau neuronal contrôlant la locomotion. Il sera mené sur 2 sites différents, (établissements 1 et 2) qui sont à proximité l'un de l'autre.

Bénéfices attendus

La complémentarité des procédures employées dans ce projet offrira une meilleure compréhension des mécanismes responsables du déséquilibre entre excitation/inhibition au sein du réseau moteur sous-lésionnel. En ciblant spécifiquement ces protéines par l'outil génétique sur le modèle murin, ces études approfondies fourniront des données solides pouvant être transposées à la recherche clinique. En effet, ce travail proposera des outils thérapeutiques innovants pour répondre précisément aux besoins des patients souffrant de spasticité, car à l'heure actuelle le choix médicamenteux est très restreint avec beaucoup d'effets secondaires indésirables, et avec une efficacité éphémère. Ce projet pourra bénéficier à l'ensemble de la communauté biomédicale travaillant sur la spasticité.

Procédures

Une lésion de la moelle épinière sera réalisée dans l'établissement 1 sous anesthésie générale sur l'ensemble des animaux de ce projet (durée intervention 5-8min), suivie d'une seule injection d'un composé potentiellement thérapeutique dans la patte postérieure gauche et droite de chaque animal (durée de l'intervention 5min). Une fois lésés les animaux ne ressentent plus la douleur dans leur arrière train donc toute injection dans la cavité du péritoine (durée intervention 1min) se fera sans analgésie préalable. Chez les jeunes souris, cette injection sera faite soit une fois par jour sur une période de 7 jours, à partir du sixième jour après la naissance, soit 2 jours consécutifs au début des première, deuxième et troisième semaines après la naissance. Chaque injection précède un enregistrement électromyographique (EMG) des muscles de la patte postérieure avec l'animal en contention sans analgésie préalable (car l'animal ne ressent plus rien en dessous de la lésion) d'une durée de 20 min maximum et une vidéo de 5 min de l'animal pour observer son comportement. Au total, il y aura 6 ou 7 EMG par animal et autant de vidéos. Ces expérimentations sont effectuées dans l'établissement 2 tant qu'une installation pérenne n'est pas disponible dans l'établissement 1.

Impact sur les animaux

Afin d'induire une hyperexcitabilité de la moelle épinière et des symptômes de spasticité, nous procédons à une lésion complète de la moelle épinière chez les souris nouveau-née. Suite à cette intervention les symptômes de la spasticité se manifestent quelques jours seulement après la lésion chez les jeunes souris. Une conséquence de la chirurgie peut être l’émergence de la douleur. Suite à l’intervention, une perte de poids (10%) peut être observée. Les manipulations des animaux pour les enregistrements electromyographiques et vidéos peuvent également engendrer du stress.

Devenir

Les animaux à la fin de chaque procédure seront euthanasiés. Chez la grande majorité des animaux (533 souris), le tissu sera prélevé pour une étude approfondie de l'activité et la fonctionnalité des cellules nerveuses mais aussi pour les protéines présentes à leur surface.

Remplacement

Notre projet vise à comprendre et à lutter contre la pathologie du système moteur suite à une lésion de la moelle épinière. Les données préliminaires de ce projet ont été obtenues à partir de lignées cellulaires et de modélisation, ce qui nous a permis de réduire le nombre d'animaux sollicités. Néanmoins, l'expérimentation sur l'animal lésé demeure essentielle, en effet, le modèle de spasticité chez la souris possède les principales caractéristiques de la spasticité chez l'homme. Comme la compréhension de ces mécanismes ne peut être obtenue par une exploration fonctionnelle directe chez l'humain, le modèle murin, reste pour le moment, indispensable. Nous supposons ainsi que l'identification d'un acteur principal dans cette pathologie chez la souris, aurait un potentiel thérapeutique significatif pour l'homme.

Réduction

Ce projet nécessitera un total de 554 animaux lésés. Il s'agit d'une continuation directe des recherches précédemment menées par notre équipe. Cela nous a permis de réduire le nombre d'animaux utilisés. Afin de minimiser davantage ce nombre, les médicaments testés seront administrés en série aux mêmes groupes expérimentaux lors des différentes procédures. Chez la grande majorité des animaux, les tissus seront prélevés à la fin des procédures pour être utilisés, ce qui permettra de limiter encore le nombre d'animaux. Le nombre de rongeurs par groupe expérimental sera limité à son strict minimum, en tenant compte des contraintes de chaque technique, et les analyses statistiques seront adaptées. L'expérimentateur ne sera pas informé du groupe expérimental afin d'éviter tout biais possible.

Raffinement

Les animaux anesthésiés, reçoivent une injection d'analgésique. Une fois opérées, les souris sont maintenues en fratrie et ramenées à la mère. Pour minimiser les épisodes de cannibalisme de la mère envers les nouveau-nés blessés, nous évaluons soigneusement le comportement de la mère en choisissant des femelles plus calmes et sans comportements anxieux. De plus, nous utilisons des friandises autorisées comme récompense pour la mère la semaine précédant la mise bas et la première semaine après la naissance. Nous prenons un soin particulier à enrichir leur cage (rondin de bois,matériel de nidification, tunnel...).Que ce soit pour la chirurgie ou les tests comportementaux, les animaux resteront en contact avec de la litière provenant de leur cage d'origine pour qu'ils soient en présence d'odeurs familières. Tout au long de l’étude, la douleur et/ou la détresse de l’animal seront évaluées 2 à 3 fois par semaine par l’expérimentateur et les zootechniciens, en observant leur état général et leur comportement. Du gel nourrissant sera proposé aux animaux âgés de plus de 15 jours à chaque sortie de leur zone d'hébergement pour les séries d'expérimentation. le transport des animaux entre les deux sites d'expérimentation se fait en moins de 10 minutes grâce à une cage de transport confinée à l'abri de la lumière et des odeurs extérieures. et contenant la litère de la cage d'origine. De plus pour minimiser le stress des animaux au cours du transport, des friandises leurs seront données.

Choix des espèces

Le modèle de souris est utilisé dans notre étude car c'est un modèle de spasticité reconnu. Nous supposons que l'identification des mécanismes moléculaires engendrant cette pathologie pourrait avoir un potentiel thérapeutique significatif pour d'autres mammifères, y compris l'homme. La compréhension de ces mécanismes ne peut être obtenue par une exploration fonctionnelle directe chez l'humain, ainsi une grande partie de cette recherche a déjà été menée sur des lignées cellulaires et par modélisation. Néanmoins, l'expérimentation sur l'animal lésé demeure essentielle. Le modèle de spaticité chez la souris juvénile est choisi en première intention car l'apparition de la spasticité est rapide (5 à 6 jours). Ce modèle est également compatible avec les investigations fonctionnelle qui font appel à la technique d'électrophysiologie, ce qui n'est pas le cas du modèle de spasticité adulte. Enfin la gestion des animaux opérés est plus simple car c'est essentiellement la mère qui s'en charge. Juste une surveillance accrue des animaux pour déceler une souffrance, ou un comportement anormal relative à la chirurgie est faite par l'expérimentateur et le zootechnicien. Nous avons choisi cette lignée de souris pour les raisons suivantes : (1) les mères de cette souche ont un bon instinct maternel et prennent généralement bien soin des nouveau-nés, y compris ceux qui sont blessés ; (2) les portées sont plus nombreuses que chez les autres souches de souris, avec une moyenne de 12-14 nouveau-nés par portée ; (3) les nouveau-nés sont plus gros à la naissance (poids moyen = 1,6 - 1,8 g), ce qui augmente le taux de survie après une lésion de la moelle épinière. Une partie des animaux sera utilisée à un stade développemental précoce correspondant à la première, deuxième et troisième semaine postnatale.