Procédures sévères

Le pédicule d'un rein ou des deux clampé pour couper le flux sanguin, l'uretère gauche ligaturé, ou du cisplatine injecté dans le péritoine : 750 souris et 750 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, 1 000 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 500 un niveau sévère. Les chirurgies durent jusqu'à deux heures sous anesthésie générale, et souris et rats reçoivent ensuite les composés à tester par voie intranasale, intratrachéale, intramusculaire, intradermique, orale, sous-cutanée ou intrapéritonéale. Le porteur ne décrit qu'une douleur "modérée durant 3 jours environ" après les chirurgies, alors qu'un tiers d'entre eux relève d'un niveau de souffrance sévère. L'effectif de dix rongeurs par groupe peut être porté à vingt si les analyses réclament un volume de prélèvement plus important, le nombre d'individus utilisés suivant ainsi les besoins de la bioanalyse.

Objectifs

L’objectif est de tester l’efficacité thérapeutique de composés chimiques ou biologiques dans des modèles de lésions rénales résultant en des états inflammatoires aigus et chroniques du rein : lésions dues à une ischémie/reperfusion rénale ou à une obstruction urétérale unilatérale causant de la fibrose. En général, la lésion rénale initiale est associée à une insuffisance rénale aiguë (déclin rapide et potentiellement réversible de la fonction rénale), tandis que la fibrose tend à se produire dans le cadre de la maladie rénale chronique. La maladie rénale chronique peut par ailleurs résulter d’une non résolution d’insuffisance aiguë. Chez l’homme, plusieurs agressions initiales peuvent déclencher des lésions rénales. L’objectif de ce projet est de modéliser chez le rongeur deux d’entre elles : l’ischémie-reperfusion (arrêt temporaire du flux sanguin dans un rein ou les deux), et l’obstruction des voies urinaires (uretère). Ces modèles nous permettront de tester des candidats médicaments visant à traiter des patients présentant des lésions rénales. Les lésions d'ischémie reperfusion (IR) rénales sont une cause fréquente d'insuffisance rénale aiguë chez les patients. Aucun traitement spécifique n'est actuellement disponible. Parmi les modèles in vivo existants, le modèle de clampage du pédicule rénal (contenant les vaisseaux sanguins rénaux) chez la souris est couramment décrit dans la littérature et utilisé en raison de l’existence de nombreuses souches de souris transgéniques. Ce clampage temporaire génère une ischémie rénale. Selon l’objectif à atteindre, le clampage peut être réalisé sur un rein (pour mimer une ischémie-reperfusion au cours de la transplantation de l’organe) ou sur les deux reins à la fois (pour mimer une ischémie-reperfusion secondaire à une forte hypotension). Aucun traitement n’existe à ce jour pour la fibrose rénale chez l’homme. Le modèle d'obstruction urétérale unilatérale (UUO) sera utilisé pour modéliser des affections rénales aboutissant à un fibrose rénale. Ce modèle d’obstruction urétérale se caractérise par une dilatation tubulaire, une expansion interstitielle, une perte de masse tubulaire proximale, une hypertrophie, une hydronéphrose, une infiltration de leucocytes, la mort des cellules épithéliales tubulaires et la présence de fibroblastes, qui conduisent tous à une fibrose tubulo-interstitielle progressive.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de tester de nouvelles molécules candidates pour une utilisation mode préventif ou thérapeutique sur les lésions rénales. A terme, cela permettra l’introduction en clinique de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces lésions rénales pour laquelle les options sont pour le moment limitées.

Procédures

Les lésions rénales seront induites sur des animaux sevrés de plus de 6 semaines soit ischémie reperfusion unilatérale ou bilatérale rénale ou par ligature de l’uretère gauche soit par administration de cisplatine (intrapritonéale). Les trois procédures chirurgicales auront lieu sous anesthésie générale qui durera au maximum deux heures. Le cisplatine sera administré sur animal vigile (5 min maximum) ou anesthésié (30 minutes maximum). Afin d’évaluer l’efficacité de potentiels traitements sur les lésions rénales, des composés chimiques ou biologiques pourront être administrés aux animaux par toutes les voies possibles : intranasale et intratrachéale, sous anesthésie générale d’au maximum une heure; intramusculaire et intradermique sous anesthésie générale d’environ une heure avec analgésie ou en moins de 5 min sur animal vigile; orale sur animaux vigiles (acte bref d’une minute environ); sous cutanée et intrapéritonéale sur animal anesthésié ou vigile (acte bref d’une minute sur animal vigile, anesthésie d’au maximum une heure sinon). Les volumes administrés et fréquences d’administration respecteront les recommandations. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés. Les prélèvements de sang sur animal vigile prendront environ deux minutes. En fin de projet, les animaux seront euthanasiés pour récupération des tissus, organes, et du sang. Les études dureront au maximum 2 mois pour les modèles chirurgicaux et au maximum une semaine pour le cisplatine

Impact sur les animaux

La constitution de groupes lors de la randomisation impliquera un remaniement des groupes sociaux qui pourra générer un stress léger durant moins de 3 jours. Les chirurgies pourront générer une douleur modérée durant 3 jours environ compte tenu de l’analgésie prévue. Dans le cas d’administrations par injections ou dans le cas de prélèvements sanguins, ceux-ci génèreront une douleur limitée à celle d’une piqûre d’aiguille.

Devenir

Après les trois procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’efficacité des composés testés sur les maladies d’intérêt.

Remplacement

L'étude des mécanismes impliqués ne peut être remplacée par des modèles cellulaires en raison des très nombreux types cellulaires composant le rein et de la complexité des voies de signalisation cellulaire modifiées par l'ischémie reperfusion rénale ou l’obstruction des voies urinaires, à l’origine de fibrose. Ainsi, ce projet ne peut être évalué que dans un modèle in vivo chez l’animal tant pour la compréhension précise de ces phénomènes que pour la mise en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est réduit au minimum nécessaire pour permettre une analyse statistique fiable des résultats. Dans le cas où des composés auraient besoin d’être testés dans les trois modèles au même moment, les animaux sham seront mis en commun pour ne pas être dédoublés. Sur la base de la littérature, le nombre minimum permettant d’obtenir une puissance statistique suffisante pour conclure est de 10 animaux par groupe. Cependant, les premières études visant à établir les modèles permettront de modifier au besoin ce nombre, s’il est insuffisant, ou au contraire s’il peut être réduit. Dans le cas où la bioanalyse suite aux prélèvements nécessiterait un volume trop important de fluides, le nombre d’animaux devra être augmenté, jusqu’à au maximum 20 animaux par groupe. Dans le cas de prélèvements terminaux à différents points de temps (collecte d’organes/tissus), un groupe d’animaux devra être inclus pour chaque point de temps. Le nombre d’animaux nécessaire a été validé par une analyse statistique.

Raffinement

Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale et analgésique avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermostatée. Une surveillance quotidienne stricte, avec évaluation du réveil et de l’état de santé post-opératoire, permet de détecter rapidement toute complication éventuelle et d’adapter immédiatement la prise en charge, en respect des points limites préétablis, en particulier par un traitement analgésique adapté. Les animaux recevront une analgésie préalable à la chirurgie (buprénorphine au moins 30 minutes avant la chirurgie) et un anesthésique local sera utilisé (SC autour du site d’ouverture chirurgicale au moins 5 minutes avant, et sur le feuillet musculaire avant fermeture de la peau). En cours d’étude, les animaux seront pesés 2 fois par semaine jusqu’à la chirurgie puis tous les jours à partir de la chirurgie. La déshydratation sera évaluée quotidiennement à partir de la chirurgie et les animaux déshydratés seront réhydratés par voie sous cutanée. A partir de la chirurgie, de la nourriture gélifiée sera placée en fond de cage, pendant une semaine Les points limites concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans la procédure. Si la litière venait à se souiller plus rapidement que ce qui est constaté habituellement, la fréquence de change des cages sera augmentée.

Choix des espèces

Ces modèles sont décrits dans la littérature chez le rat et la souris. Les mâles seront privilégiés car leur utilisation est bien décrite dans la littérature. La souris sera privilégiée lorsque l’utilisation de souches génétiquement modifiées est nécessaire. Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum), tel que référencé dans la littérature.

Des cellules tumorales humaines sont injectées dans la veine ou dans le péritoine de souris immunodéficientes, qui développent des tumeurs du péritoine, du foie, des ovaires ou des poumons, avec ascite, difficultés respiratoires, prostration et apathie. 7 186 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 190 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 6 996 un niveau modéré. Chacune passe deux séances d'imagerie par semaine pendant huit à douze semaines, sous anesthésie à chaque fois. Le porteur écrit que le raffinement de ces modèles "ne fait pas appel à des antalgiques mais à un suivi rapproché", en s'appuyant sur les recommandations européennes en cancérologie expérimentale, et fait reposer la limitation de la souffrance sur des points d'arrêt anticipés grâce au niveau de bioluminescence.

Objectifs

Au cours de la dernière décennie, les immunothérapies ont révolutionné la façon dont nous traitons le cancer. En particulier, l’immunothérapie cellulaire permet d’éliminer les cellules cancéreuses, entraînant des rémissions durables dans certains cancers du sang et de ses précurseurs. Cette technologie repose sur l’utilisation de cellules immunitaires (lymphocyte) faisant suite à une modification génétique lui permettant de reconnaitre spécifiquement des marqueurs présents à la surface des cellules cancéreuses. Ces cellules (CAR-T) sont modifiées en laboratoire et réinjectées ensuite aux patients pour cibler et détruire la tumeur. Les avantages des cellules CAR T sont nombreux, notamment la possibilité d'un traitement plus court, d'une durabilité prolongée et d'une réduction des effets secondaires. Cependant, les avantages cliniques sont encore limités pour les tumeurs solides et même dans le domaine des cancers du sang, les patients qui répondent aux thérapies par des cellules CAR T restent exposés au risque de rechute en raison de plusieurs facteurs, notamment l'absence de réponse durable après le transfert chez le patient. Au laboratoire, on a récemment démontré que le ciblage de notre gène d’intérêt renforce la protection à long terme induite par les cellules CAR T contre les rechutes tumorales. Malheureusement, le manque de durabilité n'est pas la seule limitation des thérapies cellulaires. En effet, un autre facteur qui compromet l’utilisation des cellules CAR T pour le traitement de certains cancers est la difficulté à trouver des marqueurs spécifiques (ou associés) aux tumeurs. La plupart des marqueurs tumoraux identifiés sont des protéines mutées ou surexprimées, mais ces antigènes sont parfois aussi exprimés par des cellules saines. En plus, plusieurs cancers n’expriment pas ces antigènes. Dans ce contexte, nous avons récemment découvert des nouveaux antigènes (appelés par la suite néo-antigènes) spécifiques de tumeurs, ce qui élargit la gamme des cancers pouvant être traités par la thérapie cellulaire. L’objectif général de ce projet est d’utiliser nos cellules CAR T plus durables dans plusieurs modèles de cancers d’origine très diverse et exprimant des néo-antigènes, en plus des antigènes spécifiques connus.

Bénéfices attendus

L'immunothérapie cellulaire représente une avancée importante dans le domaine de l'oncologie et de la médecine personnalisée. Toutefois, cette thérapie pose des problèmes tels que les rechutes ainsi qu’une activité limitée sur les tumeurs solides. Ce projet a pour but de surmonter ces deux obstacles à travers : I. L'optimisation du processus de fabrication des cellules CAR T par des approches d'ingénierie en laboratoire, en particulier en produisant des cellules CAR T déficientes pour notre gène d’intérêt. Ceci devrait renforcer leur persistance in vivo et donc la capacité à éliminer les tumeurs de façon maintenue dans le temps. II. L’identification d’antigènes spécifiques aux tumeurs qui garantissent une élimination sûre et efficace des cellules cancéreuses par les cellules CAR T, avec un risque réduit de cibler des tissus sains. À long terme, notre projet a le potentiel clinique d’augmenter l'efficacité des cellules CAR T actuellement disponibles, en plus d'élargir les types de cancers qui pourront être traités. Cela augmenterait considérablement le nombre de patients pouvant bénéficier de cette technologie révolutionnaire.

Procédures

Dans une première procédure des celulles tumorales seront injectées aux animaux vigiles (une seule injection de cellules tumorales au cours de l’expérience – durée du geste inférieure à 20 sec). Puis 3-4 jours après l’injection des cellules, les souris seront imagées. Pour l’imagerie, les souris vigiles recevront une injection (durée du geste inférieure à 10 sec), 12 à 15 minutes plus tard, les souris seront anesthésiées pour être imagées (durée de l’anesthésie : 15 min). Deux séances d’imagerie seront effectuées par semaine pendant 8-12 semaines. Dans une seconde procédure, des cellules tumorales seront injectées aux animaux vigiles (une injection de cellules tumorales au cours de l’expérience – durée du geste inférieure à 20 sec). Les souris seront ensuite traitées par une seule injection unique (durée du geste inférieure à 20 sec). Puis, 3-4 jours après l’injection du traitement, les souris seront imagées. Pour l’imagerie, les souris vigiles recevront une injection (durée du geste inférieure à 10 sec), 12 à 15 minutes plus tard, les souris seront anesthésiées pour être imagées (durée de l’anesthésie : 15 min). Une à deux séances d’imagerie seront effectuées par semaine.

Impact sur les animaux

Les animaux greffés avec des cellules tumorales développeront potentiellement des tumeurs au niveau du péritoine, du foie, des ovaires ou des poumons Les effets indésirables subies par les animaux seront les suivantes : prise ou perte de poids excessive par rapport au poids de départ, difficultés respiratoires, ascite, troubles du comportement (difficulté́ de locomotion, absence de toilettage, prostration, apathie). Les nuisances attendues lors de l’administration des produits non irritants et non toxiques seront celles liées à l’injection elle-même (gêne de courte durée)

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem

Remplacement

Jusqu'à présent, aucun modèle n'a été décrit pouvant remplacer les fonctions complexes d'un système vivant, respirant, multi-organe avec des structures pulmonaires et circulatoires comme celles de l'homme. L'efficacité des cellules CAR T sera préalablement évaluée dans des modèles in vitro (2D et 3D) en utilisant les mêmes lignées cellulaires tumorales qu’on utilisera pour l’établissement des modèles in vivo. Néanmoins, bien qu'il existe des modèles de tumeurs in vitro, aucun ne permet de reproduire la physiopathologie du cancer aussi bien que les modèles murins. Les cultures cellulaires en 2D ou 3D ne permettent pas de modéliser toutes les interactions physiques et mécaniques entre la cellule tumorale et son environnement. De plus, la thérapie cellulaire est administrée par voie intraveineuse et, malheureusement, la complexité de la vascularisation est aujourd'hui impossible à reproduire, même avec des modèles complexes tels que les organoïdes tumoraux générés par la culture tridimensionnelle de cellules tumorales issues de biopsies de patients. Pour qu'une cellule CAR-T atteigne la tumeur, elle doit passer d’abord par le sang, franchir la barrière imposée par l'endothélium vasculaire par diapédèse, pénétrer le stroma (tissu non-tumoral présent dans tous les types de cancers invasifs) pour enfin exercer son activité antitumorale. Avant d'envisager de passer à l'homme, le recours à la souris reste donc inévitable.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés dans ce projet, l'efficacité des cellules CAR T sera préalablement évaluée dans des modèles in vitro (2D et 3D) en utilisant les mêmes lignées cellulaires tumorales qu’on utilisera pour l’établissement des modèles in vivo. Nous avons également décidé d'utiliser des modèles de tumeurs par injection intraveineuse et intrapéritonéale. Ces modèles nous permettent (i) de mimer différents processus physiopathologiques du cancer. (ii) d'induire des tumeurs de manière très homogène. Pour chaque lignée cellulaire utilisée dans ce projet, l'homogénéité de leur croissance chez les souris NSG sera vérifiée par imagerie de bioluminescence longitudinale. Leur localisation et leur cinétique de croissance seront vérifiées deux fois par semaine. Les lignées tumorales qui mettent longtemps à établir des foyers métastatiques (plus de 21 jours) ou qui présentent une cinétique de croissance ou une localisation hétérogène ne seront pas utilisés dans la suite du projet. Le nombre de souris porteuses de tumeurs et traitées par des cellules CAR-T sera de 8 par condition, afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante. Ce nombre d’animaux tient compte de la nécessité d'utiliser le moins de souris possible et de pouvoir effectuer des statistiques fiables pour valider les effets biologiques observés.

Raffinement

Afin d’éviter le recours à la chirurgie (et les nuisances associées : douleurs, risques d’infection) pour l’implantation des tumeurs, l'utilisation de modèles de tumeurs solides induites par dissémination métastatique a été privilégiée dans ce projet (injection intraveineuse et intrapéritonéale de la cellule tumorale). En effet, ce type de modèle nous permet de limiter les infections associées à la chirurgie, tout en permettant de mimer des processus physiopathologiques du cancer. Ceci est particulièrement important, puisqu’afin d'éviter le rejet de cellules d'origine humaine, l'ensemble du projet nécessitera l'utilisation de souris immunodéficientes qui présentent un risque d’infection très élevé. Une injection intraveineuse ou intrapéritonéale permettra aux cellules tumorales de se loger dans différents organes. Pour évaluer le lieu exact où les cellules tumorales se développent, nous utiliserons l'imagerie par bioluminescence. Cette technique, réalisée sous anesthésie, extrêmement sensible (seules quelques dizaines de cellules tumorales peuvent être détectées) nous permettra de savoir très précisément et très précocement où les tumeurs vont former des foyers métastatiques. Cette technologie, non invasive, permet donc de suivre un même animal au cours du temps. Des corrélations entre l’état de la souris et le niveau de bioluminescence qui seront établies dans une étude pilote vont nous permettre d’anticiper dans les expériences d’efficacité l’atteinte des points limites ce qui évitera la souffrance de l’animal. En effet, conformément aux guides de la Commission Européenne et aux recommandations internationales en cancérologie expérimentale, le raffinement de ces modèles ne fait pas appel à des antalgiques mais à un suivi rapproché pour déterminer des points d’arrêt les plus précoces possibles. Un contrôle fréquent du site de croissance de la tumeur, ainsi que la mise en place d’une grille de score adaptée prenant en compte l'ensemble des symptômes associés à la douleur chez la souris nous permettront de limiter au maximum la souffrance. En cas d’atteinte d’un point-limite, l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en recherche en immunologie anti-cancéreuse, car la connaissance complète du génome murin permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés, dont les souris génétiquement modifiées pour des protéines spécifiques d’intérêt ainsi qu’un grand nombre de modèles de tumeurs transplantées En particulier pour notre projet, la disponibilité de souches murines parfaitement définies et hautement immunodéficientes sera clé. En effet, ces souches favorisent le développement de cellules tumorales humaines, ainsi que le traitement ultérieur par de la thérapie cellulaire, également d'origine humaine. Autrement, le système immunitaire de la souris rejetterait facilement les cellules humaines greffées. Les souris seront utilisées à l'âge adulte afin qu’elles aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés par des modifications dues à un âge trop avancé des animaux. De plus, cet âge est adapté pour générer des modèles de tumeurs par la greffe de lignées de cellules tumorales.

Greffées de cellules tumorales sous la peau du flanc, dans le ventre ou dans une veine, des souris peuvent développer des tumeurs qui s'ulcèrent ou se nécrosent, des métastases pulmonaires qui gênent leur respiration ou des nodules qui remplissent leur abdomen de liquide. 5 408 souris, immunocompétentes ou immunodéficientes, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, pour tester environ neuf virus anticancéreux par an, seuls ou associés à d'autres traitements. Elles reçoivent jusqu'à trois injections de virus, un traitement antitumoral jusqu'à cinq fois par semaine pendant trois semaines et des prises de sang jusqu'à 120 jours après le virus, gestes dont le porteur écrit que chacun "ne dure que quelques secondes". Les souris greffées en surnombre, pour compenser les greffes qui ne prennent pas, peuvent être réutilisées pour former des techniciens, jusqu'à 200 en cinq ans, ou sinon tuées, et toutes celles qui reçoivent les virus sont tuées au point limite ou à la fin de l'étude.

Objectifs

Le but du projet est d’évaluer sur différents modèles de xénogreffes et de greffes syngéniques chez la souris l’activité antitumorale de nos virus candidats-médicaments seuls ou en combinaison avec des therapies antitumorales. Nos virus oncolytiques sont produits en supprimant plusieurs gènes viraux afin de diminuer la réplication du virus dans les tissus sains, tout en gardant la capacité de réplication dans les tumeurs et ainsi de limiter sa toxicité. Avant d’être testés en modèles murins, les virus candidats ont été évalués sur des modèles alternatifs, notamment par culture cellulaire sur de nombreuses cellules tumorales établies et caractérisées, ainsi que dans des cellules primaires (non tumorales). Ne seront évalués chez l’animal que les virus ayant une activité antitumorale et ne présentant pas de cytotoxicité sur les modèles alternatifs. Concernant les combinaisons avec les thérapies antitumorales, ne seront évaluées chez l’animal, que les combinaisons efficaces. En conclusion, nous testerons chez l’animal uniquement les virus candidats-médicament et les combinaisons préalablement sélectionnée avec un rapport bénéfice/risque significatif.

Bénéfices attendus

Les progrès scientifiques de ces dernières années sur la compréhension de la croissance tumorale ont permis d’ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques dans la lutte contre le cancer. La mise au point de ces nouveaux médicaments n’est possible qu’en passant par des modèles animaux adaptés. Les bénéfices portent sur la mise au point des traitements plus efficaces contre les cancers chez l’homme. Les virus oncolytiques du fait de leur réplication spécifique dans la tumeur induisent moins d’effets secondaires que les traitements standards (chimiothérapies, …) utilisés aujourd’hui. A court terme, ces bénéfices porteront sur l’amélioration de la prise en charge des patients atteints de cancer et à long terme sur l’allongement de la survie des patients.

Procédures

Dans ce projet, les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Implantation des cellules tumorales par injection sur animal vigile ou sous anesthésie légère puis 3 injections maximum (espacées de 30h minimum) de virus sur animal vigile puis administration d’une substance antitumorale sur animal vigile (maximum 5 fois par semaine pendant 3 semaines), un minimum de 3h est respecté entre chaque substance, - Imagerie sous une anesthésie légère, -Prélèvement de sang (espacés d'une semaine minimum et jusqu'à 120 jours après l'administration du virus). Chaque geste ne dure que quelques secondes, sauf l’anesthésie pour l’imagerie qui dure environ 15 minutes.

Impact sur les animaux

Malgré toute l’attention portée aux évaluations précédentes des études chez l’animal, nous ne pouvons pas exclure la survenue d’effets secondaires des médicaments. Ils peuvent se manifester sous la forme d’une perte de poids, des troubles gastro-intestinaux ou de troubles du comportement. Les injections répétées peuvent être une source de stress, de douleur pour l’animal et peuvent parfois engendrer une induration ou très rarement une ulcération au niveau des sites d’injection. Une ulcération ou nécrose des tumeurs sur le flanc peut être observée. Une gêne dans la mobilité de la souris peut également être observée en fonction de l’implantation sur le flanc. Le développement de métastases pulmonaires peut entrainer une difficulté respiratoire. La présence de nodules dans l’abdomen peut provoquer de l’ascite. Tous ces symptômes sont décrits dans une grille de score.

Devenir

Les animaux supplémentaires pourront être utilisés dans le cadre de la formation continue et/ou initiale de nos techniciens en s’appuyant sur un projet dédié et en accord avec le responsable de la SBEA (structure en charge du bien-être animal). Nous prévoyons la réutilisation de maximum 200 animaux sur 5 ans pour la formation. Dans le cas où aucune formation n’est nécessaire, ces animaux seront mis à mort. Toutes les souris inclues dans l’évaluation des virus seront mises à mort soit après atteinte d’un point limite, soit à la fin de l’étude pour le prélèvement de tissus. En raison des modèles et de l’utilisation de virus oncolytiques, ces animaux ne peuvent être réutilisés, replacés ou adoptés.

Remplacement

Avant d’être testés chez l’animal, les virus candidats et leur combinaison avec les thérapies antitumorales ont été évalués et sélectionnés pour leur rapport bénéfice/risque significatif dans les modèles alternatifs disponibles. Ces modèles étant incomplets, il reste indispensable de tester les candidats sélectionnés chez l’animal. L’étude de l’activité antitumorale d’un candidat médicament nécessite un modèle intégré faisant intervenir un ensemble complexe de phénomènes biologiques, impossible à modéliser, conduisant au développement de la tumeur, à la distribution, à la toxicité et à l’élimination des médicaments.

Réduction

La réalisation de ces procédures par un technicien rompu à ces manipulations, et la standardisation du protocole garantissent une bonne reproductibilité et permettent de réduire le nombre d’animaux. Le nombre d’animaux par groupe est choisi selon des contraintes statistiques. Du fait de la variabilité des prises de greffes tumorales, des animaux supplémentaires sont intégrés dans chaque expérience. Ces animaux ne recevront qu’une injection de cellules tumorales pour assurer l’obtention d’un nombre suffisant de souris présentant la croissance tumorale attendue dans le modèle sous-cutané, ou pour vérifier la bonne prise tumorale dans les modèles d’implantation en intra-péritonéale ou intra-veineux. Des tests statistiques seront utilisés sur les données obtenues (volumes tumoraux). Il est prévu l’utilisation de 5408 souris pour l’évaluation d’environ 9 virus candidats-médicaments par an et la combinaison avec 4 thérapies antitumorales.

Raffinement

Seuls les virus oncolytiques et leur combinaison avec les thérapies antitumorales présentant le meilleur rapport efficacité/non toxicité dans nos modèles alternatifs seront étudiés chez l’animal. De précédents dossiers déposés et apptouvés nous ont permis et nous permettent de tester la toxicité des nouvelles souches de virus. Seuls les virus ne risquant d'induire une souffrance chez l'animal seront testés dans ce projet. Durant l’étude in vivo, nous portons une attention particulière au bien-être de l’animal. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux afin de réduire le stress et un enrichissement du milieu est prévu (coton et tunnel de change) dans chaque cage avec eau et nourriture ad libitum. Les animaux sont toujours manipulés en douceur. Une période d’acclimatation et d’habituation aux gestes sont respectées avant de démarrer un protocole pour que les animaux puissent s’habituer à leur nouvel environnement et ainsi, diminuer le stress lié au transport et à la manipulation. Des points limites ont été établis pour permettre de soustraire l’animal à la souffrance. L’implantation des cellules en sous-cutanée, en intraveineux, l’injection des virus et l’administration des substances à activité anti tumorale s’effectueront sur animal vigile. Une anesthésie légère est prévue lors de l’injection des cellules en intra péritonéale ainsi que dans le cas de la mesure de bioluminescence. Afin d’éviter une hypothermie due à l’anesthésie, l’animal est placé sur un tapis chauffant de son endormissement à son réveil. Pour le prélèvement de sang terminal une anesthésie et une analgésie sont prévues. Nous veillons à limiter l’angoisse et la souffrance des animaux, en surveillant l’apparition d'éventuels effets secondaires occasionnés par les traitements et en appliquant le cas échéant des critères d’interruption de l’expérimentation en fonction de l’aspect clinique des animaux.

Choix des espèces

Tous les traitements standards que nous souhaitons tester en combinaison avec nos virus oncolytiques sont décrits dans la littérature dans de nombreux modèles de cancers de souris. Par conséquent, la souris est un modèle de référence en oncologie, avec de multiples modèles expérimentaux disponibles. De nombreux outils permettant de caractériser les réponses immunitaires sont disponibles dans cette espèce. Des souris immuno compétentes et immuno déficientes seront utilisées dans ce projet afin d’évaluer nos virus oncolytiques dans différents modèles de tumeurs solides de type carcinome. Animaux âgés entre 6 et 8 semaines lors de l’injection des cellules tumorales (avec un âge plus avancé il y a un risque non négligeable de prise tumorale moins homogène et par conséquent la nécessité d’augmenter le nombre d’animaux).

Des rongeurs sont opérés pour qu'on leur induise une maladie de Parkinson, d'Alzheimer ou un trouble cardiaque, afin que des clients de l'industrie pharmaceutique y testent leurs substances et leurs dispositifs médicaux. 13 500 rongeurs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 7 500 rats, 3 000 souris, 1 500 cochons d'Inde et 1 500 hamsters, 8 100 d'entre eux dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Les opérations, d'une durée maximale de deux heures, consistent à déposer ou injecter une substance directement dans le cerveau ou dans le cœur, à poser un cathéter dans l'intestin grêle, ou à provoquer une insuffisance de la circulation sanguine dans le cœur. Le porteur écrit que les effets indésirables "ne dépassent pas deux semaines" et prévoit de tuer les animaux dont l'état ne s'améliore pas au-delà, l'établissement décrivant par ailleurs une prestation graduée pour ses clients, du développement du modèle à l'étude réglementaire.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de réaliser différentes chirurgies chez le rongeur pour induire une pathologie, comme des troubles neurologiques tels que Alzheimer ou Parkinson mais aussi différents troubles cardio-vasculaires, ou encore pour réaliser des administrations directes dans l’intestin sans passer par l’estomac. Le but est d’évaluer l’efficacité ou la toxicité de substances ou dispositifs médicaux pour l’industrie pharmaceutique.

Bénéfices attendus

Ce projet permet d’induire des pathologies par chirurgie afin de tester une substance ou un dispositif médical sur des modèles expérimentaux correspondants. In fine, le bénéfice attendu est de pouvoir développer et tester ces substances sur l’Homme.

Procédures

Tous les animaux sont anesthésiés et analgésiés avant le début de la chirurgie. Pour les modèles de chirurgie intracérébrales, les animaux subissent le dépôt d'une substance test au contact du cerveau ou une injection directement dans le cerveau. Pour le modèle de pose de cathéter intraduodénal, les animaux subissent la pose d'un cathéter dans la partie initiale de l'intestin grêle pour administrer en direct une substance test. Pour les modèles de chirurgies cardiaques, les animaux subissent le dépôt d'une substance test au contact du coeur, ou une injection dans le coeur, ou encore une insufissance de la circulation du sang dans le coeur. En fonction du projet, différents prélèvements sanguins peuvent être réalisés. A l'issue du projet, tous les animaux sont mis à mort pour des analyses vitro et ex-vivo. La durée maximale de tous les actes chirurgicaux énoncés est de 2h.

Impact sur les animaux

Les modèles d’injections intracérébrales peuvent générer de la douleur et potentiellement des troubles neurologiques à plus ou moins long terme. Le modèle d’administration intraduodénale peut générer de la douleur et potentiellement des troubles intestinaux à plus ou moins long terme. Les modèles de chirurgies cardiaques peuvent générer de la douleur et potentiellement des troubles cardiaques à plus ou moins long terme. Ces effets peuvent aboutir à une baisse d’activité ainsi qu’un changement de comportement (baisse de la prise alimentaire, agressivité, auto-mutilation,…). Ces effets sont limités dans le temps et ne dépassent pas deux semaines. Si les effets indésirables, provenant de la chirurgie ou du traitement, s’étendent au-delà de deux semaines sans aucun signe d’amélioration, alors les animaux seront mis à mort.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux sont mis à mort pour des analyses vitro et ex-vivo.

Remplacement

Le développement de produits pharmaceutiques ou de dispositifs médicaux nécessite de réaliser des expériences chez l’animal dans le cadre du développement non clinique, afin d’évaluer l’activité des produits dans un organisme complet et complexe : - Développement du modèle sur un petit nombre d’animaux, inférieur à 10 - Validation du modèle sur un plus grand nombre d’animaux - Etude pilote : application de la substance test sur un petit nombre d’animaux - Etude réglementaire : application de la substance test sur un nombre d’animaux permettant une analyse statistique représentative. Des tests in vitro sont réalisés au préalable par nos clients ou par notre installation. Il est nécessaire de recourir aux animaux afin de tester une substance dans un organisme complexe.

Réduction

Pour chaque protocole, le nombre d’animaux est réduit au minimum requis tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement fiables. Les analyses statistiques seront effectuées à l'aide d'un logiciel, comme décrit dans les procédures internes. La distribution des données sera vérifiée et les tests statistiques seront sélectionnés en fonction de la normalité des données. Afin de réduire le nombre d’animaux, des échantillons de sang, d’urine, de salive, de LCR (liquide céphalo-rachidien), de fécès ou des organes peuvent être prélévés pour des analyses à posteriori.

Raffinement

Pour les rongeurs, de l’enrichissement comme des batonnêts à ronger, des huttes/tunnels et du papier kraft sont ajoutés dans les cages. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux compatibles. Pour la chirurgie, une anesthésie générale, adaptée en fonction des espèces, est réalisée. Une couverture analgésique adaptée est appliquée et évaluée en fonction des observations quotidiennes des animaux. En fonction du projet, le poids des animaux est enregistré deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience. Les animaux sont observés quotidiennement et un monitoring (observation du déplacement, posture, paralysie, comportement, respiration, aspect des yeux, de la peau, des poils, des muqueuses et des excrétions dans la cage) peut être mis en place. La perte de poids est évaluée en fonction du poids de départ de chaque animal ou du poids maximal de l’animal si celui-ci n'est pas adulte au début de l’étude. Selon les essais et besoins expérimentaux, une observation de la tolérance locale après chaque traitement peut être réalisée. Une observation accrue des animaux est réalisée 2 à 6 heures après les traitements. Des points limites adaptés sont mis en place.

Choix des espèces

Les rongeurs sont des mammifères de petite taille ayant un organisme similaire à l’Homme. Leur génotype est connu et ils sont faciles à héberger. En outre, de nombreux articles bibliographiques sont disponibles pour décrire les différents modèles. En fonction de la demande de nos clients (liée aux caractéristiques de la substance ou du dispositif testé) les animaux utilisés seront des adultes ou des jeunes adultes, car ils nécessitent un système immunitaire et des organes totalement développés et fonctionnels.

Les rats utilisés sont génétiquement dépourvus de dystrophine, donc atteints d'une dégénérescence musculaire progressive qui rend, passé dix mois, la mastication difficile et une tumeur musculaire probable. 54 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, 30 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 24 un niveau modéré. Chacun reçoit jusqu'à vingt-quatre injections intraveineuses précédées d'un sédatif, une dizaine de prélèvements sanguins mensuels complétés par des séries de six ponctions étalées sur 168 heures, et des sessions répétées de mesure de force musculaire de trente minutes sous anesthésie. Ils sont maintenus en vie jusqu'à treize mois, âge où la maladie a le plus progressé, puis tués pour les analyses histologiques, le porteur retenant le rat plutôt que la souris parce qu'il "mime les maladies humaines similaires de manière beaucoup plus fidèle".

Objectifs

Les dystrophies musculaires sont des myopathies génétiques rares qui touchent principalement les muscles et le cœur. Certaines dystrophies sont causées par des changements dans le gène DMD, porté par le chromosome X. Pour cette raison, cette maladie touche surtout les hommes. Le gène DMD produit normalement une protéine appelée "dystrophine". Chez les patients, la production anormalement faible ou absente de dystrophine induit une détérioration progressive des muscles, provoquant une faiblesse musculaire. La forme la plus sévère (absence de dystrophine) apparaît dès l'enfance et entraîne un déclin progressif de la mobilité et du fonctionnement cardiaque, fatale de façon prématurée. L’objectif de notre étude est de comparer l’efficacité à long terme d’une thérapie génique qui permettra de contourner les changements dans le gène DMD afin de produire à nouveau de la dystrophine chez le rat. La dystrophine produite dans le cadre de ce traitement, plus petite que la dystrophine naturelle, conserve une partie importante de son activité. En adoptant un protocole le plus proche possible de celui réalisé chez les enfants actuellement suivis dans le cadre d'un essai clinique, ce projet permettra d’obtenir des données complémentaires précieuses impossibles à obtenir en un temps court chez les enfants. Ces données éclaireront donc les cliniciens pour optimiser les prochaines étapes de l'essai clinique.

Bénéfices attendus

L’absence totale de dystrophine au sein du muscle le fragilise et précipite la mort des fibres qui le composent. L’hypothèse sous-jacente propose que la conversion dystrophique du muscle squelettique, au moins en partie, peut être réversible après une restauration efficace et à long terme de la dystrophine. Comme chez la souris, nous espérons que le traitement restaurera la dystrophine de façon homogène le long de la fibre entière avec une large distribution homogène dans les fibres. Cette restauration répandue est probablement essentielle au succès thérapeutique. L’étude va permettre de fournir des preuves de l’efficacité thérapeutique à long terme. Nos résultats seront comparés à ceux obtenus chez les enfants enrôlés dans l'essai clinique en cours en vue d’affiner les futures analyses réalisées lors de sa probable extension.

Procédures

Le projet se décompose en deux parties distinctes, une première pour déterminer la dose idéale du composé à injecter et une seconde pour mesurer son bénéfice thérapeutique. Pour la première procédure, chaque animal recevra en 2 mois 8 injections intraveineuses durant 30 secondes, chacune précédée d'une injection sous-cutanée (20 secondes) d'un sédatif. La première et la dernière injection seront suivies de 6 prélèvements sanguins de 30 secondes étalés sur 168h. À trois reprises et 1 mois d'intervalle, les animaux réaliseront trois tests non invasifs (test d’agrippement, électrocardiogramme et analyse du patron ventilatoire) pour une durée respective de 20, 10 et 25 minutes. De plus, la locomotion spontanée et les comportements quotidiens seront investigués par le biais d’une évaluation cognitive en filmant les animaux dans une cage à furet pendant une heure. A l'issue du traitement, les animaux recevront une injection sous-cutanée (20 secondes) et la force isométrique produite par leur muscle tibial antérieur (TA) sera mesurée pendant des sessions de 30 minutes via un ergomètre. Avant le début de la seconde procédure, chaque animal vigile réalisera test d’agrippement, un ECG et une pléthysmographie pour une durée respective de 20, 10 et 25 minutes. Puis les animaux seront anesthésiés par une injection sous-cutanée (20 secondes) et la force isométrique produite par leur muscle tibial antérieur sera mesurée pendant des sessions de 30 minutes à l’aide d’un ergomètre. Le traitement sera ensuite dispensé sur 8 mois par 16 injections intraveineuses d’une durée de 30 secondes, chacune précédée d'une injection sous-cutanée (20 secondes) d'un sédatif. À 9 reprises (au début de la procédure puis tous les mois), les animaux se verront prélever leur sang au moyen d’un geste de 30 secondes. Les deux premières prises de sang seront également suivies de 6 autres prélèvements sanguins de 30 secondes étalés sur 168h. À 5 reprises pendant 8 mois (tous les 2 mois), les animaux vigiles réaliseront les tests fonctionnels, test d’agrippement, ECG et pléthysmographie pour une durée respective de 20, 10 et 25 minutes. À 3 reprises pendant 8 mois (tous les 4 mois), les animaux seront anesthésiés par une injection sous-cutanée (20 secondes) et la force isométrique produite par leur muscle TA sera mesurée pendant des sessions de 30 minutes via un ergomètre. Enfin, les animaux anesthésiés en fin de procédure seront également soumis à une échocardiographie de 20 minutes.

Impact sur les animaux

Pour la première partie de ce projet, les animaux DMD seront mis à morts à l’âge de 3 mois, bien avant l’expression des signes cliniques évocateurs d’un effet délétère majeur du phénotype sur les animaux. Jusqu’à 10 mois, aucune entrave majeure à une qualité de vie autonome et globalement compatible avec la vie dans une cage n’a été observée. Pour la seconde partie, les animaux DMD seront mis à morts à l’âge de 13 mois, soit après l’âge de 10 mois à partir duquel les nuisances majeures du phénotype dystrophique sont observées (difficulté croissante à mastiquer et probabilité croissante du développement d’une tumeur musculaire).. Il est attendu que le traitement atténue, réduise voire annule l'ensemble de ces nuisances. Toute observation ou signe clinique anormal dans le décours de la maladie (gêne, douleur ou souffrance exprimée par l'animal) sera quantifiée par le remplissage de la grille d’évaluation dédiée. En fonction du score, les actions décrites sur la grille seront mises en œuvre. L'équipe sera donc mobilisable 7 jours sur 7 pour préserver ces données dans un contexte de décision médicale rapide et centrée sur le bien-être des animaux. Les cas d’insuffisance cardiaque décompensée et mortelle n’ont été observés qu’au-delà de 13 mois. Un effet indésirable du test d’agrippement est la cassure d’une griffe trop longue lors du saisissement de la barre, raison pour laquelle nous vérifions les griffes avant le test et les raccourcissons si besoin. Les rats DMD peuvent exprimer une réponse aiguë de stress supérieure à la normale. Ils se figent pendant quelques minutes. Nous connaissons cette réaction et l'évitons à travers l'habituation progressive des animaux à la manipulation et aux différentes procédures. Nous pouvons aussi- avoir recours à un sédatif administré qui protège l'animal des problèmes cardiaques éventuellement induits par l'excès de cette réponse de stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Ce qui a pu être testé de l’efficacité des composés sans l’usage d’animaux a été réalisé en amont de ce projet. L’innocuité dans un organisme mammifère a été validée chez des souris. Cette étape est indispensable pour évaluer l’éventuelle toxicité des produits administrés, mais aussi de tous leurs métabolites issus de leur transformation par les organes du corps, en particulier le foie. Sur ces bases robustes, nous souhaitons avec ce projet répondre à la question qui ne peut être obtenue que chez l’animal vivant avec l’ensemble de ses organes en interrelation constante : l’action du composé testé permet-elle de limiter la progression de la maladie ou même d’inverser les signes cliniques associés à cette maladie et ce, de façon très large, incluant bien entendu la musculature mais aussi le système nerveux.

Réduction

De nombreuses données ont été cumulées sur les modèles de rats utilisés dans ce projet. Nous avons optimisé la correction des données avant analyse statistique. Le calcul de puissance statistique nous recommande de n’utiliser qu'un maximum de 8 rats par groupe. Ce nombre a été validé avec d’autres projets similaires terminés, pour lesquels nous avons pu conclure qu'il était suffisant. En raison du nombre important de projets qui incluent toujours des animaux sains et atteints traités avec un placebo, l’histoire naturelle de la maladie est documentée avec fiabilité en comparaison avec les congénères sauvages. Pour la première partie du projet concernant la pharmacocinétique du composé, des projets antérieurs ont permis de s’assurer que 6 animaux par groupe étant suffisant pour obtenir des données fiables.

Raffinement

Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont la température et l’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Pour le bien-être des rats, nous avons fait le choix des plus grandes cages disponibles sur le marché, de sorte qu’ils peuvent marcher et se dresser sur leurs pattes arrière. Cet exercice spontané quotidien est pleinement justifié pour des rats dont nous évaluons les capacités locomotrices. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Le cycle d’éclairage respecte l’alternance jour/nuit. Les rats, des animaux sociaux, sont hébergés avec des congénères, l’isolement n’existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft, des bâtons de bois à ronger, des balles rondes, des tunnels ou des carrés de coton compacté. Pour éviter une réponse de stress induite par les divers tests, les animaux seront habitués dès leur arrivée à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel par ailleurs compétent pour reconnaître, quantifier, atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux. Une grille d’évaluation critériée de la douleur et des points limites ont été établis et affichés. Les rats seront constamment évalués en observant individuellement les animaux, week-ends et jours fériés inclus. Toute atteinte des points limites sera suivi d’une action correctrice. En cas d’absence de bénéfice (trouble irréversible), nous procéderons à la mise à mort compassionnelle de l’animal avant qu’il ne souffre.

Choix des espèces

Le rat est une espèce de mammifère évolutivement proche de nous et constitue donc un modèle biomédical apprécié. Les récents outils d’édition du génome ont permis d’en faire un modèle de choix pour l’analyse des affections musculaires. Nos modèles de rats déficients en dystrophine miment les maladies humaines similaires de manière beaucoup plus fidèle que ne le font les modèles historiques de la souris. Le rat conserve néanmoins certains atouts des rongeurs (courte durée de gestation, taille raisonnable, longévité moyenne, effectifs plus importants). En médecine translationnelle, le rat s’insère entre les données obtenues in vitro et la validation translationnelle du chien dont la valeur est inestimable en médecine de précision (hétérogénéité génétique, épigénome, système immunitaire, partage des facteurs d’environnement, format). Pour la première procédure de ce projet, les animaux utilisés seront âgés de 4 à 12 semaines. À cet âge, l’impact de la maladie sur les muscles est détectable par des analyses de sang, de force, cardiaques et respiratoires. En utilisant des animaux de cet âge, il sera possible de conclure sur l’efficacité d’un traitement à un stade précoce de la malade. Pour la seconde procédure, les rats seront âgés de 5 à 13 mois, ce qui correspond au stade où la maladie progresse le plus et les muscles sont de plus en plus impactés, fonctionnellement et morphologiquement. Cet âge correspond également chez le rat au stade de développement de la maladie des enfants, âgés de 6 ans ou plus, pour lesquels une thérapie est envisagée.